CN103408610A - 从梨树叶中提取熊果苷的方法 - Google Patents

Abstract

从梨树叶中提取熊果苷的方法，从梨树叶中提取含熊果苷的叶汁，经浓缩、净化及重结晶得到熊果苷。步骤1，将梨树叶烘干、粉碎后，用甲醇浸渍，过滤，将滤液浓缩为浸膏；步骤2，取树脂装柱，将步骤1所得浸膏用水溶解，过滤，滤液中熊果苷含量为2mg/mL，滤液上柱净化，得熊果苷粗提物；步骤3，取ENV填料装柱，将步骤2所得熊果苷粗提物溶解后上柱再净化，得熊果苷粗品；步骤4，对步骤3所得熊果苷粗品进行结晶，得熊果苷。步骤5，对步骤4所得熊果苷进行重结晶。本发明所用的原料为经济型果木采收后的废料，原料来源丰富，便于获取，且成本低。本发明提取方法工艺简单，操作方便，且所得熊果苷纯度高。

Description

从梨树叶中提取熊果苷的方法

技术领域

本发明属于熊果苷提取方法技术领域，涉及一种从梨树叶中提取熊果苷的方法。

背景技术

熊果苷（arbutin）是一种天然活性物质，能有效地抑制皮肤中的生物酪氨酸酶活性，阻断黑色素的形成，加速黑色素的分解与***，从而减少皮肤色素沉积，祛除色斑和雀斑，是目前国内外美白化妆品中的主要活性物质。近年来，随着国内化妆品业的发展，为顺应护肤化妆品“回归自然”的潮流，天然活性物质的“绿色美白”也日益盛行，而熊果苷作为无毒无害、美白效果明显的天然活性物质，市场需求量日益扩大。

目前，提取熊果苷的原料主要为果木，如蓝莓果，其工艺路线复杂，且由于果源有限，因此导致提取熊果苷的成本很高。

本文所涉及试剂的浓度为体积浓度，其余所涉及百分比均指重量百分比。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从梨树叶中提取熊果苷的方法，解决现有技术存在的工艺复杂，成本高的问题。

本发明的技术方案，从梨树叶中提取熊果苷的方法，从梨树叶中提取含熊果苷的叶汁，经浓缩、净化及重结晶得到熊果苷。

本发明的特点还在于，具体包括以下步骤：

步骤1，将梨树叶烘干、粉碎后，用甲醇浸渍，过滤，将滤液浓缩为浸膏；

步骤2，取树脂装柱，将步骤1所得浸膏用水溶解，过滤，滤液中熊果苷含量为2mg/mL，滤液上柱净化，得熊果苷粗提物；

步骤3，取ENV填料装柱，将步骤2所得熊果苷粗提物溶解后上柱再净化，得熊果苷粗品；

步骤4，对步骤3所得熊果苷粗品进行结晶，得熊果苷。

步骤5，对步骤4所得熊果苷进行重结晶。

步骤1中，浸膏得率为7%～10%，浸膏中熊果苷含量约6%～10%。

步骤2中的树脂为LSA-900B树脂；滤液上柱净化，用不同浓度甲醇淋洗，保持流速0.4～0.5倍柱体积/小时，得净化液，净化液经浓缩后，得固体状态的熊果苷粗提物，其中熊果苷含量30%～34%。

步骤3中，滤液上柱净化后，收集流出液，用2倍柱体积的水淋洗，上样流出液中熊果苷含量低于0.005mg/mL，弃去流出液，再用10倍柱体积的10%甲醇洗脱，每次收集1倍柱体积的洗脱液，整个过程流速保持2～3mL/min；前三次洗脱所得洗脱液中熊果苷含量最高，分别为3.0mg/mL、4.8mg/mL、1.6mg/mL，收集前三次洗脱所得的洗脱液，浓缩，得固体状态熊果苷粗品，其熊果苷含量大于82%。

步骤4中，将熊果苷粗品加入乙酸乙酯，加热回流0.5～1h，趁热过滤，静置过夜，析出白色粉末状固体，过滤，干燥，得白色粉末状固体，该粉末状固体中熊果苷含量大于95%。

