CN103396954A

CN103396954A - 一种防控水稻纹枯病的生物防治菌株、生物有机肥及其制备方法

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Publication number: CN103396954A
Application number: CN2013103075611A
Authority: CN
Inventors: 陈立华; 邵孝侯; 毛欣宇; 朱福新; 谈俊益; 崔智伟; 王莎莎
Original assignee: Hohai University HHU
Current assignee: Nanjing Sanmei Agricultural Development Co ltd
Priority date: 2013-07-22
Filing date: 2013-07-22
Publication date: 2013-11-20
Anticipated expiration: 2033-07-22
Also published as: CN103396954B

Abstract

本发明为一种防控水稻纹枯病的生物防治菌株、生物有机肥及其制备方法，涉及水稻的生物防治菌株及其生物有机肥，属于农业集约化生产技术。本发明分离到了对水稻纹枯病有显著生物防治作用的棘孢木霉菌株12(Trichodermaasperellum12），利用该生物防治菌株与稻壳、秸秆、畜禽粪便堆肥制成生物有机肥料，肥料中含有0.5×10⁸cfug^-1以上该菌株休眠孢子、含水量为小于15%、有机质含量大于35%。试验表明，这种生物有机肥料施入水稻田后，有机肥中大部分物质都能够浮在水面，吸附在有机肥上的生防菌株的休眠孢子在水面迅速繁殖，在水-气交界地带形成气生菌丝，在水稻茎秆和水面接触处形成菌丝带，有效的防止水面水稻纹枯病立枯丝核菌接触水稻茎秆，对水稻纹枯病的防治率达70%以上。

Description

一种防控水稻纹枯病的生物防治菌株、生物有机肥及其制备方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一株水稻生物防治菌株分离鉴定，该生物防治菌株制成的生物有机肥及其在水稻纹枯病防治上的应用。

二、背景技术

水稻是世界上种植面积最大的作物，其种植面积达1.5亿公顷，占世界耕地面积的11%，我国水稻播种面积占全部农作物播种面积的20%以上，是我国主要的粮食作物，也是第一大农作物，40%以上的人口主食是稻米。

水稻纹枯病是水稻主要病害之一，目前发病面积以及危害损失居水稻病害首位，一般可以使水稻减产10%—30%，严重时候可以减少50%。除了常见导致水稻纹枯病发病越发严重之外，如水稻种植密度增加，生长周期缩短，水稻矮杆高分蘖品种的推广，氮肥使用量增加，近年由于农村大量劳动力外出，水稻秸秆由以前的运出农田造肥或者燃烧作为能源变成直接还田，大量的菌核长期滞留农田，一旦外界环境适合菌核萌发，非常容易导致水稻纹枯病爆发。水稻纹枯病病原菌无性阶段为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)，在分类上属于半知菌亚门，丝孢纲，无孢目，丝核菌属。有性阶段为瓜亡革菌(Thanatephorus cucumris)，属于担子菌亚门，担子菌纲，角担菌目，角担子菌科，亡革菌属。根据菌丝融合现象立枯丝核菌分为14个融合群，该类菌寄主范围非常广泛，为害稻、麦、玉米、棉、麻、大豆、花生、甜菜、烟草和蔬菜等很多种植物的茎基部和根，导致苗枯、茎枯和根腐等立枯病，或者在茎基部、叶鞘上产生颜色深浅不同的褐色云纹斑，导致禾谷类植物纹枯病。该病导致水稻不能抽穗，或抽穗的秕谷较多，粒重下降。

病菌主要以菌核在土壤中越冬，也能以菌丝体在病残体上或在田间杂草等其它寄主上越冬，耐受不良环境能力很强。第二年水稻栽种时，由于稻田灌溉使菌核单独或者混在秸秆残骸等杂物上飘浮于水面，秧苗栽种后，菌核粘附于秧苗近水面的叶鞘上，条件适宜萌发出菌丝侵入叶鞘组织，入侵水稻的后，病菌形成气生菌丝，可以直接侵染邻近植株。早期落入水中菌核也可引发稻株再侵染，早稻菌核是晚稻纹枯病的主要侵染源水，不同发育阶段的菌核均能够萌发致病且形成新的菌核，菌核具有多次萌发和地下侵染的能力，菌核的这些特性为防治带来非常复杂的问题。

当前农业生产中主要以井冈霉素防治该病，井冈霉素对环境的危害较小，但是因为井冈霉素长期使用，已经产生井冈霉素抗性菌株。因此，寻找环境友好、人畜安全、高效防治方法十分必要。

利用生物防治微生物结合农业生产措施控制病害是替代化学农药防控水稻纹枯病的有效途径，随着社会发展，农业发展越发需求无公害、高效、低劳动力需求，因此，应用高效生物防治菌株结合高效的应用方式防治水稻纹枯病非常必要。

