CN103387277B

CN103387277B - 酸性电解水及其组合物

Info

Publication number: CN103387277B
Application number: CN201210157127.5A
Authority: CN
Inventors: 萧述文; 周德清; 陈世辉; 王惠民; 廖伟廷; 黄采菽; 邱建智; 潘建亮; 梁世欣; 陈炳宏
Original assignee: TAIYAN INDUSTRY Co Ltd
Current assignee: TAIYAN INDUSTRY Co Ltd; Taiwan Salt Co
Priority date: 2012-05-11
Filing date: 2012-05-11
Publication date: 2015-04-15
Anticipated expiration: 2032-05-11
Also published as: CN103387277A

Abstract

本发明公开一种酸性电解水及含有该酸性电解水的组合物，其是利用具有弱酸性、低电导度以及高氧化电位的酸性电解水，确实具有抑菌、抗发炎、抗氧化、促进伤口愈合等效果，但不具细胞毒性又不引起过敏，且经证实又可抑制皮肤黑色素癌细胞的增生与移行，故可安全应用于皮肤表面消毒的化妆品组合物、医药组合物或其它组合物中。

Description

酸性电解水及其组合物

技术领域

本发明是有关于一种电解水及其组合物，特别是有关于一种具有抑菌、抗发炎、抗氧化、促进伤口愈合、抑制癌细胞但不具细胞毒性又不引起过敏的酸性电解水及其组合物。

背景技术

随着消费者健康意识逐渐抬头，为避免因化学成分的化妆保养品伤害皮肤，因此化妆保养品的成分受到越来越严格的检视。

酸性电解水是藉由电解槽将食盐水或稀盐酸加以电解，于阳极产生无色高浓度氢离子的酸性电解水。酸性电解水对环境无害，量产容易，故可广泛应用。举例而言，目前已知pH值小于2.5的超酸性电解水具有杀菌功能，在日本有医疗机构以超酸性电解水作为消毒伤口以及杀菌用。其次，在农业上也有以超酸性电解水替代农药杀菌后，再以碱性水改善土壤pH值。另外，日本厂商亦发展出以酸性电解水清洗晶片表面的残余金属离子，以减少化学药剂的使用量。

以杀菌用途而言，已知技术必须使用pH值小于2.5的超酸性电解水，始具有杀菌功能。惟具有杀菌功能的超酸性电解水若直接使用于皮肤，则会因pH值过酸而有伤害皮肤细胞的疑虑。倘若超酸性电解水经稀释调整至弱酸性，则其杀菌效果不彰。

发明内容

本发明的目的在于提供一种酸性电解水(Acidic Electrolyzed Water)，以克服已知酸性电解水的上述疑虑，进而开发其于化妆品组合物进一步的应用面。

因此，本发明的一个方面是在于提供一种酸性电解水，其是利用具有弱酸性、低电导度以及高氧化电位的酸性电解水，其具有抑菌、抗发炎、抗氧化、促进伤口愈合、抑制癌细胞等效果，但不具细胞毒性又不引起过敏。

本发明的另一方面则是在于提供一种用于皮肤表面消毒的组合物，其包含上述酸性电解水为皮肤表面消毒的有效成分，可安全应用于皮肤表面消毒的化妆品组合物、医药组合物或其它组合物中。

根据本发明的上述方面，提出一种酸性电解水。在一实施方式中，此酸性电解水的特征在于其具有pH3.0至4.8的酸碱值、150微秒/公分(μs/cm)至300μs/cm的电导度以及350毫伏特(mV)至450mV的氧化电位，且此酸性电解水是用以抑制绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、痤疮杆菌以及大肠杆菌的生长，但不具细胞毒性且不引起过敏。

根据本发明的另一方面，提出一种用于皮肤表面消毒的组合物，其包含1重量百分比至30重量百分比的上述的酸性电解水为皮肤表面消毒的有效成分，以抑制绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、痤疮杆菌以及大肠杆菌的生长但不具细胞毒性，且此组合物具有抗发炎效果、抗氧化效果、促进小鼠纤维母细胞的增生及抑制人类皮肤黑色素癌细胞的增生与移行。

应用本发明的酸性电解水及其化妆品组合物，其是利用具有弱酸性、低电导度以及高氧化电位的酸性电解水，确实具有抑菌、抗发炎、抗氧化、促进伤口愈合等效果，但不具细胞毒性又不引起过敏，且经证实又可抑制皮肤黑色素癌细胞的增生与移行，故可安全应用于皮肤表面消毒的化妆品组合物、医药组合物、或其它组合物中。

附图说明

为让本发明的上述和其它目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附附图的说明如下：

图1是绘示根据本发明一实施方式的酸性电解水的制造流程示意图；

图2是显示根据本发明实施例一的酸性电解水的液相层析质谱(LCMS)分析图谱；

图3A至图3L是显示根据本发明数个实施例的细胞毒性测试的细胞生长情形；

图4A至图4E是显示根据本发明数个实施例的细胞移行测试的细胞生长情形；

图5是显示根据本发明一实施例的体外抑菌试验结果；

图6A至图6B是绘示根据本发明一实施例的利用生理食盐水(控制组)或不同浓度的实施例一的酸性电解水处理PBMCs后的TNF-α(图6A)与IL-4(图6B)的浓度变化；

