CN103388031A - 结合非特异性扩增和多点rtq-pcr的食品微生物检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种结合非特异性扩增和多点RTQ-PCR的食品微生物检测方法，其将非特异性扩增培养、多点实时定量采样及特异性实时定量PCR鉴定技术结合起来，并根据PCR结果进行数据分析，其中非特异性扩增培养提供了多种微生物的扩增条件，特异性PCR把握了测定特异性，因此无需对特定菌微生物做进一步的选择性培养；多点实时采样和特异性定量PCR结合可测定微生物初始浓度及增长过程，并提供活性与死亡微生物的比例，因此能精确的在短时间内判断出食品污染程度、活菌比例、污染微生物活性状况及污染历史，为进一步毒素测定提供指导作用；此外还可同时测定同一样品中共存的多种微生物，使食品微生物检测实现了高通量化；本发明还提供了根据上述方法获得的检测试剂盒，为生产实际的应用提供了极大方便。

Description

结合非特异性扩增和多点RTQ-PCR的食品微生物检测方法

技术领域

本发明涉及一种食品微生物的快速检测方法，尤其涉及一种结合非特异性扩增和实时多点采样及RTQ-PCR来检测食品中微生物活性的方法，属于食品微生物检测领域。

背景技术

食品安全是一个世界性的影响人类健康的重大问题，其与人类生存环境和社会稳定息息相关。其中细菌性食物中毒的危害最为严重，感染者轻可造成发热、头痛、腹痛、腹泻和呕吐，重则会出现肌肉痉挛，甚至休克直至死亡，因此微生物的检验成为食品检测必不可少的重要组成部分，是衡量食品卫生质量的重要指标之一，也是判定被检食品能否食用的科学依据之一。通过食品微生物检验，还可以判断食品加工卫生环境，能够对食品被细菌污染的程度做出正确的评价，为各项卫生管理工作提供科学依据，提供传染病和人畜食物中毒的防治措施。

据统计，目前导致细菌性食物中毒的细菌种类中，最常见的主要是沙门氏菌、单核细胞增生性李斯特菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、大肠杆菌等。针对这些细菌及其他易危害人体健康的食品微生物，现有的检测方法主要依赖于微生物富集培养-选择性分离-生化鉴定方法，该方法存在手工操作繁琐费时、检测灵敏度低、易出现假阴性等缺陷，且卫生指导反馈慢，给商品生产和流通带来一定的影响。此外还有常用的免疫学方法和基因探针法，前者虽能弥补传统方法的一些不足，但也有误差大、周期长的局限性；而后者也存在检测费用昂贵、实验步骤多且费时的缺点。因此研究食品微生物快速、准确、经济的检测方法以预防和控制食品安全事件的发生，具有重要的现实意义。

针对上述问题，近年来微生物学专家和工程技术人员密切合作，采用了各种物理化学及生物技术对如何快速准确经济的鉴定微生物进行了研究分析，如采用了光散射技术、发光技术、色谱技术、电气电子技术、免疫技术及放射技术等，并基于上述分析技术发明了许多定性或定量鉴定微生物的分析方法。常见的有：（1）检测某些细菌的专有酶及代谢产物进行快速鉴定；（2）应用免疫学方法检测微生物抗原或抗体，如放射免疫分析（RIA）、酶免疫分析（EIA）、荧光免疫分析（FIA）、化学发光免疫分析（CIA）、生物发光免疫分析（BIA）等；（3）细菌毒素的快速检测；（4）细菌对抗菌药物的敏感性试验的快速检测；（5）分子生物学技术在检测微生物中的应用，如核酸探针(Nuclear acid probe)、聚合酶链反应(Polymerase chainreaction，PCR)、基因芯片技术(microarray)等；（6）快速检测细菌生化反应及成套鉴定***；（7）病原微生物的自动化***，其中最有代表性的是AMS微生物自动分析***。

上述各种方法与传统检测方法相比，在高效快速方面已具有较大的进步，但仍不能适应日益严格的食品质量检测方面的高要求，如当前食品微生物检测体现出的自动化检验和快速检验的发展方向，其具体要求表现为灵敏度高、特异性强、重复性大、快速、简易和经济等。经大量实践发现，上述各方法中PCR鉴定方法基本上具备了食品微生物检验新要求的各种条件，但在实际操作中仍会存在假阳性和无法判断微生物活性状态等问题，因此这也使得微生物定性或定量检测中仍不能放弃微生物培养的传统做法。