迄今为止，没有发现涉及本发明主题的文献报道。

三、发明内容

技术问题

本发明的目的在于筛选一株高效防治水稻纹枯病病原菌立枯丝核菌的微生物菌株，该菌株通过空间竞争、产生抑菌物质和寄生作用抑制病原菌感染水稻，通过该菌株特定的生产工艺和后期的发酵工艺生产生物肥料，该肥料有利于生物防治菌株在水稻生长环境中的存活和有利于维持生防菌株抑制病原菌能力。

技术方案

一种防控水稻纹枯病的生物防治菌株，其特征为该菌株为棘孢木霉12（Trichoderma asperellum 12），2013年5月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉市武昌珞珈山，菌株保藏号为CCTCC NO：M 2013213，简称为棘孢木霉CCTCC NO：M 2013213。

所述的棘孢木霉CCTCC NO：M 2013213的主要生物学特性为：在PDA培养基上28℃培养3天，菌丝可以布满整个培养皿，菌丝生长初期白色，毡状，由中心至边缘逐渐形成环状，靠近边缘环状菌丝颜色较浅，在靠近中心同心圆上产生稠密的暗绿色分生孢子，生长菌丝的培养皿散发出很重的椰汁芳香气味，背面深黄色；分生孢子梗对生生长，呈树状分枝，暗绿色，瓶梗短，基部变细，中间膨大；分生孢子呈球形，表面粗糙，大小为3.5～5.0 μm×2.0～5.0 μm；ITS序列进化分析显示该菌株为棘孢木霉T. asperellum。

一种生物有机肥料，其特征在于含有0.5×10⁸cfu g^-1以上所述的棘孢木霉CCTCC NO：M 2013213菌株休眠孢子、含水量低于15%、有机质含量大于35%。

所述的生物有机肥料的制备方法，其特征在于按如下步骤实现：

1）将所述的棘孢木霉CCTCC NO：M 2013213接种到PDA培养液，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：初始pH自然，培养温度25~30℃，溶氧通气量范围为30～100％，170rpm，发酵后期菌丝球全部打碎成菌丝片段，发酵液菌株的菌落形成单位≥1×10⁸cfu ml^-1；

2）稻壳、秸秆和鸡粪按照50：30：20比例堆肥，15~30天后，稻壳软化、秸秆腐烂，基质100℃灭菌36小时，高温干燥，干燥后基质含水量低于5%，形成固体发酵基质；

3）将步骤（1）中所述的发酵液按200 L/吨的接种量接种到步骤（2）所述的固体发酵基质进行固体发酵，发酵温度为20~35℃，发酵过程中翻堆2~3次，发酵10~15天后结束，形成固体发酵物。

4）将步骤（3）所述固体发酵物按照体积比20%~30%接种到腐熟的猪粪堆肥或牛粪堆肥，并后熟5~8天，后熟过程中翻堆3~5次，最后在温度不超过35℃的条件下将生物有机肥的含水量蒸发至15%以下，包装出厂即为防治水稻纹枯病的生物有机肥料。

其中步骤（1）所用PDA培养液配制方法为，以配制1L培养基为例：

用200 g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30 min，经过滤后滤液中加20 g普通蔗糖，定容至1000 ml，pH值自然，121℃灭菌20 min。

其中步骤（4）所用腐熟后的猪粪或牛粪堆肥为发芽指数98%以上，有机质质量比含量≥35%，有机氮质量比含量为1.2%~2%，含水量质量比20%~30%。

所述生物有机肥料可用于防治水稻纹枯病。

有益效果

本发明的一种能够生物防治水稻纹枯病的生物有机肥及其生产方法，利用生防菌株发酵农业固体废弃物生产生防菌株营养体和无性孢子，再和有机肥料混合将绝大部分的营养体转换成休眠的无性孢子的生物有机肥，其产品与目前市场上的产品相比具有如下优点：

1）该肥料产品中的稻壳和水稻秸秆粉末等可以长期地浮在稻田水面，吸附在稻壳和稻草粉末上的生防菌株的菌丝或者无性孢子可以形成大量的气生菌丝，有效抑制水中立枯丝核菌菌核感染水稻茎秆，其抑制水稻纹枯病病原菌效果非常显著，同时生物肥料能够提供生防菌体营养，供菌株持续快速生长。

2）该产品可以有效避免单纯的应用生防菌株导致菌体沉入稻田水面底层，从而抑制生防菌株的生长，也可以避免生防菌株落在植株表面被紫外线、高温、农药等杀死或者减弱活性。试验结果表明该产品的水稻纹枯病的生物防治效果达70%以上。

