CN103374055B - 从含有还原型谷胱甘肽的发酵抽提液中分离纯化还原型谷胱甘肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种从含有还原型谷胱甘肽的发酵抽提液中分离纯化还原型谷胱甘肽的方法,所述方法包括以下步骤:1)使所述发酵抽提液顺次经过阴离子交换树脂、非极性吸附剂处理后,得到含还原型谷胱甘肽的溶液;2)浓缩、结晶、干燥上述含还原型谷胱甘肽的溶液。使用本发明方法分离纯化后的还原型GSH的纯度可达98.5%以上(滴定法,折干),相关杂质符合欧洲药典的要求。
Description
技术领域
本发明涉及还原型谷胱甘肽(简称GSH)的分离纯化方法,具体地说涉及一种通过树脂法从含还原型GSH的发酵液中分离纯化还原型GSH的方法。
背景技术
GSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通过肽键缩合而成的三肽化合物,是一种用途广泛的活性短肽。GSH的分子量为307.33,熔点为189~193℃(分解),等电点为5.93,晶体呈无色透明细长棒状。它溶于水、液氨,不溶于醇、醚和丙酮。GSH固体较为稳定,其水溶液在空气中易被氧化。还原型结构式为
由于GSH是一种非常特殊的氨基酸衍生物,又是含有巯基的三肽,所以在生物体内有着重要的作用。(1)抗自由基,保护细胞。GSH可以作为谷胱甘肽过氧化物酶的底物,抑制脂质过氧化,保护细胞膜,恢复细胞功能。(2)解除外源性有毒物质(包括药物)的毒性。GSH能与进入机体的有毒化合物、重金属离子或致癌物质等相结合,并促其排出体外,起到中和解毒作用。(3)促进细胞合成蛋白质。GSH可保护细胞膜,使之免遭氧化性破坏,防止红细胞溶血及促进高铁血红蛋白的还原,对缺氧血症、恶心及肝脏疾病引起的不适具有缓解作用。(4)参与转甲基、转丙氨基反应,维持肝细胞正常功能。(5)参与胆红素代谢,促进胆酸代谢,减轻出血倾向。GSH对于放射线、放射性药物或由于抗肿瘤药物引起的白细胞减少等症状能起到保护作用。
GSH的纯化方法据文献报道,主要有铜盐法和阳离子树脂法。
采用铜盐法为主的提取工艺主要存在重金属污染以及采用有毒气体硫化氢的弊端,而电化学的方法还存在成本和应用上的难题。
中国专利申请200810233835.5、200610040606.3公开的方法是用阳离子交换树脂纯化GSH的方法,与本发明采用的阴离子树脂有很大差异,而且纯度不及本发明。
日本专利申请JP20032845公布了一种依次用吸附树脂和离子交换树脂去除还原型谷胱甘肽制备氧化型谷胱甘肽的方法,所公布的氧化型谷胱甘肽的分离方法为sp207树脂吸附——WA30离子交换树脂并以2%和5%醋酸梯度解吸——收集5%醋酸解吸的馏分浓缩后再用XAD-4树脂处理——浓缩至40%浓度后,2℃,6小时结晶得到氧化型固体。其制备的主要为氧化型的谷胱甘肽,收率约58%,未提及相关的纯度信息。
发明内容
鉴于现有技术的现状,本发明的目的是提供一种高效率低成本的从GSH发酵液中分离纯化GSH的方法,本发明方法操作简便、污染小、条件温和,便于工业化放大生产,采用本发明制备的GSH纯度高,符合欧洲药典的要求。
本发明所述的从含有还原型谷胱甘肽的发酵抽提液中分离纯化还原型谷胱甘肽的方法包括以下步骤:
1)使所述发酵抽提液顺次经过阴离子交换树脂、非极性吸附剂处理,得到含还原型谷胱甘肽的溶液;
