CN103387975A - 一种固定化环脂肽酰基转移酶及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种固定化环脂肽酰基转移酶及其制备方法和用途。所述环脂肽酰基转移酶固定于载体上；所述环脂肽酰基转移酶来源于天然或人工突变体、或者变种及由通过导入外来的环状酰基转移酶基因后转化得到的，所述载体材料选自无机载体、或聚丙烯树脂载体。本发明还公开了所述固定化环脂肽酰基转移酶的制备方法和用途。

Description

一种固定化环脂肽酰基转移酶及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及到酶固定化技术，尤其涉及一种固定化环脂肽酰基转移酶及其制备方法和用途。
背景技术
棘球白素作为一类新的抗真菌药物，在治疗由念珠菌或曲霉引起的感染方面效果良好。这类药物又以卡泊芬净、米卡芬净、阿尼芬净为代表。棘球白素类药物通过抑制1，3-β糖苷键的形成来抑制真菌，从而更好地减小了对人体的伤害，在高效的同时尽可能的降低了副作用，因此它们在使用过程中比传统抗真菌药更安全。
FK463（米卡芬净）是如式〔Ie〕所示的化合物，它是以式Ia化合物FR901379为前体通过切侧链得到式〔Ic〕化合物FR179642，然后经过合成方法得到的。
Anidulafungin(阿尼芬净)是如式〔If〕所示的化合物，它是以式Ib化合物echinocandin B为前体通过切侧链得到式〔Id〕化合物，然后经过合成方法得到的。
关于使环状脂肽物质例如FR901379、echinocandin B（棘白菌素B）、棘孢曲菌素A等物质及其类似物的酰基侧链脱酰的酶，已经报道了属于犹他游动放线菌（Actinoplanes utahensis）IFO-13244、（A.utahensis）NRRL-12052生产的酶。在WO97/32975号专利中，报道了属于链霉菌属（Streptomyces）的细菌（例如环圈链霉菌（Streptomyces anulatus）4811号菌株、环圈链霉菌8703号菌株、链霉菌（Streptomyces sp.）6907号菌株）生产的酶。另外，在WO97/47738号专利中，报道了Oidiodendron tenuissimum IFO 6797菌株、Oidiodendron echinulatum IFO 31963菌株、Oidiodendron truncatum IFO 9951菌株、Oidiodendron truncatum IFO 31812菌株、树粉孢（Oidiodendron sp.）30084号菌株、轮枝孢（Verticillium sp.）30085号菌株生产的酶。
所述酰基转移酶在培养菌丝中及滤液中可以找到。通常回收这种生物活性物质的方法为，培养肉汤经过过滤或离心所得的菌丝及滤液经传统的方法进行分离、纯化，如高浓度盐溶液抽提，常用溶剂抽提，减压浓缩，冷冻干燥，PH调整，阴离子交换树脂或阳离子交换树脂、结晶、再结晶等，可得到该酰基转移酶。在专利CN 1161462C中，公开了所述酶的脱酰化方法，该方法用培养液转化环状脂肽物质（如FR901379、echinocandin B等），其缺点为转化体系中有有机溶剂，产物后处理困难，转化速度慢，酰基转移酶不可重复使用，转化产物纯度低，增加脱酰后产物的纯化难度。
因此人们一直在寻求一种固定所述酶的方法，来回收、纯化所述酰基转移酶，提高该酶的利用率。
发明内容
本发明旨在提供一种固定化环脂肽酰基转移酶。
本发明还提供上述固定化环脂肽酰基转移酶的制备方法。
本发明的再一个目的是提供上述固定化环脂肽酰基转移酶的用途。
在本发明的第一方面，提供了一种固定化环脂肽酰基转移酶，所述环脂肽酰基转移酶固定于载体上；所述环脂肽酰基转移酶来源于天然或人工突变体、或者变种及由通过导入外来的环状酰基转移酶基因后转化得到的，所述载体材料选自无机载体、或多孔亲水性酶载体。
所述固定化环脂肽酰基转移酶，是用于催化如式Ⅰ的化合物中的R1的酰基脱酰化，产生如式Ⅱ所示的化合物，
Figure BDA00001629632800021
Figure BDA00001629632800031
式中，R1为酰基，R2为羟基或酰氧基，R3为氢或羟基，R4为氢或羟基，R5为氢或羟基璜酰氧基，R6为氢或氨基甲酰基。
在另一优选例中，所述能催化进行酰基脱酰化反应的化合物或其药学上可接受的盐，为如式Ⅰa或式Ⅰb所示；
。
Figure BDA00001629632800032
在一优选例中，所述载体材料选自以下无机载体：以所述无机载体的总重量计，其中SiO2含量大于50wt%，Al2O3含量大于1wt%；优选自：催化剂载体CELITE、膨化珍珠岩、硅藻土、高岭土、或多孔玻璃。
在另一优选例中，所述载体材料选自以下多孔亲水性酶载体：以聚甲基丙烯酸酯为基体键合环氧化物或者含氨基功能基团的多孔亲水性酶载体；优选自：Relizyme EP403、SEPABEADS EC-EP、Relizyme HA403或SEPABEADS EC-HA。
