CN103364389A

CN103364389A - 快速检测和判断白蛋白制品分析方法

Info

Publication number: CN103364389A
Application number: CN2012100973670A
Authority: CN
Inventors: 杨永健; 毛丹卓; 翁欣欣; 王彦
Original assignee: Shanghai Food & Drug Testing Institute
Current assignee: Shanghai Food & Drug Testing Institute
Priority date: 2012-04-05
Filing date: 2012-04-05
Publication date: 2013-10-23

Abstract

本发明涉及一种白蛋白制品的无损快速检测方法，具体地涉及一种采用白蛋白的特征谱段来预测白蛋白浓度并进一步鉴别白蛋白制品的真假伪劣的分析方法。本发明还涉及执行该分析方法的分析装置和包括该分析装置的分析***。本发明的方法、装置和***采用激光拉曼光谱与偏最小二乘法相结合，预测白蛋白制品中白蛋白的含量，相对于其他定量技术具有操作简便、分析快速等特点。

Description

快速检测和判断白蛋白制品分析方法

技术领域

本发明涉及一种白蛋白制品的无损快速检测方法，特别地涉及一种采用白蛋白的特征谱段来预测白蛋白浓度并进一步鉴别白蛋白制品，特别是人血白蛋白制品的真假伪劣的分析方法。

背景技术

人血白蛋白溶液为澄清、略黏稠的液体，几乎无色，或黄色、棕黄色或绿色，源于人静脉血浆，经过一系列沉淀、离心、过滤、灭菌等步骤制备而成。该药一直有“生命制品”、“救命药”之称，主要用于治疗血容扩张不足引起的急性和重症监护病人，包括营养不良、烧伤、严重损伤、感染、大手术、出血、肾***过度、胰腺炎、妊娠中毒、新生儿高胆红素血症、肝硬化及肾病引起的水肿或腹水，癌症术后恢复等方面的治疗，是临床急救的一种特殊药品。其应用较为广泛，属于市场上的紧俏药品。人血白蛋白溶液的供应紧张情况在国内已持续了两年有余，如今更有愈演愈烈之势。因而有不法分子唯利是图，制售假劣人血白蛋白溶液，坑害广大患者，扰乱医药市场。

人血白蛋白溶液制假主要有两种情况：一、不含人血白蛋白；二、人血白蛋白的真实含量低于样品包装上所标示的含量。

出于基层打假经常性的大范围筛查样品的需求，需要有一些准确、快速、简便的方法。近几年来，在分析过程中不对样品造成化学的、机械的、光化学和热分解的分析手段，是分析科学领域的研究热点之一。随着化学计量学的发展，光谱法受到国内外广泛的重视：近红外光谱重叠严重，对很多药品的测定精度不够理想；红外光谱法对测试环境温湿度要求相当高，样品制作也较麻烦，检测周期较长，不能满足快速检验的要求；拉曼光谱技术具有化学分子的指纹辨识、快速、无需繁杂的样品前处理、无损检测、不受水分子干扰等优点，适用于假药的检测，可用于人血白蛋白的真假伪劣鉴别。目前各种人血白蛋白溶液质量标准均使用中国药典附录蛋白质测定法第一法，也就是传统的凯氏定氮法进行蛋白质含量测定，操作较繁琐耗时，在应用于快速检测时存在一些不足之处。有文献报导，采用拉曼光谱法对人血白蛋白溶液进行定性分析鉴别，但是至今没有对人血白蛋白进行含量测定的相关报导。采用拉曼光谱进行定量分析，需要消除测定中的不稳定性，一方面消除随机噪声、样品背景干扰、测样器件引起光谱差异等因素对校正结果产生的影响；另一方面是谱图信息的优化，对样品信息突出的光谱区域进行选择，筛选出最有效的光谱区域，提高运算效率。目前，还没有对人血白蛋白溶液的拉曼光谱定量分析的研究报道。

因此，如何在人力、试验场地、试验仪器等均有限的条件下，采用拉曼光谱仪，发展准确、易用的拉曼光谱信息处理方法，从而有效且准确地对人血白蛋白实现无损、低成本、简便、快速、易于普及推广的人血白蛋白快速检测，从而达到对人血白蛋白真伪假劣问题的及时发现和监控管理，已成为众多科研、药检人员关注的重点之一。