发明内容

为了克服上述现有技术中存在的不足，本发明提供了一种结合非特异性扩增和多点RTQ-PCR的食品微生物检测方法，该方法将短期非特异性扩增培养、多点实时定量采样及特异性实时定量PCR（RTQ-PCR）鉴定技术结合起来，无需对特定菌种做进一步的选择性培养，可精确的在短时间内判断出食品污染程度、活菌比例、污染微生物的活性状况及污染历史，还能为进一步的毒素测定提供指导作用，并提供了根据次方法获得的试剂盒。

本发明所述食品微生物检测方法的主要内容和原理解释如下所述。

本发明所述食品微生物检测方法主要包括四个步骤，即无选择性的非特异扩增步骤、多点实时定量采样步骤、对采样所得样品进行特异性实时定量PCR鉴定步骤和根据特异性实时定量PCR鉴定分析所得Ct值进行数据处理并分析结果的步骤。其中前三个步骤的结合使用创造了食品微生物快速检测的新思路。其中非特异扩增步骤使得多项微生物指标可以同时检测，不必特异培养单一微生物种；多点实时定量采样步骤可以得到微生物的增长曲线和初始活性状态，近而得到初始状态死菌和活菌的比例；高灵敏的特异性实时定量PCR鉴定步骤可使检测在简化的前提下保证准确短时内完成。

具体来讲，本发明所述食品微生物检测方法中所述的非特异性扩增步骤中，可以通过采用非特异性高效培养基来实现无选择性的微生物扩增。该非特异性高效培养基是对微生物没有选择性抑制的分离培养基，营养成分齐全，无抑制成分，并添加有微生物生长所需的有效营养成分，且由于该培养基不存在特异性选择，因此可在短期内有效修复并扩增所有污染微生物，使所有活性污染微生物在此培养基存在的培养条件下迅速恢复活力并可以按一定速度扩增。该非特异性高效培养基可由本领域技术人员根据需要进行自行配制，也可选择目前微生物培养领域中通用的非特异性选择培养基，如缓冲蛋白胨水等。此外本发明中采用非特异性高效培养基进行无选择性的微生物培养扩增时，培养时间可以从一小时到若干小时，但一般通常在3至6小时内完成。

该步骤与传统检测方法中的特异性培养步骤相比，传统方法中的特异性培养需要针对目标微生物进行特异性的选择培养扩增才能做进一步的微生物分离及分析，否则将会后续疑似存在微生物的判定和分析带来极大的难度；而本发明所述方法采用非特异性高效培养而并未进行选择性的进一步培养，是因为后续的分析将会采用具有特异性高、目标微生物不易受其他微生物干扰的定量PCR鉴定方法，此外本发明所述方法中的非特异性高效培养基可用于多种微生物的生长，为下一步多种微生物的分析带来极大优势。

本发明所述食品微生物检测方法中所述的实时定量采样步骤中，是在非特异性扩增的过程中，根据不同微生物生长情况在若干个不同培养时间点进行实时定量取样，其中取样时的培养时间点包括培养阶段的零时刻及微生物增长阶段内的至少一个非零时刻，并需将采样所得的样品进行迅速灭活。这样操作的原理在于，在前述采用非特异性高效培养基进行无选择性的微生物扩增过程中，随着培养时间的延长活性微生物将不断***复制进行生长扩增，且不同微生物一般均有不同的生长速度。培养开始前先进行留样（即在培养阶段的零时刻进行采样），该留样为原始污染微生物，其中包括活性微生物、死亡微生物及其代谢产物。在培养过程中，根据不同微生物生长情况在微生物增长阶段内的若干个（至少一个）不同培养时间点进行实时定量取样并留样。将上述通过取样所得的各样品经加热、超声或其他物理、化学及生物方法对其中含有的微生物进行迅速灭活。本发明所述的取样方式中，由于取样时间点包括培养阶段的零时刻及微生物增长阶段内的至少一个非零时刻，取样代表了样品最初微生物污染情况和其中活菌的生长情况。其中零时刻取样中包括活性微生物、死亡微生物和DNA片段，这些成分在下一步的测试中均可无区别的测得，因此一般PCR无法对上述成分进行判别。而本发明所述方法中由于还在微生物增长阶段内的至少一个非零时刻进行了取样，这些取样中不仅含有前述零时刻取样中含有的各原始成分，还包括培养过程中新生的微生物。因此从后续的实时定量PCR中对零时刻及各非零时刻所得取样中目标微生物的定量分析可以测定出活性目标微生物的生长情况，同时对比初始微生物含量可以得到死亡微生物和活性微生物在原始微生物中所占的比例，这些数据均对后续的毒素测定具有非常重要的指导意义。

