CN103402542B - 恶性肿瘤转移抑制用药物 - Google Patents

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Abstract

一种用于抑制或预防恶性肿瘤的转移的药物，其含有至少一种血管内皮细胞内cGMP增强剂作为有效成分。

Description

恶性肿瘤转移抑制用药物
技术领域
本发明涉及将以利尿钠肽受体GC-A及GC-B激动剂为代表的血管内皮细胞内cGMP增强剂（vascular endothelial intracellular cGMP enhancer）作为有效成分的、包括癌在内的恶性肿瘤的转移抑制用药物组合物。
背景技术
以癌为代表的恶性肿瘤是基于细胞的异常增殖的疾病，作为恶性肿瘤的最大的特征是向周边组织的浸润和向其它脏器的转移。自古以来已知恶性肿瘤患者的死因很多并不是原发病灶的增大，而是伴随肿瘤细胞的远转移的多脏器衰竭，恶性肿瘤转移的控制近年来也未实现，是癌治疗全体中的最重要课题之一。
上皮系恶性肿瘤(癌)的转移被认为是通过基于上皮间质转换(Epithelial toMesenchymal Transition、以下称为“EMT”)癌细胞获得运动能力及浸润能力、向周边组织的浸润、向血管或***的移动和侵入、向远组织的定植和转移病灶的形成等多种生理现象而引起的，近年来特别是EMT受到注目。在正常的上皮组织中，细胞彼此介由粘接分子紧密地接合而形成组织，但是EMT是随着恶变的进行，细胞彼此的粘接能力丧失而向获得游走能力·运动能力的细胞转换的现象。在EMT的过程中，由于E钙粘附蛋白的表达减少，N钙粘附蛋白的表达亢进，所以可以认为N钙粘附蛋白/E钙粘附蛋白的基因表达比为EMT的指标。通过该EMT获得游走能力·运动能力的癌细胞由于能够进行从原发病灶向周边组织的浸润、向血管或***的侵入，所以成为癌转移的触发(非专利文献1：Thomas R.Geiger etal.,Biochim.Biophys.Acta.、2009年、293-308页)。此外，在上皮系以外的恶性肿瘤(肉瘤等)中，也是恶变而获得运动能力·浸润能力的肿瘤细胞向血管等侵入，经由向远组织的血管内皮的定植、向组织内的浸润，从而形成转移病灶。这样，恶性肿瘤的转 移是以与肿瘤细胞的增殖完全不同的机制进行的，通过现有的具有细胞毒效果或细胞增殖抑制活性的药剂无法充分抑制。此外，这些药剂一般存在对正常组织的不良影响，在长期给予的情况下存在副作用严重的问题。为了控制恶性肿瘤转移，通常需要长期的给予，所以期望发现·开发用于抑制转移的安全性高的药剂。
细胞内的cGMP作为介导生物体的信号传导的第二信使被广泛所知，特别是在血管平滑肌的控制中被经常研究。一般已知血管平滑肌细胞的细胞内cGMP的上升会使平滑肌松弛，血压下降，作为具有这种作用的药剂的代表性例子，可列举出利尿钠肽。
已知被称为利尿钠肽的肽有心钠肽(ANP)、脑钠肽(BNP)及C型利尿钠肽(CNP)，这些肽通过在细胞内与具有鸟苷酸环化酶结构域的膜跨受体特异性地结合，使细胞内的cGMP上升，从而表现出各种生理活性。已知作为这种受体有利尿钠肽受体GC-A(别名：NPR-A)和利尿钠肽受体GC-B(别名：NPR-B)这2种，ANP和BNP与GC-A特异性结合，CNP与GC-B特异性结合(非专利文献2：Silver MA,Curr.Opin.Nephrol.Hypertens.,2006年,15卷,14-21页)。
ANP是在心房细胞中产生并分泌的具有由28个氨基酸构成的环状结构的肽，在肾脏中显示利尿作用，在血管中松弛·扩张血管平滑肌。ANP进一步对肾素-血管紧张素-醛固酮***及血管加压素产生拮抗作用。这些作用综合地通过血压的下降、体液量的降低等向减轻心脏负担的方向起作用。BNP是从脑中发现的具有由32个氨基酸构成的环状结构的肽，但在之后的研究中判明与脑相比主要在心肌细胞中产生并分泌，具有与ANP同样的作用。ANP和BNP与GC-A特异性地结合，促进cGMP的产生而表现出上述的作用(非专利文献3：Yoshibayashi M.et al,Eur.J.Endocrinol.,1996年、135卷，265-268页)。实际上，在充血性心力衰竭等中伴随着心房充盈压的上升ANP的分泌得到促进，通过上述的作用而起到减轻充血性心力衰竭等症状的作用，人型ANP(hANP)在日本作为急性心力衰竭治疗药在临床上使用。此外，在心力衰竭患者中BNP分泌也亢进，通过上述的作用而起到缓解伴随心力衰竭的诸症 状的作用，人型BNP(hBNP)在美国等中作为急性心力衰竭治疗药被认可。
已知ANP或BNP除了利尿作用、血管扩张作用等血压调整作用以外还具有各种生理活性，例如报道了ANP对由细菌感染引起的炎症或伴随其的内皮保护功能不全具有作用(例如非专利文献4：Xung J.,et al,J.appl.Physiol.(2011年)、110卷、1号、213-224页、等)。关于恶性肿瘤，对ANP在实验中抑制癌细胞的增殖的效果有Vesely等作的许多报道(例如，非专利文献5(Vesely BA et al,Eur J Clin Invest.(2005)、35卷、60-69页)等)。在这些报道中，指出除了ANP以外，长效利尿钠肽（Long Acting Natriuretic Peptide）、血管舒张因子（Vessel Dilator）及利钾尿肽（Kalliuretic Peptide）等认为由其氨基酸序列来看难以与利尿钠肽受体GC-A结合的肽具有与ANP同样、或比其更强的癌细胞增殖抑制活性，此外指出，BNP不显示这样的增殖抑制作用。由此认为，他们报道的ANP的癌细胞增殖抑制作用并非基于对GC-A的激动剂活性。此外，包括Vesely等的报道在内，关于ANP或BNP的与肿瘤细胞的转移有关的作用也是未知的。
已知CNP是从猪的脑内发现的生理活性肽，在哺乳类的体内，存在由22个氨基酸构成的CNP-22、和其N末端侧延长而由53个氨基酸构成的CNP-53。CNP起初被认为作为脑神经肽发挥功能，但通过之后的研究判明在末梢也存在，确认在骨的生长过程中发挥重要的作用。迄今为止，确认了CNP主要在骺板的软骨组织中控制软骨细胞的分化或增殖，期待作为以软骨发育不全症为首的侏儒症的治疗药的可能性。CNP在除了骨·软骨以外中也已知有各种生理活性，对于血管，已知有抑制血管平滑肌细胞的增殖、或促进血管内皮细胞的增殖等作用。然而，关于CNP对恶性肿瘤的转移的作用是未知的。
此外，作为其它的使细胞内cGMP浓度上升的药剂，已知有柠檬酸西地那非那样的cGMP的分解酶即磷酸二酯酶(PDE)5的抑制剂、***那样的NO供给剂、精氨酸那样的eNOS底物、分解ANP或BNP的中性肽链内切酶(NEP)的抑制剂等。此外，已知在消化器官中有作用的鸟苷酸环化酶C(GC-C)的激动剂即鸟苷素（guanylin）、尿鸟苷素（uroguanylin）等也会使细胞内的 cGMP浓度上升。关于这些药剂，也已知与包括炎症反应、过敏反应的各种生理现象有关，近年来，也存在一些与肿瘤细胞的控制有关的报道，但是对于作用于血管内皮细胞并在实际的生理条件下抑制肿瘤细胞的转移是未知的。例如，关于西地那非，也有对恶性肿瘤具有抑制效果的报道((例如，非专利文献6：Das et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(2010年)、107卷、42号、18202-18207页等)，但另一方面，也有对肿瘤细胞的增殖及转移没有影响的报道(例如，非专利文献7：Dian C.N.,et al,Journal of.Urology(2003年)、170卷(3)、994-997页)。关于GC-C，已知与结肠直肠癌细胞中的表达亢进或因癌细胞而产生MMP9有关(例如，非专利文献8：Lubbe W.J.,et al、Cancer Res.(2009年)、69卷、8号、3529-3536页)等。关于NO，有阻碍肿瘤细胞向经LPS处理的分离的大鼠毛细血管后微静脉粘接的报道(非专利文献9：Kong L.,et al、Clin Exp.Metastasis(1996年)、14卷、3号、335-343页)，但其是使用了LPS这样的强炎症诱导剂的实验，认为与实际的肿瘤转移中的生理现象相差悬殊。此外，在之后十几年间没有追随其的报道，关于对生理性肿瘤转移的作用并不清楚。
然而，关于作用于血管内皮细胞而抑制肿瘤的转移是未知的。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Thomas R.Geiger et al.,Biochim.Biophys.Acta.、2009年、293-308页
非专利文献2：Silver MA,Curr.Opin.Nephrol.Hypertens.,2006年，15卷，14-21页
非专利文献3：Yoshibayashi M.et al,Eur.J.Endocrinol.,1996年、135卷，265-268页
非专利文献4：Xung J.,et al,J.appl.Physiol.(2011年)、110卷、1号、213-224页
非专利文献5：Vesely BA et al,Eur J Clin Invest.(2005)、35卷、60-69页
非专利文献6：Das et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(2010年)、107卷、42号、18202-18207页
非专利文献7：Dian C.N.,et al,Journal of.Urology(2003年)、170卷(3)、994-997页
非专利文献8：Lubbe W.J.,et al、Cancer Res.(2009年)、69卷、8号、3529-3536页
非专利文献9：Kong L.,et al、Clin Exp.Metastasis(1996年)、14卷、3号、335-343页
发明内容
发明要解决的问题
本发明的课题是提供用于抑制以癌为首的恶性肿瘤的转移的安全性高的药物。
用于解决问题的方案
本发明人等对能够抑制癌的转移的药剂进行了深入研究，结果发现，利尿钠肽受体GC-A激动剂通过具有抑制癌细胞的EMT、以及抑制癌细胞的游走能力、运动能力、浸润能力等与转移有关的细胞活性的获得的作用，特异性诱导癌细胞凋亡，进一步对宿主侧的因子即血管内皮细胞起作用，从而抑制癌的植入（implantation）转移等。进而，通过实际的癌患者中的临床研究发现，在癌患者的癌切除术中，在术后3天给予血压不发生变动的低用量的hANP的患者组中癌的复发被显著地抑制。此外，在肿瘤细胞的小鼠尾静脉注入转移试验中，不仅对于表达GC-A的肿瘤细胞，对于B6黑色素瘤那样的不表达GC-A的肿瘤细胞的转移，也通过GC-A激动剂的给予确认到显著的肿瘤转移抑制效果。进而，在使用了内皮组织特异性敲除GC-A基因的小鼠的该转移试验中，确认到与野生型小鼠相比显著的肿瘤转移的增大，相反在使用了使GC-A基因在内皮细胞中过量表达的小鼠的该转移试验中，确认到与野生型小鼠相比显著的肿瘤转移的抑制，暗示了内皮组织中表达的GC-A介 导的信号在肿瘤细胞的转移中发挥核心作用，进而，对于该转移试验，即使给予CNP那样的GC-B激动剂、柠檬酸西地那非那样的PDE5抑制剂等通过GC-A以外的机制使细胞内cGMP上升的药剂，也观察到显著的转移抑制效果。基于这些见解进一步反复研究，从而完成本发明。
即，利尿钠肽受体GC-A激动剂对于表达GC-A的肿瘤细胞，通过直接作用于肿瘤细胞并抑制以EMT为首的游走能力及浸润能力而显示抑制转移的效果(直接效果)。除此以外，像GC-A激动剂、GC-B激动剂或PDE5抑制剂那样利用细胞内cGMP的上升而引起信号传导的物质还具有以下效果(间接效果)：通过作用于血管或***的内皮细胞，从而与肿瘤细胞中的GC-A表达的有无无关地阻碍肿瘤细胞向血管内皮的粘接·浸润，抑制肿瘤的转移。由于在内皮细胞中通常表达GC-A、GC-B，所以该间接效果不论肿瘤的种类均能够抑制肿瘤转移。
本发明提供以下的发明。
本发明涉及一种用于抑制或预防癌等恶性肿瘤的转移的药物，其含有至少一种使血管内皮的细胞内cGMP浓度上升的药剂(称为“血管内皮细胞内cGMP增强剂”)(例如，利尿钠肽受体GC-A激动剂)作为有效成分。
此外，本发明涉及一种预防或抑制癌等恶性肿瘤的转移的方法，其中，包括对需要控制癌等恶性肿瘤的转移的患者给予有效量的至少一种血管内皮细胞内cGMP增强剂(例如，利尿钠肽受体GC-A激动剂)。
此外，本发明进一步涉及至少一种血管内皮细胞内cGMP增强剂(例如，利尿钠肽受体GC-A激动剂)，其用于预防或抑制癌等恶性肿瘤的转移的用途。
在本发明所提供的药物、治疗方法等(以下，称为“药物等”。)中，血管内皮细胞内cGMP增强剂优选为利尿钠肽受体GC-A激动剂、利尿钠肽受体GC-B激动剂、GC-C激动剂、NEP抑制剂、PDE5抑制剂、NO供给剂、eNOS活化剂、cGMP类似物等具有作用于血管内皮细胞而使其细胞内cGMP浓度上升的活性的物质。更优选为利尿钠肽受体GC-A激动剂、利尿钠肽受体GC-B激动剂、NEP抑制剂或PDE5抑制剂，进一步优选为利尿钠肽受体GC-A激动 剂。本发明的血管内皮细胞内cGMP增强剂至少具有作用于血管或***的内皮细胞而使其细胞内cGMP浓度上升的活性，但优选在给生物体给予的情况下使末梢血管的内皮细胞的细胞内cGMP浓度上升。
在本发明所提供的药物等中，利尿钠肽受体GC-A激动剂优选为选自以下的(a1)到(a6)中的任一种或其药理上可接受的盐、且对利尿钠肽受体GC-A具有激动剂活性的物质；