3）由于是生物菌株制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，有利于农业的无公害生产和农业可持续发展。

四、附图说明

图1 生物防治菌株电镜照片，生物防治菌株无性孢子和分生孢子梗. a 无性孢子，b 分生孢子梗；

图2 生物防治菌株抑制水稻纹枯病病原菌的效果，即生物防治菌株对水稻纹枯病病原菌的抑制作用，其中 A 生物防治菌株的竞争性抑制作用，B 生物防治菌株的寄生抑制作用；

图3 不同处理水稻纹枯病的发病率，不同字母表示处理之间有显著差异（p>0.05）。

五、具体实施方式

实施例1

（一）菌株的分离和鉴定

采集通气性较差土壤、滩涂粉砂质土壤、潜水淤泥等样品，低温保存，采用马丁氏培养基分离真菌，采用对峙培养分离对水稻纹枯病病原菌立枯丝核菌具有抑制作用的菌株。生物防治菌株能够在72小时完全抑制立枯丝核菌的生长（图2）。

上述马丁氏培养基配制方法为（以配制1L培养基为例）：蛋白胨5g，葡萄糖10g，KH₂PO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，琼脂20g，水1000ml，pH自然，1%孟加拉红水溶液3.3ml，115℃灭菌30分钟，临用时每100ml培养基中加1%链霉素液0.3ml。

生物防治菌株属于棘孢木霉（T. asperellum），主要生物学特性为：在PDA培养基上28℃培养3天，菌丝可以布满整个培养皿，菌丝生长初期白色，毡状，由中心至边缘逐渐形成环状，靠近边缘环状菌丝颜色较浅，在靠近中心同心圆上产生稠密的暗绿色分生孢子，生长菌丝的培养皿散发出很重的椰汁芳香气味，背面深黄色；分生孢子梗对生生长，呈树状分枝，暗绿色，瓶梗短，基部变细，中间膨大；分生孢子呈球形，表面粗糙，大小为3.5～5.0 μm×2.0～5.0 μm（图1）；ITS序列进化分析显示该菌株为棘孢木霉（T. asperellum）。该生防菌株于2013年5月16日保藏与中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉市武昌珞珈山，保藏编号CCTCC NO：M 2013213，简称棘孢木霉CCTCC NO：M 2013213。

（二）菌剂生产

1）将棘孢木霉CCTCC NO：M 2013213接种到PDA培养液中，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：初始pH自然，培养温度25℃，溶氧：通气量范围为30～100％，170rpm，发酵中后期形成菌丝片段，发酵液菌株的菌落形成单位≥1×10⁸cfu ml^-1；

所用PDA培养液配制方法为（以配制1L培养基为例）：用200 g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30 min，用纱布过滤后，滤液加20 g普通蔗糖，定容至1000 ml，pH值调至6.5~7.0，121℃灭菌20 min。

2）稻壳、秸秆和猪粪按照50：30：20比例堆肥，15~25天后，堆肥基质开始降温，基质100℃灭菌36小时，高温干燥，干燥后基质含水量低于5%；

3）将发酵液菌剂按200 L/吨的接种量接种到烘干、稳定、无菌物料进行固体发酵，发酵温度为20~35℃，发酵过程中翻堆2~3次，发酵10~15天后结束，形成固体发酵物。

（三）生物有机肥生产

将含有棘孢木霉CCTCC NO：M 2013213的发酵基质按照体积比20~30%接种到腐熟的猪粪堆肥或牛粪堆肥，并后熟5~8天，后熟过程中翻堆3~5次，最后在温度不超过35℃的条件下将生物有机肥的含水量蒸发至15%以下，包装出厂即为防治水稻纹枯病的生物有机肥料。

所述生物有机肥料可用于防治水稻纹枯病。

（四）生物防治试验

1. 水稻品种 “武运粳24”。处理如下：

T₁:对照；T₂：接种病原菌；T₃：接种病原菌+生物有机肥

每处理采用5个重复，每重复5kg土/盆。

T₁处理不接种病原菌和不施用生物有机肥

T₂每盆接种立枯丝核菌菌核200个/kg土壤，水稻移栽后，菌核均匀的洒在水面上；

T₃每盆施用立枯丝核菌菌核200个/kg土壤，水稻移栽后，菌核均匀的洒在水面上，在水稻移栽之前施用生物有机肥10g/kg土壤。

水稻移栽后5天开始记录发病情况，10天后，施入水稻田的生物有机肥在水-气交界地带形成气生菌丝，在水稻茎秆和水面接触处形成菌丝带，20天后，T₂处理叶片出现很明显的病斑，T₁和T₃处理叶片没有出现病斑。