在一优选例中，所述固定化环脂肽酰基转移酶，每克载体固定有10-1000单位（u）环脂肽酰基转移酶；优选20-600单位（u）。
在另一优选例中，所述固定化环脂肽酰基转移酶，固定在无机载体上，每克载体固定有10－100单位（u）环脂肽酰基转移酶；优选20-80单位（u）。
在另一优选例中，所述固定化环脂肽酰基转移酶，固定在多孔亲水性酶载体，例如聚甲基丙烯酸酯为基体键合环氧化物或者含氨基功能基团的酶载体，每克载体可固定100-1000单位（u）环脂肽酰基转移酶；优选120-600单位（u）。
在本发明的第二方面，提供了一种如上所述的本发明提供的固定化环脂肽酰基转移酶的制备方法，所述的方法包括步骤：
将含有游离的环脂肽酰基转移酶的溶液与载体混合，进行吸附、固定化，得到如上所述的本发明提供的固定化环脂肽酰基转移酶。
在上述制备方法中，所述环脂肽酰基转移酶来源于天然或人工突变体、或者变种及由通过导入外来的环状酰基转移酶基因后转化得到的。
在上述制备方法中，所述菌株是放线菌属或链霉菌属的。
在上述制备方法中，所述含有游离的环脂肽酰基转移酶的溶液通过下述方式得到：菌株培养，得到含有游离的环脂肽酰基转移酶的溶液；或菌株培养后将得到的菌丝体进行破壁，得到含有游离的环脂肽酰基转移酶的溶液。或将含有游离的环脂肽酰基转移酶的溶液纯化，除去杂蛋白，得到更加纯净的环脂肽酰基转移酶的溶液。
在上述制备方法中，所述载体材料选自无机载体、或多孔亲水性酶载体。
在上述制备方法中，所述无机载体选自：以所述无机载体的总重量计，其中SiO2含量大于50wt%，Al2O3含量大于1wt%；优选自：催化剂载体CELITE、膨化珍珠岩、硅藻土、高岭土、或多孔玻璃。
在上述制备方法中，所述多孔亲水性酶载体选自：以聚甲基丙烯酸酯为基体键合环氧化物或者含氨基功能基团的酶载体；优选自：Relizyme EP403、SEPABEADS EC-EP、Relizyme HA403或SEPABEADS EC-HA。
在上述制备方法中，所述游离的环脂肽酰基转移酶与载体的混合比例为每克载体需酶10-1000单位（u）；优选每克载体需酶20-600单位（u）。
在上述制备方法中，所述游离的环脂肽酰基转移酶与无机载体的混合比例为每克载体需酶10-100单位（u）；优选每克载体需酶20-80单位（u）。
在上述制备方法中，所述游离的环脂肽酰基转移酶与多孔亲水性酶载体的混合比例为每克载体需酶100-1000单位（u）；优选每克载体需酶120-600单位（u）。
在上述制备方法中，所述含有游离的环脂肽酰基转移酶的溶液的pH值为4-9；优选6-7。
在上述制备方法中，所述含有游离的环脂肽酰基转移酶的溶液和载体混合的温度为0-80℃；优选20－35℃；最优选20-25℃。
在上述制备方法中，将含有游离的环脂肽酰基转移酶的溶液与载体混合后，将游离的环脂肽酰基转移酶和结合于载体的环脂肽酰基转移酶分离，得到固定化环脂肽酰基转移酶。
在本发明的第三方面，提供了一种如式Ⅱ所示的化合物的制备方法，所述的方法包括步骤：
（a）将如式Ⅰ的化合物和缓冲溶液混合，得到溶液1；
（b）将溶液1和如上所述的本发明提供的固定化环脂肽酰基转移酶混合，进行脱酰化反应，得到如式Ⅱ所示的化合物；
Figure BDA00001629632800051
式中，R1为酰基，R2为羟基或酰氧基，R3为氢或羟基，R4为氢或羟基，R5为氢或羟基璜酰氧基，R6为氢或氨基甲酰基。
在另一优选例中，所述固定化环脂肽酰基转移酶和式Ⅰ的化合物的比例在0.01-10u/g。
在另一优选例中，所述步骤（a）中缓冲液的pH在4-9；优选6-7；所述步骤（a）中缓冲液选自下述溶液中的一种或一种以上：柠檬酸钠缓冲液、磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液和Tris-HCl缓冲液。
在另一优选例中，所述步骤（b）中脱酰化反应的温度为20-70℃；优选40-50℃。
在另一优选例中，所述步骤（b）中脱酰化反应后，将固定化环脂肽酰基转移酶与含产物的反应液分离，得到如式Ⅱ所示的化合物；较佳地，所述将固定化环脂肽酰基转移酶与含产物的反应液分离的方法包括过滤或离心。
据此，本发明提供了一种固定环脂肽酰基转移酶的方法，从而回收、纯化所述酰基转移酶，提高了该酶的利用率。
附图说明
图1为实施例10固定化酶（vi）脱酰化产物的HPCL分析图谱。
图2为对比例1游离酶液脱酰化产物的HPCL分析图谱。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，找到了一种固定化环状脂肽酰基转移酶的工业化生产方法，以及利用该固定化酶制剂使环状脂肽物侧链的“酰胺基”脱酰化形成“氨基”的生产方法，该方法技术先进，工艺简单，操作方便，脱酰化产物纯度高。
进一步讲，本发明涉及由微生物Colephoma sp.F-11899株（FERM BP-2635）所产生的FR901379物质（专利号CN1051757A）、由微生物Aspergillusnidulans Nrrl 11440株所生产的echinocandin B（棘白菌素B）（专利号US4288549）及其它们的类似物的酰基侧链脱酰化的酰基转移酶的固定化方法，以及用该固定化酶进行脱酰化的方法。