(a1)心钠肽、(a2)脑钠肽、(a3)包含(a1)或(a2)的活性片段的物质、(a4)在(a1)到(a3)中的任一氨基酸序列中取代、缺失、***和/或附加1～数个氨基酸而得到的突变体、(a5)(a1)到(a4)中任一种的衍生物、以及(a6)(a1)到(a5)中任一种的修饰体。
其中，作为利尿钠肽受体GC-A激动剂的更优选的方式，可分别列举出以下的物质等。
作为(a1)心钠肽，优选由序列表的序列号1或2中记载的氨基酸序列构成的肽。此外，作为(a2)脑钠肽，优选由序列表的序列号3、4或5中记载的氨基酸序列构成的肽。(a3)活性片段优选为具有序列表的序列号6的氨基酸序列的肽，更优选为由序列表的序列号1或2的7位到27位的氨基酸序列、序列号3或4的10位到30位的氨基酸序列、或序列表的序列号5的23位到43位的氨基酸序列构成的肽。(a4)突变体优选为在序列表的序列号1到5中任一项中记载的氨基酸序列中，在除了序列号6所表示的氨基酸以外的氨基酸的1处～数处取代、缺失、***和/或附加1个～数个氨基酸而得到的肽，更优选为(i)在序列号1或2的氨基酸序列的1位到6位及28位中的任一处～数处取代、缺失、***和/或附加一个～数个氨基酸而得到的肽、(ii)在序列号3或4的氨基酸序列的1到9位、31位及32位中的任一处～数处取代、缺失、***和/或附加一个～数个氨基酸而得到的肽、或(iii)在序列号5的氨基酸序列的1位到22位、44位及45位中的任一处～数处取代、缺失、***和/或附加一个～数个氨基酸而得到的肽。(a5)衍生物优选为包含序列表的序列号1到5中的任一氨基酸序列、或上述的(a3)活性片段的物质，更优选为进一步包含免疫球蛋白Fc部分、血清 白蛋白、及来自生长素释放肽的C末端的部分序列中的至少一种的物质。(a6)修饰体优选为包含序列表的序列号1到5中的任一氨基酸序列、且在其氨基酸序列中的相当于序列号6所表示的氨基酸以外的氨基酸的至少一个中接受化学修饰的物质，更优选为通过结合PEG、PVA等制药上使用的高分子聚合物进行化学修饰而得到的物质。
此外，在本发明所提供的药物等中，利尿钠肽受体GC-A激动剂也可以是抗GC-A抗体。这样的抗GC-A抗体也可以使用与GC-A特异性结合、且对GC-A具有激动剂活性的抗体。作为这样的抗体，可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体，但优选为人源化单克隆抗GC-A抗体、或人型（human type）单克隆抗GC-A抗体。
在本发明所提供的药物等中，利尿钠肽受体GC-B激动剂优选为选自以下的(b1)到(b5)中的任一种或其药理上可接受的盐、且对利尿钠肽受体GC-B具有激动剂活性的物质；(b1)C型利尿钠肽、(b2)包含(b1)的活性片段的物质、(b3)在(b1)或(b2)的氨基酸序列中取代、缺失、***和/或附加1～数个氨基酸而得到的突变体、(b4)(b1)到(b3)中任一种的衍生物、以及(b5)(b1)到(b4)中任一种的修饰体。
其中，作为利尿钠肽受体GC-B激动剂的进一步优选的方式，可分别列举出以下的物质等。
(b1)C型利尿钠肽优选为由序列表的序列号7(hCNP-22)、序列号8(hCNP-53)、序列号9(来自鸡的CNP)或序列号10(来自青蛙的CNP)中记载的氨基酸序列构成的肽。(b2)活性片段优选为具有序列表的序列号11的氨基酸序列的物质，更优选活性片段为由序列表的序列号7的6位到22位的氨基酸序列(hCNP6-22)构成的物质。(b3)突变体为在序列表的序列号7到10中任一项记载的氨基酸序列中，在除了序列号11所表示的氨基酸以外的氨基酸的1～数处取代、缺失、***和/或附加1～数个氨基酸而得到的物质，更优选突变体为(i)在序列号7、9或10的氨基酸序列的1位到5位中的任一处～数处取代、缺失、***和/或附加一个～数个氨基酸而得到的肽、或(ii)在序列号8的氨基酸 序列的1位到36位中的任一处～数处取代、缺失、***和/或附加一个～数个氨基酸而得到的肽。(b4)衍生物优选为包含序列表的序列号7到11中的任一氨基酸序列的物质、或进一步包含免疫球蛋白Fc部分、血清白蛋白、及来自生长素释放肽的C末端的部分序列中的至少一种的物质。(b5)修饰体优选为包含序列表的序列号7到10中的任一氨基酸序列、且在其的相当于序列号11所表示的氨基酸以外的氨基酸的至少一个中接受化学修饰的物质，更优选修饰体为通过附加制药上使用的高分子聚合物进行化学修饰而得到的物质。
此外，在本发明所提供的药物等中，利尿钠肽受体GC-B激动剂也可以是抗GC-B抗体。这样的抗GC-B抗体也可以采用与GC-B特异性结合、并对GC-B具有激动剂活性的物质。作为这样的抗体，可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体，但优选为人源化单克隆抗GC-B抗体、或人型单克隆抗GC-B抗体。
作为本发明的药物等中使用的PDE5抑制剂，可以使用西地那非、伐地那非、他达拉非、乌地那非、米罗那非等许多的化合物、或它们的药理上可接受的盐，但优选为柠檬酸西地那非、盐酸伐地那非、或他达拉非。
此外，在本发明所提供的药物等中，利尿钠肽受体GC-A激动剂等血管内皮细胞内cGMP增强剂可以调节为不使患者的血压、心律或尿量中的至少一项目发生较大变动的程度的用量进行给予，作为其用量，例如对于利尿钠肽受体GC-A激动剂或GC-B激动剂而言，可以为0.1μg/kg/分钟以下的连续给予，优选为0.05μg/kg/分钟以下的连续给予，更优选采用0.025μg/kg/分钟以下的连续给予。连续给予时的给予期间通常为1天以上，优选为1到数天。
此外，本发明所提供的药物等，可以对接受恶性肿瘤的切除手术的患者，在与该手术对应的期间(例如，从该切除手术前一天到术后数天)给予的形态中利用。作为此时的给予方法，例如为将利尿钠肽受体GC-A激动剂或利尿钠肽受体GC-B激动剂以0.1μg/kg/分钟以下从手术前到术后一定期间连续给予的方法，优选为将由序列号1到5、7到10中任一项中记载的氨基酸序列构成的肽以0.05μg/kg/分钟以下的用量从肿瘤切除手术前到术后一定期间(优 选为5天以下)的期间连续地给予的方法，更优选为将由序列号1的氨基酸序列构成的肽以0.025μg/kg/分钟的用量从肿瘤切除手术前到术后3天连续地给予的方法。
此外，在本发明所提供的药物等中，也包括组合2种以上的血管内皮细胞内cGMP增强剂作为有效成分进行给予(可以配合到单一的制剂中，也可以同时或在不同的时期给予分别制剂化而得到的制剂)那样的方式。在这样的组合中，优选为利尿钠肽受体GC-A激动剂或利尿钠肽受体GC-B激动剂与PDE5抑制剂或NO供给剂的组合，更优选为由序列号1、序列号3、序列号7或序列号7的氨基酸号6到22所组成的氨基酸序列构成的肽与西地那非的组合。
此外，本发明提供通过血管内皮细胞内cGMP增强剂(例如，利尿钠肽受体GC-A激动剂)的给予而作用于患者的体内的血管内皮细胞，并呈现出抑制肿瘤细胞的向血管内皮组织的粘接及浸润的药理作用那样的药物或治疗方法等。
进而，本发明所提供的药物还提供一种药物，其特征在于，含有利尿钠肽GC-A激动剂作为血管内皮细胞内cGMP增强剂，对可能患有上皮系恶性肿瘤的对象(优选为在肿瘤细胞中表达GC-A的对象)进行给予。此时，除了对血管内皮的作用以外，对表达GC-A的肿瘤细胞也显示出抑制肿瘤细胞的转移能力获得的药理作用，从而可以期待协同效果。作为这样的对肿瘤细胞的药理作用，为选自抑制癌细胞的EMT、阻碍癌细胞获得游走能力、阻碍癌细胞获得运动能力、抑制癌细胞的浸润及特异性诱导癌细胞凋亡中的至少一种，更优选显示多种作用。
发明的效果
本发明所述的以利尿钠肽受体GC-A激动剂等血管内皮细胞内cGMP增强剂作为有效成分的用于抑制或预防恶性肿瘤的转移的药物具有通过作用于***或血管的内皮细胞而抑制肿瘤细胞的向血管内皮的粘接、浸润，从而不论肿瘤的种类都能够抑制或预防转移那样的优异的效果。特别是关于作 为血管内皮细胞内cGMP增强剂含有利尿钠肽受体GC-A激动剂的药物，对表达GC-A的肿瘤细胞显示抑制EMT、游走活性、浸润活性等与转移相关的各过程的效果，发挥能够在多个阶段抑制恶性肿瘤的转移那样的特别的效果。通过这样的本发明的优异效果，不仅能够预防恶性肿瘤的转移或利用肿瘤切除术治疗后的复发，也能够有效地抑制、预防难以切除的恶性肿瘤的转移。进而，由于hANP、hBNP、西地那非等已经在临床上给多数患者给予，确认了安全性，所以本发明所提供的药物成为副作用风险少、且具有优异的肿瘤转移抑制作用的药物。
附图说明
图1是表示对A549细胞的由利尿钠肽(hANP(●)、hBNP(▼)、hCNP(○))刺激引起的细胞内cGMP水平的变动的图表。图表的各点中的例数为n=5～7。
图2是通过培养48小时为止的活细胞数表示在各浓度的hANP(图2的A)、hBNP(图2的B)、hCNP(图2的C)存在下及非存在下的A549细胞的增殖状况的图表。各利尿钠肽的浓度为对照(0M)(○)、1×10-9M(●)、1×10-8M(△)、1×10-7M(□)及1×10-6M(▼)。图表的各点中的例数为n=10～12。
图3是表示在1μM hANP存在下(图3的C)及非存在下(图3的B)的由TGF-β1刺激引起的A549细胞的形态变化的显微镜照片(图3的A：无刺激的A549细胞(对照)、图3的B：TGF-β1(1ng/ml)、图3的C：hANP(1μM)+TGF-β1(1ng/ml))。
图4是以mRNA水平进行表示的、在1μM hANP存在下及非存在下分别以0.25、0.5及1.0ng/ml TGF-β1刺激A549细胞时的作为EMT的指标的各因子(分别为图4的A：VEGF-A、图4的B：E-钙粘附蛋白、图4的C：N-钙粘附蛋白、图4的D：PDGF-B、图4的E：TNF-α及图4的F：IL-6)的基因表达的图表。图表中，横轴表示TGF-β1的浓度，纵轴表示mRNA水平。此外，图表中，在1μM hANP非存在下的各基因的表达以灰色的棒表示，在hANP存在下的各基因的表达以黑色的棒表示。
图5是表示在1μM hANP存在下及非存在下分别以0.25、0.5及1.0ng/ml TGF-β1刺激A549细胞时的E-钙粘附蛋白与N-钙粘附蛋白的表达比率(N-Cad/E-Cad)的图表。图表的横轴表示TGF-β1的浓度，纵轴表示E-钙粘附蛋白与N-钙粘附蛋白的表达比率(N-Cad/E-Cad)。在1μM hANP非存在下的E-钙粘附蛋白与N-钙粘附蛋白的表达比率(N-Cad/E-Cad)以灰色的棒表示，在hANP存在下的E-钙粘附蛋白与N-钙粘附蛋白的表达比率(N-Cad/E-Cad)以黑色的棒表示。
图6的A及图6的B是表示在使用TGF-β1作为游走激发物质的博伊登室试验（BoydenChamber Assay）中在hANP的存在下及非存在下的A549细胞的游走能力的图。图6的A是各组中的试验20小时后的细胞培养池(cell culture insert)下表面的细胞的显微镜照片(图6的A之a：对照组、图6的A之b：TGF-β1组、图6的A之c：TGF-β1+hANP组)。图6的B是表示各组中的附着在试验20小时后的细胞培养池下表面的细胞数的图表。
图7是伤口愈合分析(Wound Healing Assay)中的刚负伤后的培养皿的伤口部分的显微镜照片(图7的A)、以及对照组(图7的B)、TGF-β1组(图7的C)及TGF-β1+hANP组(图7的D)各组的负伤24小时后的培养皿的伤口部分的显微镜照片。
图8是表示伤口愈合分析中的对照组、TGF-β1组及TGF-β1+hANP组各组的负伤24小时后的移动率的图表。
图9的A及图9的B表示在使用TGF-β1作为游走激发物质并在上层形成有基质胶(Matrigel)层的博伊登室试验中在hANP的存在下及非存在下的A549细胞的浸润能力。图9的A是各组中的试验40小时后的细胞培养池下表面的细胞的显微镜照片(图9的A之a：对照组、图9的A之b：TGF-β1组、图9的A之c：TGF-β1+hANP组)。图9的B是表示各组中的附着在试验40小时后的细胞培养池下表面的细胞数的图表。
图10是表示对于各种癌细胞(图10的A：A549细胞、图10的B：H460细胞、图10的C：H520细胞、图10的D：H358细胞)的依赖于hANP的浓度(1、5、10μM) 的凋亡诱导的图表。
图11是表示顺铂的各浓度下的由1μM hANP引起的对各种癌细胞(图11的A：A549细胞、图11的B：H460细胞、图11的C：H520细胞、图11的D：H358细胞)的凋亡诱导的图表。图表的横轴表示顺铂的浓度。各图表中，灰色是顺铂(CDDP)单独组，黑色是1μM hANP组。
图12是表示顺铂的各浓度下的由10μM hANP引起的对各种癌细胞(图12的A：A549细胞、图12的B：H460细胞、图12的C：H520细胞、图12的D：H358细胞)的凋亡诱导的图表。图表的横轴表示顺铂的浓度。各图表中，灰色是顺铂(CDDP)单独组，黑色是10μM hANP组。
图13是表示VEGF、及hANP对铺满培养的HUVEC细胞的细胞间粘接的作用的显微镜照片(图13的左上：对照、右上：添加VEGF的HUVEC细胞、左下：添加hANP的HUVEC细胞、右下：添加VEGF及hANP的HUVEC细胞)。图13中，以圆或椭圆状染色(灰色(实际的彩色照片中为蓝色))的地方是被Topro3染色的细胞核。在细胞外缘附近以带状染色的地方(细胞核以外的带状的染色部分：灰色(实际的彩色照片中(绿色))是被免疫染色的VE-钙粘附蛋白，表示细胞间粘接的状况。
图14是以癌的进展程度(图14的A：1A期(Stage1A)、图14的B：1B期(Stage 1B)、图14的C：2期(Stage2)、图14的D：3期(Stage3))表示通过Kaplan-Meier法(采用癌的复发作为监测变量（censor variable）)解析肺癌切除术患者的对照组及hANP组中的术后早期(2年以内)无复发生存率(累计生存率)的结果的图表。平均观察期间为：hANP组：21.8个月、对照组：22.0个月。图14的A、图14的B、图14的C及图14的D中，●、■、▲及◆分别表示对照组。图表上没有表示标绘意味着没有发生死亡、复发等事件。