在进行结果分析时，若整个培养过程中没有量的增加则可以说明没有活性目标微生物存在；若虽没有量的增加，但培养过程中始终存在有高含量的DNA成分，则说明样品中曾经有大量的目标微生物存在且已经死亡，此时应考虑进行毒素测定并鉴定目标微生物与毒素之间的吻合度；若培养过程中自始至终检测到的量均为零，则说明样品中既无活性目标微生物也没有死亡目标微生物，这种情况可以考虑不做毒素测定。因此本发明所述方法中的定时定量采样步骤中取样时间点的分布中，几个时间点的目标微生物的增长量将反映出活性微生物的生长情况，同时对比初始微生物含量可得到死亡微生物和活性微生物的比例，这些数据均对后续的毒素测定具有指导意义。

本发明所述食品微生物检测方法中所述的特异性实时定量PCR鉴定步骤中，是对实时定量采样步骤所得样品进行DNA提取后，对提取出的DNA采用针对目标微生物的特异性定量PCR试剂进行特异性实时定量PCR鉴定分析。该步骤中通过选择针对目标微生物DNA的特异性引物对与目标微生物DNA特异性结合并定量扩增，所得的扩增产物可采用DNA染料法或荧光探针法进行定量测定。由于特异性实时定量PCR具有非常强的特异性，在无选择性培养中其他同时扩增的微生物对检测没有任何影响，因此不需如传统方法一般进行选择特异培养基对样品进行针对目标微生物的特异性培养；此外特异性实时定量PCR的灵敏度高且不需长时间培养（通常可在半小时至两小时内完成），使得整个过程简单快速化。其通过和对照比较可得出样品在培养过程中的DNA拷贝数，并可根据微生物的扩增情况定性判定微生物的存在与否、微生物的生长情况及其中活菌比例。此外该步骤可同时测定一个样品中同时疑似存在的多种目标微生物，具体为针对不同目标微生物采用不同颜色的特异性荧光标记探针，这是因为本发明所述方法采用的是非特异性培养基扩增样品中的微生物，样品中所含的多种不同微生物都得以恢复和扩增，而实时定量PCR技术由于采用针对目标微生物DNA的特异性引物对，因此也具备同时测定多个不同微生物的功能，使检测高同通量化，大大提高了食品微生物的检测效率。

本发明所述食品微生物检测方法中，无选择性的非特异扩增、实时定量采样和特异性实时定量PCR鉴定的结合是本发明的特点。

基于上述本发明主要发明内容及相应技术原理，为解决前述背景技术中阐述的各种技术问题，本发明提供的解决技术方案如下所述：

一种结合非特异性扩增和多点RTQ-PCR的食品微生物检测方法，所述方法包括以下步骤：

（1）非特异性扩增步骤：将疑似含有目标微生物的样品通过无选择性的非特异性培养进行微生物扩增；

（2）实时定量采样步骤：在（1）中所述非特异性扩增过程中在若干个不同培养时间点进行实时定量取样，该取样时的培养时间点包括培养阶段的零时刻和微生物增长阶段内的至少一个非零时刻；