发明内容

为了解决本领域的上述问题，本发明提供了一种新颖的预测白蛋白浓度并进一步鉴别白蛋白制品的真假伪劣的方法，该方法对样品测得的拉曼光谱进行平滑滤波消除噪声干扰、二阶导数处理、定量回归分析，然后通过内部交叉验证法建立模型。

因此，在第一个方面，本发明提供了一种预测待测样品的白蛋白浓度的方法，该方法包括以下的步骤：

1)获取白蛋白标准品的拉曼光谱图：将n个系列浓度的白蛋白标准溶液作为定标样品，通过拉曼光谱仪获得所述n个定标样品的拉曼光谱图；

2)选取特征谱段：从步骤1)获得的n个定标样品的拉曼光谱图中选取与芳香族氨基酸苯环上C＝C对称伸缩振动相对应的拉曼峰范围作为特征谱段，所述特征谱段优选为960-1100cm^-1；

3)Savitsky-Golay(下面简称S-G)平滑处理：将从每个浓度的标准溶液的拉曼光谱图中所选取的上述特征谱段的数据进行多点(优选9～21点，更优选9～17点，最优选13～17点，可具体选择9点、13点、15点和17点，优选13点和17点，最优选17点)Savitsky-Golay平滑滤波消除噪声干扰；

4)二阶导数处理：对步骤3)获得的数据进行二阶导数处理；

5)偏最小二乘法定量(PLS)回归分析：将步骤4)获得的光谱数据中n个定标样品的光谱矩阵和浓度矩阵进行偏最小二乘法定量回归分析，并计算出每个定标样品的预测浓度；

6)交叉验证：对步骤5)中获得的每个定标样品的预测浓度通过F-检验进行交叉验证，获得在所述交叉验证中达到最优主因子数时以真实浓度为横坐标，预测浓度为纵坐标的所述特征谱段的标准曲线，由此建立白蛋白的偏最小二乘法模型；

7)获得待测样品的拉曼光谱图：通过拉曼光谱仪，选择与测定白蛋白标准溶液时相同的参数条件，获得所述待测样品的拉曼光谱图；

8)预测待测样品的浓度：选取待测样品的拉曼光谱图中的特征谱段，将该特征谱段如上面步骤3)和4)所述进行多点Savitsky-Golay平滑处理以及进行二阶导数处理，得到待测白蛋白溶液的光谱矩阵，然后用步骤6)获得的偏最小二乘法模型对所述待测样品进行含量预测，获得所述待测样品的预测浓度。

在本发明中，所述白蛋白制品可以是牛白蛋白、人血白蛋白等市售制品。

在本发明的预测待测样品的白蛋白浓度的方法中，二阶导数处理如下进行：

一阶导数：f′(x)＝dy/dx

二阶导数：f″(x)＝d^2y/dx^2＝d(dy/dx)/dx

f′(x)和f″(x)分别为一阶导数、二阶导数函数表示的方式，y为拉曼光谱的吸收度，x为拉曼光谱上的波数。

在本发明的预测待测样品的白蛋白浓度的方法中，PLS定量回归分析如下进行：

设A为n个定标样品在m个波长处的光谱矩阵，C为白蛋白在n个定标样品中的浓度矩阵，E、F分别为残差矩阵，所述光谱矩阵A正交分解为吸光度隐变量矩阵T与载荷矩阵P的乘积，所述浓度矩阵C正交分解为浓度隐变量矩阵U与载荷矩阵Q的乘积：

A(n×m)＝T(n×h)P(h×m)+E(n×m)

C(n×l)＝U(n×h)Q(h×l)+F(n×l)

然后，把隐变量矩阵T、U做线性回归，用对角矩阵B并联：

U(n×h)＝T(n×h)B(h×h)，

对预测集中要预测的样品，设所述集中要预测的样品的光谱矩阵为A_pre，则由：

A_pre＝T_preP

可求出T_pre，则：

C_pre＝T_preBQ

T_pre为预测浓度计算过程中产生的矩阵，C_pre为预测的浓度。

在本发明的白蛋白浓度预测方法中，交叉验证可以根据公知的方法如下进行：

(a)从n个定标样品中剔除k个样品，所述k为样品数的公约数，最大为n/4，最小为1；

(b)用剩下的n-k个样品来计算参数矩阵，用所求得的参数矩阵来预测被剔除的k个样品的浓度，将所述k个样品的预测浓度C_i，pre与其已知浓度C_i比较，可得其残差平方和PRESS：