图15是分别表示hANP给予组(○)(n=23)及对照组(●)(n=21)的从癌切除术前到术后4天为止的舒张期血压(图15的A)、收缩期血压(图15的B)、心律(图15的C)及尿量(图15的D)的图表。
图16是荧光标记的A549细胞的小鼠尾静脉注入转移试验中的肿瘤细胞 注入8周后的肺的荧光显微镜照片。图16的A是对照组(给予28天生理盐水)的照片，图16的B是ANP给予组(hANP：0.5μg/kg/分钟、给予28天)的照片。
图17是表示GFP标记的A549细胞的小鼠尾静脉注入转移试验中的肿瘤细胞注入8周后的通过向肺的转移而形成的结节数的图表。纵轴表示肺中形成的结节数。左边的棒为对照组(给予28天生理盐水)，右边的棒为ANP给予组(hANP：0.5μg/kg/分钟、给予28天)。
图18是小鼠黑色素瘤B16-F10细胞的小鼠尾静脉注入转移试验中的肿瘤细胞注入2周后的肺的显微镜照片。黑色部分为通过转移的黑色素瘤形成的结节(转移病灶)。图18的A为对照组(生理盐水)的照片，图18的B为ANP给予组(hANP：0.5μg/kg/分钟)的照片。
图19是表示小鼠黑色素瘤B16-F10细胞的小鼠尾静脉注入转移试验中的肿瘤细胞注入2周后的通过向肺的转移而形成的结节数的图表。纵轴表示每一个体的肺中形成的结节数。各棒自左向右为对照组(给予生理盐水)、ANP给予组(hANP：0.5μg/kg/分钟、连续给予)、BNP给予组(小鼠BNP：0.5μg/kg/分钟、连续给予)、CNP给予组(hCNP-22：2.5μg/kg/分钟、连续给予)及西地那非给予组(柠檬酸西地那非：20mg/kg、腹腔内给予)。
图20是表示小鼠黑色素瘤B16-F10细胞的向GC-A敲除小鼠的尾静脉注入转移试验中的肿瘤细胞注入2周后的通过向肺的转移而形成的结节数的图表。纵轴表示每一个体的肺中形成的结节数。左边的棒表示野生型小鼠的结果，中央的棒表示全身性GC-A敲除小鼠的结果，右边的棒表示内皮特异性GC-A敲除小鼠的结果。
图21是表示小鼠黑色素瘤B16-F10细胞的向血管内皮特异性GC-A过量表达小鼠的尾静脉注入试验中的肿瘤细胞注入2周后的通过向肺的转移而形成的结节数的图表。纵轴表示每一个体的肺中形成的结节数。右边的棒表示血管内皮特异性GC-A过量表达小鼠的结果，左边的棒表示野生型的结果。
具体实施方式
<血管内皮细胞内cGMP增强剂>
在本发明中，血管内皮细胞内cGMP增强剂是指至少具有如下活性(称为细胞内cGMP增强活性)的药剂，所述活性为：作用于生物体内的***或血管的内皮细胞使其细胞内cGMP浓度上升而引起的信号传导亢进的活性。由于血管内皮细胞的cGMP也向血中释放，所以在生物体内，该增强活性不仅可以作为血管内皮细胞内的cGMP浓度的上升也可以作为血中的cGMP浓度的上升进行观察。由于细胞内的cGMP通过鸟苷酸环化酶(GC，作为GC，有GC-A、GC-B那样的跨膜受体型和可溶型(sGC))产生，所以通过引起GC的活化而上升。此外，由于细胞内的cGMP通过磷酸二酯酶5(phosphodiesterase5，(PDE5))进行分解，所以通过使例如西地那非那样的PDE5抑制剂发挥作用也可引起细胞内cGMP浓度的上升。进而，通过追加外来性的cGMP或其类似物，也可以介导细胞内cGMP浓度上升而使信号亢进。本发明中的细胞内cGMP增强活性只要是直接、或间接地介导细胞内cGMP浓度上升而使信号传导亢进的活性，则不论其机制如何均可，但优选为GC-A的活化、GC-B的活化及PDE5的阻碍，更优选为GC-A的活化作用。
作为跨膜受体型GC的利尿钠肽受体GC-A、利尿钠肽受体GC-B，在血管内皮细胞中确认到表达。因此，针对它们的激动剂即ANP或CNP等利尿钠肽可以作为本发明的血管内皮细胞内cGMP增强剂使用。特别是GC-A激动剂不仅具有对血管内皮的作用，而且对于在肿瘤细胞中表达GC-A的上皮系的恶性肿瘤也具有抑制肿瘤细胞的EMT、游走活性等的活性，对于上皮系恶性肿瘤，发挥良好的转移抑制作用。此外，各种利尿钠肽被中性肽链内切酶(Neutral endopeptidase)(NEP)切断，活性消失。因此，NEP抑制剂也可以作为本发明的细胞内cGMP增强剂使用。
此外已知，已知主要在消化器官中作用的针对GC-C的激动剂即鸟苷素、尿鸟苷素等也具有细胞内cGMP增强活性。
作为可溶型GC，已知有sGCα、sGCβ等，它们通过NO(一氧化氮，Nitric Oxide)而活化。因此，关于***等NO供给剂、在内皮细胞中表达的NO 产生酶即eNOS的底物(精氨酸等)或活化剂，也可以作为本发明的血管内皮细胞内cGMP增强剂使用。
肿瘤细胞的转移大多通过向末梢的血管或***的内皮组织粘接而达成。因此，本发明的血管内皮细胞内cGMP增强剂优选为在给生物体给予时能够使末梢血管的内皮细胞中的cGMP浓度上升、或使末梢血的cGMP浓度上升的药剂。
本发明中使用的血管内皮细胞内cGMP增强剂的对于血管内皮细胞的细胞内cGMP增强活性，可以基于本发明的见解采用通常的方法来确认。例如，在HUVEC那样的来自血管内皮的细胞或从动物采集的血管内皮组织的培养液中添加待检物质，培养一定期间后，使用市售的cGMP测定试剂盒(例如，Cyclic GMP Assay kit(Yamasa Corp.制))，测定细胞内或培养液中的cGMP浓度。通过将其结果与未添加待检物质时进行比较，可以检测cGMP浓度的上升。此外，通过对小鼠等实验动物给予待检物质，测定血液中的cGMP浓度，与该动物中的给予前的血中cGMP浓度或非给予组的血中cGMP浓度进行比较，也可以测定对血管内皮细胞的细胞内cGMP增强活性。
作为本发明中使用的血管内皮细胞内cGMP增强剂，只要是利尿钠肽受体GC-A激动剂、利尿钠肽受体GC-B激动剂、GC-C激动剂、NEP抑制剂、PDE5抑制剂、NO供给剂、eNOS活化剂、cGMP类似物等具有作用于血管内皮细胞而使其细胞内cGMP浓度上升的活性的物质，则没有特别限定，但优选为利尿钠肽受体GC-A激动剂、利尿钠肽受体GC-B激动剂、NEP抑制剂或PDE5抑制剂，进一步优选为利尿钠肽受体GC-A激动剂。
<利尿钠肽受体GC-A激动剂>
在本发明中，“利尿钠肽受体GC-A激动剂”是指具有与利尿钠肽受体GC-A(以下，有时也简记为“GC-A”。(Chinkers M,et al.,Nature338;78-83,1989))结合而将其鸟苷酸环化酶活化的作用(以下，“GC-A激动剂活性”)的物质，本说明书中有时也简记为“GC-A激动剂”。作为代表性的GC-A激动剂，可列举出例如心钠肽(Atrial Natriuretic Peptide：ANP)或脑钠肽(Brain Natriuretic Peptide：BNP)。本发明的GC-A激动剂只要是具有GC-A激动剂活性的物质则没有特别限定，可以使用ANP、BNP、它们的活性片段及它们的突变体、它们的衍生物以及它们的修饰体等。此外，即使是与ANP或BNP不具有结构上的共同性的肽或低分子化合物，只要是具有GC-A激动剂活性的物质，也包含在本发明的GC-A激动剂中。
作为本发明中的ANP，可列举出由28个氨基酸构成的来自人的ANP(SLRRSSCFGGRMDRIGAQSG LGCNSFRY：序列号1)、来自大鼠的ANP(SLRRSSCFGG RIDRIGAQSG LGCNSFRY：序列号2)等。关于来自人的ANP，Biochem.Biophys.Res.Commun.，118卷，131页，1984年中记载的α-hANP以一般名carperitide在日本取得制造销售认可，并被销售(商品名：HANP)。α-ANP一般也作为Human pro-ANP[99-126]被知晓。
作为本发明中的BNP，可例示出由32个氨基酸构成的来自人的BNP(SPKMVQGSGCFGRKMDRISS SSGLGCKVLR RH：序列号3)、来自猪的BNP(SPKTMRDSGC FGRRLDRIGSLSGLGCNVLR RY：序列号4)、来自大鼠的BNP(SQDSAFRIQE RLRNSKMAHS SSCFGQKIDRIGAVSRLGCD GLRLF：序列号5)等。人BNP以一般名nesiritide在美国等受到药事认可，并以商品名：Natrecor被销售。
此外，在各种ANP及BNP中，在通过序列中包含的2个Cys残基间的二硫键而形成的环结构(例如，在hANP中，在序列号1的7位Cys与23位Cys之间产生二硫键而形成环结构，在hBNP中，在序列号3的10位Cys与26位Cys之间产生二硫键而形成环结构)中包含的由17个氨基酸构成的序列及紧接着其C末端的氨基酸序列中，Cys-Phe-Gly-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Asp-Arg-Ile-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Leu-Gly-Cys-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Arg(其中，Xaa3为Met、Leu或Ile)(序列号6，以下称为“环结构序列A”)在各种肽间保守性良好，认为对于受体的结合和表现活性是重要的。(Silver,MA,,Curr.Opin.Nephrol.Hypertens.(2006),15,p14-21、A.Calderone,MinervaEndocrinol.(2004),29,p.113-127)。
<利尿钠肽受体GC-B激动剂>
在本发明中，“利尿钠肽受体GC-B激动剂”是指具有与利尿钠肽受体GC-B(有时也简记为“GC-B”(Suga S.,et al.,Endocrinology(1992),130(1),p.229-239))结合而将其鸟苷酸环化酶活化的作用(以下、“GC-B激动剂活性”)的物质，在本说明书中有时也简记为“GC-B激动剂”。作为代表性的GC-B激动剂，可列举出例如C型利尿钠肽(C-typeNatriuretic Peptide：CNP)。本发明的GC-B激动剂只要是具有GC-B激动剂活性的物质则没有特别限定，可以使用CNP、其活性片段、它们的突变体、它们的衍生物以及它们的修饰体等。此外，即使是与CNP不具有结构上的共同性的肽或低分子化合物，只要是具有GC-B激动剂活性的物质，也包含在本发明的激动剂中。
作为本发明中的CNP，可列举出由22个氨基酸构成的来自人的CNP-22(GLSKGCFGLKLDRIGSMSGL GC：序列号7、本说明书中也称为hCNP-22、在猪及大鼠等哺乳类中具有共同的氨基酸序列)、由53个氨基酸构成的来自人的CNP-53(DLRVDTKSRA AWARLLQEHP NARKYKGANKKGLSKGCFGL KLDRIGSMSG LGC：序列号8、本说明书中也称为hCNP-53)、来自鸡的CNP(GLSRSCFGVK LDRIGSMSGL GC：序列号9)、来自青蛙的CNP(GYSRGCFGVK LDRIGAFSGL GC：序列号10)等。
在各种CNP中，通过序列中包含的2个Cys残基间的二硫键而形成的环结构(例如，在hCNP-22中，在序列号7的6位Cys与22位Cys之间产生二硫键而形成环结构)被认为对于与GC-B受体的结合和表现活性是重要的(Furuya,M.Et al,Biochem.Biophys.Res.Commun.,(1992),183,No3,p.964-969,Silver,MA,,Curr.Opin.Nephrol.Hypertens.(2006),15,p14-21、A.Calderone,Minerva Endocrinol.(2004),29,p.113-127)。根据Furuya等的报道，报道了即使在仅由环结构构成的肽即hCNP6-22(由序列号7的氨基酸号6到22构成的肽)或环结构的N末端和C末端上分别附加ANP的N末端侧、C末端侧的序列，也显示与hCNP-22基本相同程度的GC-B激动剂活性，在hCNP-22的9位Leu和10位Lys上具有突变的肽活性减弱，但在其以外的部位(例如，17位Ser、18位Met)上 具有突变的肽、或将hANP的10到12位的氨基酸序列取代成相应的hCNP-22序列即Leu-Lys-Leu(序列号7的9位到11位)的肽显示与hCNP-22基本相同程度的GC-B激动剂活性等。根据这些见解，对于GC-B激动剂活性重要的环结构的氨基酸序列为Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Xaa1-Xaa2-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys(其中，Xaa1表示Ser或Ala，Xaa2表示Met、Phe或Glu，序列号11)，以下，将该序列称为“环结构序列B”。
在本发明中，具有生物活性的肽或蛋白质的“活性片段”是指由与该肽或蛋白质的生物活性相关的部位构成、且保持该肽或蛋白质所具有的生物活性的至少一部分的物质。作为本发明中的ANP或BNP的活性片段，可以使用具有上述的与GC-A结合而将其鸟苷酸环化酶活化的作用的肽。作为这样的活性片段，可列举出具有上述的环结构序列A(序列号6的氨基酸序列)的肽，优选由环结构序列A(序列号6的氨基酸序列)构成的肽。作为其具体例子，可列举出由序列号1或2的7到27位中记载的氨基酸序列、序列号3或4的10到30位中记载的氨基酸序列、或序列号5的23到43位中记载的氨基酸序列构成的肽等，但并不限定于此，具有环结构序列A、且具有GC-A激动剂活性的物质可以作为本发明的ANP或BNP的活性片段采用。