步骤5中，重结晶可重复进行多次，熊果苷纯度达99%以上。

本发明具有如下有益效果：

1、本发明所用的原料为经济型果木采收后的废料，原料来源丰富，便于获取，且成本低。

2、本发明提取方法工艺简单，操作方便，且所得熊果苷纯度高。

附图说明

图1为采用本发明从梨树叶中提取熊果苷的方法制得的熊果苷的红外光谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式和附图对本发明作进一步详细的说明。

从梨树叶中提取熊果苷的方法，从梨树叶中提取含熊果苷的叶汁，经浓缩、净化及重结晶得到熊果苷。具体包括以下步骤：

步骤1，将梨树叶烘干、粉碎后，用甲醇浸渍，过滤，将滤液浓缩为浸膏；浸膏得率为7%～10%，浸膏中熊果苷含量约6%～10%。浸膏得率即浸膏占所用梨树叶的质量的百分含量。

步骤2，取树脂装柱，将步骤1所得浸膏用水溶解，过滤，滤液中熊果苷含量为2mg/mL，滤液上柱净化，得熊果苷粗提物；树脂为LSA-900B树脂；滤液上柱净化，用不同浓度甲醇淋洗，保持流速0.4～0.5倍柱体积/小时，得净化液，净化液经浓缩后，得固体状态的熊果苷粗提物，其中熊果苷含量30%～34%。

步骤3，取ENV填料装柱，将步骤2所得熊果苷粗提物溶解后上柱再净化，得熊果苷粗品；滤液上柱净化后，收集流出液，用2倍柱体积的水淋洗，上样流出液中熊果苷含量低于0.005mg/mL，弃去流出液，再用10倍柱体积的10%甲醇洗脱，每次收集1倍柱体积的洗脱液，整个过程流速保持2～3mL/min；前三次洗脱所得洗脱液中熊果苷含量最高，分别为3.0mg/mL、4.8mg/mL、1.6mg/mL，收集前三次洗脱的洗脱液，浓缩，得固体状态熊果苷粗品，其熊果苷含量大于82%。

步骤4，对步骤3所得熊果苷粗品进行结晶，得熊果苷。具体为将熊果苷粗品加入乙酸乙酯，加热回流0.5～1h，趁热过滤，静置过夜，析出白色粉末状固体，过滤，干燥，得白色粉末状固体，该粉末状固体中熊果苷含量大于95%。

步骤5，对步骤4所得熊果苷进行重结晶。可重复进行多次重结晶，熊果苷纯度达99%以上。

实施例1

步骤1、从梨树叶中提取含熊果苷的提取物，其具体步骤为：

步骤1a：摘取梨树叶样品，在40℃烘箱中烘干，粉碎。

步骤1b：称粉碎后的梨树叶样品400g，加入4L纯甲醇，常温下，浸渍3日，过滤，将滤液进行旋转蒸发，浓缩去除甲醇，得到含熊果苷的浸膏，浸膏得率7%，浸膏中熊果苷含量约6%。

步骤2、用LSA-900B树脂制备熊果苷粗提物：

步骤2a：树脂的筛选：

采用静态吸附试验对4种不同型号树脂的吸附效果进行了研究，选用的4种树脂为LSA-900B、LSA-900C、LX-200和LX-400，精确称取各型号树脂1g，按要求预处理后加入具塞锥形瓶中，取0.1g梨树叶提取浸膏，加入40mL水溶解，每种树脂中加入10mL浸膏水溶液，室温下静态吸附1h，取每种树脂的上层清液，用HPLC法测定熊果苷含量（测定方法见文献：赵洁，何强，姚秉华，等，梨树叶中有效成分熊果苷的确证及HPLC检测，中国现代应用药学，2011年），与初始溶液中熊果苷含量比较，计算各种树脂对熊果苷的静态吸附率，结果如表1所示，由表1可见，LSA-900B型树脂的静态吸附率最高，所以选择LSA-900B型树脂进行初步净化。

表1不同型号树脂对熊果苷静态吸附率

树脂型号	LSA-900B	LSA-900C	LX-200	LX-400
					吸附率（%）	62.8	9.4	20.8	8.5

步骤2b：用LSA-900B型树脂分离得到熊果苷粗提物：

取LSA-900B型树脂300g装柱（柱体积约450mL），按要求活化，取8g梨树叶提取浸膏，用240mL水溶解，过滤，滤液中熊果苷含量为2mg/mL，滤液上柱净化，保持流速0.4倍柱体积/小时，收集上样流出液（编号0），再依次用1倍柱体积的蒸馏水（编号1）、1倍柱体积的10%甲醇（编号2）、1倍柱体积的20%甲醇（编号3）、1倍柱体积的30%甲醇（编号4）、1倍柱体积纯甲醇（编号5）、1倍柱体积纯甲醇（编号6），收集各阶段的淋洗液，检测淋洗液中熊果苷含量，结果如表2所示。