（3）特异性实时定量PCR鉴定步骤：对（2）中实时定量采样所得样品进行DNA提取后，对提取出的DNA进行特异性实时定量PCR鉴定分析；和

（4）根据特异性实时定量PCR鉴定分析所得Ct值进行数据处理并分析结果的步骤。

其进一步的技术方案是：

所述非特异性培养通过采用非特异性高效培养基实现。

所述非特异性高效培养基能够同时培养扩增多种不同微生物。

所述实时定量采样步骤中还包括将取样所得样品中微生物迅速灭活的步骤。

所述特异性实时定量PCR鉴定步骤中采用目标微生物DNA的特异性引物对与目标微生物DNA相结合并定量扩增。

所述特异性实时定量PCR鉴定步骤中，目标微生物DNA的特异性引物对与目标微生物DNA的扩增产物采用DNA染料法或荧光探针法进行定量。

所述特异性实时定量PCR鉴定步骤中采用特异性荧光标记探针测定样品中疑似存在的某种目标微生物。

所述特异性实时定量PCR鉴定步骤中采用不同颜色的特异性荧光标记探针测定样品中疑似同时存在的多种目标微生物。

根据特异性实时定量PCR鉴定分析所得Ct值分析样品中某种活性目标微生物初始浓度及扩增过程的状态。

根据特异性实时定量PCR鉴定分析所得Ct值分析样品中某种目标微生物初始浓度中死亡微生物和活性微生物的比例。

根据特异性实时定量PCR鉴定分析所得Ct值分析样品中同时存在的多种活性目标微生物的初始浓度及扩增过程的状态。

根据特异性实时定量PCR鉴定分析所得Ct值分析样品中同时存在的多种目标微生物初始浓度中各自死亡微生物和活性微生物的比例。

所述目标微生物为细菌。

所述目标微生物为沙门氏菌、单核细胞增生性李斯特菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和大肠杆菌。

所述疑似含有目标微生物的样品来源为疑似受微生物污染的食品和生物制品。

本发明还提供了一种用于上述食品微生物检测方法时的试剂盒，该试剂盒包括以下成分：

无选择性的非特异性高效培养基；

目标微生物的DNA提取试剂；

能够与目标微生物DNA相结合的特异性引物对；

能够与目标微生物DNA扩增产物相结合的特异性荧光标记探针；和

实时定量PCR鉴定试验常用试剂。

本发明的有益技术效果是：本发明所述的食品微生物检测方法将短期非特异性扩增培养、多点实时定量采样及特异性实时定量PCR鉴定技术结合起来，并根据特异性实时定量PCR鉴定分析所得Ct值进行数据处理及分析结果，其中非特异性扩增培养提供了多种微生物的扩增条件，特异性实时定量PCR把握了测定的特异性，因此无需对特定菌种做进一步的选择性培养；多点实时定量采样和特异性实时定量PCR结合可以测定出微生物初始浓度及增长过程，并提供活性微生物与死亡微生物在初始样品中的比例，因此能够精确高效的在短时间内判断出食品污染程度、活菌比例、污染微生物的活性状况及污染历史，为进一步的毒素测定提供指导作用；此外该方法还可同时测定一个样品中同时存在的多种微生物，使食品微生物的检测实现了高通量化；本发明还提供了根据上述此方法获得的检测试剂盒，为生产实际的应用提供了极大的方便。

附图说明

图1为对比实施例二的具体操作步骤示意图；

图2为具体实施例一的具体操作步骤示意图；

图3为具体实施例一的数据处理结果图；

图4为具体实施例二的数据处理结果分析图；

图5为具体实施例三的具体操作步骤示意图；

图6为具体实施例三的数据处理结果图。

具体实施方式

下面结合对比实施例和具体实施例对本发明做进一步的详细说明，且下述对比实施例和具体实施例中均以沙门氏菌的检测为例进行主要说明，但本发明所述方法可检测的菌种不仅限于沙门氏菌。

对比实施例一：

采用传统微生物富集培养-选择性分离-生化鉴定法检测沙门氏菌，其具体步骤如下所述。

1.前增菌

称取25g含有沙门氏菌的样品放入盛有225mL BPW（缓冲蛋白胨水）的无菌均质杯中，以10000r/min进行均质2min，然后用1mol/mL无菌NaOH溶液将pH调整至6.8。无菌操作条件下将上述处理好的样品转移至500mL锥形瓶中，于36℃下培养18h。

2.增菌

将上述经前增菌处理培养后的样品混合物轻轻摇匀后移取2mL，其中1mL转种于10mL TTB（四硫磺酸钠亮绿培养基）内，于42℃下培养24h；其中另1mL转种于10mL SC（***盐胱氨酸增菌液）内，于36℃下培养24h。

3.分离

将上述经TTB增菌培养后的增菌液用接种环分别取两环，一环划线接种于BS（亚硫酸铋）琼脂平板上，另一环划线接种于XLD（木糖赖氨酸脱氧胆盐）琼脂平板上；此外将经SC增菌培养后的增菌液用也用接种环分别取两环，一环划线接种于BS琼脂平板上，另一环划线接种于XLD琼脂平板上；将上述各划线接种好的琼脂平板于36℃下分别培养24h，观察各平板上生长菌落的状况，进行沙门氏菌的判定。判定方法和判定依据均为本领域技术人员熟知技术，本发明不再赘述。

