CN103349786A

CN103349786A - 一种以trpv3通道蛋白为靶点的用于治疗皮肤瘙痒药物的筛选方法

Info

Publication number: CN103349786A
Application number: CN2013102184414A
Authority: CN
Inventors: 杨勇; 林志淼; 曹旭; 张洁
Original assignee: Peking University First Hospital
Current assignee: Peking University First Hospital
Priority date: 2013-06-04
Filing date: 2013-06-04
Publication date: 2013-10-16
Anticipated expiration: 2033-06-04
Also published as: CN103349786B

Abstract

本发明公开了一种用于治疗皮肤瘙痒药物的筛选方法，首先筛选对TRPV3通道蛋白功能具有调控作用的目标致痒物质；然后分别检测多种不同化合物对于目标致痒物质对TRPV3通道蛋白功能调控作用所产生的影响，从而从所述多种不同化合物中筛选用于治疗皮肤瘙痒的药物。本发明方法是基于以下发现和研究提出的：首先发现致痒物质在野生型小鼠和TRPV3通道蛋白敲除小鼠的瘙痒模型上所产生的瘙痒反应有着显著的差异，进一步通过荧光和电生理学研究发现致痒物质激活其受体GPCR后，通过释放激活G蛋白βγ二聚体直接作用于TRPV3，从而调控TRPV3通道蛋白功能。本发明为针对GPCR与TRPV3通道蛋白偶联作用机制而开发和筛选用于皮肤瘙痒或皮肤相关疾病的药物提供了靶点，具有广泛的应用前景。

Description

一种以TRPV3通道蛋白为靶点的用于治疗皮肤瘙痒药物的筛选方法

技术领域

本发明涉及一种药物筛选方法，特别是涉及一种用于治疗皮肤瘙痒药物的筛选方法。

背景技术

瘙痒是一种机体应对有害刺激的防御机制，会导致搔抓行为。它既是皮肤病最常见的症状，也可见于***性疾病，常常影响患者的生活质量。根据对瘙痒中枢和外周发生机制的研究，将其分为五类：1）皮肤源性瘙痒：起源于皮肤，由于炎症、干燥及其他皮肤操作引起，由C类神经纤维传导，如疥疮、荨麻疹等；2）神经病性瘙痒：由于感觉神经传入通路中发生病理改变而引起的瘙痒，如疱疹后遗神经痛伴随的瘙痒；3）神经源性瘙痒：起源于中枢，但无神经病学依据，如由阿片样肽作用于μ-阿片肽受体引起的胆汁淤积性瘙痒；4）心源性瘙痒：由心理异常所引发的瘙痒，如寄生虫恐怖症的妄想状态；5）混合性瘙痒：由两种或两种以上机制引起，如特应性皮炎，其既有皮肤源性瘙痒又有神经源性瘙痒。

神经生理学研究表明，痒觉感受器存在于真皮与表皮连接处的感觉神经游离末梢，这些感受器可以特异性结合致痒物质（瘙痒的传导介质），如胺类、蛋白酶、生长因子、神经肽、类阿片物质、二十烷类、细胞素等。这些物质表达于不同的皮肤细胞中，如角质细胞、上皮细胞、内皮细胞，不同的痒觉感受器与来源不同的配体特异性结合后，传递冲动导致瘙痒。

瞬时感受器电位离子通道蛋白（transient receptor potential ion channel protein，TRPs）是一类在外周和中枢神经***分布很广泛的阳离子通道蛋白，TRP家族主要由七个亚族组成：TRPC、TRPV、TRPM、TRPML、TRPP、TRPA和TRPN。TRP受到多种因素的调节，包括渗透压、pH值、机械力以及一些内、外源性配体和细胞内信号分子，其参与生物体内感觉信息传递如视觉、温度觉、痛觉和触觉等，并且具有调节胞内Ca²⁺平衡等多种重要的生理功能。TRP家族与其它离子通道家族的显著区别在于家族各成员之间的同源性较低，并且可被多种介质和配体激活或敏化。

TRPV即瞬时感受器电位香草酸受体亚型通道，是TRP通道家族中的一类亚型，共包括1-6六个亚型，其中TRPV1、TRPV2、TRPV3和TRPV4被称为“温度敏感”（thermosensitive）通道，V代表vanilloid(辣椒素类物质)，以纪念该家族第一个成员TRPV1被vanilloid类化学物质特别是辣椒素(capsaicin)所激活，所以TRPV1又被成为辣椒素受体。TRPV通道有和经典的电压依赖钾通道相同的拓扑结构，包含6个疏水跨膜区域，1个胞内ANK区及1个C端区，跨膜区域可以形成同源性或者异源性四聚体，组成一个疏水孔道，开放时阳离子经该孔道进入细胞内。自1997年Caterina等在背根神经节（DRG）成功克隆了TRPV1受体后，TRPV2、TRPV3、TRPV4以及TRPM8和TRPA1也相继被发现存在于背根神经节中。这些离子通道被认为参与了化学物质、温度以及机械刺激所诱导的痛觉的形成。