表2不同洗脱液中熊果苷含量

从表2可以看出，3号洗脱液（20%甲醇）开始有较多的熊果苷被洗脱下来，5号洗脱液（纯甲醇）基本将树脂上吸附的熊果苷洗脱完全，所以，根据表2中的实验结果，确定上样后先用1倍柱体积的水淋洗，再用1倍柱体积的10%甲醇淋洗，弃去淋洗液，洗脱液经后续优化，1.4倍柱体积的纯甲醇基本能够将树脂上吸附的熊果苷洗脱完全。将甲醇洗脱液浓缩至干，得熊果苷粗提物约1.2g，其中熊果苷含量约30%。

步骤3、用ENV聚合填料净化熊果苷粗提物。

经过大量预实验，选择ENV吸附填料对熊果苷粗提物进行进一步净化。ENV填料是一种聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物材料，对水溶液中的熊果苷有较好的吸附作用，而对糖类等大极性物质基本没有吸附，而且吸附在ENV上的熊果苷容易被10%甲醇溶液洗脱下来，其他吸附在ENV填料上的杂质需要较高浓度的甲醇才能洗脱下来，从而达到很好的净化效果。

具体实验步骤：取20g ENV填料装柱（柱体积约56mL），依次用1倍柱体积的甲醇、1倍柱体积的水活化柱子，取1.2g经过LSA-900B初步净化得到的熊果苷粗提物，用50mL水溶解，过滤，滤液过柱净化，收集流出液，用2倍柱体积的水淋洗，上样流出液中熊果苷含量均低于0.005mg/mL，弃去流出液，再用10倍柱体积的10%甲醇洗脱，每次收集1倍柱体积的洗脱液（编号为1～10），整个过程流速保持2mL/min，前三次洗脱所得洗脱液中熊果苷含量最高，分别为3.0mg/mL、4.8mg/mL、1.6mg/mL，第4次洗脱所得洗脱液中熊果苷含量已经较低，仅为0.06mg/mL，从第5次洗脱液开始，洗脱液中主要为其它成分。所以根据检测情况，收集前三次所得洗脱液，浓缩，得到约0.3g纯度较高的熊果苷粗品（为固体状态），经检测，熊果苷含量约为82%。

步骤4、重结晶得到熊果苷单体

取约0.3g较纯的熊果苷粗品，加入10mL乙酸乙酯，加热回流0.5h，趁热过滤，静置过夜，析出白色粉末状固体，过滤，干燥，得白色粉末状固体约0.2g，该粉末状固体中熊果苷含量约为95%，如果需要制备纯度更高的熊果苷，可以重复进行重结晶，重结晶3次，熊果苷纯度可达99%以上。

步骤5、熊果苷的确证

对分离得到的熊果苷，采用高效液相色谱、质谱、红外光谱和核磁共振H谱和C谱进行了确证，其中分离得到的熊果苷的红外光谱如图1所示，与标准谱库中熊果苷的标准红外光谱图一致。

陕西省是水果生产大省，其中梨树的种植面积近百万亩，梨树叶作为梨树种植的副产物，来源非常丰富，成本低。

实施例2

步骤1、从梨树叶中提取含熊果苷的提取物，其具体步骤为：

步骤1a：摘取梨树叶样品，在50℃烘箱中烘干，粉碎。

步骤1b：称粉碎后的梨树叶样品450g，加入4.5L纯甲醇，常温下，浸渍4日，过滤，将滤液进行旋转蒸发，浓缩去除甲醇，得到含熊果苷的浸膏，浸膏得率8%，浸膏中熊果苷含量约7%。