关于背景技术和本发明涉及的化合物的结构式列于下表：
Figure BDA00001629632800081
Figure BDA00001629632800101
式中，R1为酰基，R2为羟基或酰氧基，R3为氢或羟基，R4为氢或羟基，R5为氢或羟基璜酰氧基，及R6为氢或氨基甲酰基。
本发明的环状脂肽酰基转移酶是固定化的，其制备过程包括以下步骤：
a.制备环状脂肽酰基转移酶液；
b.将环状脂肽酰基转移酶液与载体按一定的比例混合，将环脂肽酰基转移酶固定在载体材料上；
c.将环脂肽酰基转移酶液与酶载体分离，得到固定化的环脂肽酰基转移酶。
本发明所用的环状脂肽酰基转移酶对于其来源没有特别的限制，来源于天然或人工突变体、或者变种及由通过导入外来的环状酰基转移酶基因后转化得到的所述酶也全都包括在内。
所述载体材料选自无机载体或多孔亲水性酶载体。无机载体的优点是不会使酶失活，吸附到载体上的酶都是有活性的，但缺点是比活较低，单位载体可吸附的酶量远远低于多孔亲水性酶载体；而多孔亲水性酶载体虽然能吸附更多的酶，但会使部分酶失活，即吸附到载体上的酶只有部分是有活性的，回收率较低。
无机载体可以是疏水性载体例如常用于固定化作用的催化剂载体CELITE[化学组成：87%SiO2，0.9%CaO，6.1%Al2O3,1.6%Fe2O3,1.6%Na2O+K2O]，膨化珍珠岩[化学组成：SiO2(70-75%)、CaO(0.1-2.0%)、Al2O3(12-16%)、Na2O(1.0-5.0%)、Fe2O3(0.1-1.5%)、K2O(1.0-5.0%)]，硅藻土，高岭土，或多孔玻璃等载体，其化学组成以无机载体的总重量计，其中SiO2含量大于50wt%，Al2O3含量大于1wt%；优选自：催化剂载体CELITE、膨化珍珠岩、硅藻土、高岭土、或多孔玻璃；最优选的为催化剂载体CELITE、膨化珍珠岩。
多孔亲水性酶载体可以是以聚甲基丙烯酸酯为基体键合环氧化物或者含氨基功能基团的酶载体。例如功能基团为环氧化物的酶载体，包含有RelizymeEP403、SEPABEADS EC-EP。功能基团为已二胺的酶载体，包含有Relizyme HA403。功能基团为六亚甲基亚胺的酶载体，包含有SEPABEADS EC-HA。
使用无机载体在固定化过程中，酶和载体的比例范围是每克载体需酶10-100u,优选的酶20-80u/g载体。当酶用量小于10u/g载体时，固定化的酶活太低，酶促反应很难发挥出来，但酶活大于100u/g载体时，酶的固定化效率太低，部分酶呈游离状态，使用一次就会流失。
使用多孔亲水性酶载体在固定化过程中，酶和载体的比例范围是每克载体需酶100-1000u,优选的酶120-600u/g载体。特别地，使用多孔亲水性酶载体固定化过程中，使用的酶液优选纯化的，酶液中杂蛋白的比例越小越有利于固定化。
使用无机载体的固定化条件是：将上述得到的粗酶液中的环状脂肽酰基转移酶，用高效液相色谱（HPLC）测定酶活力，按一定的酶\载体比例,加入固态载体。pH4-9,温度0-80℃，搅拌半小时以上，充分洗涤，过滤，低温干燥，可得固定化环状脂肽酰基转移酶，于0-5℃保存。
使用功能基团为环氧化物的多孔亲水性酶载体的固定化条件是：将上述得到的较为纯净的酶液中环状脂肽酰基转移酶，用高效液相色谱（HPLC）测定酶活力，按一定的酶\载体比例，加入功能基团为环氧化物的酶载体。pH4-9,温度0-80℃，搅拌24小时以上充分洗涤，过滤，低温干燥，可得固定化环状脂肽酰基转移酶，于0-5℃保存。
使用功能基团为氨基的多孔亲水性酶载体的固定化条件是：预先将酶载体用戊二醛活化，活化完成后充分洗涤去除残余的戊二醛，将上述得到的较为纯净的酶液中环状脂肽酰基转移酶，用高效液相色谱（HPLC）测定酶活力，按一定的酶\载体比例，加入戊二醛活化好的酶载体，pH4-9,温度0-80℃，搅拌24小时以上充分洗涤，过滤，低温干燥，可得固定化环状脂肽酰基转移酶，于0-5℃保存。
在本发明中，上述酶活力单位定义为：40℃时，在一小时内生成1微摩尔产物所需的酶量，即定义为1u。步骤为：分别量取17.5ml粗酶液，含有FR901379的磷酸二氢钾缓冲盐（0.25mol/L）pH6.0的缓冲液5ml,2.5ml甲醇。于40℃水浴条件下，反应一小时。去离子水适当稀释，0.22um尼龙膜过滤，HPLC测定产物浓度。或者
在本发明中，上述酶活力单位定义为：40℃时，在一小时内生成1微摩尔产物所需的酶量，即定义为1u。步骤为：分别量取17.5ml粗酶液，将echinocandin B的二甲基亚砜溶液（100mg/ml）2.5ml，加入1.2M氯化钾、0.5M磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液5.0ml。于40℃水浴条件下，反应一小时。去甲醇适当稀释，0.22um尼龙膜过滤，HPLC测定产物浓度。
在本发明的一个优选例中在上述步骤a中环状脂肽酰基转移酶的制备方法包括下述步骤：菌株培养，将得到的菌丝体进行破壁，获得环脂肽酰基转移酶液。