作为本发明中的CNP的活性片段，可以使用例如由序列号7到10中的任一氨基酸序列的至少一部分氨基酸序列构成、且具有GC-B激动剂活性的肽。作为这样的活性片段，可列举出具有上述的环结构序列B(序列号11的氨基酸序列)的肽，优选由环结构序列B(序列号11的氨基酸序列)构成的肽，作为其具体例子，可列举出：hCNP6-22、序列号7、9或10的氨基酸序列的1位到5位中的、包含1位的连续的氨基酸部分或全部缺失的肽，序列号8的氨基酸序列的1位到36位中的、包含1位的连续的氨基酸部分或全部缺失的肽等，但并不限定于此，具有环结构序列B、且具有GC-B激动剂活性的物质可以作为本发明的CNP的活性片段采用。
作为本发明的GC-A激动剂及GC-B激动剂，可以采用上述的活性片段本身，此外，即使是在活性片段的N末端、C末端或其两者上附加1到多个氨基 酸的肽(活性片段的衍生物)，只要保持所期望的激动剂活性，就可以采用。作为这样的肽，可列举出在hCNP6-22的N末端、C末端及其两者上附加来自ANP的C末端、及N末端的序列的肽(Furuya,M.Et al,Biochem.Biophys.Res.Commun.,(1992),183,No3,p.964-969)等。
在本发明中，具有生物活性的肽或蛋白质的“突变体”是指在该肽或蛋白质的氨基酸序列的一处～数处取代、缺失、***和/或附加(以下、称为“取代等”)一个～数个氨基酸而得到的、且保持该肽或蛋白质所具有的生物活性的至少一部分的物质。“数处”通常为3处左右，优选为2处左右。“数个”通常为10个左右，优选为5个左右，更优选为3个左右，进一步优选为2个左右。在多处被取代等的情况下，可以是取代、缺失、***及附加中的任一个，也可以组合二个以上。此外，被取代等的氨基酸可以是天然存在的氨基酸，也可以是其酰化体等修饰物，还可以是人工合成的氨基酸类似体。此外，被取代等的部位只要是保持原本的肽或蛋白质的活性的一部分，则可以选择任意部位，但优选在该原本的肽或蛋白质的活性部位或受体结合部位以外的部位进行取代等。作为ANP或BNP的突变体，只要保持GC-A激动剂活性，则可以采用在所期望的部位被取代等的肽，但优选列举出保持上述的环结构序列A、且在其以外的部位被取代等的肽。
例如，ANP的突变体只要具有GC-A激动剂活性，例如也可以在序列号1或2中记载的氨基酸序列中的所期望的1处～多处取代等1～数个氨基酸，但优选为在序列号1或2中记载的氨基酸序列中的除序列号6所表示的氨基酸以外的氨基酸中在1处～数处取代等一个～数个氨基酸而得到的肽，更优选为在序列号1或2中记载的氨基酸序列的1到6位及28位中的任1处～数处取代等一个～数个氨基酸而得到的肽。此外，BNP的突变体只要具有GC-A激动剂活性，则可以在序列号3、4或5中记载的氨基酸序列的所期望的1处～多处取代等一个～数个氨基酸，但优选为在序列号3、4或5中记载的氨基酸序列中的除序列号6所表示的氨基酸以外的氨基酸中在1处～数处取代等一个～数个氨基酸而得到的肽，更优选为在序列号3或4中记载的氨基酸序列的1到9 位、31位及32位中的任1处～数处取代等一个～数个氨基酸而得到的肽、或在序列号5中记载的氨基酸序列的1位到22位、44位及45位中的任一处～数处取代等一个～数个氨基酸而得到的肽等。
作为ANP的突变体的具体例子，可列举出例如hANP的12位的Met取代成Ile的大鼠α-rANP(Biochem.Biophys.Res.Commun.，121卷，585页，1984年)、N末端的Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser缺失的hANP等。关于这样的ANP或BNP突变体，可列举出例如MedicinalResearch Review，10卷，115页，1990年中记载的一系列的肽等。此外，作为氨基酸序列的1到多个氨基酸缺失并且氨基酸序列的1到多个氨基酸被取代成其它氨基酸的例子，可列举出例如由15个氨基酸残基构成的mini-ANP(Science，270卷，1657页，1995年)等。
此外，作为CNP的突变体，只要保持GC-B激动剂活性，则可以采用在所期望的部位被取代等的肽，但优选可列举出保持上述的环结构序列B、且在其以外的部位被取代等的肽。作为具体的CNP的突变体，只要具有GC-B激动剂活性，则可以在序列号7到10中记载的氨基酸序列中的所期望的1处～多处取代等1～数个氨基酸，但优选为在序列号7到10中任一项中记载的氨基酸序列中的除序列号11所表示的氨基酸以外的氨基酸中在1处～数处取代等一个～数个氨基酸而得到的肽，更优选为在序列号7、9或10中记载的氨基酸序列的1到5位中的任1处～数处取代等一个～数个氨基酸而得到的肽、或在序列号8中记载的氨基酸序列的1到36位中的任1处～数处取代等一个～数个氨基酸而得到的肽。
作为CNP的突变体的具体例子，报道了在hCNP-22的17位和18位上具有突变的肽具有与hCNP-22同等的GC-B激动剂活性，将这样的突变体的环结构部分的N末端和C末端取代成来自hANP的序列的突变体的衍生物也显示hCNP-22的活性的90%左右的GC-B激动剂活性，在hCNP-22的9位到11位中的任一处具有突变的肽显示hCNP-22的50%以上的GC-B激动剂活性，在hCNP-22的10位和11位的两者上具有突变的肽具有hCNP-22的40%以上的GC-B激动剂活性等(Furuya,M.Et al,Biochem.Biophys.Res.Commun.,(1992), 183,No3,p.964-969)。此外，在其它文献中，记载了hCNP-22的各种突变体保持GC-B激动剂活性，且其进一步具有对CNP的分解酶即中性肽链内切酶(NEP)的切断的耐性等(WO2009/067639号小册子)。此外，作为其它的hCNP-22的衍生物，已知有CD-NP。其是在hCNP-22的C末端上连接了来自蛇毒的利尿钠肽即DNP(dendroapsis natriuretic peptide)的C末端序列的肽，作为保持GC-A激动剂活性和GC-B激动剂活性这两者的肽被知晓(Deborah et al.,J.Biol.Chem.,(2008),Vol.289,No.50,pp.35003-35009)。
在本发明中，具有生物活性的肽或蛋白质的“衍生物”是指包含该肽或蛋白质的氨基酸序列、且进一步附加其它的肽或蛋白质的融合肽、且保持该生理活性肽或蛋白质所具有的生物活性的至少一部分的融合肽。将具有这样的生物活性(在本发明中，与GC-A或GC-B结合而将其鸟苷酸环化酶活化的作用)的至少一部分的融合肽也称为生理活性肽的衍生物。本发明的衍生物中，可以是在原本的生理活性肽或蛋白质的C末端或N末端的一者上融合附加肽，也可以是在C末端及N末端的两者上融合附加肽的衍生物。作为附加的肽，没有特别限定。但优选该肽自身不具有生理活性。此外，附加肽可以直接结合，也可以介由由1～数个氨基酸构成的接头序列而结合。作为接头序列，已知有各种序列，但优选使用包含较多Gly、Ser等的序列。作为这样的附加肽，可列举出免疫球蛋白(优选IgG)的Fc部位、血清白蛋白、生长素释放肽的C末端侧序列等(例如使ANP与免疫球蛋白的Fc部位结合而成的融合蛋白质(参照美国专利公开US2010-0310561等)、使GLP-1与血清白蛋白结合而成的融合蛋白质(参照国际专利公开WO2002/046227等))。作为用作本发明的GC-A激动剂的衍生物，可例示出ANP或BNP的衍生物、ANP或BNP的活性片段的衍生物、ANP或BNP的突变体的衍生物等，优选为hANP的衍生物及hBNP的衍生物。作为用作本发明的GC-B激动剂的衍生物，可例示出CNP的衍生物、CNP的活性片段的衍生物、CNP的突变体的衍生物等，优选为hCNP-22的衍生物、hCNP-53的衍生物或hCNP6-22的衍生物。
例如已知：作为GC-A激动剂采用的衍生物的例子的、使ANP与免疫球 蛋白的Fc部位结合而成的融合蛋白质(参照美国专利公开US2010-0310561等)在保持ANP的生物活性的状态下可改善血中滞留性。此外，关于ANP及BNP的各种衍生物，可列举出例如MedicinalResearch Review，10卷，115页，1990年中记载的一系列的肽。
此外，作为ANP或CNP的衍生物的具体例子，可列举出国际专利公开WO2009/142307号公报(对应美国专利公开US2010-305031号公报)中公开的各种ANP衍生物、CNP衍生物等。其中，报道了：在ANP、CNP、胃动素等生理活性肽上附加来自生长素释放肽的C末端的部分序列的衍生物，在保持原肽的生理活性的状态下可改善血中滞留性。该报道中，在hANP的N末端或C末端中的任一者及它们两者上附加来自生长素释放肽的C末端的部分肽的多种衍生物中的任一种，均保持了GC-A激动剂活性，其血中半衰期延长。此外，在hCNP6-22的N末端或C末端中的任一者及它们两者上附加来自生长素释放肽的C末端的部分肽的多种衍生物中的任一种，均保持了GC-B激动剂活性，其血中半衰期延长。
进而，作为CNP或其活性片段的衍生物的其它例子的、在hCNP-22的C末端附加了ANP的C末端部分的肽、或在hCNP6-22的N末端及C末端附加了ANP的N末端部分及C末端部分的肽(CNP活性片段的衍生物)，也保持了与CNP-22相同程度的GC-B激动剂活性(Furuya,M.Et al,Biochem.Biophys.Res.Commun.,(1992),183,No3,p.964-969)。进而，在其它文献中，记载了hCNP-22及hCNP-53的各种衍生物保持GC-B激动剂活性，其中的多个衍生物进一步具有NEP分解耐性等(WO2009/067639号小册子)。
这些现有的利尿钠肽的衍生物可以作为本发明的GC-A激动剂和/或GC-B激动剂采用。
在本发明中，具有生物活性的肽或蛋白质的“修饰体”是指该肽或蛋白质中包含的氨基酸的1处到数处通过与其它化学物质的化学反应而被修饰、且保持该肽或蛋白质所具有的生物活性的至少一部分的物质。接受修饰的部位只要保持原本的肽或蛋白质的活性，则可以选择任意部位。例如当附加达到 一定程度大小的化学物质如聚合物的修饰中，优选在肽或蛋白质的活性部位、或受体结合部位以外的部位被修饰。此外，在用于防止分解酶的切断而进行修饰的情况下，也可以采用在接受该切断的部位进行了修饰的物质。
作为化学修饰的方法，已知有各种方法，已知有例如附加聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)等在制药技术中利用的(药理上使用的)高分子聚合物的方法、在Lys残基等的侧链的氨基上附加作为接头的化合物并介由其与其它蛋白质等(例如血清白蛋白)结合的方法等，但并不限定于这些，可以采用各种方法。此外，关于各种生理活性肽的修饰体的制造方法，例如可以参考美国专利公开US2009-0175821号等适当制作。修饰体优选为通过附加制药上使用的高分子聚合物进行化学修饰而得到的物质。
例如，ANP的修饰体只要具有GC-A激动剂活性，则可以在序列号1或2的氨基酸序列中的所期望的1处～多处被修饰，但优选为包含序列表的序列号1或2的氨基酸序列、且在其中的相当于序列号6所表示的氨基酸以外的氨基酸的至少一个中接受化学修饰的肽。更优选为在序列号1或2的氨基酸序列中的除了序列号6所表示的氨基酸以外的氨基酸中在1处～数处被修饰的肽，进一步优选为在序列号1或2的氨基酸序列的1到6位及28位中的任1处～数处被修饰的肽。此外，BNP的突变体只要具有GC-A激动剂活性，则可以在序列号3、4或5的氨基酸序列的所期望的1处～多处被修饰，但优选为包含序列表的序列号3、4或5的氨基酸序列、且在其中的相当于序列号6所表示的氨基酸以外的氨基酸的至少一个中接受化学修饰的肽。更优选为在序列号3、4或5的氨基酸序列中的除了序列号6所表示的氨基酸以外的氨基酸中在1处～数处被修饰的肽，更优选为在序列号3或4的氨基酸序列的1到9位、31位及32位中的任1处～数处被修饰的肽、或在序列号5中记载的氨基酸序列的1位到22位、44位及45位中的任1处～数处被修饰的肽。进而，上述的ANP或BNP的活性片段、突变体及它们的衍生物的修饰体也包含在本发明中。这样的各种修饰体也只要保持GC-A激动剂活性，就可以用于本发明中。
例如已知：作为这样的可作为GC-A激动剂采用的修饰体的具体例子的 在hBNP、其突变体及其活性片段上结合了PEG、PVA等亲水性聚合物或以烷基、芳基等烃基为代表的疏水性基的各种修饰体，均保持GC-A激动剂活性(参照美国专利USP7,662,773号等)。
关于ANP或BNP与GC-A受体的结合，由于ANP及BNP的环结构和其C末端尾部部分很重要，所以特别是在其N末端部上结合了其它序列或物质的衍生物或修饰体，其附加肽或修饰物对环结构造成的影响少，在不会阻碍与GC-A受体的结合的情况下保持GC-A激动剂活性。这通过上述的许多文献得到证实。
此外，CNP的修饰体只要具有GC-B激动剂活性，则可以在序列号7到10中的任一氨基酸序列中的所期望的1处～多处被修饰，但优选为在序列号7到10中的任一氨基酸序列中的除了序列号11所表示的氨基酸以外的氨基酸中在1处～数处被修饰的肽，更优选为在序列号7、9或10的氨基酸序列的1到5位中的任1处～数处被修饰的肽。此外，在赋予对酶NEP的切断的耐性的修饰的情况下，由于已知在各种CNP肽中包含的环结构序列B中在序列号11的1位Cys与2位Phe之间被切断，所以也可以修饰其间的键。
进而，上述的CNP的活性片段、突变体及它们的衍生物的修饰体也包含在本发明中。这样的各种修饰体只要保持GC-B激动剂活性，则可以用于本发明中。