步骤2、用LSA-900B树脂制备熊果苷粗提物：

步骤2a：树脂的筛选：

采用静态吸附试验对4种不同型号树脂的吸附效果进行了研究，选用的4种树脂为LSA-900B、LSA-900C、LX-200和LX-400，精确称取各型号树脂3g，按要求预处理后加入具塞锥形瓶中，取0.3g梨树叶提取浸膏，加入120mL水溶解，每种树脂中加入30mL浸膏水溶液，室温下静态吸附1h，取每种树脂的上层清液，用HPLC法测定熊果苷含量（测定方法见文献：赵洁，何强，姚秉华，等，梨树叶中有效成分熊果苷的确证及HPLC检测，中国现代应用药学，2011年），与初始溶液中熊果苷含量比较，计算各种树脂对熊果苷的静态吸附率，结果如表3所示，由表3可见，LSA-900B型树脂的静态吸附率最高，所以选择LSA-900B型树脂进行初步净化。

表3不同型号树脂对熊果苷静态吸附率

树脂型号	LSA-900B	LSA-900C	LX-200	LX-400
					吸附率（%）	60.6	8.3	18.1	7.4

步骤2b：用LSA-900B型树脂分离得到熊果苷粗提物：

取LSA-900B型树脂350g装柱（柱体积约530mL），按要求活化，取9g梨树叶提取浸膏，用320mL水溶解，过滤，滤液中熊果苷含量为2mg/mL，滤液上柱净化，保持流速0.4倍柱体积/小时，收集上样流出液（编号0），再依次用1倍柱体积的蒸馏水（编号1）、1倍柱体积的10%甲醇（编号2）、1倍柱体积的20%甲醇（编号3）、1倍柱体积的30%甲醇（编号4）、1倍柱体积纯甲醇（编号5）、1倍柱体积纯甲醇（编号6），收集各阶段的淋洗液，检测淋洗液中熊果苷含量，结果如表4所示。

表4不同洗脱液中熊果苷含量

从表4可以看出，3号洗脱液（20%甲醇）开始有较多的熊果苷被洗脱下来，5号洗脱液（纯甲醇）基本将树脂上吸附的熊果苷洗脱完全，所以，根据表2中的实验结果，确定上样后先用1倍柱体积的水淋洗，再用1倍柱体积的10%～15%甲醇淋洗，弃去淋洗液，洗脱液经后续优化，1.4～1.5倍柱体积的纯甲醇基本能够将树脂上吸附的熊果苷洗脱完全。将甲醇洗脱液浓缩至干，得熊果苷粗提物约2.1g，其中熊果苷含量约30%。

步骤3、用ENV聚合填料净化熊果苷粗提物。

经过大量预实验，选择ENV吸附填料对熊果苷粗提物进行进一步净化。ENV填料是一种聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物材料，对水溶液中的熊果苷有较好的吸附作用，而对糖类等大极性物质基本没有吸附，而且吸附在ENV上的熊果苷容易被10%甲醇溶液洗脱下来，其他吸附在ENV填料上的杂质需要较高浓度的甲醇才能洗脱下来，从而达到很好的净化效果。

具体实验步骤：取22g ENV填料装柱（柱体积约60mL），依次用1～1.5倍柱体积的甲醇、1～2倍柱体积的水活化柱子，取2.1g经过LSA-900B初步净化得到的熊果苷粗提物，用55mL水溶解，过滤，滤液过柱净化，收集流出液，用2倍柱体积的水淋洗，上样流出液中熊果苷含量均低于0.005mg/mL，弃去流出液，再用10倍柱体积的10%甲醇洗脱，每次收集1倍柱体积的洗脱液（编号为1～10），整个过程流速保持3mL/min，前三次所得洗脱液中熊果苷含量最高，分别为2.8mg/mL、4.5mg/mL、1.7mg/mL，第4次所得洗脱液中熊果苷含量已经较低，仅为0.05mg/mL，从第5次所得洗脱液开始，洗脱液中主要为其它成分。所以根据检测情况，收集前三次洗脱所得的洗脱液，浓缩，得到约0.44g纯度较高的熊果苷粗品（为固体状态），经检测，熊果苷含量约为85%。

步骤4、重结晶得到熊果苷单体

取约0.44g较纯的熊果苷粗品，加入30mL乙酸乙酯，加热回流1h，趁热过滤，静置过夜，析出白色粉末状固体，过滤，干燥，得白色粉末状固体约0.3g，该粉末状固体中熊果苷含量大于95%，如果需要制备纯度更高的熊果苷，可以重复进行重结晶，重结晶3次，熊果苷纯度可达99%以上。