4.各项生化判定试验

4.1自上述BS和XLD琼脂平板上分别挑取2个沙门氏菌的典型菌落，接种于三糖铁琼脂平板上，接种时先在斜面划线，再于底层穿刺；同时接种针不要灭菌，直接接种于赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板上，于36℃下培养48h。通过三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内菌落的特征，鉴定沙门氏菌。

4.2进行4.1中接种三糖铁琼脂试验和接种赖氨酸脱羧酶培养基试验的同时，从营养琼脂平板上挑取可疑菌落分别直接接种于蛋白胨水培养基（供做靛基质试验）、尿素琼脂培养基（pH7.2）、***培养基（KCN）内，并均于36℃下培养48h，根据培养后所得菌落特性判定沙门氏菌。

4.2.1补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质试验中阳性变体两项试验结果均为阳性，但仍需要结合下述5中所述血清学鉴定试验的结果进行准确判定。

4.2.2补做邻硝基酚β-D-半乳糖昔（ONPG）培养基接种试验。沙门氏菌表现为ONPG阴性，同时在赖氨酸脱羧酶培养基试验结果表现为阳性，甲型副伤寒沙门氏菌表现为赖氨酸脱羧酶阴性。

4.2.3进行沙门氏菌生化群的鉴别，鉴别方法为本领域技术人员熟知技术，本发明中不再赘述。

4.3生化鉴定试剂盒及全自动微生物生化鉴定***进行鉴定。根据上述4.1中的初步判断结果，从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成菌悬液，用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定***进行鉴定。

5.血清学鉴定试验

5.1抗原的准备

采用1.5wt.％琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。O血清不凝集，由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反应；

5.2多价菌体抗原（O）鉴定；

5.3多价鞭毛抗原（H）鉴定；

5.4血清学分型O抗原的鉴定和Vi抗原的鉴定。

综合上述4中各项生化判定试验和5中血清学鉴定试验所得结果，可判定25g样品中检出有沙门氏菌。

对比实施例二：

通过传统特异性培养和实时定量PCR测定沙门氏菌及其存在和生长情况，其具体步骤如下及图1中所示。

1.前增菌

分别称取25g不含沙门氏菌的样品一和25g含沙门氏菌的样品二分别放入盛有225mL BPW的无菌均质杯中，以10000r/min进行均质2min，然后用1mol/mL的无菌NaOH溶液将pH均调整至6.8。无菌操作条件下将上述处理好的样品一和二分别转移至500mL锥形瓶中，同时各取1mL留样A和A’，并将锥形瓶均置于36℃下培养8h后同时各取1mL留样B和B’。

2．增菌

将上述经前增菌处理培养后的样品一和样品二分别轻轻摇均后各移取2mL，其中1mL转种于10mL TTB内，于42℃下培养24h后留样1mL C和C’；其中另1mL转种于10mL SC内，于36℃下培养24h后留样1mL D和D’。

3.提取DNA和定量PCR反应

将上述步骤中不同阶段留样所得的样品A、B、C、D、A’、B’、C’和D’以10000r/min离心5min后移去上清液，对所得沉淀采用DNA提取试剂盒进行DNA提取（Qiagen公司生产的试剂盒QIAamp DNA Mini Kit），具体提取方法参见该DNA提取试剂盒的使用说明。将提取出的DNA各取1μL进行实时定量PCR分析，该PCR分析中采用沙门氏菌的特异性引物，其特异性引物序列如下所述：正向引物为GAATCCTCAGTTTTTCAACGTTTC（SEQ ID NO:1）；反向引物为GAAGCCCGAACGTGGCGA（SEQ ID NO:2），且PCR的反应条件如下：

95℃，10分钟；

40个循环（95℃，30s；62℃，30s；72℃，30s）；

72℃，5min；

4℃恒温。

结果显示样品一中未检测到沙门氏菌的DNA，样品二中沙门氏菌PCR结果表现为阳性，同时在样品二的PCR试验中待反应完成后可以找出Ct值（即每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数），并经数据处理后得到沙门氏菌存在和其增长相关性，其中数据处理过程为本领域技术人员熟知的处理方法，本发明中不再赘述。