PRESS (h) = PRESS (h) + Σ_{1}^{n} {(C_{i, pre} - C_{i})}^{2}

(c)将被删除的k个样品恢复，再剔除尚未剔除过的k个样品，计算转回(b)，每个定标样品的浓度在PRESS中出现一次，且仅出现一次；

(d)最后，计算主因子数为1到h时的预测残差平方和，当预测残差平方和达到最小时或残差平方和不再减小时的主因子数作为最优主因子数。

在第二个方面，本发明提供了一种白蛋白制品的真伪判别方法，包括以下步骤：

1)获得待测白蛋白样品，通过所述待测样品的包装标识得到待测样品的白蛋白标识浓度；

2)根据本发明的上述预测方法预测待测样品的白蛋白浓度；

3)将上述预测的待测样品的白蛋白浓度和各自的标识浓度之间的差异与预定的判别标准比较，从而判定所述待测样品为真品、可疑样品或伪品。

在本发明的一个实施方案中，所述预定判别标准为：若预测的待测样品的白蛋白浓度与其标识浓度的相对偏差在±10％内，则可判定该待测样品为真品，若预测的白蛋白浓度与其标识浓度相对偏差在±10％～±20％，则判定为可疑样品，若预测浓度与标识浓度相对偏差大于±20％，则判定为伪品。

在第三个方面，本发明提供了一种用于预测待测样品的白蛋白浓度的分析装置，该装置包括处理器和控制器，所述控制器包括下列模块：

1)数据接收模块：所述数据接收模块接收由拉曼光谱仪获得的待测样品或定标样品的拉曼光谱图，所述定标样品为n个系列浓度的白蛋白标准溶液；

2)特征谱段选取模块：所述特征谱段选取模块被配置成从数据接收模块接收的拉曼光谱图数据中选取与芳香族氨基酸苯环上C＝C对称伸缩振动相对应的拉曼峰范围作为特征谱段，所述特征谱段优选为960-1100cm^-1；

3)S-G平滑处理模块：所述S-G平滑处理模块被配置成将从上述拉曼光谱图中所选取的上述特征谱段的数据进行多点，优选9～21点，更优选9～17点，最优选13～17点S-G平滑滤波消除噪声干扰；

4)二阶导数处理模块：所述二阶导数处理模块被配置成将经S-G平滑处理的数据进行二阶导数处理；

5)偏最小二乘法定量回归分析模块：所述偏最小二乘法定量回归分析模块被配置成将经二阶导数处理的光谱数据进行偏最小二乘法定量回归分析，并计算出每个定标样品的预测浓度；

6)偏最小二乘法构建模块：对所述每个定标样品的预测浓度通过F-检验进行交叉验证，获得在选择在交叉验证中达到最优主因子数时以真实浓度为横坐标，预测浓度为纵坐标的所述特征谱段的标准曲线，建立白蛋白的偏最小二乘法模型；

7)浓度预测模块：所述浓度预测模块被配置成对待测样品的拉曼光谱图数据经上述模块2)-4)处理后的数据，用所述偏最小二乘法构建模块获得的白蛋白的偏最小二乘法模型对待测样品进行含量预测以获得所述待测样品的预测浓度。

本发明的分析装置还可以根据需要包括判别模块，所述判别模块被配置成将预测的待测样品的白蛋白浓度结合所述待测样品的标识浓度与预定的判别标准比较，从而判定所述待测样品为真品、可疑样品或伪品。

在包括判别模块的情况下，本发明的分析装置实际上已经成为一种可以鉴别药品真伪的判别分析装置。本领域技术人员可以理解的是，所述判别模块可以如上所述与本发明的分析装置集成在一起，仅作为一种功能存在于本发明的分析装置中，或者也可以作为独立于本发明的分析装置的判别装置存在。在后一种情况下，该判别装置可以与本发明的分析装置以任何适宜的数据通信或电连接方式连接，组合成为一个判别药品真伪的分析***，或者仅为便携式装置或类似形式的独立装置，其可以接收来自本发明的分析装置或其他分析设备的样品数据(包括浓度数据、光谱数据等)，依照其预设的或由用户设定的判别标准对所述样品数据进行判别。