2)浓缩、结晶、干燥上述含还原型谷胱甘肽的溶液。
本发明所述的发酵抽提液为微生物发酵结束后,通过常规方法得到的含有还原型GSH的抽提液。例如,按中国专利申请200710036925.1所述方法培养含还原型GSH的酵母,发酵结束后,采用常规的固液分离手段分离发酵液,例如经过酸性热水抽提或酸性菌液高压破壁后得到含有还原型GSH的发酵抽提液。优选地,可以浓缩抽提液得到含还原型GSH的浓缩液。
根据本发明的一个优选的实施方式,所述发酵抽提液中还原型谷胱甘肽的含量随发酵水平变化和加水量的不同而有所差异约在5~10mg/ml。
根据本发明的一个优选的实施方式,上述步骤1)中所述的阴离子交换树脂为强碱性阴离子交换树脂或弱碱性阴离子交换树脂,更优的为强碱性阴离子交换树脂。
或者,上述步骤1)中所述的阴离子交换树脂为大孔型阴离子交换树脂或凝胶型阴离子交换树脂,更优的为凝胶型阴离子交换树脂。
根据本发明的一个优选的实施方式,用阴离子交换树脂处理之前,将所述发酵抽提液的pH调节为3.0-5.0,优选3.5-4.0。
通常,经过阴离子交换树脂后,可用2-4倍,优选3倍树脂体积的去离子水洗树脂,再用0.05-0.2mol/L,优选0.1mol/L的酸解吸,流速为1-2BV/h。所述酸选自硫酸,甲酸或乙酸。
根据本发明的一个优选的实施方式,上述步骤1)中所述的极性吸附剂包括苯乙烯系吸附树脂、含卤素的苯乙烯系吸附树脂、活性炭和碳化树脂,优选为苯乙烯系吸附树脂、含卤素的苯乙烯系吸附树脂,更优选为含卤素的苯乙烯系吸附树脂。
根据本发明的一个优选的实施方式,用非极性吸附剂处理之前,将所述发酵抽提液的pH调节为1.0~4.0,优选2.5~3.0。
通常,经过非极性吸附树脂后,用2-4倍,优选3倍树脂体积的去离子水洗树脂,用0.5-5%,优选2%的有机溶剂水溶液解吸,流速为小于1BV/h。所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇或丙酮。
根据本发明的一个特别优选的实施方式,上述步骤2)的具体步骤如下:发酵抽提液经非极性吸附剂处理之后,得到含高纯度的还原型GSH解吸液,浓缩该解吸液,加入晶种,加入与水互溶的溶剂,如低级醇、丙酮等,或者与水互溶的溶剂-水混合物,搅拌结晶后过滤、干燥得到GSH晶体。
根据本发明的一个优选的实施方式,所述低级醇为甲醇、乙醇或异丙醇。根据本发明的另一个优选的实施方式,所述与水互溶的溶剂-水混合物中溶剂的浓度为20-80%(V/V),优选50%。
本发明方法操作简便、污染小、条件温和,便于工业化放大生产。使用本发明方法分离纯化后的还原型GSH的纯度可达98.5%以上(滴定法,折干),相关杂质符合欧洲药典的要求。
具体实施方式
以下是实施方式的HPLC的检测方法:
流动相:
A相:称取磷酸二氢钠6.8g,庚烷磺酸钠2.2g加水溶解,定容至1000ml,用磷酸调至pH3.0
B相:甲醇
A∶B=97∶3
色谱柱:C18色谱柱,4.6×250mm,5μm
色谱条件:流速1ml/min,柱温30℃,检测波长210nm
以下实施方式的滴定方法:
称取0.5g待测物和2.0g碘化钾溶于水后,用容量瓶定容至50ml,冰浴。加入10ml盐酸和20.0ml0.05mol/L的碘,在避光处放置15min。用0.1mol/L的硫代硫酸钠滴定,以1ml淀粉溶液作为指示剂。做空白对照计算消耗的碘量。每毫升0.05mol/L的碘相当于30.73mg的还原型谷胱甘肽。
