CN103405437B

CN103405437B - 一种pi3k小分子抑制剂及其应用

Info

Publication number: CN103405437B
Application number: CN201310387348.6A
Authority: CN
Inventors: 毛新良; 汤娟; 朱景宇; 乔春华; 俞洋; 张祖斌
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2013-08-30
Filing date: 2013-08-30
Publication date: 2015-01-21
Anticipated expiration: 2033-08-30
Also published as: CN103405437A

Abstract

本发明公开了一种PI3K小分子抑制剂及其应用，所述抑制剂为5-[3-(2-噻吩)-2-丙烯-1-]2,4,6(1H,3H,5H)-巴比妥酸，其具有能够有效抑制多种肿瘤细胞的增殖，并诱导其凋亡的功能。本发明新开发的PI3K小分子抑制剂对正常细胞毒性低，并对PI3K诱导的AKT磷酸化、AKT下游蛋白的激活有显著的抑制作用，因此能够有效抑制多种肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡，从而有望将其开发成新的抗肿瘤药物。对急慢性白血病、多发性骨髓瘤、淋巴瘤等多种肿瘤具有体内外的治疗作用。

Description

一种PI3K小分子抑制剂及其应用

技术领域

本发明属于药物化学领域，涉及PI3K抑制剂，具体涉及一种PI3K小分子抑制剂及其应用。

背景技术

癌症目前仍是人类主要的死因之一。临床医生和科学家们都在致力于肿瘤治疗方法的改进，如改进外科手术技巧、精炼放射疗法、研发新的化学制剂，虽然这些努力对于癌症的治疗发展都是有所裨益的，但目前肿瘤的治疗仍然有很大的发展空间，发现新型低毒高效和高特异性的抗肿瘤药物是生命科学家们研究的重要方向。

磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，简称PI3K）是一种影响多种通路的决定性的激酶，这些通路可以调节细胞增长、凋亡以及存活等细胞生命活动，尤其是Ⅰ型的PI3K，包含一个P85调节亚基和P110催化亚基，在这些细胞生命活动中都起着重要的作用，PI3K一旦被激活，就会磷酸化AKT（蛋白激酶B），被激活的AKT就会依次激活调节蛋白质转录的GSK、P70S6k、4EBP1，以及调节细胞周期的P27、P21、cMyc、cyclinD1等，此外，被激活的AKT同样可以作用于如Bad等诱导凋亡以及抗凋亡的线粒体蛋白。

最近研究发现，PI3K信号通路是人类肿瘤细胞中最常见的异体突变的信号通路，该信号通路的过度激活与肿瘤的发生、发展、预后密切相关，抑制PI3K活性，癌细胞出现凋亡；抑制PI3K信号可以克服包括白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤等多种肿瘤的化学耐药性，所以以PI3K为靶点的抗肿瘤药物的研发已经越来越越受到人们的重视。国内外许多医药公司和科研机构也正在积极的开发以此为靶点的化合物，有的已经进入了临床试验。

尽管现有技术中已经报道了许多化合物能够抑制PI3K信号传导，但存在着药物活性太强，对正常细胞毒性大以及在水相中不稳定，限制其应用的缺点。因此需要研究一种新的有机小分子抑制剂，能够对PI3K信号通路有明显抑制作用，从而开发出新的有效的抗肿瘤药物。

发明内容

本发明的发明目的是提供一种PI3K小分子抑制剂，所述抑制剂具有能够抑制多种肿瘤细胞的增殖，并诱导其凋亡的功能。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种PI3K小分子抑制剂，所述抑制剂由下列化学结构式表达：

。

本发明公开的PI3K小分子抑制剂的化学名称为5-[3-(2-噻吩)-2-丙烯-1-]2,4,6(1H,3H,5H)-巴比妥酸，称为C96。

本发明同时保护上述PI3K小分子抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

优选的，所述肿瘤为以下的任一种：白血病、骨髓瘤、淋巴瘤。

本发明的原理为：本发明开发的新PI3K小分子抑制剂主要通过抑制PI3K/AKT信号通路，进而抑制细胞周期素的表达，抑制AKT的磷酸化而抑制细胞周期的进行，从而能有效抑制肿瘤细胞的增殖；并激活细胞凋亡酶诱导其凋亡。