所述的菌株是指具有能分泌环状脂肽酰基转移酶的优良菌株，是放线菌属或链霉菌属的。主要有以下几种：犹他游动放线菌（Actinoplanes utahensis）IFO-13244、（A.utahensis）NRRL-12052生产的酶。在WO97/32975号专利中，报道了属于链霉菌属（Streptomyces）的细菌（例如环圈链霉菌（Streptomycesanulatus）4811号菌株、环圈链霉菌8703号菌株、链霉菌（Streptomyces sp.）6907号菌株）生产的酶生产的酶。另外，在WO97/47738号专利中，报道了Oidiodendron tenuissimum IFO 6797菌株、Oidiodendron echinulatum IFO31963菌株、Oidiodendron truncatum IFO 9951菌株、Oidiodendron truncatumIFO 31812菌株、树粉孢（Oidiodendron sp.）30084号菌株、轮枝孢（Verticillium sp.）30085号菌株生产的酶。
优选犹他游动放线菌（Actinoplanes utahensis）IFO-13244、（A.utahensis）NRRL-12052生产的酶，链霉菌（Streptomyces sp.）6907号菌株。
菌株培养所用的培养基包括以下几种物质：蔗糖1-10%，大豆蛋白胨0.1-0.1%，K2HPO40.1-0.2%,KH2PO40.01-0.1%，MgSO4.7H2O 0.01-0.05%。培养条件是在25-36℃，优选30℃，通气量1-2vvm，搅拌速度200-800r/min。经过3-5天培养，获得大量菌丝体。
上述得到的菌丝体可以先进行破壁，收集这些菌体细胞的胞内酶，这样可以获得较好的环状脂肽酰基转移酶，所述的菌体破壁可用已知的方法，如：高浓度盐溶液抽提法，超声波破碎法，机械破碎法，溶菌酶法等将环状脂肽酰基转移酶转移到细胞的胞外，再用过滤法或离心法将酶液与菌丝体分离，得到粗酶液。
为了获得更好的固定化酶，还可以先将环状脂肽酰基转移酶液进行纯化：将上述所得的粗酶液，按照一定的比例加入所用的无机载体吸附游离酶。将吸附有酶的无机载体与酶液分离，经过充分洗涤后，用高浓度的盐溶液将环状脂肽酰基转移酶从无机载体上解吸下来，得到较为纯净的酶液。
环状脂肽酰基转移酶的纯化过程还可以参照文献Membrane-associateechinocandin B deacylase of Actinoplanes utahensis:purification,characterization,heterologous cloning and enzymaticdeacylation reaction使用超滤、离子交换树脂的方法纯化环状脂肽酰基转移酶，此方法能够得到更加纯净的酶液，但此方法的缺点是酶的回收率很低。
本发明使用固定化酶进行脱酰化过程，包括以下步骤：
A.加入缓冲溶液，制备含有环状脂肽物的溶液1；
B.在溶液1中加入固定化酰基转移酶，进行脱酰化反应；
C.将固定化酰基转移酶与含产物的反应液分离。
其中，固定化酰基转移酶与环状脂肽物的比例在0.01-10u/g，优选0.1-5u/g。
步骤A中所述缓冲液的pH控制在4-9，优选pH 5-7，更佳地pH约6.0。缓冲液的种类为0.5M柠檬酸钠缓冲液、0.5M磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液和Tris-HCl缓冲液的的一种或它们的混合物，优选0.5M磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液。
步骤B中所述脱酰化反应的温度控制在约为20-70℃，优选的温度范围是约30-50℃。
步骤C中所述的将固定化酶与含产物的反应液分离的方法包括过滤法或离心法。
当将酶固定到合适的载体上时，本发明的脱酰化作用可顺利地在连续搅拌反应釜器中进行而不是分批地进行。
本发明中所讲“环状脂肽物”或“环脂肽”指含有多肽环，该环上侧链含有“酰基氨基”的物质，该物质也可有其它的侧链。
该“环状脂肽物”的代表为FR901379、echinocandin B(棘白菌素B)，该类物质是具有抗真菌活性的已知物。
该发明的固定化环状脂肽酰基转移酶，能使环状脂肽物侧链的“酰胺基”脱酰化形成“氨基”，具体的讲它能使物质FR901379或其盐的棕榈酰侧链或含有FR901379、式Ⅰ中所示的化合物的酰基侧链脱酰化，形成式Ⅱ所示的环状肽物质。
如本文所用，“药学上可接受的盐”优选：包括金属盐例如碱金属盐（如钠盐、钾盐）、碱土金属盐（如钙盐、镁盐等）、铵盐、与有机碱形成的盐（如三甲胺盐、三乙胺盐、吡啶盐、甲基吡啶盐、二环己铵盐、N,N’-二苄基乙二胺盐、二异丙基乙胺盐等）等、有机酸加成盐（如甲酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐等）、无机酸加成盐（如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、磷酸盐等）、与氨基酸（如精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等）形成的盐等。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