具体实施例一：

通过非特异性培养扩增和多点RTQ-PCR测定沙门氏菌生长情况，其具体步骤如下及图2所示。

称取25g含沙门氏菌的样品放入盛有225mL BPW的无菌均质杯中，以10000r/min进行均质2min，用1mol/mL无菌NaOH溶液调pH至6.8。无菌操作条件下将上述处理好样品转至500mL锥形瓶中，同时取1mL留样A（为培养0h时的留样），并将锥形瓶置于36℃下培养24h，并在培养过程中的3h、6h、9h和24h时各留样1mL为B、C、D和E。将上述样品A、B、C、D和E均以10000r/min离心5min后移去上清液，对所得沉淀中的DNA采用DNA提取试剂盒进行DNA提取（Qiagen公司生产的试剂盒QIAamp DNA Mini Kit），具体提取方法参见该DNA提取试剂盒的使用说明。将提取出的DNA各取1μL进行实时定量PCR分析，该PCR分析中采用沙门氏菌的特异性引物，其具体序列和PCR反应条件如对比实施例二所述。反应完成后进行数据处理，可根据Ct值计算细菌的存在和增长情况，其中数据处理过程为本领域技术人员熟知的处理方法，本发明中不再赘述。该具体实施例一的数据处理结果如表1和图3所示，可见随培养时间的增加，菌落数呈增加趋势，PCR的Ct值呈下降趋势。

表1

培养时间（hr）	Ct值	菌落计数（CFU/mL）
			6	32.94	2500000
8	28.85	20000000
			10	25.56	120000000
12	23.23	890000000

具体实施例二：

通过非特异性培养扩增和多点RTQ-PCR测定食品样品中死沙门氏菌存在情况及活性沙门氏菌存在和生长情况，其具体步骤如下所述。

称取25g含沙门氏菌的样品放入盛有225mL BPW的无菌均质杯中，以10000r/min进行均质2min，用1mol/mL无菌NaOH溶液调pH至6.8。无菌操作条件下将上述处理好的样品转至500mL锥形瓶中，并加入经灭活的死沙门氏菌至100cfu/mL，同时取1mL留样A（为培养0h时的留样），并将锥形瓶置于36℃下培养24h，并在培养过程中的3h、6h、9h和24h时各留样1mL为B、C、D和E。将上述样品A、B、C、D和E均以10000r/min离心5min后移去上清液，对所得沉淀中的DNA采用DNA提取试剂盒进行DNA提取（Qiagen公司生产的试剂盒QIAamp DNA Mini Kit），具体提取方法参见该DNA提取试剂盒的使用说明。将提取出的DNA各取1μL进行实时定量PCR分析，该PCR分析中采用沙门氏菌的特异性引物，其具体序列和PCR反应条件如对比实施例二所述。反应完成后进行数据处理，可根据Ct值计算死沙门氏菌存在情况和活性沙门氏菌存在和生长情况，其中数据处理过程为本领域技术人员熟知的处理方法，本发明中不再赘述。数据处理结果如图4所示，可判定死微生物和活微生物的存在比例及灵敏度。

具体实施例三：

通过非特异性培养扩增和多点RTQ-PCR测定一个食品样品中存在的多种微生物细菌，本具体实施例中以一个食品样品中同时存在沙门氏菌和金黄色葡萄球菌为例，通过测定两种细菌的死菌存在情况及活菌存在和生长情况进行说明，其具体步骤如下及图5中所示。

称取25g同时含沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的样品放入盛有225mL BPW的无菌均质杯中，以10000r/min进行均质2min，用1mol/mL无菌NaOH溶液调pH至6.8。无菌操作条件下将上述处理好的样品转至500mL锥形瓶中，并在同一锥形瓶中加入经灭活的死沙门氏菌至100cfu/mL，和经灭活的死金黄色葡萄球菌至100cfu/mL，同时取1mL留样A（为培养0h时的留样），并将锥形瓶置于36℃下培养24h，并在培养过程中的3h、6h、9h和24h时各留样1mL为B、C、D和E。将上述样品A、B、C、D和E均以1100r/min离心5min后移去上清液，对所得沉淀中的DNA采用DNA提取试剂盒进行DNA提取（Qiagen公司生产的试剂盒QIAamp DNA Mini Kit），具体提取方法参见DNA提取试剂盒的使用说明。将提取出的DNA各取1μL进行实时定量PCR分析，该PCR分析中采用沙门氏菌特异性引物和金黄色葡萄球菌特异性引物，其中沙门氏菌特异性引物的序列对如对比实施例二中所述，金黄色葡萄球菌特异性引物的序列如下所述：正向引物为5-AATTTAACAGCTAAAGAGTTTGGT-3（SEQ ID NO:3）；反向引物为5-TTCATTAAAGAAAAAGTGTACGAG-3（SEQ IDNO:4），且所述PCR反应条件如对比实施例二中所述。反应完成后进行数据处理，可根据Ct值计算死沙门氏菌和死金黄色葡萄球菌存在情况、活性沙门氏菌和活性金黄色葡萄球菌存在和增生长情况，其中数据处理过程为本领域技术人员熟知的处理方法，本发明中不再赘述。数据处理结果如图6所示。