本发明同时要求保护一种抗肿瘤药物组合物，所述抗肿瘤药物的活性成分为上述PI3K小分子抑制剂，还包括药学上能接受的载体或辅料。

本发明所述PI3K小分子抑制剂可以单独或与一种以上可接受的载体组合剂制成制剂给药。例如，溶剂、稀释剂等。可以口服剂型给药，如片剂、胶囊、可分散粉末、颗粒剂等；也可以注射型给药，如冻干粉针剂。本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域中熟知的方法进行制备。这些药用制剂中可以含有与载体组合的例如 0.05%～90% 重量活性成分，更常见约15%～60%之间的活性成分。本发明化合物剂量可以使0.005～5000mg/kg/天，也可根据疾病严重程度或剂型的不同使用剂量超出此剂量范围。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

1．本发明通过计算机辅助药物筛选以及生物学相互结合的方法制备PI3K小分子抑制剂，反应简单易操作，产物易提纯、得率高、稳定；

2．本发明所研发的PI3K信号通路小分子抑制剂对正常细胞毒性低，并对PI3K诱导的AKT磷酸化、AKT下游蛋白的激活有显著的抑制作用，因此能够有效抑制多种肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡，从而有望将其开发成新的抗肿瘤药物。

附图说明

图1为实施例二中化合物C96抑制多发性骨髓瘤细胞生长的效果图；

图2为实施例二中化合物C96抑制白血病细胞生长的效果图；

图3为实施例三中化合物C96诱导多发性骨髓瘤凋亡的效果图；

图4为实施例三中化合物C96诱导多发性骨髓瘤凋亡的效果图；

图5为实施例四中化合物C96对多种多发性骨髓瘤细胞凋亡酶的活化的诱导的效果图；

图6为实施例四中化合物C96对多发性骨髓瘤细胞凋亡酶的活化的诱导与化合物浓度关系的效果图；

图7为实施例四中化合物C96对多发性骨髓瘤细胞凋亡酶的活化的诱导与化合物作用时间关系的效果图；

图8为实施例五中化合物C96对由ICFⅠ刺激的P-AKT的抑制作用；

图9为实施例五中化合物C96对由ICFⅠ刺激的P-AKT抑制作用与化合物浓度的效果图；

图10 为实施例五中化合物C96对由ICFⅠ刺激的P-AKT的抑制作用与作用时间的效果图；

图11为实施例五中化合物C96对由ICFⅠ刺激的P-AKT转移到细胞膜上的抑制作用；

图12为实施例六中化合物C96对PI3K-AKT-mTOR信号通路下游相关蛋白的作用效果图；

图13为实施例六中化合物C96对其他通路相关蛋白的作用效果图；

图14为实施例七中异种移植实验中给药组和对照组的肿瘤体积比较图；

图15为实施例七中异种移植实验中给药组和对照组的小鼠体重比较图；

图16为实施例七中异种移植实验中，化合物C96对AKT磷酸活化的抑制作用图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：5-[3-(2-噻吩)-2-丙烯-1-]2,4,6(1H,3H,5H)-巴比妥酸（C96）的合成

总路线：

具体各步反应：

将化合物1（500mg,4.46mmol,1eq），丙二酸（695.9mg,6.69mol,1.5eq），***啉(38.8mg ,0.45mmol,0.1eq)，溶于5mL的吡啶中，80℃回流反应24h，反应液用二氯甲烷(DCM)稀释，1M盐酸(HCl)洗涤，有机相无水硫酸钠(NaSO₄)干燥，浓缩，柱层析（DCM+0.5%醋酸(HAc)），得化合物4为淡黄色固体634.0mg(92%)； ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 10.75 (s, 1H), 7.89 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 7.43 (d, J = 4.9 Hz, 1H), 7.30 (s, 1H), 7.08 (t, J = 4.0 Hz, 1H), 6.25 (d, J = 15.6 Hz, 1H)。

将化合物4（20mg,0.13mmol,1.0eq）溶于0.5ml 甲醇(MeOH)中，滴入两滴二氯亚砜(SOCl₂)室温搅拌过夜，反应完成后，旋蒸除去甲醇以及二氯亚砜，得淡黄色固体化合物5, 21mg(100%)。