在一个优选的实施方案中，所述预定的判别标准为：若预测的待测样品的白蛋白浓度与其标识浓度相对偏差在±10％内，则可判定该待测样品为真品，若预测待测样品的白蛋白浓度与其标识浓度相对偏差在±10％～±20％，则判定为可疑样品，若预测浓度与标识浓度相对偏差大于±20％，则判定为伪品。

在本发明的分析装置的各种实施方案中，各个模块可以参照上述本发明第一和第二个方面的分析方法和判别方法中所采用的各种参数、算法和数据处理方法进行设置。

在第四个方面，本发明还涉及一种白蛋白制品分析***，其包括拉曼光谱仪和本发明的分析装置，所述分析装置与所述拉曼光谱仪可通信地连接，所述通信连接可以经由无线或有线连接。

本发明的优点在于不需要对每个白蛋白制品进行繁琐的常规化学分析检验，大大减少了分析工作量，提高了检测效率和速度，可以对市场上的人血白蛋白溶液进行快速的筛查，避免了盲目的抽验，大大降低了抽验的成本。本发明的有益效果综合如下：

1、满足对白蛋白溶液的快速无损检测的要求，具有检测速度快、效率高、操作方便、不添加任何试剂的特点，是一种绿色环保的分析测试方法。

2、对样品测得的拉曼光谱进行平滑滤波消除噪声干扰、二阶导数处理、定量回归分析，然后通过交叉验证法建立定量模型，可以实现对市售的人血白蛋白溶液的快速筛查，无损、简便、准确率高。

3、本发明采用激光拉曼光谱与偏最小二乘法相结合，测定人血白蛋白溶液的含量，相对于其他定量技术具有操作简便、分析快速等特点。

附图说明

图1为9组标准溶液的原始拉曼光谱图。

图2为PLS的线性图。

图3为根据本发明的分析方法和判别方法的流程示意图。

图4为根据本发明的分析装置的一个实施方案的配置示意图。

具体实施方式

术语定义

下面给出本发明中所使用的一些术语的定义。在此应注意，如没有定义，其准确的含义应以本领域普通技术人员所知晓的在本领域中所使用的常用定义，或是本领域的工具参考书中的定义为准；如与本领域中的含义不同，则以本发明中的定义为准。

特征谱段：在本发明的预测待测样品的白蛋白浓度的方法中，由于市售白蛋白溶液的包装各不相同，考虑到玻璃瓶的厚度不一，为保证激光都聚焦在溶液内部，并且使玻璃对拉曼信号的干扰减至最小，对聚焦位置作了比较。将同一份白蛋白溶液分别装入标准瓶和不同厂家市售包装的玻璃瓶内后测定，结果发现聚焦位置越深信号基本呈减弱趋势，但在部分位置时标准瓶内和市售玻璃瓶内白蛋白溶液的特征峰强度比较接近。通过标准白蛋白溶液的原始拉曼光谱的分析发现这些光谱曲线呈规律性分布，不同浓度的人血白蛋白溶液中各拉曼特征峰的强度随浓度的增加而增加，综合比较之下以芳香族氨基酸苯环上C＝C对称伸缩振动(1004cm^-1±4cm^-1)的拉曼峰最为突出，故选择光谱范围为960-1100cm^-1作为本发明的特征谱段，即对各种白蛋白溶液均适用的谱段范围。

S-G平滑：平滑由于受各种因素的影响，拉曼光谱仪所测得的光谱数据不可避免地伴随着随机误差和噪声，得到的往往是一条不光滑的曲线，平滑可以降低高频随机噪声。Savitsky-Golay平滑算法是应用最广泛的光谱平滑方法，用多项式在最小二乘法下的光谱数据，对光谱进行平滑处理，还可用于光谱数据的求导。该算法的实质是一种加权平均，可以避免光谱峰形的失真。在本发明中，通过权衡了白蛋白标准溶液和待测白蛋白溶液的拉曼光谱图的信噪比，选择13点、15点和17点Savitsky-Golay平滑滤波较为合适，最优选15点和17点。