本发明的主要优点在于：
1、本发明提供的脂肽酰基转移酶固定化方法，可反复使用该酶，提高环状脂肽酰基转移酶的利用率、降低生产成本，有利于工业化生产和降低成本。
2、本发明的脱酰化产物纯度得到特别显著提高。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。
本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
下述实施例中化合物〔Ⅱ〕HPLC检测所用的方法：
样本在Waters分析性HPLC体系上进行分析。反相HPLC分析用于测定FR179642、棘白菌素B核物质及其它类似物。反相分析采用PLATISIL ODS色谱柱（粒径5μm，4.6mmi.d×250cm），并且保持在30℃。以3%乙腈/0.5%磷酸二氢钠作流动相，流速为1ml/分钟，并在210nm下UV检测。
实施例1
犹他游动放线菌（Actinoplanes utahensis）IFO-13244株生产的酰基转移酶a的制备
采用犹他游动放线菌IFO-13244菌株，按照US5376634专利上的发酵方法，进行发酵培养，得到菌丝体培养液150L。加入0.01M磷酸二氢钾缓冲盐，pH调至6.0，加入1.0M氯化钾，低温下搅拌抽提20小时以上。然后于铺有滤纸的布氏漏斗过滤，收集含有酰基转移酶的滤液116L，即游离酶液（a）,收集滤液经HPLC检测酶活2.3×105u。
实施例2
犹他游动放线菌（A.utahensis）NRRL-12052株生产的酰基转移酶b的制备
采用犹他游动放线菌NRRL-12052菌株，按照US4320053专利上的发酵方法，进行发酵培养，得到菌丝体培养液160L。加入0.01M磷酸二氢钾缓冲盐，pH调至6.0，加入1.0M氯化钾，低温下搅拌抽提20小时以上。然后于铺有滤纸的布氏漏斗过滤，收集含有酰基转移酶的滤液121L，即游离酶液（b）,收集滤液经HPLC检测酶活2.1×105u。
实施例3
链霉菌（Streptomyces sp.）6907号菌株生产的酰基转移酶c的制备
采用链霉菌6907号菌株，按照WO97/32975专利上的发酵方法，进行发酵培养，得到菌丝体培养液160L。加入0.01M磷酸二氢钾缓冲盐，pH调至6.0，加入1.0M氯化钾，低温下搅拌抽提20小时以上。然后于铺有滤纸的布氏漏斗过滤，收集含有酰基转移酶的滤液124L，即游离酶液（c）,收集滤液经HPLC检测酶活2.9×105u。
实施例4
酰基转移酶b的纯化
参照文献Membrane-associate echinocandin B deacylase ofActinoplanes utahensis:purification,characterization,heterologouscloning and enzymatic deacylation reaction的方法纯化实施例2中得到的粗酶液，最终得到纯净的酰基转移酶液3.0L,即游离酶液（d），收集酶液经HPLC检测酶活0.5×105u。
实施例5
无机载体固定酰基转移酶
为了固定化，分别取50升游离酶液（a）、（b）、（c），然后分别加入1.5公斤的膨化珍珠盐，25℃下，搅拌吸附1小时以上。过滤收集固定化酰基转移酶，即固定化酶（ⅰ）、（ⅱ）、（ⅲ）用0.01M磷酸二氢钾缓冲盐,pH6.0的缓冲液洗涤三次，并在室温下干燥几小时。该固定化酶用前储存在4℃。
表1用膨化珍珠盐作为载体对不同游离酶液的吸附率
Figure BDA00001629632800161
实施例6
功能基团为环氧化物的多孔亲水性酶载体固定酰基转移酶
为了固定化，分别取0.8升上述实施例4制备的纯净的酰基转移酶液（d）两份，分别加入59.2g氯化钾，和0.01mol/L的磷酸二氢钾缓冲盐,pH7.0，分别加入30g Reli zyme EP403和SEPABEADS EC-EP 30g,25℃下,搅拌24小时以上，过滤收集固定化酰基转移酶，即固定化酶（ⅳ）、（ⅴ）用0.01M磷酸二氢钾缓冲盐,pH7.0的缓冲液洗涤三次，并在室温下干燥几小时。该固定化酶用前储存在4℃。
表2用环氧化物的多孔亲水性酶载体对游离酶液的固定情况
Figure BDA00001629632800171
实施例7
功能基团为氨基的多孔亲水性酶载体固定酰基转移酶
为了固定化，先对载体进行活化：分别取8gRelizyme HA403和SEPABEADSEC-HA8g,加入90毫升2%的戊二醛溶液，0.02mol/L的磷酸氢二钾缓冲盐，pH8.0,在20-25℃下搅拌1小时，去除上清，纯化水清洗树脂。分别取0.4升上述实施例4制备的纯净的酰基转移酶液（d）两份，将两份活化好的酶载体添加到酶液中，在20-25℃下，搅拌20小时以上，过滤收集固定化酰基转移酶，即固定化酶（ⅵ）、（ⅶ）用0.01M磷酸二氢钾缓冲盐,pH7.0的缓冲液洗涤三次，并在室温下干燥几小时。该固定化酶用前储存在4℃。