图6C至图6F是绘示根据本发明一实施例的利用生理食盐水(控制组)或不同浓度的实施例一的酸性电解水分别处理四种T细胞的细胞激素的变化；

图7A至图7B是绘示根据本发明一实施例的PBMCs经LPS刺激再利用实施例一的酸性电解水(斜线长条)分别处理PBMCs或未处理PBMCs(空白长条)后，其TNF-α、IL-4(图6A)、IFN-γ、IL-13、TGF-β以及IL-17A(图6B)的浓度变化；

图8是绘示根据本发明实施例一的酸性电解水对于RBL-2H3细胞的无致敏现象长条图；

图9A与图9B是显示根据本发明实施例一的酸性电解水对于抑制A375.S2细胞的增生(图9A)与移行(图9B)的结果；

其中，主要元件符号说明：

101：海水引入池 103：砂滤床

105：离子交换膜电透析机 107：蒸发结晶器

109：原水槽 113：过滤器

115：逆渗透净水机 117：混合槽

119：电解机 123：酸性电解水。

具体实施方式

承前所述，本发明提供一种酸性电解水及其化妆品组合物，其是利用具有弱酸性、低电导度以及高氧化电位的酸性电解水，抑制皮肤表面的绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、痤疮杆菌以及大肠杆菌的生长但不具细胞毒性。

申言之，本发明所称的“酸性电解水”，是指藉由离子交换膜电透析制盐法利用海水制盐的过程中，于阳极产生高浓度氢离子的酸性电解水。请参阅图1，其是绘示根据本发明一实施方式的酸性电解水的制造流程示意图。首先，将海水导入海水引入池101，并利用砂滤床103初步过滤海水。经过初步过滤后的海水导入离子交换膜电透析机105及蒸发结晶器107中，进行离子交换，以分离出原料水、结晶盐及苦卤，其中原料水输送至原水槽109。上述原料水利用过滤器113过滤后，再导入逆渗透净水机115中进行净水，以制得洁净的纯水。

然后，在混合槽117中加入纯水。之后，将前述纯水导入已知电解机119中，并设定电解机119的电流强度后进行强迫电解，以于阳极产生高浓度氢离子的酸性电解水123，而获得的酸性电解水123可进行其它应用以及功能评估。

进而言之，此酸性电解水为弱酸性，其酸碱值为pH3.0至pH 4.8，因此不刺激皮肤。其次，此酸性电解水具有150μs/cm至300μs/cm的电导度以及350毫伏特(mV)至450mV的氧化电位，经进一步分析后，可有效抑制皮肤表面的绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、痤疮杆菌以及大肠杆菌的生长又不具细胞毒性。

在一例示中，上述酸性电解水可具有pH3.1至4.5的酸碱值、170μs/cm至250μs/cm的电导度以及350mV至450mV的氧化电位。在另一例示中，上述酸性电解水亦可具有pH3.3至4.2的酸碱值、190μs/cm至210μs/cm的电导度以及390mV至420mV的氧化电位。

值得一提的是，已知所得的超酸性电解水的酸碱度需达pH2.5才具有抑菌能力，本发明的酸性电解水具有弱酸性(pH3.0至pH 4.8)、低电导度以及高氧化电位，有效抑制皮肤表面的绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、痤疮杆菌以及大肠杆菌的生长但不具细胞毒性，且经证实同时具有抗发炎、抗氧化、促进伤口愈合等效果、但不具细胞毒性又不引起过敏，且经证实又可抑制皮肤黑色素癌细胞的增生与移行，故可安全应用于皮肤表面消毒的化妆品组合物、医药组合物或其它组合物中。

在一例示中，本发明的用于皮肤表面消毒的组合物，其包含5重量百分比至20重量百分比的上述的酸性电解水为皮肤表面消毒的有效成分。

以下利用实施例以说明本发明的应用，然其并非用以限定本发明，本发明技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰。

实施例一：制备酸性电解水

此实施例是藉由离子交换膜电透析制盐法制盐的过程中，于阳极产生高浓度氢离子的酸性电解水。申言之，请参阅图1，其是绘示根据本发明一实施例的酸性电解水的制造流程示意图。首先，将海水导入海水引入池101，并利用砂滤床103初步过滤海水。经过初步过滤后的海水导入离子交换膜电透析机105及蒸发结晶器107中，进行离子交换，以分离出原料水、结晶盐及苦卤，其中原料水输送至原水槽109，苦卤则存放在储卤槽111中。上述原料水利用过滤器113过滤后，再导入逆渗透净水机115中进行净水，以制得洁净的纯水。

然后，在混合槽117中加入纯水。之后，将纯水导入电解机119(例如OSGMelta Super Alkalizer，型号NDX-3000，OSG，Japan)中，并控制电解机119的电流强度进行强迫电解，以于阳极获得酸性电解离子水。