二阶导数：导数法对样品扫描时，由于制样条件和仪器参数等对光谱的影响，谱图可能发生平移、旋转(随着波数的变小，差谱值呈现规律上升)以及图谱的其它变形。导数法可消除信号中的低频背景和常数项，降低高次项的幂次，从而使高频信号显现出来，对光谱进行二阶求导可以消除光谱的旋转。光谱的求导可以有更高阶，但光谱导数处理扣除背景干扰的同时，会损失一些低频信息，在消除***误差的同时会放大随机误差。

偏最小二乘法(PLS)：设A为n个定标样品在m个波长处的吸光度矩阵，C为1种组分(在本发明中具体为白蛋白)在n个定标样品中的浓度矩阵，E、F分别为残差矩阵。PLS不仅把光谱矩阵A正交分解为吸光度隐变量矩阵T与载荷矩阵P的乘积，还把浓度矩阵C正交分解为浓度隐变量矩阵U与载荷矩阵Q的乘积：

A(n×m)＝T(n×h)P(h×m)+E(n×m)

C(n×l)＝U(n×h)Q(h×l)+F(n×l)

然后，把隐变量矩阵T、U做线性回归，用对角矩阵B并联：

U(n×h)＝T(n×h)B(h×h)，

对预测集中要预测的样品，设其光谱矩阵A_pre，则由：

A_pre＝T_preP

可求出T_pre，则：

C_pre＝T_preBQ

T_pre为预测浓度计算过程中产生的矩阵，C_pre为预测的浓度，B、P和Q如上面所定义。

偏最小二乘法(PLS)利用主成分分析将吸光度矩阵和浓度矩阵先分别分解为特征向量和载荷向量，然后用偏最小二乘法在这些稳变量之间建立相互关系，从而得到光谱矩阵与浓度矩阵之间的数学校正模型(即偏最小二乘法模型)。这些是偏最小二乘法在后台运行工作的原理，最后得到实际浓度为横坐标，预测浓度为纵坐标的线性曲线图。

交叉验证：交叉验证(Cross-validation)主要用于建模应用中，在应用PLS方法作定量分析时，维数的确定非常重要，通常采用交叉校验方法来确定维数，其可以采用如下的步骤进行：

设有n个定标样品：

(a)从n个定标样品中剔除k个样品(k为样品数的公约数，最大为n/4，最小为1)；

(b)用剩下的n-k个样品来计算模型的参数矩阵，用所求得的模型参数矩阵来预测被剔除的k个样品的浓度，将所述k个样品的预测浓度C_i，pre与其已知浓度C_i比较，可得其残差平方和：

PRESS (h) = PRESS (h) + Σ_{1}^{n} {(C_{i, pre} - C_{i})}^{2}

(c)将被删除的k个样品恢复，再剔除尚未剔除过的k个样品，计算转回至(b)，每个定标样品的浓度在PRESS中出现一次，且仅出现一次。

(d)最后，得到某一因子数h所对应的总的PRESS最小或PRESS不再减小的因子数。

在本发明的预测方法中，在建立PLS回归建模中，从给定的建模样本中，拿出大部分样本进行建模型，留小部分样本用刚建立的模型进行预报，并求这小部分样本的预报误差，记录它们的平方加和。这个过程一直进行，直到所有的样本都被预报了一次而且仅被预报一次。把每个样本的预报误差平方加和，称为预测残差平方和(PRESS)，应用交互验证方法，通过F-检验来确定当PRESS达到最小时的主因子数，即最优主因子数。此优化模型是一个检测奇异点、强响应点、确定最优主因子和相应交互验证均方残差RMSECV的协同过程。

主因子数的选择直接关系到模型的实际预测能力。若建立模型时使用的主因子数过少，不能充分反映样品被测组分产生的光谱信息，导致不充分拟合；若使用主因子数过多，一些包含了噪音的信息也掺入计算，就会导致过拟合，从而降低模型的预测能力。在本发明中，经过筛选和预实验，选择的主因子数一般在10以下(即h≤10)。