作为这样的CNP、其活性片段、它们的突变体及它们的衍生物的修饰体的具体例子，例如在WO2009/067639号小册子中，公开了在hCNP-22及hCNP-53上结合了PEG等各种亲水性聚合物的修饰体、在hCNP-22中将NEP的切断部位即Cys6-Phe7的肽键取代成(-CH2-NH-)或(-C(=O)-N(R)-：R表示甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基等低级烷基)等伪肽键的修饰体大多保持了GC-B激动剂活性，此外，其多数具有与hCNP-22相比得到改善的血中滞留性。此外，关于各种生理活性肽的修饰体的制造方法，例如，可以参考美国专利公开US2009-0175821号等适当制作。
关于CNP与GC-B受体的结合，由于CNP的环结构很重要，所以特别是 在其C末端和/或N末端部上结合了其它序列或物质的衍生物或修饰体，其附加肽或修饰物对环结构造成的影响少，在不会阻碍与GC-B受体的结合的情况下保持GC-B激动剂活性。这通过上述的许多文献得到证实。
上述的ANP、BNP及CNP、它们的活性片段、它们的突变体、它们的衍生物以及它们的修饰体可以从天然的细胞或组织中采集，也可以采用基因工程学的方法、细胞工程学的方法进行生产，也可以化学合成，还可以进一步将它们进行酶处理或化学处理而将氨基酸残基进行修饰或除去氨基酸序列的一部分。这样的制造适宜参考本说明书中记载的文献按照常规方法来进行。
此外，作为本发明的GC-A激动剂或GC-B激动剂，也可以使用在单一的物质中兼具作为GC-A激动剂和GC-B激动剂的性质这两者的物质(本发明中，也称为“两活性物质”)。作为这样的两活性物质，只要是保持GC-A激动剂活性和GC-B激动剂活性两者的物质则没有特别限定。作为这样的物质，可列举出例如在同一分子中包含环结构序列A(序列号6)和环结构序列B(序列号11)这两者的物质(例如，包含两者的序列的融合肽、或由两者的序列构成的肽介由接头化合物连接而成的修饰体等)、包含将环结构序列A和环结构序列B的特征融合从而兼具的氨基酸序列的物质等。作为这样的两活性物质的具体例子，已知有CD-NP。其是在hCNP-22的C末端上连接了来自蛇毒的利尿钠肽即DNP(dendroapsis natriureticpeptide)的C末端序列的肽，作为保持GC-A激动剂活性和GC-B激动剂活性这两者的肽被知晓(Deborah et al.,J.Biol.Chem.,(2008),Vol.289,No.50,pp.35003-35009)。此外，作为其它例子，将hANP(序列号1)的9位到11位取代成Leu-Lys-Lue的肽保持了GC-A激动剂活性和GC-B-激动剂活性这两者(Furuya,M.Et al,Biochem.Biophys.Res.Commun.,(1992),183,No3,p.964-969)。
此外，本发明的GC-A激动剂及GC-B激动剂可以采用作为抗利尿钠肽受体GC-A或GC-B的抗体、且具有相对于各自的受体的激动剂活性的物质。
在本发明中，“抗体”是与作为对象的抗原(GC-A或GC-B)特异性结合的 抗体或保持其结合活性的片段(结合片段、例如Fab片段等)。此外，作为本发明的抗体，可列举出抗血清、多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、人型抗体、人抗体、它们中的任一者的活性片段等。这些抗体可以使用成为免疫源的受体的全体或其胞外结构域作为免疫源，通过通常的方法来制造。例如，关于人源化抗体，可以参照例如WO91/009968号等的记载，关于人型抗体，可以参照例如WO92/03918号、WO94/25585号等的记载，进而采用各种周知技术。此外，关于所制造的抗体，可以通过利用后述的方法测定GC-A激动剂活性或GC-B激动剂活性，挑选具有所期望的活性的抗体。
作为本发明的GC-A激动剂使用的抗GC-A抗体是与利尿钠肽受体GC-A特异性结合、且具有GC-A激动剂活性的抗体或其结合片段，优选为作为单克隆抗体的抗GC-A单克隆抗体，更优选为人源化的抗GC-A抗体或作为人型抗体的抗GC-A抗体。
此外，作为本发明的GC-B激动剂使用的抗GC-B抗体是与利尿钠肽受体GC-B特异性结合、且具有GC-B激动剂活性的抗体或其结合片段，优选为作为单克隆抗体的抗GC-B抗体，更优选为作为人源化抗体的抗GC-B抗体或作为人型抗体的抗GC-B抗体。
关于某种物质是否具有GC-A激动剂活性，本领域技术人员可以通过以往已知的方法容易地实施测定。具体而言，可以在强制表达GC-A(Chinkers M,et al.,Nature338;78-83,1989)的培养细胞中添加物质，测定细胞内cGMP水平。保持GC-A激动剂活性的一部分通常是指，在使用同一试验体系，将GC-A激动剂物质和ANP或BNP(该激动剂物质为参考ANP或BNP的序列而制作的物质时，该作为参考的肽)平行地测定GC-A激动剂活性的情况下，cGMP上升活性的峰至少保持ANP或BNP所显示的cGMP上升活性峰的约10%以上，但优选是指保持约30%以上，进一步优选为保持约50%以上，进一步更优选为保持约70%以上。
关于某种物质是否具有GC-B激动剂活性，本领域技术人员可以通过以往已知的方法容易地实施测定。具体而言，可以在强制表达GC-B(Chinkers M,et al.,Nature338;78-83,1989)的培养细胞中添加物质，测定细胞内cGMP水平。保持GC-B激动剂活性的一部分通常是指，在使用同一试验体系，将GC-B激动剂物质和CNP平行地测定GC-B激动剂活性的情况下，cGMP上升活性的峰至少保持CNP所显示的cGMP上升活性峰的约10%，但优选是指保持约30%以上，进一步优选为保持约50%以上，进一步更优选为保持约70%以上。
此外，就本发明的GC-A激动剂活性或GC-B激动剂活性而言，即使在上述的方法中在峰上活性的上升没有变大，给生物体给予时的活性持续时间长的物质也可以用于本发明。为了进行这样的评价，对动物给予待检物质，经时地测定血中的cGMP浓度。对所得到的数据，可以制成X轴标绘时间、Y轴标绘cGMP浓度的图表，将其线之下的面积(AUC)与ANP或CNP等对照物质进行比较来评价。在该评价方法中保持活性通常是指与对照物质相比较通常保持约10%以上，但优选是指保持约30%以上，进一步优选为保持约50%以上，进一步更优选为保持约70%以上。
此外，对于这样的评价体系，添加低分子的化合物，若是cGMP产生能力提高那样的化合物，则即使是不具有与利尿钠肽共同的结构的物质(例如，低分子化合物)，也可以作为GC-A激动剂或GC-B激动剂用于本发明中。
作为本发明的GC-A激动剂优选的物质为ANP、BNP、具有其环结构序列A的活性片段、或在其环结构序列A以外被取代等的突变体、它们的衍生物或修饰体，更优选为hANP、hBNP、它们的衍生物或它们的修饰体，进一步更优选为hANP或hBNP。
作为本发明的GC-B激动剂优选的物质为CNP、具有其环结构序列B的活性片段、或在其环结构序列B以外被取代等的突变体、它们的衍生物或修饰体，更优选为hCNP-22、hCNP-53、作为其活性片段的hCNP6-22、它们的衍生物或它们的修饰体，进一步更优选为hCNP-22、hCNP-53或hCNP6-22。
<NEP抑制剂>
作为本发明中使用的NEP抑制剂，只要是具有抑制NEP的上述那样的切断利尿钠肽的天然型的活性的物质，则可以没有特别限定地使用，通过许多 文献被介绍(例如，Cuculi,E et al.(Expert Opinn Investig Drugs)(2011),20(4),pp.457-463)、MatthewI.et al.(Br.J.Clin.Pharmacol.(2004),57(1),pp.27-36)。本发明的目的中，作为NEP抑制剂，也可以是NEP选择性抑制剂。作为本发明的NEP抑制剂，优选为山帕曲拉（sampatrilat）、西诺番（sinorphan）、奥马曲拉（omapatrilat）、格莫曲拉（Gemopatrilat）、法西多曲（Fasidotril）、米克山普（Mixanpril）、Z-13752A、MDI-100240等。对于这些药剂，可以通过上述的参考文献(包含其引用文献)的记载及周知的技术进行制造及制剂化。
<PDE5抑制剂>
作为本发明中使用的PDE5抑制剂，只要是具有作用于血管内皮细胞而且阻碍PDE5酶分解cGMP的活性的物质，则没有特别限定，可以采用公知的各种药剂(例如，参照M.P.Govannoni,et al.(Curr.Med.Chem.(2010)17,pp.2564-2587)等)。优选为西地那非(sildenafil)、伐地那非(vardenafil)、他达拉非(tadalafil)、乌地那非(udenafil)、米罗那非(mirodenafil)、SLx-2101、罗地那非(lodenafil)、罗地那非碳酸酯(Lodenafilcarbonate)、依昔舒林(Exisulind)等、及它们的衍生物、以及它们的药理上可接受的盐，更优选为西地那非、伐地那非、他达拉非、乌地那非、米罗那非或它们的药理上可接受的盐，进一步优选为柠檬酸西地那非、盐酸伐地那非、他达拉非、乌地那非或米罗那非，最优选为柠檬酸西地那非。关于这些药剂，可以通过上述的参考文献(包含其引用文献)的记载及周知的技术进行制造及制剂化。
<GC-C激动剂>
作为本发明中使用的GC-C激动剂，只要是具有与GC-C结合而使细胞内cGMP浓度上升的活性的物质就没有特别限定，可以使用公知的各种物质(例如，Potter L.R.(Pharmacology&Therapeutics(2011),130(1),pp.71-82)等)。例如，作为本发明中使用的GC-C激动剂，可列举出ST(Heat Stable Enterotoxin)或其类似物质、鸟苷素(guanylin)、尿鸟苷素(uroguanylin)等的肽、其活性片段、它们的突变体、它们的衍生物或修饰体等，优选为利那洛肽(linaclotide)、鸟苷素或尿鸟苷素。关于这些药剂，可以通过上述的参考文献(包含其引用 文献)的记载及周知的技术进行制造及制剂化。
<NO供给剂>
本发明中使用的NO供给剂是指其自身或其分解物、代谢物具有NO结构、且释放NO的物质，本技术领域中已知有各种NO供给剂(例如，参照(J.Clin.Hypertens.(2006),No.12,vol.8,suppl.4,pp.40-52)等)，例如，可列举出NO气体、硝酸盐、Sydnomine等。作为Sydnomine，可列举出例如吗多明或作为其活性代谢物的林西多明等。对于它们，例如在R.P.Mason,et al(J.ClinHypertens.(2006),8(Sppl.S12),pp.40-52)等中有记载，可以通过这些文献(包含其引用文献)的记载及周知的技术进行制造、制剂化等。
<eNOS活化剂>
本发明的eNOS活化剂只要是NOS(Nitric Oxide Synthase)的底物或提高该酶的活性的药剂，则没有特别限定，可以使用各种物质，但优选为L-精氨酸。NOS是由L-精氨酸产生NO的酶，在血管内皮中，恒定表达内皮型NOS(eNOS)。因此，通过提高eNOS的底物即L-精氨酸的血中浓度，增进NO产生，在血管内皮细胞中引起细胞内cGMP浓度的上升。
<cGMP或其类似物>
作为本发明中使用的cGMP类似物，是对cGMP的化学结构(guanosine3’，5’-cyclicmonophosphate)实施化学修饰而得到的物质，是具有活化cGMP依赖性蛋白激酶的作用的物质，可以采用公知的文献(例如，Corbin J.D.,et al.(J.Biol.Chem.(1986),261(3),pp.1208-1214)等)中记载的各种物质，但优选为8-溴cGMP(8-bromoguanosine3’,5’-cyclic monophosphate)。
在本发明中，“药物”是指含有规定的有效成分且为了体现规定的药理作用而利用的药物品，对于其形态、组成、给予方法等没有限定。作为本发明的药物的实施方式，其有效成分可以作为单一的制品被制品化，也包含通过将多个制品组合而使用从而达成本发明的方式。
在本发明中，“有效成分”是指为药物品中包含的组成之一、且该药物品具有目标药理作用的至少一部分作用的组成。相对于药物品的含量/含有比例 没有特别限定，可以依赖于该成分所具有药理作用的程度，以各种比例配合。
本发明所述的药物中可作为有效成分使用的物质也可以是上述的GC-A激动剂等具有血管内皮细胞内cGMP增强活性的物质的药学上可接受的盐，优选为hANP、hBNP、hCNP-22、hCNP-53、hCNP6-22或西地那非的药学上可接受的盐。即，在本发明中，也可以使用上述的物质的无机酸如盐酸、硫酸、磷酸、或有机酸如甲酸、醋酸、丁酸、琥珀酸、柠檬酸等的酸加成盐（acid addition salts）作为有效成分。或者，在本发明中，也可以使用上述的物质的钠、钾、锂、钙等的金属盐、由有机碱形成的盐的形态作为有效成分。此外，本发明所述的药物组合物也可以作为其有效成分所述的物质的游离形、或其药学上可接受的盐。作为西地那非的盐，最优选为柠檬酸盐。
可作为本发明所述的药物等的有效成分使用的物质或其药学上可接受的盐优选与公知的药学上可接受的载体、赋型剂、稀释剂等混合而制成药物组合物，通过药物中一般使用的给予方法、即经口给予方法或经粘膜给予、静脉内给予、肌肉内给予或皮下给予等非经口给予方法对个体进行给予。