在以下实施方式中,含还原型GSH发酵液的获得按中国专利200710036925.1所述方式进行,具体为:
取酵母菌SaccharomycescerevisiaeATCC7754湿菌体2kg置于7.5L的生物反应器中,再加2L自来水、160g葡萄糖(浓度4%)、24g大豆蛋白胨(浓度0.6%)、48g硫酸铵(浓度1.2%)和0.04g硫酸铜(浓度0.001%),组成4L发酵液,搅拌速度为300rpm,通气量为0.5vvm,温度控制在30℃培养28h,取样分析,结果得到3.2g/L的GSH发酵液。发酵液经固液分离得到菌体后,按湿菌体的量加0.5倍量(质量体积比)的去离子水,用硫酸调至pH2,加热至80℃~90℃维持20min,冷却后除去菌体得到含GSH的抽提液。
实施例1
取GSH抽提液2L,含GSH12.8g。将抽提液调至pH4.0用凝胶型强碱阴离子交换树脂FPA40纯化,用3倍树脂体积的去离子水洗树脂,再用0.1mol/L盐酸解吸,收集浓度高于1mg/ml的解吸液并浓缩至200ml。将该浓缩液调pH2.8上含卤素的非极性吸附树脂SP207,用3倍树脂体积的去离子水洗树脂,用2%的乙醇水溶液解吸,综合考虑收率和纯度的影响,收集还原型谷胱甘肽浓度:氧化型谷胱甘肽浓度的比值(R/O)大于20的解吸液并浓缩至30ml,在室温下搅拌加入少量晶种后再加入15ml乙醇,继续搅拌至母液浓度不再明显降低,停止搅拌后过滤、干燥晶体,得晶体6.1g,显微镜下观察为白色或半透明柱状晶体,总收率47.6%,用HPLC法(下同)测得固体的重量纯度99.62%(折干,下同),滴定含量99.66%(折干,下同),符合欧洲药典的要求。
实施例2
取GSH发酵液2L,含GSH12.1g。将抽提液调至pH4.0用凝胶型强碱阴离子交换树脂FPA40,用3倍树脂体积的去离子水洗树脂,再用0.1mol/L盐酸解吸,收集浓度高于1mg/ml的解吸液并浓缩至200ml。将该浓缩液调pH2.8上含卤素的非极性吸附树脂SP207,用3倍树脂体积的去离子水洗树脂,用2%的乙醇解吸,收集还原型谷胱甘肽浓度:氧化型谷胱甘肽浓度的比值大于20的解吸液并浓缩至30ml,在室温下搅拌加入少量晶种后再加入15ml乙醇,继续搅拌至母液浓度不再明显降低,停止搅拌后过滤、干燥晶体,得晶体5.9g,显微镜下观察为白色或半透明柱状晶体,总收率68.8%,固体的重量纯度99.23%,滴定含量>99.95%。
实施例3
取GSH抽提液2L,含GSH12.1g,含谷胱甘肽11.3g。调至pH4.0用大孔型强碱阴离子交换树脂IRA900纯化,用3倍树脂体积的去离子水洗树脂,再用0.1mol/L盐酸解吸,收集浓度高于1mg/ml的解吸液并浓缩至200ml。将该浓缩液调pH2.8用含卤素的非极性吸附树脂SP207纯化,用3倍树脂体积的去离子水洗树脂,用2%的乙醇解吸,收集R/O比值大于20的解吸液并浓缩至25ml,在室温下搅拌加入少量晶种后再加入12.5ml乙醇,继续搅拌至母液浓度不再明显降低,停止搅拌后过滤、干燥晶体,得晶体5.0g,总收率41.3%,固体的重量纯度99.53%,滴定含量99.53%,。
实施例4