本发明的分析装置和包括该分析装置的药物分析***

在图4中图示了根据本发明的分析装置的一个实施方案的配置示意图。在图4中，分析装置1包括处理器、控制器，所述控制器与数据接收模块相连，在处理器的指令下控制数据接收模块从拉曼光谱仪或其他测量设备或数据库(本地数据库或位于互联网上的远程数据库)接收标准品或待测样品的光谱数据(包括但不限于拉曼光谱数据、红外光谱数据等)。在此要说明的是，如果仅用于预测待测样品的浓度，则如图4中所示，根据本发明的分析装置不包括判别模块。如果需要判别药品真伪，则在另一个实施方案中，根据本发明的分析装置可以包括判别模块(如图4中虚线框所示的判别模块)以用于根据预定的判别标准判断待测样品的真假伪劣。

在图4中，根据本发明的分析装置1还包括如上文所定义的特征谱段选取模块，S-G平滑处理模块，二阶导数处理模块，PLS定量回归分析模块，PLS构建模块，和浓度预测模块。

尽管没有图示，在本发明的分析装置1中，除了必要的设备如处理器、输入输出装置、存储装置(诸如内部存储器、硬盘等)以外，可根据需要包括其他硬件设备诸如显示装置、打印设备等，还可包括网络通信设备用于通过局域网、互联网、无线宽带或移动通信网络等与远程数据库连接或与其他设备进行数据交换。要理解的是，在本发明中，处理器可以理解为单独执行数据处理功能或执行数据处理器和控制器两者的功能。此外，本发明的控制器或执行控制器功能的处理器可以执行本发明的分析方法和判别方法所需的各种算法、数据处理功能。

在本发明中，拉曼光谱仪用来获取待测样品和药物标准品的拉曼光谱图，因此只要能够获得样品的拉曼光谱图，在本发明的分析***中可以使用多种型号的拉曼光谱仪，例如ThermoScientific公司的DXR及AlmegaXR、Horiba公司的LabRam、Renishaw公司的inVia等。

在本发明的分析***中，本发明的分析装置和拉曼光谱仪可通过各种连接方式连接以传输数据，包括但不限于电缆直接连接、通过有线或无线局域网连接、有线或无线互联网远程连接、蓝牙、红外线、或通过移动网络等数据传输方式。

要理解的是本发明的分析装置或***可以以其他的方式实现，例如，如上所述，拉曼光谱仪仅作为获取光谱数据的仪器使用，而单独采用分析装置来分析或处理光谱数据。此外，当然，本发明的分析装置还可以通过任何方式结合到拉曼光谱仪中，至少可以实现本发明的目的即可，例如以软件或硬件或软硬件结合的方式将用于实现本发明的方法的各步骤的功能或模块嵌入至拉曼光谱仪的硬件或软件中，诸如计算机程序或单片机的形式。

本发明的浓度预测和判别方法

本发明的方法(包括浓度预测方法或判别方法)可通过编程的计算机程序并借助于计算软件来实现，也可通过硬件来实现。用来实现本发明的方法的计算软件的例子为TQ Analysis，它们可以单独使用或组合使用。另外，本发明的方法还可以用Matlab、VB、VC、C++等语言进行编写。

本发明的分析和判别方法可以依照图3所示的流程示意图来进行：

下面依照图3的流程来说明本发明的浓度预测方法和判别方法的流程：

在步骤S1，制备浓度递增的系列白蛋白标准溶液。

在步骤S2，从拉曼光谱仪接收白蛋白标准溶液的光谱数据。

在步骤S3，对接收到的光谱进行Savitsky-Golay平滑。

在步骤S4，将步骤S3中经Savitsky-Golay平滑的光谱图进行二阶导数运算，获得新的二阶导数后光谱。

在步骤S5，将对步骤S4获得的二阶导数后光谱建立PLS定量模型。

在步骤S6，获得的待测样品白蛋白溶液的拉曼光谱。

在步骤S7，将待测样品的拉曼光谱重复上述步骤S3-S4的数据处理方法。

在步骤S8，用PLS定量模型预测待测样品的浓度。

在步骤S9，对预测结果进行判断，若预测的待测样品的白蛋白浓度与其标识相对偏差在±10％内，则可判定该待测样品为真品，若预测的白蛋白浓度与其标识浓度相对偏差±10％～±20％，则判定为可疑样品，若预测浓度与标识浓度相对偏差大于±20％，则判定为伪品。可疑样品和伪品均抽验至相关部门进行法定检验。