有效成分为肽性物质时，也可以制成在消化道内不易受到分解的制剂、例如将作为活性成分的肽容纳在脂质体中的微胶囊剂进行经口给予。此外，也可以是从直肠、鼻内、舌下等消化道以外的粘膜吸收的给予方法。此时可以以坐剂、点鼻喷雾剂、吸入药、舌下片之类的形态对个体进行给予。此外，对于通过采用以葡聚糖等多糖类、多胺、PEG等为代表的生物降解性高分子作为载体的各种控释制剂、持续化制剂等来改善肽的血中滞留性的制剂，也可以在本发明中使用。
可作为本发明所述的药物的有效成分使用的物质的给予量根据疾病的种类、个体(患者)的年龄、体重、症状的程度及给予途径等也不同，但通常，对于一种有效成分作为每1天的合计的给予量的上限，例如为约100mg/kg以下，优选为约50mg/kg以下，进一步优选为1mg/kg以下。此外，对于一种有效成分，作为每一天的合计的给予量的下限，例如为约0.1μg/kg以上，优选为0.5μg/kg以上，更优选为1μg/kg以上。
本发明所述的药剂(药物组合物)的给予频率也可根据所使用的有效成分、给予途径、及处理的特定的疾病而改变。例如经口给予利尿钠肽时，优选每一天以4次以下的给予次数进行处置，此外，在非经口给予、例如静脉内给予的情况下优选利用输液泵、导管等持续地进行给予。
在给予ANP或BNP等肽或它们的盐的情况下，例如只要将冷冻干燥制剂溶解到注射用水中使用微量输液泵(在没有微量输液泵的情况下，小儿用微量输液器)等进行连续给予(也称为持续给予)即可。作为连续给予时的给予期间，为数小时～数天(例如3～14天(优选3～7天)左右)。作为此时的给予量的有效成分的上限，对各有效成分可以适当采用例如约50μg/kg/分钟(每一天、约72mg/kg)以下的浓度，也可以为约5μg/kg/分钟(每一天、约7.2mg/kg)以下，优选为约0.5μg/kg/分钟(每一天、720μg/kg)以下，更优选为约0.2μg/kg/分钟以下，进一步优选为约0.1μg/kg/分钟以下，进一步更优选为约0.05μg/kg/分钟以下。此外，作为下限，为约0.0001μg/kg/分钟(每一天约0.144μg/kg)以上，优选为约0.001μg/kg/分钟(每一天1.44μg/kg)以上。作为具体的给予方法，可以采用例如3天以上(优选3到4天)、约0.025μg/kg/分钟，此时的每一天的给予量以有效成分计达到约36μg/kg。
利尿钠肽由于如上所述具有松弛·扩张血管而使血压降低的作用，所以在预防和/或治疗恶性肿瘤的转移时，优选以不会使血压降低至必要以上的速度进行给予，优选在给予时及刚给予后监测血压。此外，此时的hANP等的给予期间通常为1天以上。优选在该期间连续给予，作为此时的给予期间通常为1天以上，优选为数天，更优选为1天以上且5天以下。当长期地控制恶性肿瘤时，可以适当重复上述的给予方法、或根据患者的状态适当变更给予量或给予期间。
此外，作为本发明的血管内皮细胞内cGMP增强剂的给予量，优选选择对接受给予的对象的末梢血管的内皮细胞使细胞内cGMP浓度上升、或使末梢血液中的cGMP浓度上升的程度的用量、用法。这样的用量·用法可以通过采集患者的末梢血并监测cGMP浓度适当选择。
具体而言，在将ANP给予到静脉中的情况下，例如优选将ANP的1000μg(例如，HANP注射用1000、第一三共(株)制)溶解到注射用水10mL中，以“体重×0.06mL/小时”的速度(0.1μg/kg/分钟或其以下的给予速度)进行给予。给予速度不限于上述的速度，优选根据病情，以0.2μg/kg/分钟以下的速度(优选约0.01μg/kg/分钟以上)边监测血压或心律边进行适当调整。特别是确认到即使将hANP以0.025μg/kg/分钟的用量连续给予3或4天，也不会使血压、心博等体液状态发生很大变动，优选采用该用量用法。
在将BNP给予到静脉中的情况下，例如优选将hBNP以约0.01μg/kg/分钟进行连续给予，也可以采用进一步在其给予开始前组合约2μg/kg的hBNP的快速浓注给予的给予方法。此时也优选以不会使血压降低至必要以上的速度进行给予，推荐在给予时及刚给予后监测血压。在ANP或BNP以上述的给予速度不会给血压或心律等造成较大影响的情况下，也可以进一步提高给予速度。另外，关于其它的ANP或BNP的活性片段、突变体、衍生物或突变体等，只要考虑其活性和持续性来决定给予速度即可。
在并非天然型的肽(hANP、hBNP、hCNP-22等)，而使用ANP、BNP、CNP等的活性片段、突变体、衍生物、修饰体等时，可以考虑其活性的强度、在体内的持续性、分子量等该物质的特征，适当决定给予量、给予方法、给予速度、给予频率等。此外，对于hANP、hBNP、CNP(hCNP-22、hCNP-53)等有效成分，通过采用控释制剂技术或持续化制剂技术、不易受到肽的分解的各种突变体、衍生物或修饰体等，可以不限定于连续给予或快速浓注给予，选择对患者的负担更少的给予方法、给予频率等。
作为给予的时期，只要是在患者中发现癌后，则可以在任何时期给予，但从通常的抑制转移的观点出发，优选持续地、或空出一定期间的间隔定期地给予。此外，进行癌的切除手术时，通过从手术中到手术后数天进行给予，可以显著地抑制癌的复发。
本发明的目的是抑制恶性肿瘤的转移，其对象患者通常为恶性肿瘤的患者。对象患者可以是没有其它基础疾病的癌患者，此外，也可以是例如心力 衰竭风险高的恶性肿瘤患者。作为恶性肿瘤的种类，没有特别限定，可以对所有种类的恶性肿瘤的患者进行给予。作为这样的恶性肿瘤，可列举出例如癌那样的上皮系的恶性肿瘤、肉瘤那样的非上皮系的恶性肿瘤、黑色素瘤等各种种类的恶性肿瘤。本发明的血管内皮细胞内cGMP增强剂由于作用于血管内皮而抑制所有肿瘤细胞转移共同的进程、即肿瘤细胞向***或血管内皮的粘接、浸润，所以认为不论肿瘤的种类，均发挥抑制所有恶性肿瘤的转移的效果(间接效果)。因此，即使不表达GC-A的肿瘤细胞发生恶变并向血管或***侵入，通过该间接效果，也无法向血管内皮细胞粘接、向组织浸润，转移被阻碍。这样的作用通过以下事实得到证明：不仅对于在肿瘤细胞中表达GC-A的来自肺癌的细胞株A549或H460，对于不表达GC-A且具有强的转移能力的黑色素瘤细胞，在小鼠尾静脉注入转移模型中，以GC-A激动剂为首，GC-B激动剂或PDE5抑制剂的给予也可显著地抑制肿瘤细胞向各脏器的转移。进而，在内皮组织特异性敲除GC-A的小鼠中，在同样的黑色素瘤尾静脉注入转移试验中，与野生型小鼠相比确认到显著的转移的增大，进而，在内皮组织特异性过量表达GC-A的小鼠中，与野生型小鼠相比确认到显著的转移的抑制。在GC-A敲除小鼠中，由于在通常肿瘤不转移的心脏中也见到黑色素瘤的转移，所以认为在增强细胞内cGMP的信号中，特别是GC-A介导的信号阻碍肿瘤细胞向内皮组织的粘接、浸润。
此外，可以是原发性肿瘤，也可以是转移性肿瘤。在原发性肿瘤的情况下，优选与癌切除手术配合进行给予。在转移性肿瘤的情况下，若能够进行切除手术，则同样地优选与手术配合从术中起给予数天。在切除困难、或怀疑向脏器转移的情况下，优选通过定期地给予来控制转移。
进而，对于像上皮系的恶性肿瘤那样在肿瘤细胞中表达利尿钠肽受体GC-A的恶性肿瘤患者，通过GC-A激动剂的给予，通过以EMT的抑制为首的直接效果和基于阻碍向血管内皮的粘接、浸润的转移抑制这样的间接效果的两者，能够多方面地抑制转移，所以可以期待更良好的转移抑制效果。作为这样的恶性肿瘤，可列举出例如肺癌、胰腺癌、甲状腺癌、乳癌、子宫癌、 卵巢癌、***癌、骨肿瘤、脑肿瘤等。在筛选通过这样的本发明的药物的给予连肿瘤细胞自身的转移能力的获得也能够抑制的给予对象时，也可以在给予前采集肿瘤组织，确认细胞中的GC-A的表达，对确认到受体的表达的患者进行给予。
此外，本发明的药物等也包含将作为有效成分的2种以上的血管内皮细胞内cGMP增强剂组合使用那样的预防或抑制恶性肿瘤的转移的方法、为此的给予方法和/或这样的方法中使用的药物。将多个有效成分或药剂“组合给予的药物”是预想将该有效成分或药剂组合给予的药物。
在本发明中，将多个有效成分或药剂“组合给予”是指在某一定期间，被给予对象将组合的全部有效成分或药剂摄入其体内。可以作为全部有效成分包含于单一制剂中的制剂(所谓的配合剂)给予，此外，也可以将各有效成分分别制剂化，分别将它们的全部进行给予(所谓的并用给予)。在分别制剂化的情况下，其给予的时期没有特别限定，可以同时给予，也可以空出时间在不同的时间、或不同的日子给予。多个有效成分分别在不同的时间或日子给予时，有效成分的给予的顺序没有特别限定。通常，由于各制剂按照各自的给予方法给予，所以它们的给予有时为同一次数，有时为不同的次数。此外，在各有效成分分别被制剂化时，各制剂的给予方法(给予途径)可以相同，也可以以不同的给予方法(给予途径)进行给予。此外，全部有效成分没有必要同时存在于体内，只要在某一定期间(例如一个月、优选1周、进一步优选数天、进一步更优选1天)内，全部有效成分被摄入体内即可，当给予一个有效成分时其它的有效成分已从体内消失的情况也是可以的。
在本发明的药物等中，若例示出将作为有效成分的2种以上的血管内皮细胞内cGMP增强剂组合给予时的组合，当含有至少一种GC-A激动剂作为有效成分时，可以进一步组合选自GC-B激动剂、NEP抑制剂、PDE5抑制剂、NO供给剂、eNOS活化剂、GC-C激动剂及cGMP类似物中的至少一种，优选组合选自GC-B激动剂、NEP抑制剂、PDE5抑制剂、及NO供给剂中的至少一种，更优选组合GC-B激动剂或PDE5抑制剂。此外，当采用至少一种GC-B 激动剂作为有效成分时，可以进一步组合选自NEP抑制剂、PDE5抑制剂、NO供给剂、eNOS活化剂、GC-C激动剂及cGMP类似物中的至少一种，优选组合选自NEP抑制剂、PDE5抑制剂、及NO供给剂中的至少一种，更优选组合NEP抑制剂或PDE5抑制剂。此外，当采用至少一种PDE5抑制剂作为有效成分时，可以进一步组合选自NEP抑制剂、NO供给剂、eNOS活化剂、GC-C激动剂及cGMP类似物中的至少一种，优选组合选自NEP抑制剂、及NO供给剂中的至少一种。
此外，本发明的药物通过与其它的通常使用的抗肿瘤剂的至少一种并用，可以有效地进行恶性肿瘤的治疗，本发明也提供这样的与其它的抗肿瘤剂的并用疗法。本发明的药物由于可以控制肿瘤细胞的转移、浸润，所以通过在利用其它的抗肿瘤剂的治疗中一并适当给予，可以期待能够提高利用该抗肿瘤剂的治疗的效率及改善治疗预后。作为并用的抗肿瘤剂，可列举出例如烷化剂、代谢拮抗剂、抗肿瘤抗生素、抗肿瘤性植物成分、BRM(生物学响应性控制物质)、激素、维生素、抗肿瘤性抗体、分子靶标药、其它的抗肿瘤剂等。
更具体而言，作为烷化剂，可列举出例如氮芥、氮芥N-氧化物或苯丁酸氮芥等烷化剂；卡波醌或塞替派等氮丙啶系烷化剂；二溴甘露醇或二溴卫矛醇等环氧化物系烷化剂；卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、盐酸尼莫司汀、链脲霉素、氯脲菌素或雷莫司汀等亚硝基脲系烷化剂；白消安、甲苯磺酸英丙舒凡或达卡巴嗪等。
作为各种代谢拮抗剂，可列举出例如6-疏嘌呤、6-硫鸟嘌呤或硫肌苷等嘌呤代谢拮抗剂；氟尿嘧啶、替加氟、替加氟·尿嘧啶、卡莫氟、去氧氟尿苷、溴尿苷、阿糖胞苷或依诺他宾等嘧啶代谢拮抗剂；甲氨喋呤或三甲曲沙等叶酸代谢拮抗剂等。
作为抗肿瘤性抗生素，可列举出例如丝裂霉素C、博来霉素、培洛霉素、柔红霉素、阿柔比星、多柔比星、吡柔比星、THP-阿霉素、4’-表阿霉素或表柔比星等蒽环系抗生素抗肿瘤剂；色霉素A3或放线菌素D等。
作为抗肿瘤性植物成分，可列举出例如长春地辛、长春新碱或长春花碱等长春花生物碱类；紫杉醇、多西他赛等紫杉烷类；或依托泊苷或替尼泊苷等表鬼臼毒素类。
作为BRM，可列举出例如肿瘤坏死因子或吲哚美辛等。
作为激素，可列举出例如氢化可的松、***、甲泼尼龙、***龙、普拉雄酮、倍他米松、曲安西龙、羟甲烯龙、诺龙、美替诺龙、磷雌酚、炔雌醇、氯地孕酮或甲羟孕酮等。
作为维生素，可列举出例如维生素C或维生素A等。
作为抗肿瘤性抗体、分子靶标药，可列举出曲妥珠单抗、利妥昔单抗、西妥昔单抗、尼妥珠单抗、地诺单抗、贝伐单抗、英夫利昔单抗、甲磺酸伊马替尼、吉非替尼、厄洛替尼、舒尼替尼、拉帕替尼、索拉非尼等。
作为其它的抗肿瘤剂，可列举出例如顺铂、卡铂、奥沙利铂、他莫昔芬、喜树碱、异环磷酰胺、环磷酰胺、马法兰、L-天冬酰胺酶、醋葡醛内酯、西佐喃、溶链菌、丙卡巴肼、哌泊溴烷、新抑癌素、羟基脲、乌苯美司或云芝胞内多糖等。
本发明中，在除了血管内皮细胞内cGMP增强剂以外还组合其它抗肿瘤剂给予的情况下，1种或2种以上的血管内皮细胞内cGMP增强剂及其它抗肿瘤剂可以含有于单一制剂中，也可以分别作为不同的制剂的有效成分含有。给予一种或2种以上的血管内皮细胞内cGMP增强剂及其它抗肿瘤剂的顺序等也没有特别限定。
此外，本发明的药物可以作为试剂盒提供。作为含有至少一种血管内皮细胞内cGMP增强剂的用于抑制或预防恶性肿瘤的转移的试剂盒，可列举出将ANP、BNP或CNP等利尿钠肽或它们的盐作为冷冻干燥制剂封入的小药瓶与用于溶解其的注射用水组合而制成的试剂盒等，此外，可以将用于溶解·给予的注射用注射器与它们组合，也可以进一步组合微量输液泵或小儿用微量输液器。此外，在作为有效成分组合2种以上的血管内皮细胞内cGMP增强剂使用的情况下，也可以将含有各有效成分的小药瓶、片剂等组合而试剂盒 化。
此外，本发明的血管内皮细胞内cGMP增强剂为利尿钠肽等肽性的物质时，也可以通过导入编码其的基因而在患者的体内表达该肽，基于此进行基因治疗。