上述所得的酸性电解水的酸碱度、电导度以及氧化电位可利用任何市售的仪器，例如酸碱度计(例如NeoMet pH/mV/ORP/Temp Meter，型号pH-220L，istek，Inc.，Korea)以及电导度计(例如Conductivity Meter，型号430C，istek，Inc.，Korea)或其它具有相同功能的仪器进行，惟上述数值的测量为本发明所属技术领域中任何具有通常知识者所熟知，不另赘述。上述酸性电解水测得的pH3.35，电导度为199.6±2.1μs。

实施例二：评估酸性电解水的组成

此实施例是将实施例一的酸性电解水进一步利用市售串联三段四极质谱仪(triple quadrupole mass spectrometry；MS/MS)，例如Finnigan TSQ QuantumUltra串联三段四极质谱仪(Thermo Fisher Scientific Inc.，San Jose，CA，USA)，分析其组成。简言之，首先，利用针筒将酸性电解水以1μL/min的流速注入质谱仪的NanoSpray离子源内，选择正离子模式(positive mode)，利用1800V的电洒游离电压(spray voltage)进行离子化，然后以扫描范围为20至135的质荷比(mass-to-charge ratio；m/z)进行质谱分析。

另外，利用感应耦合等离子体质谱分析仪(induced couple plasma massspectrometry；ICP-MS)分析实施例一的酸性电解水中是否含有例如铬离子(Cr⁶⁺)、汞离子(Hg²⁺)、镉(Cd)、铅(Pt)以及砷(As)等重金属；以及甲基汞[methylmercury；Hg(CH3)⁺]以及二甲基次胂酸[dimethyl arsine hydroxide；As(CH₃)₂(HO)]等有机金属；以及其它金属元素例如镁离子(Mg²⁺)、钙离子(Ca²⁺)、钠离子(Na²⁺)、钾离子(K⁺)等。

请参阅图2，其是显示根据本发明实施例一的酸性电解水的液相层析质谱(liquid chromatography mass spectrometry；LCMS)分析图谱，其中横轴为质荷比(m/z)，纵轴为相对吸收率(％)。

由图2的LCMS分析图谱可观察到，实施例一的酸性电解水含有钾离子(K⁺；m/z＝39)、与质子水合的氯化钾(KCl+H⁺；m/z＝75)等矿物质，但不含重金属。其次，实施例一的酸性电解水更含有抑制发炎因子，例如镁离子、锌离子；镁离子与一个氯离子耦合(Mg³⁵Cl⁺；m/z＝59)或与一个氯离子同位素(³⁷Cl)耦合(Mg³⁷Cl⁺；m/z＝61)；与一个质子水合的二氯化镁(Mg³⁵Cl₂+H⁺；m/z＝95)、与一个质子水合的氯(³⁵Cl)及氯同位素(³⁷Cl)化镁(Mg³⁵Cl³⁷Cl+H⁺；m/z＝97)，以及与一个质子水合的二氯同位素(³⁷Cl)化镁(Mg³⁷Cl₂+H⁺；m/z＝99)。由于自然界中，氯同位素(Cl³⁷)大约占25％，因此二氯同位素(³⁷Cl)化镁(Mg³⁷Cl₂+H⁺；m/z＝99)的含量较少。再者，金属离子与水分子水合亦可构成水合微胞(hydrated micelles)，例如二氯化镁与一个质子并与一或二个水分子水合[(Mg³⁵Cl₂+H₂O+H⁺；m/z＝113)以及(Mg³⁵Cl₂+2H₂O+H⁺；m/z＝131)]。另外，酸性电解水更含有其它金属离子，例如锌离子与一个氯离子耦合(Zn³⁵Cl₂ ⁺；m/z＝100)，钙离子与羟基耦合(CaOH⁺；m/z＝57)。上述结果证实，实施例一的酸性电解水的含镁离子可能提供抗发炎效果，至于含锌离子则可能提供抗菌效果。

实施例三：评估酸性电解水的细胞安全性

此实施例利用与实施例一的酸性电解水酸碱值相近的弱酸性溶液，测定细胞毒性。

首先，将纤维母细胞株(小鼠皮肤纤维母细胞株；BCRC 60008)利用无菌技术培养于细胞培养液中，其中细胞培养液为杜贝可改良的伊格氏培养液(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，DMEM；Cat.No.12800-017，Invitrogen Ltd.)并另添加10体积百分比的胎牛血清(fetal bovine serum，FBA；Cat.No.12003C，SAFC Biosciences Inc.)以及1体积百分比的抗生素(含有盘尼西林、链霉素与抗霉菌剂，penicillin-streptomycin-fungizone；HyClonePen/Strep/Fungizon，Cat.No.SV30079.01 Thermo Fisher Scientific Inc.)。