将化合物5（38.2mg,0.23mmol,1.0eq）加入到无水四氢呋喃(THF)中，-78℃条件下缓慢滴入DIBAL-H(31.1mg,0.27mmol,1.2eq)，加水淬灭反应，乙酸乙酯(EA)萃取，无水NaSO₄干燥，柱层析纯化得化合物6为淡黄色油状物21.3mg(66.9%)，放置过夜后成固体；¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.16 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.96 (d, J = 2.9 Hz, 2H), 6.74 (d, J = 15.7 Hz, 1H), 6.20 (dt, J = 15.7, 5.8 Hz, 1H), 4.28 (dd, J = 5.7, 1.1 Hz, 2H)。

制备活性MnO₂

将9.6gKMnO₄溶于60mL水中，加热回流，搅拌下缓慢加入含5g MnSO₄ ^.H₂O的15mL水溶液，40%氢氧化钠(NaOH)溶液11.7mL，保温搅拌反应约1h；将反应液经布氏漏斗抽滤，滤饼用水洗涤，直至洗出液为无色透明，滤饼烘箱干燥，得棕色粉末5g，为活性MnO₂，粉末细腻均匀，可用于后续氧化反应。

将化合物6（21.3mg,0.15mmol,1.0eq），加入化合物6 8当量的活性MnO₂，室温搅拌一段时间后，反应液过滤，用DCM洗涤滤饼，滤液旋蒸浓缩，得化合物7为黄色油状物16.4mg(84%)；¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 9.62 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.58 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 7.50 (d, J = 4.9 Hz, 1H), 7.36 (d, J = 2.9 Hz, 1H), 7.11 (t, J = 4.2 Hz, 1H), 6.51 (dd, J = 15.6, 7.7 Hz, 1H)。

将化合物7（100mg,0.724mmol,1eq）和巴比妥酸（92.6mg,0.724mmol,1eq）混合均匀（巴比妥酸加入到油状物7中，加入乙酸乙酯5毫升，再将乙酸乙酯旋干，即得8和巴比妥酸的均匀混合物），将该混合物置微波炉微波反应（中高火 2min×3）；反应完成后在体系内加入***，混匀后过滤，再用***洗涤三次，用热水洗涤数次，至洗出液澄清，滤饼在红外灯下干燥，得橘红色固体C96，89 mg(38.3%)；¹H NMR (400 MHz, DMSO) δ 11.23 (s, 1H), 11.18 (s, 1H), 8.17 (dd, J = 15.0, 12.0 Hz, 1H), 7.97 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 7.91 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 7.86 (d, J = 4.9 Hz, 1H), 7.52 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 7.21 (dd, J = 4.9, 3.8 Hz, 1H)。

实施例二C96抑制多发性骨髓瘤细胞以及白血病细胞的生长

培养多种多发性骨髓瘤细胞（LP1、RPMI-8226、U266、OPM2、KMS11、OCI-MY5、JJN3细胞）以及白血病细胞（THP1、K562、AML2、NB4OCI-MY5、细胞），用不同浓度的C96处理72h，用MTS/PMS染色法分析细胞存活率。

附图1为C96抑制多发性骨髓瘤细胞生长的效果图，结果表明C96对多发性骨髓瘤增殖的抑制作用呈现浓度依赖性；附图2为C96抑制白血病细胞生长的效果图，结果表明C96对白血病细胞增殖的抑制作用呈现浓度依赖性，对白血病细胞增殖的抑制作用呈现浓度依赖性。由此得出结论：C96可以有效抑制多发性骨髓瘤以及白血病细胞的生长。

实施例三C96诱导多发性骨髓瘤细胞的凋亡

培养LP1、OPM2、OCI-MY5、KMS11、RPMI-8226、JJN3细胞，用不同浓度C96处理24h，收集细胞，用Annexin V-FITC和PI双染，用流式细胞仪检测Annexin V ⁺细胞所占的比例。