步骤5、熊果苷的确证

对分离得到的熊果苷，采用高效液相色谱、质谱、红外光谱和核磁共振H谱和C谱进行了确证，均能与标准谱库相对应。

陕西省是水果生产大省，其中梨树的种植面积近百万亩，梨树叶作为梨树种植的副产物，来源非常丰富，成本低。

实施例3

步骤1、从梨树叶中提取含熊果苷的提取物，其具体步骤为：

步骤1a：摘取梨树叶样品，在60℃烘箱中烘干，粉碎。

步骤1b：称粉碎后的梨树叶样品500g，加入5L纯甲醇，常温下，浸渍5日，过滤，将滤液进行旋转蒸发，浓缩去除甲醇，得到含熊果苷的浸膏，浸膏得率10%，浸膏中熊果苷含量约10%。

步骤2、用LSA-900B树脂制备熊果苷粗提物：

步骤2a：树脂的筛选：

采用静态吸附试验对4种不同型号树脂的吸附效果进行了研究，选用的4种树脂为LSA-900B、LSA-900C、LX-200和LX-400，精确称取各型号树脂5g，按要求预处理后加入具塞锥形瓶中，取0.5g梨树叶提取浸膏，加入200mL水溶解，每种树脂中加入50mL浸膏水溶液，室温下静态吸附1h，取每种树脂的上层清液，用HPLC法测定熊果苷含量（测定方法见文献：赵洁，何强，姚秉华，等，梨树叶中有效成分熊果苷的确证及HPLC检测，中国现代应用药学，2011年），与初始溶液中熊果苷含量比较，计算各种树脂对熊果苷的静态吸附率，结果如表5所示，由表5可见，LSA-900B型树脂的静态吸附率最高，所以选择LSA-900B型树脂进行初步净化。

表5不同型号树脂对熊果苷静态吸附率

树脂型号	LSA-900B	LSA-900C	LX-200	LX-400
					吸附率（%）	69.7	10.2	21.1	9.3

步骤2b：用LSA-900B型树脂分离得到熊果苷粗提物：

取LSA-900B型树脂400g装柱（柱体积约600mL），按要求活化，取10g梨树叶提取浸膏，用500mL水溶解，过滤，滤液中熊果苷含量为2mg/mL，滤液上柱净化，保持流速0.4倍柱体积/小时，收集上样流出液（编号0），再依次用1倍柱体积的蒸馏水（编号1）、1倍柱体积的10%甲醇（编号2）、1倍柱体积的20%甲醇（编号3）、1倍柱体积的30%甲醇（编号4）、1倍柱体积纯甲醇（编号5）、1倍柱体积纯甲醇（编号6），收集各阶段的淋洗液，检测淋洗液中熊果苷含量，结果如表6所示。

表6不同洗脱液中熊果苷含量

从表2可以看出，3号洗脱液（20%甲醇）开始有较多的熊果苷被洗脱下来，5号洗脱液（纯甲醇）基本将树脂上吸附的熊果苷洗脱完全，所以，根据表2中的实验结果，确定上样后先用1倍柱体积的水淋洗，再用1倍柱体积的10%～15%甲醇淋洗，弃去淋洗液，洗脱液经后续优化，1.4～1.5倍柱体积的纯甲醇基本能够将树脂上吸附的熊果苷洗脱完全。将甲醇洗脱液浓缩至干，得熊果苷粗提物约3.0g，其中熊果苷含量约34%。

步骤3、用ENV聚合填料净化熊果苷粗提物。

经过大量预实验，选择ENV吸附填料对熊果苷粗提物进行进一步净化。ENV填料是一种聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物材料，对水溶液中的熊果苷有较好的吸附作用，而对糖类等大极性物质基本没有吸附，而且吸附在ENV上的熊果苷容易被10%甲醇溶液洗脱下来，其他吸附在ENV填料上的杂质需要较高浓度的甲醇才能洗脱下来，从而达到很好的净化效果。