上述细胞系培养于96孔细胞培养盘中，细胞密度为5×10⁶细胞/孔，然后在37℃保持湿度的5％二氧化碳浓度下培养至少24小时。之后，将10体积百分比至30体积百分比的实施例一的酸性电解水、pH4.10的果酸溶液以及pH4.10的稀盐酸水溶液)或等体积的磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered saline；PBS)，添加于上述细胞中，其中PBS是作为对照组。培养18小时后，观察细胞的细胞生长情形并计算细胞存活率，其结果如图3A至图3L与表1所示。

表1

请参阅图3A至图3L，其是显示根据本发明数个实施例的细胞毒性测试的细胞生长情形。其中，图3A、图3E与图3I分别为对照组的细胞生长情形。图3B、图3F与图3J分别为添加10体积百分比、20体积百分比与30体积百分比实施例一的酸性电解水的细胞生长情形。图3C、图3G与图3K分别为添加10体积百分比、20体积百分比与30体积百分比的果酸溶液的细胞生长情形。图3D、图3H与图3L分别为添加10体积百分比、20体积百分比与30体积百分比的稀盐酸水溶液的细胞生长情形。至于表1的细胞存活率则是以对照组的细胞存活率为100％进行分析。

由图3B、图3F与图3J与第1表的结果可知，相较于对照组的细胞，实施例一的酸性电解水经培养18小时后的细胞存活率可超过150％，远超过对照组的细胞存活率，代表实施例一的酸性电解水可以促进小鼠皮肤纤维母细胞株的增生，确实达到本发明的目的。

然而，酸碱值与酸性电解水相近的果酸溶液在添加至DMEM时，不仅瞬间使培养基变为黄色，经18小时培养后，反而造成小鼠皮肤纤维母细胞株的死亡，而且添加的浓度越高，细胞死亡情形越严重，如图3C、图3G与图3K与表1的结果所示。

至于酸碱值与酸性电解水相近的稀盐酸水溶液经18小时培养后，10体积百分比至20体积百分比的稀盐酸水溶液尚未明显造成小鼠皮肤纤维母细胞株的死亡，其细胞存活率仍可维持90百分比以上。但添加30体积百分比的稀盐酸水溶液仍会造成小鼠皮肤纤维母细胞株的死亡，如图3D、图3H与图3L与表1的结果所示。

实施例四：评估酸性电解水的抗氧化效果

此实施例利用实施例一的酸性电解水，于吩嗪硫酸甲酯-烟碱酰胺腺嘌呤二核苷酸(phenazine methosulfate-β-nicotinamide adenine dinucleotide；PMS-NADH)***中，测定清除超氧化物阴离子自由基(superoxide anion freeradical；以下简称超氧化物)的效果。

首先，以0.1M磷酸缓冲液(phosphate buffer，pH 7.4)配制240μM的PMS溶液、1872μM的NADH溶液以及600μM的硝基蓝四氮唑(nitroblue-tetrazolium；NBT)溶液。接着，将2体积百分比至20体积百分比的实施例一的酸性电解水(实验组)或0.5mg/mL的没食子酸(作为阳性对照组)，与等体积的PMS溶液、NADH溶液以及NBT溶液混合均匀后，会进行下式(I)至式(III)的反应，以产生超氧化物阴离子自由基(O₂·^-)，进而使NBT由黄色转为蓝色的唑二甲(diformazan)：

NADH+PMS→NAD⁺+PMSH (I)

PMSH+2O₂→2O₂·^-+2H⁺+PMS (II)

NBT(黄)+2Cl^-+4O₂·^-+4H⁺→diformazan(蓝)+4O₂+4HCl (III)

在室温下静置5分钟后，随即以分光光度计测量于560nm(唑二甲)的吸光值。其中，于560nm测得的吸光值愈低，代表酸性电解水清除超氧化物阴离子自由基的能力(或抗氧化能力)愈强，其测试结果如表2所示。

请参阅表2，其是显示根据本发明一实施例的利用PMS-NADH-NBT***检测酸性电解水的结果。由表2的结果可知，相较于阳性对照组，实施例一的酸性电解水呈现显著的阴离子自由基清除率，代表实施例一的酸性电解水具有良好的抗氧化能力，确实达到本发明的目的。

表2

实施例五：评估酸性电解水促进伤口愈合效果

此实施例利用实施例一的酸性电解水测定纤维母细胞的移行能力，由于纤维母细胞的移行能力与伤口愈合的效果有关，藉此评估酸性电解水对于伤口愈合的效果。

首先，将纤维母细胞株(小鼠皮肤纤维母细胞株；BCRC 60008)利用无菌技术培养于细胞培养液中，其中细胞培养液是同前所述，此处不再赘言。上述细胞系培养于6孔细胞培养盘中，细胞密度为1×10⁷细胞/孔，然后在37℃保持湿度的5％二氧化碳浓度下，培养至少24小时。之后，将5体积百分比的实施例一的酸性电解水或5体积百分比的逆渗透水，添加于上述细胞中，其中逆渗透水是作为对照组。培养48小时至72小时后，观察细胞的细胞移行情形，其结果如图4A至图4E所示。