下面结合具体实施例来说明本发明的快速检测人血白蛋白制品真假伪劣的分析方法。

实施例1人血白蛋白标准曲线的建立

1.样品的制备

由于无法获得人血白蛋白的标准品，选择市售人血白蛋白溶液(经中国药典2010年版三部附录VIB第一法(凯氏定氮法)测定其蛋白质含量)作为母液配制一系列浓度的标准溶液。取真品人血白蛋白浓度分别为24.30％(A)与4.88％(B)，相互稀释，混匀后装入标准瓶。具体配置及浓度分布如表1所示。

表1、人血白蛋白标准溶液的配置

编号	A的体积/(ml)	B的体积/(ml)	浓度/(％)
				1	0	10	4.88
2	1	9	6.82
				3	2	8	8.76
4	4	6	12.65
				5	5	5	14.59
6	6	4	16.53
				7	8	2	20.42
8	9	1	22.36
				9	10	0	24.30

本方法所用的人血白蛋白溶液为不同品牌、不同浓度、不同批次的市售样品，共计17个，样品的详细信息见表2。

表2、样品信息表

2、光谱采集

用拉曼光谱仪进行检测。激光光源发射波长为780nm，激光强度150mW，光谱扫描范围50～3411cm^-1，平板式通用样品架。将白蛋白标准溶液装入统一的标准瓶，各待测市售白蛋白溶液于原包装内，避开标签，平躺于通用样品架上，适当调整位置使瓶子与凹槽完全贴合，曝光时间10s，扫描次数10次，采集拉曼光谱，采集过程为2分钟。

3、数据处理

用数据处理软件(该软件为拉曼光谱仪标配软件)自动扣除荧光背景获得基线较平坦的人血白蛋白溶液的拉曼光谱图。图1是9组标准溶液的原始拉曼光谱，初步分析发现光谱曲线呈规律性分布，不同浓度的人血白蛋白溶液中各拉曼特征峰的强度随浓度的增加而增加，综合比较之下以芳香族氨基酸苯环上C＝C对称伸缩振动(1004cm^-1±4cm^-1)的拉曼峰最为突出，故选择光谱范围为960-1100cm^-1。

对采集得到的标准样品的拉曼光谱图进行17点S-G平滑滤波消除噪声干扰、二阶导数处理后，采用PLS进行定量回归分析，通过内部验证-交叉验证法(cross-validation)，建立白蛋白标准溶液的PLS模型。

在模型的构建中，可以计算相关系数(r)和交叉验证均方差(RMSECV)。r越接近1，说明PLS拟合的线性越好；RMSECV越小，说明拟合的线性对建模样品的预测浓度和实际浓度的误差越小，从而说明PLS模型越好。

实施例2待测样品的浓度预测

采用上面建立的PLS模型对市售人血白蛋白溶液的样品进行测定，结果详见表3。

表3

对市售的奥克特珐玛、上海生物制品研究所、上海莱士、上海新兴医药、江西博雅制药、百特6个厂家的17个人血白蛋白样品进行预测，涵盖了市售人血白蛋白的三种不同浓度：5％、20％、25％。预测结果显示，最大偏差在3.5％以内，证明了该方法具有较高的准确度。

尽管通过引述实际分析中的特定细节和参数说明了本发明，应该理解，这只是按示例的方式而不是限制的方式来描述，这些设定和数值可以有变化，这些变化仍然在本发明的范围之内。对于受本发明启示的本领域技术人员来说，许多改变和变化都是显而易见的。因此，本发明旨在包含这些本发明范围的改变和变化。

Claims

1.一种预测待测样品的白蛋白浓度的方法，该方法包括以下的步骤：

2)选取特征谱段：从步骤1)获得的n个定标样品的拉曼光谱图中选取与芳香族氨基酸苯环上C＝C对称伸缩振动相对应的拉曼峰范围作为特征谱段；

3)Savitsky-Golay平滑处理：将从n个定标样品的拉曼光谱图中所选取的上述特征谱段的数据进行多点，优选9～21点，更优选9～17点，最优选13～17点Savitsky-Golay平滑滤波消除噪声干扰；