表3用氨基型的多孔亲水性酶载体对游离酶液的固定情况
Figure BDA00001629632800172
实施例8
用固定化酶进行分批脱酰化反应
分别向FR901379物的水溶液（20mg/ml、HPLC纯度79.2%）2升（FR901379物20g,16.7mmol）中加入缓冲液（0.2M磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液；pH6.0）2升和15g固定化酶（ⅰ）、固定化酶（ⅱ）、固定化酶（ⅲ），40℃反应4小时，通过HPLC测得FR179642物的产量和纯度。
表4固定化酶4小时脱酰化后FR901379物的转化率及FR179642的纯度
  固定化酶   转化率X(%)   FR179642纯度（%）
  固定化酶（ⅰ）   94.6   95.2
  固定化酶（ⅱ）   95.2   94.7
  固定化酶（ⅲ）   98.7   95.9
实施例9
用固定化酶进行分批脱酰化反应
分别向FR901379物的水溶液（20mg/ml、HPLC纯度79.2%）2升（FR901379物20g,16.7mmol）中加入缓冲液（0.2M磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液；pH6.0）2升和15g固定化酶（ⅳ）、固定化酶（ⅴ）、固定化酶（ⅵ）、固定化酶（ⅶ），40℃反应1小时，通过HPLC测得FR179642物的产量和纯度。
表5固定化酶1小时脱酰化后FR901379物的转化率及FR179642的纯度
  固定化酶   转化率X(%)   FR179642纯度（%）
  固定化酶（ⅳ）   92.1   94.8
  固定化酶（ⅴ）   93.7   94.7
  固定化酶（ⅵ）   94.7   95.1
  固定化酶（ⅶ）   94.5   94.2
对比例1
用游离酶液进行分批试验
按照WO97/32975专利上的脱酰化方法，将FR901379物的水溶液（100mg/ml、HPLC纯度79.2%）100ml（FR901379物10g,38.35mmol）、加入缓冲液（0.2M磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液；pH6.0）100ml，甲醇100ml，然后加入游离酶液（c）700ml,40℃反应7小时，转化率71.1%，生成的FR17964纯度，经HPLC检测纯度为75.7%，其HPLC分析色谱图见图2和表10。
转化后的液体，测定酶活，经过测定基本上检测不到酶活。酶在转化过程中几乎全部失活。
表10
  峰号 保留时间（分钟） 峰面积（毫伏*秒）  峰高（毫伏）   %面积
  1 5.682 142308  14951   8.09
  2 6.290 40524  3337   2.30
  3 6.719 4818  463   0.27
  4 7.151 65642  4673   3.73
  5 8.141 20293  1597   1.15
  6 8.525 25462  2034   1.45
  7 9.218 1332042  60431   75.72
  8 11.126 21882  1041   1.24
  9 13.031 8234  516   0.47
  10 14.805 20289  961   1.15
  11 18.268 16222  421   0.92
  12 23.238 61491  2382   3.50
从上述实施例和对比例1可以得出，利用固定酶进行脱酰基化与游离酶液脱酰基相比较具有显著地优势。转化率和产物的纯度都得到极大地提高。
实施例10
在连续搅拌釜式反应器中的连续脱酰化反应
在50升连续搅拌釜式反应器中于45℃进行FR901379到FR179642的连续脱酰化反应，加入固定化酶（ⅵ）0.3Kg，FR901379物的水溶液（20mg/ml、HPLC纯度79.2%）20升，缓冲液（0.2M磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液；pH6.0）20升。底物在3小时后转化率达到95%以上，FR179642经HPLC检测纯度为95.99%，其HPLC分析色谱图见图1和表6。
表6
  峰号 保留时间（分钟） 峰面积（毫伏*秒）  峰高（毫伏）   %面积
  1 5.148 6472  590   0.32
  2 5.679 3661  467   0.18
  3 6.412 29895  2111   1.48
  4 9.223 1940814  90329   95.99
  5 11.161 8269  386   0.41
  6 18.341 24274  694   1.20