具体实验步骤：取24g ENV填料装柱（柱体积约64mL），依次用1～1.5倍柱体积的甲醇、1～2倍柱体积的水活化柱子，取3.0g经过LSA-900B初步净化得到的熊果苷粗提物，用60mL水溶解，过滤，滤液过柱净化，收集流出液，用2倍柱体积的水淋洗，上样流出液中熊果苷含量均低于0.005mg/mL，弃去流出液，再用10倍柱体积的10%甲醇洗脱，每次收集1倍柱体积的洗脱液（编号为1～10），整个过程流速保持2mL/min，前三次洗脱所得的洗脱液中熊果苷含量最高，分别为2.9mg/mL、4.9mg/mL、1.8mg/mL，第4次洗脱所得的洗脱液中熊果苷含量已经较低，仅为0.05mg/mL，从第5次所得洗脱液开始，洗脱液中主要为其它成分。所以根据检测情况，收集前三次所得洗脱液，浓缩，得到约0.84g纯度较高的熊果苷粗品（为固体状态），经检测，熊果苷含量约为85%。

步骤4、重结晶得到熊果苷单体

取约0.84g较纯的熊果苷粗品，加入50mL乙酸乙酯，加热回流1h，趁热过滤，静置过夜，析出白色粉末状固体，过滤，干燥，得白色粉末状固体约0.4g，该粉末状固体中熊果苷含量大于95%，如果需要制备纯度更高的熊果苷，可以重复进行重结晶，重结晶3次，熊果苷纯度可达99%以上。

步骤5、熊果苷的确证

对分离得到的熊果苷，采用高效液相色谱、质谱、红外光谱和核磁共振H谱和C谱进行了确证，均能与标准谱库相对应。

陕西省是水果生产大省，其中梨树的种植面积近百万亩，梨树叶作为梨树种植的副产物，来源非常丰富，成本低。

Claims (8)

1.从梨树叶中提取熊果苷的方法，其特征在于，从梨树叶中提取含熊果苷的叶汁，经浓缩、净化及重结晶得到熊果苷。

2.如权利要求1所述的从梨树叶中提取熊果苷的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

步骤1，将梨树叶烘干、粉碎后，用甲醇浸渍，过滤，将滤液浓缩为浸膏；

步骤2，取树脂装柱，将步骤1所得浸膏用水溶解，过滤，滤液中熊果苷含量为2mg/mL，滤液上柱净化，得净化液，浓缩得熊果苷粗提物；

步骤3，取ENV填料装柱，将步骤2所得熊果苷粗提物上柱再净化，得熊果苷粗品；

步骤4，对步骤3所得熊果苷粗品进行结晶，得熊果苷。

3.如权利要求2所述的从梨树叶中提取熊果苷的方法，其特征在于：还包括步骤5，步骤5为对步骤4所得熊果苷进行重结晶。

4.如权利要求3所述的从梨树叶中提取熊果苷的方法，其特征在于：重结晶可重复进行多次，熊果苷纯度达99%以上。

5.如权利要求2-4任一项所述的从梨树叶中提取熊果苷的方法，其特征在于，步骤1中，浸膏得率7%～10%；浸膏中熊果苷含量约6%～10%。

6.如权利要求2-4任一项所述的从梨树叶中提取熊果苷的方法，其特征在于，步骤2中的树脂为LSA-900B树脂；滤液上柱净化，不同浓度甲醇淋洗，保持流速0.4～0.5倍柱体积/小时，得熊果苷粗提物，其中熊果苷含量约30%～34%。

7.如权利要求2-4任一项所述的从梨树叶中提取熊果苷的方法，其特征在于，步骤3中，滤液上柱净化后，收集流出液，用2倍柱体积的水淋洗，上样流出液中熊果苷含量均低于0.005mg/mL，弃去流出液，再用10倍柱体积的10%甲醇洗脱，每次收集1倍柱体积的洗脱液，整个过程流速保持2～3mL/min；前三次洗脱所得洗脱液中熊果苷含量最高，分别为3.0mg/mL、4.8mg/mL、1.6mg/mL，收集前三次洗脱所得的洗脱液，浓缩，得固体状态熊果苷粗品，其熊果苷含量大于82%。

8.如权利要求2-4任一项所述的从梨树叶中提取熊果苷的方法，其特征在于，步骤4中，熊果苷粗品加入乙酸乙酯，加热回流0.5～1h，趁热过滤，静置过夜，析出白色粉末状固体，过滤，干燥，得白色粉末状固体，该粉末状固体中熊果苷含量大于95%。

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