请参阅图4A至图4E，其是显示根据本发明数个实施例的细胞移行测试的细胞生长情形。其中，图4A为细胞移行测试开始的细胞生长情形。图4B与图4D分别为添加5体积百分比的逆渗透水经培养48小时或72小时的细胞生长情形。图4C与图4E分别为添加5体积百分比的实施例一的酸性电解水经培养48小时或72小时的细胞生长情形。

由图4C与图4E的结果可知，相较于对照组的细胞(图4B与图4D)，实施例一的酸性电解水经培养48小时或72小时后的细胞移行能力略优于对照组，代表实施例一的酸性电解水可以促进伤口愈合，确实达到本发明的目的。实施例六：评估酸性电解水的抑菌效果

1.体外抑菌试验(I)

首先，将待测菌株例如绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa；ATCC 9027)以及金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus；ATCC 6538)，分别培养于改良型李氏培养液(modified Letheen broth；例如BD DifcoTM MLB MLB，Catalog No.263010，Becton，Dickinson and Company)平板琼脂培养基上，于35℃培养48小时后，计算菌落数。痤疮杆菌(Propionibacterium acne；ATCC 6919)则培养于强化梭状芽孢菌培养液(Reinforced Clostridial Medium；例如Oxoid CM149)平板琼脂培养基，于37℃厌氧条件下培养72小时后，计算菌落数。其结果如表3所示。

请参阅表3，其是显示根据本发明一实施例的检测酸性电解水的抑菌效果。由表3的结果可知，实施例一所得的酸性电解水可有效抑制绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌以及痤疮杆菌的生长，确实可达到本发明的目的。

表3

注：多至无法计数(too numerous to count；TNTC)

2.体外抑菌试验(II)

另外，利用无菌生理食盐水(normal saline)将待测菌株例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus；ATCC 29213)以及大肠杆菌(Escherichia coli；ATCC35210)的菌液适当稀释至McFarland 0.5的标准浓度(1.5×10⁸CFU/mL)。接着，将每1mL的细菌悬浮液以9000rpm的转速离心3分钟后，移除上清液，并利用0.95mL的酸性水(实验组)或生理食盐水(控制组)分别处理细菌达30秒、60秒、180秒、300秒或900秒，再离心2分钟，利用无菌生理食盐水润洗一次后，悬浮于无菌生理食盐水中。每组细菌悬浮液稀释10⁴倍，分别取10μL培养于血液琼脂平板(blood agar plate，Columbia agar with 5％sheep blood；Becton，Dickinson and Company，Sparks，MD，US)上，于35℃培养24小时后，计算菌落数，其结果如表4以及图5所示。

表4

请参阅表4以及图5，其是显示根据本发明一实施例的体外抑菌试验结果，其中图5的横轴代表待测菌株于实施例一的酸性电解水的暴露时间(秒)，而图5的纵轴为细菌生长率(％)。

由表4以及图5的结果可知，金黄色葡萄球菌以及大肠杆菌分别暴露于实施例一的酸性电解水5秒或15分钟，可有效抑制89％的金黄色葡萄球菌(图5图号■)或52％的大肠杆菌(图5图号●)的生长，确实可达到本发明的目的。

3.皮肤涂抹试验

此实施例利用实施例一的酸性电解水清洗一侧脸部皮肤作为实验组，利用逆渗透(RO)水清洗另一侧脸部皮肤作为对照组。清洗完毕后，利用棉花棒分别涂抹两侧皮肤采样后，将采样后的棉花棒置于ATP冷光仪(ATP luminometer，3M)测量相对吸光值，其结果如表5所示。

表5

由表5的结果可知，实施例一的酸性电解水可有效降低皮肤表面的菌数，确实可达到本发明的目的。

实施例七：评估酸性电解水的抗发炎效果

此实施例是利用人类周边血液单核球细胞(peripheral blood mononuclearcells；PBMCs)，评估酸性电解水的抗发炎效果。

利用肝素处理捐赠成人(25至40岁)的静脉血(h)，移去血浆后，将白血球层细胞(buffy coat)利用淋巴细胞分离液(Ficoll-Hypaque cushion，比重为1.077g/mL；Sigma-Aldrich Co.，MO，USA)形成清晰界面后，置于水平式离心机上，以300倍重力加速度(×g)的转速离心20分钟，以形成分层。接着，吸取PBMCs层，用RPMI-1640培养液(Sigma-Aldrich Co.，MO，USA)调整细胞浓度至1.0×106cells/mL。然后，将含有氯化镓(GaCl₃)的PBS溶液加入PBMCs中进行细胞培养，其氯化镓的最终浓度分别为0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL或1000μg/mL。

请参阅图6A至图6B，其是绘示根据本发明一实施例的利用生理食盐水(控制组)、5体积百分比、10体积百分比或20体积百分比的实施例一的酸性电解水处理PBMCs后的TNF-α(图6A)与IL-4(图6B)的浓度(pg/mL)变化。