  7 23.249 8466  334   0.42
固定化的酰基转移酶至少可保持30小时的稳定性和活性，因此在生产过程中可连续重复使用5次以上。
从实施例10与对比例1相比可以得出，固定化酶的另一大优势是可以重复利用。极大地提高使用效率，减少对环境的破坏污染。
实施例11
不同载体对游离酶的固定化及固定化酶脱酰化比较
为了固定化，分别取5升游离酶液（c），然后分别加入0.15公斤的膨化珍珠盐，硅藻土（CELITE），和活性碳（SiO2含量小于1%）,分子筛、多孔玻璃。30℃下，搅拌吸附1小时以上。过滤收集固定化酰基转移酶，即固定化酶（ⅷ）、（ⅸ）、（ⅹ）、（xi）、（xii）用0.01M磷酸二氢钾缓冲盐,pH6.0的缓冲液洗涤三次，并在室温下干燥几小时，该固定化酶用前储存在4℃。
然后，分别向FR901379物的水溶液（20mg/ml、HPLC纯度79.2%）2升（FR901379物20g,16.7mmol）中加入缓冲液（0.2M磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液；pH6.0）2升和15g（ⅷ）、（ⅸ）、（ⅹ）、（xi）、（xii），40℃反应4小时，通过HPLC测得FR179642物的产量和纯度。
表7三种载体对不同游离酶液的吸附率及固定化酶脱酰化比较
Figure BDA00001629632800201
Figure BDA00001629632800211
实施例12
不同比例载体对游离酶的固定化及固定化酶脱酰化比较
为了固定化，分别取5升游离酶液（c），HPLC检测酶活1.17×104U，然后分别加入0.05公斤，0.12公斤，0.15公斤,0.24公斤,0.58公斤,1.17公斤,1.75公斤的硅藻土（CELITE），30℃下，搅拌吸附1小时以上。过滤收集固定化酰基转移酶，用0.01M磷酸二氢钾缓冲盐,pH6.0的缓冲液洗涤三次，HPLC检测滤液中的酶活。固定化酶在室温下干燥几小时，该固定化酶用前储存在4℃。
然后，分别向FR901379物的水溶液（20mg/ml、HPLC纯度79.2%）1升（FR901379物10g,8.35mmol）中，加入缓冲液（0.2M磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液；pH6.0）1升和75g，40℃反应4小时，通过HPLC测得FR179642物的生产量和纯度。
表8不同比例载体对游离酶的吸附率及固定化酶脱酰化比较
  酶与载体比例(U/g)   吸附率（%）   转化率X(%)
  243/1   46.1   60.3
  97.5/1   82.0   99.1
  约80.0/1   98.1   97.2
  约50/1   98.5   95.7
  20.0/1   99.5   93.9
  10/1   98.2   87.8
  15/1   98.1   41.2
实施例13
不同pH对载体固定化游离酶的比较
为了固定化，分别取5升游离酶液（a），HPLC检测酶活1.0×104U，然后分别加入0.15公斤的硅藻土（CELITE），用2mol/L的盐酸或2mol/L氢氧化钠溶液调节pH至3.5，4.0，6.0，9.0，9.5。25℃下，搅拌吸附1小时以上。过滤收集固定化酰基转移酶。固定化酶在室温下干燥几小时，该固定化酶用前储存在4℃。
然后，分别向FR901379物的水溶液（20mg/ml、HPLC纯度79.2%）1升（FR901379物10g,8.35mmol）中，加入缓冲液（0.2M磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液；pH6.0）1升和75g，40℃反应4小时，通过HPLC测得FR179642物的生产量。
表9不同pH对载体固定化游离酶的比较
  固定化pH   转化率X(%)
  3.5   8.6
  4.0   89.1
  6.0   96.2
  9.0   95.9
  9.5   61.5
实施例14
将echinocandin B的二甲基亚砜溶液（100mg/ml）100ml(棘白菌素B为10g；9.43mmol)，加入1.2M氯化钾、0.5M磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液500ml，pH7.0,然后加入固定化酶（ⅱ）25g,于50℃转化2小时，转化率85.6%。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

Claims (22)

1.一种固定化环脂肽酰基转移酶。
2.如权利要求1所述的固定化环脂肽酰基转移酶，其特征在于，所述环脂肽酰基转移酶固定于载体上；所述载体材料为无机载体、或多孔亲水性酶载体。
3.如权利要求2所述的固定化环脂肽酰基转移酶，其特征在于，所述无机载体以总重量计，其中SiO2含量大于50wt%，Al2O3含量大于1wt%。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述多孔亲水性酶载体选自：以聚甲基丙烯酸酯为基体键合环氧化物、或者含氨基功能基团的酶载体。