作为ANP的基因，只要使用包含编码序列号1或2的氨基酸序列的核苷酸序列的基因(例如，Science，226卷，1206页，1984年中记载的基因)即可。此外，作为BNP的基因，只要使用包含编码序列号3、4或5的氨基酸序列的核苷酸序列的基因(例如，Biochem.Biophys.Res.Commun.，165卷，650页，1989年中记载的基因)即可。此外，作为CNP的基因，只要使用包含编码序列号7到10中的任一氨基酸序列的核苷酸序列的基因(例如，Biochem.Biophys.Res.Commun.，165卷，650页，1989年中记载的基因)即可。在使用上述的基因进行治疗的情况下，只要使用反转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒或人工载体作为载体，通过肌肉注射或局部注射导入基因即可。此外，也可以不使用上述那样的载体，以质粒的形式导入基因。关于具体的基因治疗的方法，只要使用实验医学，12卷，303页，1994年中记载的方法或其中引用的文献的方法等即可。
本发明也进一步包含一种用于抑制或预防恶性肿瘤的转移的药物，其特征在于，含有至少一种血管内皮细胞内cGMP增强剂作为有效成分，对接受与其不同种类的血管内皮细胞内cGMP增强剂的给予的对象进行给予；及一种恶性肿瘤的转移的抑制或预防方法，其特征在于，将有效量的血管内皮细胞内cGMP增强剂对接受利用与其不同种类的血管内皮细胞内cGMP增强剂的进行治疗的对象进行给予。
作为有效成分的血管内皮细胞内cGMP增强剂、以及它们的给予方法等与上述的药物组合物中的情况相同。作为这样的用法中的血管内皮细胞内cGMP增强剂的组合，优选为GC-A激动剂或GC-B激动剂与PDE5抑制剂的组合，更优选为hANP、hCNP-22、hCNP6-22或它们的衍生物与西地那非或其药理上可接受的盐的组合，进一步优选为hANP与柠檬酸西地那非的组合。
实施例
以下，使用实施例对本发明具体地进行说明。实施例所示的内容为本发明的实施方式的一个例子，本发明并不限定于此。
以下的实施例中使用的实验材料的获得方法及调制方法如下所述。
hANP、及hCNP从Asubio Pharma Co.,Ltd.获得，hBNP从肽研究所(大阪)获得，将分别获得的冷冻干燥品用含有IBMX的生理盐水溶解，对其适当调节浓度使得IBMX的终浓度达到5×10-4M，用于以下的实验。
来自肺腺癌的细胞株A549细胞从ATCC(Manassas，VA)获得。细胞培养使用含有10%FCS的DMEM(Invitrogen公司、Carlsbad、VA)培养液，在37℃、5%CO2的条件下进行。关于培养液量，6孔板中设定为1.5ml，24孔板中设定为400μl，96孔板中设定为150μl。以下的实施例中，只要没有特别指定则采用该培养液及培养条件。
TGF-β1(Transforming growth factorβ1，转化生长因子β1)使用从R&D systems公司(Minneapolis，MN)购入的产品，用生理盐水适当稀释后用于以下的实验。
<实施例1>对癌细胞的由利尿钠肽刺激引起的细胞内cGMP水平的变动
将A549细胞以4×104cell/孔添加到24孔板中进行培养，第二天更换成无FCS的DMEM培养液。在培养液中添加hANP、hBNP及hCNP溶液(最终浓度：从1×10-11M到1×10-6M的10倍稀释系列，对照中为等量的生理盐水)，其10分钟后添加400μL的冷却70%乙醇(含有0.1N盐酸)，立即进行超声波处理。将处理后的溶液进行冷冻干燥，使用Cyclic GMP Assay kit(Yamasa Corp.制)测定cGMP水平。将cGMP水平的测定结果示于图1中。
作为GC-A激动剂的hANP和hBNP浓度依赖性地增进A549细胞的细胞内cGMP。另一方面，作为CG-B受体激动剂的不与GC-A受体结合的hCNP中，未观察到这样的增进。由此表示，在A549细胞中，特异性地响应来自GC-A受体的刺激而引起信号传导。
<实施例2>利尿钠肽对A549细胞的增殖抑制效果
将A549细胞以4×104cell/孔添加到24孔板中进行培养，第二天更换成无FCS的DMEM培养液。在培养液中添加hANP、hBNP及hCNP溶液(最终浓度：从1×10-9M到1×10-6M的10倍稀释系列，对照中为等量的生理盐水)，在24、48小时后使用活细胞数测定试剂SF(Nacalai Tesque制)进行细胞增殖分析。将结果示于图2中。
关于A549细胞的直到48小时后的细胞数，即使是最高1×10-6M的浓度，hANP、hBNP及hCNP与对照相比也基本没有变化。根据Vesely等的报道，ANP具有抑制来自胰腺癌、乳癌等的各种癌细胞的增殖的效果，但在本发明的实施例的试验体系中，在1×10-6M(1μM)下，全部利尿钠肽对癌细胞的增殖均没有影响。
<实施例3>hANP对TGF-β1所致的EMT诱导的效果
将A549细胞以1×105cell/孔添加到6孔板中进行培养，第二天更换成无FBS的DMEM的培养液，将培养24小时的培养液用于以下的实验。
制作ANP组(添加ANP溶液(终浓度：1μM))及对照组(添加等量的生理盐水)，分别在添加的2小时后按照终浓度达到0.125、0.25、0.5、1.0及2.0ng/ml的方式添加TGF-β1，24小时后在显微镜下观察细胞的形态变化，拍摄照片(图3)。
之后，使用总RNA分离试剂(Invitrogen公司)回收总RNA，使用逆转录酶合成cDNA，通过定量RT-PCR法测定E-钙粘附蛋白、N-钙粘附蛋白、VEGF-A、PDGF-B、TNF-α及IL-6的mRNA水平。将mRNA水平测定的结果示于图4中。此外，已知在EMT中，E-钙粘附蛋白的表达减少，N-钙粘附蛋白的表达亢进，认为N-钙粘附蛋白/E-钙粘附蛋白的表达比率作为表示EMT的程度的指标是有用的。将该比率示于图5中。
如图3所示的那样，1μM的hANP(图3的C)显著地抑制由TGF-β1刺激所诱导的EMT引起的细胞的形态变化(如图3的B那样向与间叶系成分同样的纺锤形变化)。此外，如图4所示的那样，显著地抑制由于TGFβ1刺激所诱导的EMT而表达亢进的生长因子(VEGF-A，PDGF-B)或炎症性细胞因子(TNF-α、IL-6) 的基因表达。此外，显著地抑制由TGF-β1刺激引起的N-钙粘附蛋白的表达亢进，阻碍由该刺激引起的E-钙粘附蛋白的表达减少。其结果是，如图5所示的那样，在1μM的hANP存在下，EMT的重要的指标即N-钙粘附蛋白/E-钙粘附蛋白的表达比率显著降低。此外，在使用来自肺大细胞癌的H460细胞的相同试验中也得到同样的结果。
这样，hANP在1μM的浓度下，显示显著地抑制成为癌的转移的契机的重要现象即EMT的效果。如实施例2中所示的那样，由于hANP对该癌细胞在1μM下对增殖基本不造成影响，所以认为hANP通过与对癌的增殖的效果完全不同的机制抑制癌细胞的EMT。
<实施例4>hANP对A549细胞的游走能力(Boyden Chamber Assay)的作用
将A549细胞以1×105cell/孔添加到6孔板中进行培养，第二天更换成无FBS的DMEM培养液，将培养24小时的培养液分成对照组、TGF-β1组及TGF-β1+hANP组的3组，用于以下的实验。
在培养液中，对于TGFβ+hANP组按照hANP的最终浓度达到1μM的方式添加hANP溶液，对于对照组及TGF-β1组添加等量的生理盐水。从添加开始2小时后，如下所述进行博伊登室试验。
在6孔板中，对于对照组添加1.5mL无FBS的DMEM培养液，对于TGF-β组添加1.5mL含有TGF-β1(最终浓度：1ng/ml)的相同培养液，对于TGF-β1+hANP组添加1.5mL含有hANP(最终浓度：1μM)及TGF-β1(最终浓度：1ng/ml)的相同培养液。在其液面上放置细胞培养池(8.0μmpore size，BD公司制)，在其上添加将各组的A549细胞悬浮到无FBS的DMEM(对于TGF-β1+ANP组，添加最终浓度1μM的hANP)中而得到的细胞悬浮液1.5mL，进行培养。20小时后，将各组的细胞培养池用10%***固定，擦拭上表面，仅下表面进行苏木精-伊红(H&E)染色。用显微镜观察附着在insert的下表面的A549细胞的数目。将细胞的照片示于图6的A中，将细胞数的图表示于图6的B中。A549细胞的游走能力在TGF-β1组中显著地增加，但该现象通过1μM的hANP被显著地抑制。此外，在使用了来自大细胞癌的H460细胞的 相同试验中也得到同样的结果。
<实施例5>hANP对癌细胞的运动能力(Wound healing assay)的作用
将A549细胞以4×105cell/孔添加到6孔板中进行培养，第二天更换成无FBS的DMEM培养液，培养24小时后，分成对照组、TGF-β1组及TGF-β1+hANP组的3组，用于以下的实验。
在培养液中，对于TGFβ1+hANP组按照hANP的最终浓度达到1μM的方式添加hANP溶液，对于对照组及TGF-β1组添加等量的生理盐水。2小时后用200μl用移液吸头弄伤孔的中央部。在刚弄伤后在显微镜下对各孔拍摄照片(图7的A)。其中，在TGFβ+hANP组及TGF-β1组中，按照最终浓度达到1ng/ml的方式添加TGFβ1，培养24小时后，再次对各孔的相同部位拍摄照片，按照下式计算刚弄伤后与培养24小时后的伤幅之差的平均的比例(移动率：负伤面积填充百分率)。
移动率(%)=(最初的伤幅-24小时培养后的伤幅)/(最初的伤幅)×100
将各孔的24小时后的伤口部分的照片示于图7中，将各组的移动率示于图8中。
A549细胞的运动能力通过TGF-β1刺激被增进，但在1μM的hANP存在下，该运动能力的增进被显著地抑制。此外，在使用了来自肺大细胞癌的H460细胞的相同试验中也得到同样的结果。
<实施例6>hANP对癌细胞的浸润能力的作用
将A549细胞以1×105cell/孔添加到6孔板中进行培养，第二天更换成无FBS的DMEM的培养液，将培养24小时的培养液分成对照组、TGF-β1组及TGF-β1+hANP组的3组，用于以下的实验。
在培养液中，对于TGFβ1+hANP组按照最终浓度达到1μM的方式添加hANP溶液，对于对照组及TGFβ1组添加等量的生理盐水。从添加开始2小时后，如下所述进行博伊登室试验。事前如下准备基质胶包被的细胞培养池：细胞培养池(8.0μm pore size，BD公司)放置在6孔板上，在其上添加0.5μg/μl基质胶液(通过PBS进行调整)300μl，风干12小时而制成。
在6孔板的各孔中，对于对照组添加1.5mL无FBS的DMEM培养液，对于TGF-β组添加1.5mL含有TGF-β1(最终浓度：1ng/ml)的相同培养液，对于TGFβ1+hANP组添加1.5mL含有hANP(最终浓度：1μM)及TGF-β1(最终浓度：1ng/ml)的相同培养液。在其液面上放置如上所述包被后的细胞培养池，在其上添加将各组的A549细胞悬浮到无FBS的DMEM(对于TGFβ1+hANP组，添加最终浓度为1μM的hANP)中而得到的细胞悬浮液1.5mL，进行培养。
培养40小时后，将各组的细胞培养池用10%***固定，擦拭上表面，仅下表面进行苏木精-伊红(H&E)染色。用显微镜观察附着在insert的下表面上的A549细胞的数目。将该细胞的照片示于图9的A中，将细胞数的图表示于图9的B中。
基质胶层介导的细胞浸润在TGF-β1组中显著地增加，但该细胞浸润被1μM的hANP显著地抑制。此外，在使用了来自肺大细胞癌的H460细胞的相同试验中也得到同样的结果。
<实施例7>hANP对癌细胞凋亡的诱导活性
将A549细胞以1×104cell/孔添加到96孔板中进行培养。第二天更换成无FBS的DMEM培养液，培养24小时后进行以下的实验。
在培养液中，添加按照hANP的最终浓度分别达到1、5、10μM的方式调制稀释系列的hANP溶液(对照中为等量的生理盐水)，进一步在2、4、6小时后，以该浓度追加添加(共添加4次)等量的hANP溶液(对照中为生理盐水)。48小时后用自动细胞数计测器Countess(注册商标)(Invitrogen公司)测定使用台盼蓝染色的细胞的viability(活细胞/全部细胞)。此外，使用来自肺大细胞癌的H460细胞、来自肺鳞癌细胞的H520细胞、来自支气管肺泡上皮癌的H358细胞进行同样的试验。将结果示于图10中。
各种癌细胞的活细胞数呈hANP的浓度依赖性地减少，表示hANP通过持续地存在于培养液中，对癌细胞诱导凋亡。
<实施例8>癌细胞的凋亡诱导中的hANP和顺铂的并用效果
顺铂使用注射用顺铂“MARUKO”(商品名、Nichi-Iko Pharmaceutical Co.,Ltd.)。
将A549细胞以1×104cell/孔添加到96孔板中进行培养。第二天更换成无FBS的DMEM培养液，培养24小时后，分成对照组、顺铂单独组、1μM hANP组、顺铂+1μM hANP组、10μMhANP组、顺铂+10μM hANP组进行以下的实验。
在培养液中，对于hANP添加组添加按照最终浓度分别达到1μM、10μM方式调制的hANP溶液，对于对照组、顺铂单独组添加等量的生理盐水。此外，对于顺铂添加组添加按照最终浓度分别达到1、5、10、20、30μM的方式调制了稀释系列的顺铂溶液(对照组、hANP单独组中为等量的生理盐水)。进一步在2、4、6小时后，以该浓度追加添加(共添加4次hANP)等量的hANP溶液(对照及顺铂单独组中为生理盐水)。48小时后用自动细胞数计测器Countess(注册商标)(Invitrogen公司)测定使用台盼蓝染色的细胞的viability(活细胞/全部细胞)。此外，使用H460细胞、H520细胞、H358细胞进行同样的试验。将hANP浓度1μM的结果示于图11中，将10μM的结果示于图12中。
显示hANP的对癌细胞的凋亡诱导活性通过与顺铂并用而得到增强。
<实施例9>癌细胞在血管内皮细胞系上的植入试验
正常人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)从Takara Bio Inc.购入。培养基、继代按照制品的添附的文件的指示进行。核染色使用TOPRO3(从Invitrogen公司购入)进行，VE-钙粘附蛋白的免疫染色使用抗VE-钙粘附蛋白抗体(从BD Biosciences公司购入)进行。