由图6A至图6B的结果可知，在未经脂多醣(lipopolysaccharide；LPS)刺激下，相较于控制组处理的PBMCs，利用上述浓度的实施例一的酸性电解水处理的PBMCs，并不会引起PBMCs活化而使细胞激素(例如TNF-α、IL-4)的浓度产生显著变化。

类似的结果请参阅图6C至图6F，其是绘示根据本发明一实施例的利用生理食盐水(控制组)、5体积百分比、10体积百分比或20体积百分比的实施例一的酸性电解水，分别处理四种T细胞的细胞激素的变化。其中，图6C是显示第1型辅助型T细胞(T helper 1cell；Th1)的IFN-γ浓度(pg/mL)变化，图6D是显示Th2细胞的IL-13浓度(pg/mL)变化，图6E是显示调节型T细胞(regulatory T cells；Treg)的TGF-β浓度(pg/mL)变化，而图6F则显示Th17细胞的IL-17A浓度(pg/mL)变化。

由图6C至图6F的结果可知，在未经LPS刺激下，相较于控制组处理的Th1细胞、Th2细胞、Treg细胞以及Th17细胞，利用上述浓度的实施例一的酸性电解水处理上述四种T细胞，亦不会引起上述T细胞活化而使细胞激素(例如TNF-α、IL-4、IFN-γ、IL-13、TGF-β以及IL-17A)的浓度产生显著变化。

然而，上述细胞经革兰氏阴性细菌的内毒素(endotoxin)(例如LPS)的处理后，会引起剧烈的免疫反应，使上述T细胞的各种细胞激素浓度产生显著的变化。请参阅图7A至图7B，其是绘示根据本发明一实施例的PBMCs，经LPS(0.2μg/mL)刺激后，再利用20体积百分比的实施例一的酸性电解水(斜线长条)分别处理PBMCs或未处理PBMCs(空白长条)后，其TNF-α、IL-4(图7A)、IFN-γ、IL-13、TGF-β以及IL-17A(图7B)的浓度(pg/mL)变化。

由图7A至图7B的结果可知，上述PBMCs在经脂多醣(lipopolysaccharide；LPS)刺激下，再利用20体积百分比的实施例一的酸性电解水处理上述培养的PBMCs，可显著降低PBMCs的细胞激素如TNF-α(即单核球/巨噬细胞的活化记号)、IL-4(图7A)、IFN-γ、IL-13以及IL-17A(图7B)浓度的变化，代表酸性电解水确实可有效抑制发炎反应相关的单核球(monocytes)/巨噬细胞(macrophages)的活化。其次，在LPS刺激下，利用20体积百分比的实施例一的酸性电解水处理上述培养的PBMCs，亦有助于降低细胞激素IFN-γ(即Th1细胞的活化记号)以及IL-13(即Th2细胞的活化记号)的浓度，进而抑制Th1细胞与Th2细胞的活化。此外，在LPS刺激下，利用20体积百分比的实施例一的酸性电解水处理上述培养的PBMCs，更可明显降低LPS引起的IL-17A(即Th17细胞的活化记号)的释放，不过，TGF-β(即Treg细胞的活化记号)并未出现显著变化。

综上所述，在未经LPS刺激下，利用实施例一的酸性电解水处理上述PBMCs，并不会引起PBMCs的活化而使细胞激素的浓度产生显著变化。然而，在LPS刺激下，由TNF-α(即单核球/巨噬细胞的活化记号)的浓度减少可以得知，利用实施例一的酸性电解水处理上述PBMCs后，确实可有效抑制发炎反应相关的免疫细胞的活化。其次，由IL-13(即Th2细胞的活化记号)的浓度减少可以得知，利用实施例一的酸性电解水处理上述PBMCs后，亦可有助于抑制某些过敏反应相关的免疫细胞的活化。

实施例八：评估酸性电解水的无致敏现象

此实施例是利用肥大细胞(mast cells)进一步评估实施例一的酸性电解水是否会引起过敏反应。

肥大细胞可分泌多种发炎介质(inflammatory mediators)，例如肥大细胞的颗粒含有β-氨基己糖酶(β-hexosaminidase)。当肥大细胞例如经由与FcεRIs交互作用而在免疫方面被活化时，通常会通过胞吐作用(exocytosis)释放出β-氨基己糖酶。经由抗原的交叉结合(cross-linking)引起的刺激，可活化肥大细胞或嗜碱性球(basophils)，且使这两类细胞产生去颗粒化(de-granulation)而释放出β-氨基己糖酶。藉由侦测β-氨基己糖酶的浓度变化，可应用于评估天然物或合成物的致敏现象。鉴于大鼠嗜碱性白血病细胞(rat basophilic leukemia cells；RBL-2H3细胞)可模拟粘膜型肥大细胞的多种功能，因此本实施例利用此细胞模式，评估实施例一的酸性电解水是否引起过敏反应。