附图3、4为C96诱导多发性骨髓瘤凋亡的效果图，结果显示：C96能够有效诱导多发性骨髓瘤的凋亡，并且细胞凋亡率与C96呈现浓度依赖性。

实施例四C96激活肿瘤细胞凋亡酶

将多发性骨髓瘤细胞株细胞LP1、OPM2、U266、KMS11、RPMI-8226、OCI-MY5细胞，经不同浓度C96处理24小时，用含有正钒化钠的SDS 蛋白裂解液裂解，蛋白质定量后取30mg蛋白进行凝胶电泳，检测PARP、caspase3的表达，用GAPDH或actin作为内参。

附图5为C96对多种多发性骨髓瘤细胞凋亡酶的活化的诱导的效果图，可以证明C96能够有效诱导多发性骨髓瘤的凋亡；附图6是C96对LP1、OPM2、JJN3细胞的凋亡蛋白酶的诱导作用与药物浓度的关系，可以看出Pro-Caspase3随C96浓度的上升逐渐下降，而Cle- Caspase3随着C96浓度的上升逐渐上升，PARP也出现相同的现象；附图7是C96对LP1、OPM2、JJN3细胞的凋亡蛋白酶的诱导作用与作用时间的关系。结合图6、7表明C96能够有效诱导多发性骨髓瘤的凋亡蛋白酶，并且这种诱导作用与C96呈现浓度以及时间依赖性。

实施例五C96抑制AKT活化

将多发性骨髓瘤细胞LP1、OPM2、OCI-MY5、JJN3细胞，隔夜低血清（0.5%）培养，经药物（C96或DMSO）处理2小时后用IGFI作用15min, 收集细胞，用含有正钒化钠的SDS蛋白裂解液提取总蛋白，用Western blot检测磷酸化p-AKT和总AKT的表达，GAPDH作为内参。

附图8为C96对由ICFⅠ刺激的P-AKT的抑制作用，结果表明C96能够有效抑制AKT磷酸化；附图9、附图10分别为C96对由ICFⅠ刺激的P-AKT抑制作用与化合物浓度与作用时间的关系，可以看出C96对由ICFⅠ刺激的P-AKT的抑制呈现作用时间以及浓度的依赖性。

进一步用C96处理培养的OPM2细胞，用特异性p-AKT、AKT抗体作免疫荧光分析，利用共聚焦显微镜拍摄免疫荧光图像，附图11为C96对由ICFⅠ刺激的P-AKT转移到细胞膜上的抑制作用，结果表明C96能够抑制p-AKT，并且能够抑制其向细胞膜的聚集。

实施例六C96作用于AKT下游的相关蛋白

将多发性骨髓瘤细胞株细胞LP1、OPM2、JJN3细胞，经不同浓度C96处理24小时，用含有正钒化钠的SDS蛋白裂解液裂解，取30mg蛋白进行凝胶电泳，检测相关蛋白的表达，GAPDH作为内参。

附图12、13分别为C96对PI3K-AKT-mTOR信号通路下游相关蛋白以及其他通路相关蛋白的作用效果图；可以看出C96可以使AKT的下游相关蛋白如p-mTOR、mTOR、p-P70S6K、P70S6K、p-4E-BP1、4E-BP1相应减少，也可以使p-FOXO1(FOXO3)、BCL-2相应减少，p-GSK(ser9)、随着C96的浓度升高而升。

实施例七 C96在小鼠多发性骨髓瘤模型中抑制多发性骨髓瘤的生长以及抑制其体内AKT磷酸化

骨髓瘤细胞株JJN3皮下注射，待肿瘤组织达到可以触摸时，随机分组，分为对照组以及给药组，开始给药（100mg/kg/day），连续16天。隔天测定肿瘤大小，每天称量小鼠体重，附图14为上述异种移植实验中给药组和对照组的肿瘤体积比较图；附图15为上述异种移植实验中给药组和对照组的小鼠体重比较图；结果表明C96能有效地抑制肿瘤的生长但对小鼠的体重没有明显的影响。

将实验动物的肿瘤取出，进剪碎，加入裂解液进项超声破碎，然后离心取上清，取30mg蛋白进行凝胶电泳，检测PARP、caspase3的表达，GAPDH作为内参，附图16为上述异种移植实验中，化合物C96对AKT磷酸活化的抑制作用，表明C96能够有效抑制动物肿瘤组织中的AKT磷酸化。

Claims

1.式1的化合物在制备PI3K小分子抑制剂中的应用；

式1。