取GSH抽提液2L,含GSH11.1g。调至pH4.0用凝胶型弱碱阴离子交换树脂IRA67纯化,用3倍树脂体积的去离子水洗树脂,再用0.1mol/L盐酸解吸,收集浓度高于1mg/ml的解吸液并浓缩至200ml。将该浓缩液调pH2.8用含卤素的非极性吸附树脂SP207纯化,用3倍树脂体积的去离子水洗树脂,用2%的乙醇解吸,收集R/O比值大于20的解吸液并浓缩至20ml,在室温下搅拌加入少量晶种后再加入10ml乙醇,继续搅拌至母液浓度不再明显降低,停止搅拌后过滤、干燥晶体,得晶体4.1g,总收率36.9%,固体的重量纯度99.56%,滴定含量99.55%。
实施例5
取GSH抽提液2L,含GSH12.6g。调至pH4.0用大孔型弱碱阴离子交换树脂D301纯化,用3倍树脂体积的去离子水洗树脂,再用0.1mol/L盐酸解吸,收集浓度高于1mg/ml的解吸液并浓缩至170ml。将该浓缩液调pH2.8用含卤素的非极性吸附树脂SP207纯化,用3倍树脂体积的去离子水洗树脂,用2%的乙醇解吸,收集R/O比值大于20的解吸液并浓缩至30ml,在室温下搅拌加入少量晶种后再加入15ml乙醇,继续搅拌至母液浓度不再明显降低,停止搅拌后过滤、干燥晶体,得晶体4.6g,总收率35.9%,固体的重量纯度98.55%,滴定含量99.84%。
实施例6
取GSH抽提液2L,含GSH12.6g。调至pH3.0用凝胶型强碱阴离子交换树脂FPA40纯化,用3倍树脂体积的去离子水洗树脂,再用0.1mol/L盐酸解吸,收集浓度高于1mg/ml的解吸液并浓缩至170ml。将该浓缩液调pH2.8用含卤素的非极性吸附树脂SP207纯化,用3倍树脂体积的去离子水洗树脂,用2%的乙醇解吸,收集R/O比值大于20的解吸液并浓缩至20ml,在室温下搅拌加入少量晶种后再加入10ml乙醇,继续搅拌至母液浓度不再明显降低,停止搅拌后过滤、干燥晶体,得晶体4.4g,总收率34.9%,固体的重量纯度98.91%,滴定含量99.81%。
实施例7
取GSH抽提液2L,含GSH12.9g。调至pH3.0用凝胶型强碱阴离子交换树脂FPA40纯化,用3倍树脂体积的去离子水洗树脂,再用4%醋酸解吸,收集浓度高于1mg/ml的解吸液并浓缩至170ml。将该浓缩液调pH2.8用含卤素的非极性吸附树脂SP207纯化,用3倍树脂体积的去离子水洗树脂,用2%的乙醇解吸,收集R/O比值大于20的解吸液并浓缩至20ml,在室温下搅拌加入少量晶种后再加入10ml乙醇,继续搅拌至母液浓度不再明显降低,停止搅拌后过滤、干燥晶体,得晶体4.6g,总收率35.7%,固体的重量纯度98.59%,滴定含量99.85%。
实施例8
取GSH抽提液2L,含GSH12.1g。调至pH3.0用凝胶型强碱阴离子交换树脂FPA40纯化,用3倍树脂体积的去离子水洗树脂,再用0.05mol/L硫酸解吸,收集浓度高于1mg/ml的解吸液并浓缩至170ml。将该浓缩液调pH2.8用含卤素的非极性吸附树脂SP207纯化,用3倍树脂体积的去离子水洗树脂,用2%的乙醇解吸,收集R/O比值大于20的解吸液并浓缩至20ml,在室温下搅拌加入少量晶种后再加10ml乙醇,继续搅拌至母液浓度不再明显降低,停止搅拌后过滤、干燥晶体,得晶体4.8g,总收率39.7%,固体的重量纯度98.50%,滴定含量99.55%。
实施例9