关于抗原引起RBL-2H3细胞的去颗粒化的评估方式可参考先前技术常用的β-氨基己糖酶活性检测(β-hexosaminidase activity assay)。简言之，首先，将RBL-2H3细胞(ATCC CRL-2256)植入面积75cm²的培养皿且含有杜贝可改良式伊格尔氏培养液[Dulbecco′s Modified Eagle Medium；DMEM；Gibco，GrandIsland，NY，USA，其中添加10体积百分比的胎牛血清(fetal bovine serum；FBS)，并添加100U/mL的青霉素(penicillin)与100g/mL的链霉素(streptomycin)]中，置于5％CO₂的37℃恒温培养箱培养，每隔4天以1∶2的比例进行细胞继代。进行实验的当天，细胞系预先清洗并更换新鲜的培养液。

然后，将RBL-2H3细胞(1×10⁵cells/well)植入96孔微量盘中，于37℃培养4小时至6小时，使细胞完全贴附到培养盘上。接着，将不同最终浓度(0体积百分比至20体积百分比)的实施例一的酸性电解水加入细胞培养液中，于37℃培养24小时，其中控制组细胞未经酸性电解水处理。

之后，于96孔微量盘中加入小鼠抗二硝酚(dinitrophenol；DNP)的IgE(mouse anti-DNP IgE；mIgE-DNP)单株抗体，于37℃致敏化(sensitization)16小时，控制组细胞则未经IgE致敏化。之后，利用预热的泰氏缓冲溶液(Tyrode’sbuffer；含有135mM NaCl、5mM KCl、1.8mM CaCl₂、1.0mM MgCl₂、5.6mMglucose、20mM HEPES以及1mg/ml BSA；pH7.4)，清洗96孔微量盘内经IgE致敏化的RBL-2H3细胞两次后，再加入交叉结合的抗原，例如利用泰氏缓冲溶液稀释的二硝基酚共轭结合的牛血清白蛋白(dinitrophenol-bovine serumalbumin；DNP-BSA；1μg/ml)，于37℃反应1小时。随后，将96孔微量盘放在冰浴上15分钟以终止反应。

另外，阳性对照组的细胞(未经酸性电解水处理)则预先经10nM的醣皮质类固醇(dexamethasone；Dexa)处理后，才经IgE致敏化且与DNP-BSA抗原反应。

而后，控制组细胞I(未经酸性电解水处理、未经IgE致敏化且未与DNP-BSA抗原反应)的细胞不予溶解。控制组细胞II(未经酸性电解水处理但经IgE致敏化且与DNP-BSA抗原反应)的细胞，样本组细胞(经酸性电解水处理、经IgE致敏化且与DNP-BSA抗原反应)，以及阳性对照组的细胞(以下简称Dexa组)则利用1％Triton X-100溶液溶解细胞。

之后，收取各组细胞上清液移至另一96孔微量盘，每孔加入等体积的1μMp-硝基苯基-N-乙酰-β-D-葡萄糖苷(p-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide；p-NAG；配制于0.1M柠檬酸盐缓冲溶液中，pH4.5)作为受质，于37℃反应1小时。然后，每孔加入150μL的中止溶液(0.1M Na₂/NaHCO₃，pH10.0)，利用市售的微量盘判读仪(microplate reader)测量每孔反应溶液于波长405nm的吸收值，并依下式(IV)计算RBL-2H3细胞的β-氨基己糖酶的抑制率(％)，其结果如图8所示：

其中，式(IV)的各变量的定义如表6所示：

表6

上述式(IV)所得的数值再经下式(V)换算后，即为β-氨基己糖酶的相对释放率(％)：

β-氨基己糖酶的相对释放率(％)＝1-β-氨基己糖酶的抑制率(％)(V)

请参阅图8，其是绘示根据本发明实施例一的酸性电解水对于RBL-2H3细胞的无致敏现象长条图，其中横轴代表实施例一的酸性电解水的浓度(体积百分比；％)，而纵轴为β-氨基己糖酶的相对释放率(％)。

由图8的结果可知，阳性对照组的细胞(即Dexa组)确实可以抑制经IgE致敏化的RBL-2H3细胞的β-氨基己糖酶的相对释放率，代表RBL-2H3细胞经IgE致敏化且经与DNP-BSA抗原反应后，确实引起过敏反应。然而，相较于控制组II的细胞，利用实施例一的酸性电解水处理的样本组并未增加β-氨基己糖酶的相对释放率，代表实施例一的酸性电解水并不会引起过敏。

实施例九：评估酸性电解水抗黑色素瘤增生及移行

目前尚无文献报导酸性电解水可用于对抗癌细胞。此实施例是利用人类黑色素瘤细胞株A375.S2细胞(ATCC CRL-1872)，进一步评估实施例一的酸性电解水对抗癌细胞的效果。

首先，将A375.S2细胞植入培养皿且含有DMEM[Gibco，Grand Island，NY，USA，其中添加10体积百分比的FBS，并添加100U/mL的青霉素、100g/mL的链霉素、0.03％的麸酰胺(glutamine)以及1mM的丙酮酸钠(sodium pyruvate)]中，置于5％CO₂的37℃恒温培养箱培养。