将HUVEC细胞培养至铺满状态，更换成无血清培养基后，在VEGF及hANP的存在下及非存在下，进行使用抗VE-钙粘附蛋白抗体的免疫染色及核染色，观察VE-钙粘附蛋白的表达。将各条件下的染色的情况示于图13的照片。
在VEGF单独存在下，VE-钙粘附蛋白的表达降低，观察到形成细胞的间隙的现象，但在VEGF+hANP中该现象被抑制，维持与对照组相同程度的 紧密的细胞粘接。此外，在该HUVEC细胞层上，添加A549细胞，结果在VEGF单独存在下，观察到A549细胞进入HUVEC细胞层下的植入现象，与此相对，在VEGF+hANP(1μM)中该植入现象被抑制。
由此认为，hANP具有抑制癌细胞在血管内皮组织上植入、向转移目标组织浸润的作用。
因而，若综合这些内容，则认为hANP具有通过抑制癌细胞的EMT而使浸润、转移能力降低以及特异性诱导癌细胞凋亡这样的对癌细胞的直接效果、和发挥抑制向作为植入侧的血管内皮细胞植入的作用这样的间接效果。
<实施例10>肺癌患者的癌切除术后给予hANP的癌复发抑制效果
报道了在血中BNP水平为30pg/ml以上的肺癌患者的癌切除术中，术后并发症风险高。在本试验中，在肺癌患者的癌切除术前测定血中BNP水平，以30pg/ml为基准，将其以上的患者的一部分或主治医生判断为术后并发症风险高的患者设为hANP组(全52例、癌的进展程度明细(1A期：26例(50%)、1B期：16例(23%)、2期：7例(13%)、3期：3例(6%))。此外，不管血中BNP水平如何地设定对照组(287症例、癌的进展程度明细(1A期：155例(54%)、1B期：65例(23%)、2期：35例(12%)、3期：32例(11%))。hANP组从肺癌手术中到术后3天，按照0.025μg/kg/分钟的用量调制hANP(商品名：HANP注射用1000、非快速浓注、第一三共(株))，进行持续给予。在手术前及术后4天，测定各患者的血压(收缩期及舒张期)、心律及尿量(将结果示于图15中)。
手术后约2年间，追踪调查患者的癌的早期复发状况。患者每1年施行胸部CT检查、头部MRI检查、骨闪烁显像、或正电子断层造影(PET)检查，进行关于复发的有无的全身检查。将各组中的癌无复发生存率的结果示于图14中。
手术后2年间的癌的无复发生存率在对照组中随着癌的进展程度而降低，1A期中为91.6%，1B期中为73.4%，2期中为48%，3期中为29%。另一方面，在hANP组中，无论癌的进展程度均未见到癌的早期复发。此外，如图15所示的那样，在hANP的0.025μg/kg/分钟这样的低用量疗法中对于患者 的血压、心博、尿量等体液状态未见到大的变动。这暗示了，若是该给予量，则即使在给循环***没有异常的患者给予的情况下，由hANP的主药效引起的生物体变化也为不成问题的程度。
由此表示，hANP的低用量疗法不仅对于具有心力衰竭风险的癌患者，而且对于没有心力衰竭风险的患者，作为安全、且副作用少的抗转移疗法也是非常有用的。
<实施例11>各种GC-A激动剂对A549细胞的EMT的作用
在与实施例3同样的试验中，作为待检物质，代替hANP而使用hBNP(最终浓度：1μM)、CD-NP(最终浓度：10μM(参照Deborah et al.,J.Biol.Chem.,(2008),Vol.289,No.50,pp.35003-35009))、LKL-ANP(最终浓度：1μM(hANP的10～12位的氨基酸取代成LKL的突变体。参照(Furuya,M.Et al,Biochem.Biophys.Res.Commun.,(1992),183,No3,p.964-969)))进行试验，其结果是，在E-cad/Ncad的值中，TGF-β诱导的EMT的抑制率在BNP中为44.8%、CD-NP中为37.7%、LKL-ANP中为52.9%。这样，各种GC-A激动剂显示抑制肿瘤细胞的EMT的作用。
<实施例12>小鼠尾静脉注入转移试验中的hANP对A549细胞的转移的效果
小鼠使用6周龄的雄的Balb/c nu/nu小鼠(从日本SLC株式会社购入)。
渗透泵使用ALZET(Cupertino，CA)的MODEL2004(28天给予用)。
将在小鼠的背部皮下埋入有装有0.9%生理盐水的渗透泵的小鼠设为对照组。同样地，将在小鼠的皮下埋入有按照以0.5μg/kg/分钟的给予量给予hANP的方式调制的渗透泵的组设为ANP给予组。在渗透泵埋入后第二天进行肿瘤细胞悬浮液的注入。
作为肿瘤细胞，将GFP(Green Fluorescent Protein，绿色荧光蛋白)标记的A549细胞株(从和光纯药工业株式会社购入)用含有10%FCS的RPMI1640(Life TechnologiesCorporation)在37℃、5%CO2的条件下进行培养，在即将缔合（subconfluent）的状态下进行EDTA-胰蛋白酶处理后，离心，按照达到1×107 cells/mL的方式悬浮于无血清DMEM中。以100μL/个体的体积，将1×106个A549细胞悬浮液注入小鼠的尾静脉。利用渗透泵的生理盐水或ANP的给予设为4周，通过荧光显微镜(Olympus OV100)观察从肿瘤细胞注入开始8周后的肺转移的情况(图16)。此外，将在荧光显微镜下观察的每1只小鼠的通过肺转移形成的结节数示于图17的图表中。
如图16及图17所示的那样，通过hANP的最初的4周给予，癌细胞的转移被显著地抑制。
此外，在作为肿瘤细胞使用H460细胞的试验中，也得到同样的结果。
<实施例13>小鼠尾静脉注入转移试验中的各种cGMP增强剂对黑色素瘤的转移的作用
小鼠使用6周龄的雄的C56BL/6N小鼠(从日本SLC株式会社购入)。小鼠黑色素瘤B16-F10从ATCC购入，用含有10%FCS的DMEM(Life Technologies Corporation)在37℃、5%CO2的条件下进行培养，在即将缔合的状态下进行EDTA-胰蛋白酶处理后，离心，按照达到5×106cells/mL的方式悬浮于无血清DMEM中。以100μL/小鼠的体积，将5×105个黑色素瘤细胞悬浮液从小鼠的尾静脉注入。渗透泵使用ALZET(Cupertino，CA)的MODEL2002(14天给予用)。
将在小鼠的背部皮下埋入有装有0.9%生理盐水的渗透泵的小鼠设为对照组。同样地，对于ANP组在小鼠的皮下埋入按照以0.5μg/kg/分钟的给予量给予hANP的方式调制的渗透泵，对于BNP组在小鼠的皮下埋入按照以0.5μg/kg/分钟的给予量给予小鼠BNP的方式调制的渗透泵，对于CNP组在小鼠的皮下埋入按照以2.5μg/kg/分钟的给予量给予hCNP-22的方式调制的渗透泵。此外对于西地那非组以20mg/kg的用量，一天一次腹腔内给予柠檬酸西地那非。在给予开始的第二天，按照上述的要领进行肿瘤细胞悬浮液的注入，给予药剂2周。观察从肿瘤细胞注入开始2周后的肿瘤细胞的肺转移的情况(图18)，将此时观察的每一只小鼠的由肺转移形成的结节数示于图19的图表中。
如图18及图19所示的那样，在ANP组、BNP组、CNP组、及西地那非组的全部中，与对照组相比较，黑色素瘤的肺转移被显著地抑制。
<实施例14>对GC-A敲除小鼠的黑色素瘤尾静脉注入转移试验
作为小鼠，使用12周龄的雄的GC-A敲除(KO)小鼠(全身、内皮组织特异性敲除、Tokudome T.,Kishimoto I.,Kangawa K.,et al(Arterioscler Thromb Vasc Biol.2009;29:1516-21)、Kishimoto I,Tokudome T,Nakao K,Kangawa K.(FEBS J.2011;278:1830-41))，与实施例13同样地进行(其中黑色素瘤B16-F10细胞悬浮液按照达到2.5×106cells/mL的方式调制，以100μL/小鼠的体积(2.5×105celsl/小鼠)注入)小鼠黑色素瘤细胞的肺转移试验，将2周后的野生型、全身GC-AKO、及内皮特异性GC-A KO的各小鼠的由转移到肺中的黑色素瘤细胞形成的结节数示于图20的图表中。
如图20所示的那样，在全身GC-A KO小鼠、内皮组织特异性GC-A KO小鼠这两者中，与野生型小鼠相比较黑色素瘤的肺转移均显著地增加。
<实施例15>对内皮特异性GC-A过量表达小鼠的黑色素瘤尾静脉注入转移试验
作为小鼠，使用12周龄的雄的内皮组织特异性GC-A过量表达小鼠(参考Zhun ML,et al(Cardiovasc Res.2009;84:292-9)等来制作)，与实施例13同样地进行(其中黑色素瘤B16-F10细胞悬浮液按照达到1.0×107cells/mL的方式调制，以100μL/小鼠的体积(1.0×106celsl/小鼠)注入)尾静脉注入转移试验，将2周后的野生型及GC-A过量表达小鼠的肺中形成的结节数示于图21的图表中。
如图21所示的那样，在内皮组织特异性GC-A过量表达小鼠中，与KO小鼠的结果相反，与野生型小鼠相比较黑色素瘤的肺转移被显著地抑制。
由实施例14、15的结果强烈暗示了，在生物体中特别是内皮组织中的GC-A介导的信号传导具有抑制肿瘤转移的作用。

Claims (15)

1.至少一种利尿钠肽受体GC-A激动剂作为有效成分在制备用于抑制或预防恶性肿瘤的转移的药物中的用途，所述利尿钠肽受体GC-A激动剂为脑钠肽或其药理上可接受的盐、且对于利尿钠肽受体GC-A具有激动剂活性，所述脑钠肽由序列表的序列号3、4或5中记载的氨基酸序列构成。
2.至少一种利尿钠肽受体GC-A激动剂作为有效成分在制备用于抑制或预防恶性肿瘤的转移的药物中的用途，所述利尿钠肽受体GC-A激动剂为包含脑钠肽的活性片段的物质或其药理上可接受的盐、且对于利尿钠肽受体GC-A具有激动剂活性，所述活性片段具有序列表的序列号6的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，利尿钠肽受体GC-A激动剂以不会使患者的血压、心律或尿量中的至少一项目发生较大变动的程度的用量给予。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，将利尿钠肽受体GC-A激动剂以0.1μg/kg/分钟以下连续给予1到数天。
5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，给予对象患者为接受肿瘤的切除手术的患者，从该切除手术前到术后1～数天连续地给予。
6.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，利尿钠肽受体GC-A激动剂以0.5μg/kg/分钟以下连续给予3到7天。
7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，将由序列号3到5中的任意氨基酸序列构成的肽以0.05μg/kg/分钟以下的用量从肿瘤切除手术前到手术后一定期间连续地给予。
8.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，作为有效成分，进一步组合一种以上的血管内皮细胞内cGMP增强剂，其中，作为血管内皮细胞内cGMP增强剂，至少含有选自以下的(ii)到(viii)中的任一种、且具有作用于血管内皮细胞而使细胞内cGMP浓度上升的活性的物质：(ii)利尿钠肽受体GC-B激动剂、(iii)GC-C激动剂、(iv)NEP抑制剂、(v)PDE5抑制剂、(vi)NO供给剂、(vii)eNOS活化剂、及(viii)cGMP类似物。
9.至少一种利尿钠肽受体GC-A激动剂作为有效成分在制备用于在接受给予的患者中产生肿瘤细胞向血管内皮组织的植入和/或浸润的阻碍的药物中的用途，所述利尿钠肽受体GC-A激动剂为脑钠肽或其药理上可接受的盐、且对于利尿钠肽受体GC-A具有激动剂活性，所述脑钠肽由序列表的序列号3、4或5中记载的氨基酸序列构成。
10.至少一种利尿钠肽受体GC-A激动剂作为细胞内cGMP增强剂在制备用于在接受给予的患者中产生选自下述中的至少一种药理活性的药物中的用途，抑制肿瘤细胞的上皮间质转换(EMT)、阻碍肿瘤细胞获得游走能力、阻碍肿瘤细胞获得运动能力、抑制肿瘤细胞的浸润、特异性诱导肿瘤细胞凋亡、及阻碍肿瘤细胞向血管内皮组织的植入，所述利尿钠肽受体GC-A激动剂为脑钠肽或其药理上可接受的盐、且对于利尿钠肽受体GC-A具有激动剂活性，所述脑钠肽由序列表的序列号3、4或5中记载的氨基酸序列构成。
11.利尿钠肽受体GC-A激动剂在制备用于预防或抑制肿瘤的转移的药物中的用途，所述利尿钠肽受体GC-A激动剂为脑钠肽或其药理上可接受的盐、且对于利尿钠肽受体GC-A具有激动剂活性，所述脑钠肽由序列表的序列号3、4或5中记载的氨基酸序列构成。
12.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，向接受恶性肿瘤的切除手术的患者给予利尿钠肽受体GC-A激动剂。
13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，从切除手术前一天到术后数天间向患者给予利尿钠肽受体GC-A激动剂。
14.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，在切除手术前一天向患者给予利尿钠肽受体GC-A激动剂。
15.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，通过肌肉内给予或皮下给予向患者给予利尿钠肽受体GC-A激动剂。
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