Claims (16)

1.一种结合非特异性扩增和多点RTQ-PCR的食品微生物检测方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

（1）非特异性扩增步骤：将疑似含有目标微生物的样品通过无选择性的非特异性培养进行微生物扩增；

（2）实时定量采样步骤：在（1）中所述非特异性扩增过程中在若干个不同培养时间点进行实时定量取样，该取样时的培养时间点包括培养阶段的零时刻和微生物增长阶段内的至少一个非零时刻；

（3）特异性实时定量PCR鉴定步骤：对（2）中实时定量采样所得样品进行DNA提取后，对提取出的DNA进行特异性实时定量PCR鉴定分析；和

（4）根据特异性实时定量PCR鉴定分析所得Ct值进行数据处理并分析结果的步骤。

2.根据权利要求1所述的食品微生物检测方法，其特征在于：所述非特异性培养通过采用非特异性高效培养基实现。

3.根据权利要求2所述的食品微生物检测方法，其特征在于：所述非特异性高效培养基能够同时培养扩增多种不同微生物。

4.根据权利要求1所述的食品微生物检测方法，其特征在于：所述实时定量采样步骤中还包括将取样所得样品中微生物迅速灭活的步骤。

5.根据权利要求1所述的食品微生物检测方法，其特征在于：所述特异性实时定量PCR鉴定步骤中采用目标微生物DNA的特异性引物对与目标微生物DNA相结合并定量扩增。

6.根据权利要求5所述的食品微生物检测方法，其特征在于：所述特异性实时定量PCR鉴定步骤中，目标微生物DNA的特异性引物对与目标微生物DNA的扩增产物采用DNA染料法或荧光探针法进行定量。

7.根据权利要求1所述的食品微生物检测方法，其特征在于：所述特异性实时定量PCR鉴定步骤中采用特异性荧光标记探针测定样品中疑似存在的某种目标微生物。

8.根据权利要求1所述的食品微生物检测方法，其特征在于：所述特异性实时定量PCR鉴定步骤中采用不同颜色的特异性荧光标记探针测定样品中疑似同时存在的多种目标微生物。

9.根据权利要求1所述的食品微生物检测方法，其特征在于：根据特异性实时定量PCR鉴定分析所得Ct值分析样品中某种活性目标微生物初始浓度及扩增过程的状态。

10.根据权利要求1所述的食品微生物检测方法，其特征在于：根据特异性实时定量PCR鉴定分析所得Ct值分析样品中某种目标微生物初始浓度中死亡微生物和活性微生物的比例。

11.根据权利要求1所述的食品微生物检测方法，其特征在于：根据特异性实时定量PCR鉴定分析所得Ct值分析样品中同时存在的多种活性目标微生物的初始浓度及扩增过程的状态。

12.根据权利要求1所述的食品微生物检测方法，其特征在于：根据特异性实时定量PCR鉴定分析所得Ct值分析样品中同时存在的多种目标微生物初始浓度中各自死亡微生物和活性微生物的比例。

13.根据权利要求1所述的食品微生物检测方法，其特征在于：所述目标微生物为细菌。

14.根据权利要求13所述的食品微生物检测方法，其特征在于：所述目标微生物为沙门氏菌、单核细胞增生性李斯特菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和大肠杆菌。

15.根据权利要求1所述的食品微生物检测方法，其特征在于：所述疑似含有目标微生物的样品来源为疑似受微生物污染的食品和生物制品。

16.一种用于根据权利要求1至15中任一权利要求所述食品微生物检测方法时的试剂盒，其特征在于：包括以下成分：

无选择性的非特异性高效培养基；

目标微生物的DNA提取试剂；

能够与目标微生物DNA相结合的特异性引物对；

能够与目标微生物DNA扩增产物相结合的特异性荧光标记探针；和

实时定量PCR鉴定试验常用试剂。

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