然后，将A375.S2细胞(1×10⁵cells/well)植入12孔微量盘中，于37℃培养4小时至6小时，使细胞完全贴附到培养盘上。接着，将不同最终浓度(0体积百分比至50体积百分比)的实施例一的酸性电解水加入或不加入(控制组)细胞培养液中，并以200μL微量吸管尖于培养盘上划出宽度约1mm空白刻痕，于37℃培养24小时后，计算A375.S2细胞于0小时及20小时的细胞相对存活率，并利用例如TScratch软件(网址：http://www.cse-lab.ethz.ch/index. php？&option＝com content&view＝article&id＝363)自动化分析A375.S2细胞于0小时及20小时的细胞移行，其结果分别如图9A与图9B所示。

请参阅图9A与图9B，其是显示根据本发明实施例一的酸性电解水对于抑制A375.S2细胞的增生(图9A)与移行(图9B)的细胞相对存活率(％)结果，其中横轴代表实施例一的酸性电解水的浓度(体积百分比；％)，纵轴代表A375.S2细胞于实施例一的酸性电解水的细胞相对存活率(％)。

由图9A的结果可以得知，随着实施例一的酸性电解水的浓度越高，确实越能有效抑制A375.S2细胞的增生。其次，由图9B的结果可以得知，随着实施例一的酸性电解水的浓度越高，确实越能有效抑制A375.S2细胞的移行。

上述实验例所得的数据均以平均值±平均标准误差(mean±standard errorof mean)表示，并利用司徒顿t检定(Student’s t-test)分析各组间差异显著性(p＜0.05)。

综言之，本发明利用具有弱酸性、低电导度以及高氧化电位的酸性电解水，确实具有抑菌、抗发炎、抗氧化、促进伤口愈合等效果，但不具细胞毒性又不引起过敏，且经证实又可抑制皮肤黑色素癌细胞的增生与移行。惟在此需补充的是，本发明虽以特定制程、特定分析方式、特定试验、特定反应条件、特定受试细胞、或特定设备等作为例示，说明本发明的酸性电解水，惟本发明所属技术领域中任何具有通常知识者可知，本发明并不限于此，在不脱离本发明的精神和范围内，本发明的酸性电解水亦可使用其它制程、其它分析方式、其它试验、其它反应条件、其它受试细胞或其它设备等进行。

其次，本发明的酸性电解水证实具有上述多重效果，因此可应用于化妆品组合物、医药组合物、食品组合物、清洁品组合物或其它组合物中。

由本发明上述实施例可知，本发明的酸性电解水及其化妆品组合物，其优点在于利用具有弱酸性、低电导度以及高氧化电位的酸性电解水，确实具有抑菌、抗发炎、抗氧化、促进伤口愈合等效果，但不具细胞毒性又不引起过敏，且经证实又可抑制皮肤黑色素癌细胞的增生与移行，故可安全应用于皮肤表面消毒的化妆品组合物、医药组合物或其它组合物中。

虽然本发明已以实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，在本发明所属技术领域中任何具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的权利要求书所界定的范围为准。

Claims

1.一种酸性电解水，其特征在于该酸性电解水具有pH3.0至4.8的酸碱值、150μs/cm至300μs/cm的电导度以及350mV至450mV的氧化电位，且该酸性电解水是用以抑制绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、痤疮杆菌以及大肠杆菌的生长但不具细胞毒性且不引起过敏。

2.根据权利要求1所述的酸性电解水，其中该酸性电解水具有pH 3.1至4.5的酸碱值、170μs/cm至250μs/cm的电导度以及350mV至450mV的氧化电位。

3.根据权利要求1所述的酸性电解水，其中该酸性电解水具有pH 3.3至4.2的酸碱值、190μs/cm至210μs/cm的电导度以及380mV至420mV的氧化电位。

4.根据权利要求1所述的酸性电解水，其中该酸性电解水是用以促进小鼠纤维母细胞的增生。

5.根据权利要求1所述的酸性电解水，其中该酸性电解水是具有抗发炎效果。

6.根据权利要求1所述的酸性电解水，其中该酸性电解水是用以抑制人类黑色素瘤细胞的增生与移行。

7.一种用于皮肤表面消毒的组合物，其包含1重量百分比至30重量百分比的如权利要求1至4中任一项所述的酸性电解水为皮肤表面消毒的有效成分，以抑制绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、痤疮杆菌以及大肠杆菌的生长但不具细胞毒性且不引起过敏，且该组合物具有抗发炎效果、促进纤维母细胞的增生及抑制皮肤黑色素癌细胞的增生与移行。

8.根据权利要求7所述的用于皮肤表面消毒的组合物，其中该酸性电解水为5重量百分比至20重量百分比。

9.根据权利要求7所述的用于皮肤表面消毒的组合物，其中该组合物为化妆品组合物、或医药组合物、或清洁品组合物。

10.根据权利要求7所述的用于皮肤表面消毒的组合物，其中该纤维母细胞为小鼠纤维母细胞，且该皮肤黑色素癌细胞为人类皮肤黑色素癌细胞。