（五）田间小区试验

2012年在江苏省南京市江宁区大田施用生物有机肥进行生物防治水稻纹枯病试验。

小区面积50平米，设置试验处理：1、对照，不施用有机肥或者生物有机肥，不喷施井冈霉素；2、施用普通有机肥，在田地整平后水稻移栽前施用，施用量50kg/亩；3、施用生物有机肥，在田地整平后水稻移栽前施用，施用量50kg/亩；4、井冈霉素处理，每亩喷施20%可湿性粉剂50g。水稻品种采用“武运粳24”。

水稻移栽后开始定期采集数据，统计发病率，计算不同处理间发病率的差异。发病率统计按照国际通行规则：0级，叶片健康；1级，1%~25%植株叶片发病；2级，植株叶片26%~50%发病；3级，植株叶片51%~75%发病；4，植株76%以上叶片发病；

发病率=[Σ(发病等级 × 植株数量)/(总植株数量 × 最高等级) ]× 100%

防治率=[(对照发病率-生物有机肥处理发病率)/对照发病率]×100%

水稻收获前计算累积发病率，试验结果（图3）表明，对照处理和施用普通有机肥处理的纹枯病的发病率高达10.11%~11.05%，且两个处理之间没有显著差异（p>0.05）；施用生物有机肥和喷施井冈霉素处理纹枯病的发病率为2.88%~3.03%，两个处理之间没有显著差异（p>0.05）；施用生物有机肥处理和喷施井冈霉素处理水稻纹枯病的发病率显著地低于对照和有机肥处理（p>0.05）。相对于对照处理，生物有机肥对水稻纹枯病的防治率为70%。生物有机肥能够显著地抑制水稻纹枯病的发生。

Claims

1.一种防控水稻纹枯病的生物防治菌株，其特征为该菌株为棘孢木霉12（Trichoderma asperellum 12），2013年5月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉市武昌珞珈山，菌株保藏号为CCTCC NO：M 2013213，简称为棘孢木霉CCTCC NO：M 2013213。

2.根据权利要求1一种防控水稻纹枯病的生物防治菌株，其特征在于所述的棘孢木霉CCTCC NO：M 2013213的主要生物学特性为：在PDA培养基上28℃培养3天，菌丝可以布满整个培养皿，菌丝生长初期白色，毡状，由中心至边缘逐渐形成环状，靠近边缘环状菌丝颜色较浅，在靠近中心同心圆上产生稠密的暗绿色分生孢子，生长菌丝的培养皿散发出很重的椰汁芳香气味，背面深黄色；分生孢子梗对生生长，呈树状分枝，暗绿色，瓶梗短，基部变细，中间膨大；分生孢子呈球形，表面粗糙，大小为3.5～5.0 μm×2.0～5.0 μm；ITS序列进化分析显示该菌株为棘孢木霉T. asperellum。

3.一种生物有机肥料，其特征在于含有0.5×10⁸cfu g^-1以上权利要求1或2所述的棘孢木霉CCTCC NO：M 2013213菌株休眠孢子、含水量低于15%、有机质含量大于35%。

4.一种权利要求3所述的生物有机肥料的制备方法，其特征在于按如下步骤实现：

1）将权利要求1所述的棘孢木霉CCTCC NO：M 2013213接种到PDA培养液，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：初始pH自然，培养温度25~30℃，溶氧通气量范围为30～100％，170rpm，发酵后期菌丝球全部打碎成菌丝片段，发酵液菌株的菌落形成单位≥1×10⁸cfu ml^-1；

3）将步骤（1）中所述的发酵液按200 L/吨的接种量接种到步骤（2）所述的固体发酵基质进行固体发酵，发酵温度为20~35℃，发酵过程中翻堆2~3次，发酵10~15天后结束；形成固体发酵物；

4）将步骤（3）固体发酵物按照体积比20%~30%接种到腐熟的猪粪堆肥或牛粪堆肥，并后熟5~8天，后熟过程中翻堆3~5次，最后在温度不超过35℃的条件下将生物有机肥的含水量蒸发至15%以下，包装出厂即为防治水稻纹枯病的生物有机肥料。

5.根据权利要求4所述生物有机肥料的制备方法，其特征在于其中步骤（1）所用PDA培养液配制方法为，以配制1L培养基为例：

用200 g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30 min，经过滤后滤液中加20 g普通蔗糖，定容至1000 ml，pH自然，121℃灭菌20 min。

6.根据权利要求4或5所述生物有机肥料的制备方法，其特征在于，其中步骤（4）所用腐熟后的猪粪或牛粪堆肥为发芽指数98%以上，有机质质量比含量≥35%，有机氮质量比含量为1.2%~2%，含水量质量比20%~30%。