取GSH抽提液2L,含GSH12.6g。调至pH5.0用凝胶型强碱阴离子交换树脂FPA40纯化,用3倍树脂体积的去离子水洗树脂,再用0.1mol/L盐酸解吸,收集浓度高于1mg/ml的解吸液并浓缩至100ml。将该浓缩液调pH2.8用含卤素的非极性吸附树脂SP207纯化,用3倍树脂体积的去离子水洗树脂,用2%的乙醇解吸,收集R/O比值大于20的解吸液并浓缩至16ml,在室温下搅拌加入少量晶种后再加8ml乙醇,继续搅拌至母液浓度不再明显降低,停止搅拌后过滤、干燥晶体,得晶体3.8g,总收率30.2%,固体的重量纯度98.91%,滴定含量98.81%。。
实施例10
按照实施例1的方法获得阴离子交换树脂的解吸液并浓缩。将该浓缩液调pH4.0用含卤素的非极性吸附树脂SP207纯化,用3倍树脂体积的去离子水洗树脂,用2%的乙醇解吸,收集R/O比值大于20的解吸液并浓缩至8ml,在室温下搅拌加入少量晶种后再加入4ml乙醇,继续搅拌至母液浓度不再明显降低,停止搅拌后过滤、干燥晶体,得晶体1.8g,收率为18.7%,固体的重量纯度98.91%,滴定含量98.81%。。
实施例11
按照实施例1的方法获得阴离子交换树脂的解吸液并浓缩。将该浓缩液调pH2.8用BAC球状活性炭纯化,用3倍柱体积的去离子水洗活性炭,用50%的乙醇解吸,收集R/O比值大于20的解吸液并浓缩至12ml,在室温下搅拌加入少量晶种后再加入6ml乙醇,继续搅拌至母液浓度不再明显降低,停止搅拌后过滤、干燥晶体,得晶体4.1g,收率为48.4%,固体的重量纯度99.12%,滴定含量99.25%。
实施例12
按照实施例1的方法获得吸附树脂的解吸液,浓缩至15ml,在室温下搅拌加入少量晶种后再加入7.5ml异丙醇,继续搅拌至母液浓度不再明显降低,停止搅拌后过滤、干燥晶体,得晶体4.9g,收率为65.2%,固体的重量纯度99.73%,滴定含量99.78%。
实施例13
按照实施例1的方法获得吸附树脂的解吸液,并浓缩至15ml,在室温下搅拌加入少量晶种后再加入15ml50%异丙醇,继续搅拌至母液浓度不再明显降低,停止搅拌后过滤、干燥晶体,得晶体4.2g,收率为58.4%,固体的重量纯度98.81%,滴定含量99.34%。
实施例14
按照实施例1的方法获得吸附树脂的解吸液,浓缩至15ml,在室温下搅拌加入少量晶种后再加入15ml丙酮,继续搅拌至母液浓度不再明显降低,停止搅拌后过滤、干燥晶体,得晶体4.5g,收率为50.1%,固体的重量纯度98.07%,滴定含量98.55%。
Claims (1)
1.从含有还原型谷胱甘肽的发酵抽提液中分离纯化还原型谷胱甘肽的方法,所述方法包括以下步骤:
1)使所述发酵抽提液顺次经过阴离子交换树脂、非极性吸附剂处理,得到含还原型谷胱甘肽的溶液,所述的阴离子交换树脂为强碱性阴离子交换树脂FPA40、大孔型阴离子交换树脂IRA900或凝胶型阴离子交换树脂IRA67;
2)浓缩、结晶、干燥上述含还原型谷胱甘肽的溶液;
其中:
所述发酵抽提液中还原型谷胱甘肽的含量为5-10mg/ml;
用阴离子交换树脂处理之前,将所述发酵抽提液的pH调节为4.0;
经过阴离子交换树脂后,用3倍树脂体积的去离子水洗树脂,再用0.1mol/L的盐酸解吸;
所述非极性吸附剂选自非极性吸附树脂SP207或活性炭;
用非极性吸附剂处理之前,将所述发酵抽提液的pH调节为2.8;
经过非极性吸附树脂后,用3倍树脂体积的去离子水洗树脂,用2%的乙醇水溶液解吸,收集R/O比值大于20的解吸液;
步骤2)所述的结晶步骤包括加入晶种,再加入浓度为20-80%的乙醇或异丙醇并搅拌的步骤。
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