4)二阶导数处理：对步骤3)获得的数据进行二阶导数处理；

5)偏最小二乘法定量回归分析：将步骤4)获得的光谱数据中n个定标样品的光谱矩阵和浓度矩阵进行偏最小二乘法定量回归分析，并计算出每个定标样品的预测浓度；

2.一种白蛋白制品的真伪判别方法，包括以下步骤：

2)根据权利要求1所述的方法预测待测样品的白蛋白浓度；

3.一种用于预测待测样品的白蛋白浓度的分析装置，该装置包括处理器和控制器，所述控制器包括下列模块：

2)特征谱段选取模块：所述特征谱段选取模块被配置成从数据接收模块接收的拉曼光谱图数据中选取与芳香族氨基酸苯环上C＝C对称伸缩振动相对应的拉曼峰范围作为特征谱段；

3)Savitsky-Golay平滑处理模块：所述Savitsky-Golay平滑处理模块被配置成将从上述拉曼光谱图中所选取的上述特征谱段的数据进行多点，优选9～21点，更优选9～17点，最优选13～17点Savitsky-Golay平滑滤波消除噪声干扰；

4)二阶导数处理模块：所述二阶导数处理模块被配置成将经Savitsky-Golay平滑处理的光谱数据进行二阶导数处理；

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法或分析装置，其特征在于所述特征谱段为960-1100cm^-1。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法或分析装置，其特征在于所述二阶导数处理步骤或模块被配置成根据下式进行二阶求导：

一阶导数：f′(x)＝dy/dx

二阶导数：f″(x)＝d^2y/dx^2＝d(dy/dx)/dx

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法或分析装置，其特征在于所述偏最小二乘法定量回归分析步骤或模块被配置成：

设A为n个定标样品在m个波长处的吸光度矩阵，C为白蛋白在n个定标样品中的浓度矩阵，E、F分别为残差矩阵，所述光谱矩阵A正交分解为吸光度隐变量矩阵T与载荷矩阵P的乘积，所述浓度矩阵C正交分解为浓度隐变量矩阵U与载荷矩阵Q的乘积：

A(n×m)＝T(n×h)P(h×m)+E(n×m)

C(n×l)＝U(n×h)Q(h×l)+F(n×l)

然后，把隐变量矩阵T、U做线性回归，用对角矩阵B并联：

U(n×h)＝T(n×h)B(h×h)，

A_pre＝T_preP

可求出T_pre，则：

C_pre＝T_preBQ

T_pre为预测浓度计算过程中产生的矩阵，C_pre为预测的浓度。

7.根据权利要求6所述的方法或分析装置，其特征在于交叉验证步骤或偏最小二乘法构建模块被配置成如下进行所述交叉验证：

(b)用剩下的n-k个样品来计算参数矩阵，用所求得的参数矩阵来预测被剔除的k个样品的浓度，将所述k个样品的预测浓度C_i，pre与其已知浓度C_i比较，可得其残差平方和：

PRESS (h) = PRESS (h) + Σ_{1}^{n} {(C_{i, pre} - C_{i})}^{2}

8.根据权利要求3-7中任一项所述的分析装置，还包括判别模块，所述判别模块被配置成将预测的待测样品的白蛋白浓度结合所述待测样品的标识浓度与预定的判别标准比较，从而判定所述待测样品为真品、可疑样品或伪品。

9.根据权利要求2或8所述的方法或分析装置，其特征在于所述预定的判别标准为：若预测的待测样品的白蛋白浓度与其标识浓度相对偏差在±10％内，则可判定该待测样品为真品，若预测待测样品的白蛋白浓度与其标识浓度相对偏差在±10％～±20％，则判定为可疑样品，若预测浓度与标识浓度相对偏差大于±20％，则判定为伪品。

10.一种药物分析***，包括拉曼光谱仪和根据权利要求3-9中任一项所述的分析装置，所述分析装置与所述拉曼光谱仪可通信地连接。