5.如权利要求1所述的固定化环脂肽酰基转移酶，其特征在于，所述的固定化环脂肽酰基转移酶用于催化如式Ⅰ的化合物中的R1的酰基脱酰化，产生如式Ⅱ所示的化合物，
Figure FDA00001629632700011
Figure FDA00001629632700021
式中，R1为酰基，R2为羟基或酰氧基，R3为氢或羟基，R4为氢或羟基，R5为氢或羟基璜酰氧基，R6为氢或氨基甲酰基。
6.如权利要求5所述的固定化环脂肽酰基转移酶，其特征在于，所述式Ⅰ的化合物为式Ⅰa或式Ⅰb所示化合物或其药学上可接受的盐；
Figure FDA00001629632700022
7.一种如权利要求1-6任一所述的固定化环脂肽酰基转移酶的制备方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：
将含有游离的环脂肽酰基转移酶的溶液与载体混合，得到如权利要求1-6任一所述的固定化环脂肽酰基转移酶。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述环脂肽酰基转移酶来源于天然或人工突变体、或者变种及由通过导入外来的环状酰基转移酶基因后转化得到的。
9.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述含有游离的环脂肽酰基转移酶的溶液通过下述方式得到：菌株培养，得到含有游离的环脂肽酰基转移酶的溶液；或菌株培养后将得到的菌丝体进行破壁，得到含有游离的环脂肽酰基转移酶的溶液。
10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述菌株是放线菌属或链霉菌属的。
11.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述载体材料选自无机载体、或多孔亲水性酶载体。
12.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述游离的环脂肽酰基转移酶与载体的混合比例为每克载体需酶10-1000单位(u)；优选每克载体需酶20-600单位(u)。
13.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述含有游离的环脂肽酰基转移酶的溶液的pH值为4-9。
14.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述含有游离的环脂肽酰基转移酶的溶液和载体混合的温度为0-80℃；优选20－35℃。
15.如权利要求7－14任一所述的制备方法，其特征在于，将含有游离的环脂肽酰基转移酶的溶液与载体混合后，将游离的环脂肽酰基转移酶和结合于载体的环脂肽酰基转移酶分离，得到固定化环脂肽酰基转移酶。
16.一种如式Ⅱ所示的化合物的制备方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：
（a）将如式Ⅰ所示的化合物和缓冲溶液混合，得到溶液1；
（b）将溶液1和如权利要求1-6任一所述的固定化环脂肽酰基转移酶混合，进行脱酰化反应，得到如式Ⅱ所示的化合物；
Figure FDA00001629632700041
Figure FDA00001629632700051
式中，R1为酰基，R2为羟基或酰氧基，R3为氢或羟基，R4为氢或羟基，R5为氢或羟基璜酰氧基，R6为氢或氨基甲酰基。
17.如权利要求16所述的制备方法，其特征在于，所述固定化环脂肽酰基转移酶和式Ⅰ的化合物的比例在0.01-10u/g。
18.如权利要求16所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（a）中缓冲液的pH在4-9。
19.如权利要求16所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（a）中缓冲液选自下述溶液中的一种或一种以上：柠檬酸钠缓冲液、磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液和Tris-HCl缓冲液。
20.如权利要求16所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（b）中脱酰化反应的温度为20-70℃。
21.如权利要求16－20任一所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（b）中脱酰化反应后，将固定化环脂肽酰基转移酶与含产物的反应液分离，得到如式Ⅱ所示的化合物。
22.如权利要求21所述的制备方法，其特征在于，所述将固定化环脂肽酰基转移酶与含产物的反应液分离的方法包括过滤或离心。
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