温度敏感的TRPV家族成员广泛分布于神经与非神经组织中，其中TRPV3通道主要表达在皮肤组织中，其可被31℃～38℃范围的无害温度、炎症介质、一氧化氮（NO）及外源性化学物质如植物源性皮肤致敏剂（如丁香酚、麝香草酚和香芹酚等）、樟脑和2-APB激活或敏化，TRPV3通道被打开后，以胞外阳离子向胞内流动的形式激活下游通路。研究表明，G蛋白偶联受体（GPCR）通过磷脂酶C、花生四烯酸或不饱和脂肪酸等途径均可提高TRPV3的活性，并且认为TRPV3是炎症病理过程中的痛觉增敏的介导者，其主要机制可能为：1）在人背根神经节中与TRPV1共存且形成异聚体从而感知各种伤害性刺激；2）感觉神经上受体炎症介质激活后通过PLC和PKC途径激活或敏化TRPV3；3）感觉神经产生的NO作为第二信使直接激活TRPV3；4）炎症过程中产生的花生四烯酸或其他脂肪酸来提高TRPV3的功能。

此外，有研究表明TRPV3基因敲除（knockout,KO）鼠可出现温觉的障碍；在自发性TRPV3基因突变鼠的研究中发现，DS-Nh（p.G573S突变）小鼠和WBN/Kob-Ht（p.G573C突变）大鼠可出现自发性无毛和特应性皮炎样皮损；C57BL-Nh（p.G573S突变）转基因小鼠可以出现皮肤红斑、水肿、干燥、糜烂和脱屑，以及自发性搔抓行为。组织病理见到皮肤角化过度，大量肥大细胞和CD4⁺T淋巴细胞浸润，提示TRPV3可能参与瘙痒和皮肤炎症的发病机制。近期我们发现人类功能增强的TRPV3突变会导致一种罕见的遗传性皮肤病—Olmsted综合征，表现为手足进行性损毁，脱发和严重的瘙痒。因此，TRPV3在皮肤中发挥着重要的生理和病生理功能。

目前认为皮肤源性瘙痒的产生是因为肥大细胞和角质形成细胞等释放多种瘙痒介质，激活了皮肤中的神经末稍c纤维上的瘙痒感受器，而离子通道尤其是瞬时受体电位通道（transient receptor potential channels，TRP）在其中所发挥的重要作用在近年来正逐步被揭示。因此TRPV3通道蛋白是一个重要的皮肤药物的靶点，通过修饰TRPV3通道蛋白的功能筛选化合物可以用于治疗皮肤瘙痒症及相关皮肤疾病。

发明内容

基于以上现有技术，本发明通过研究发现致痒物质在野生型和TRPV3通道蛋白敲除的小鼠的瘙痒模型上所产生的瘙痒反应有着显著的差异，进一步通过荧光和电生理学研究发现：致痒物质激活其受体GPCR后，可以通过释放激活G蛋白βγ二聚体直接作用于TRPV3的胞内C端，从而敏化TRPV3通道蛋白功能。本发明的这一发现为针对GPCR与TRPV3通道蛋白偶联作用机制而开发和筛选用于皮肤瘙痒或皮肤相关疾病的药物提供了靶点。

为此，本发明的首要目的是提供一种用于治疗皮肤瘙痒药物的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

A）筛选对TRPV3通道蛋白功能具有调控作用的目标致痒物质；

B）分别检测多种不同化合物对于目标致痒物质对TRPV3通道蛋白功能调控作用所产生的影响，从而从所述多种不同化合物中筛选用于治疗皮肤瘙痒的药物。

其中，所述调控作用具体包括：目标致痒物质通过激活其GPCR受体，释放G蛋白βγ二聚体，G蛋白βγ二聚体作用于TRPV3通道蛋白，从而调控所述TRPV3通道蛋白的功能。

特别是，所述G蛋白βγ二聚体作用于TRPV3通道蛋白具体表现为G蛋白βγ二聚体直接作用于TRPV3通道蛋白；其中，所述直接作用进一步表现为直接结合，即G蛋白βγ二聚体直接结合于TRPV3通道蛋白，从而对其功能产生调控作用。

其中，本发明中可以通过调控以下途径的一种或多种来筛选于治疗皮肤瘙痒的药物：

（1）目标致痒物质激活GPCR受体的途径；

（2）GPCR受体释放G蛋白βγ二聚体的途径；

（3）G蛋白βγ二聚体作用于TRPV3通道蛋白的途径。特别是，途径（3）中所述G蛋白βγ二聚体作用于TRPV3通道蛋白具体表现为G蛋白βγ二聚体直接结合于TRPV3通道蛋白。

尤其是，对上述途径（1）-（3）中一种或多种的所述调控具体为抑制，即通过抑制上述途径（1）-（3）中的一种或多种来筛选于治疗皮肤瘙痒的药物。

其中，所述步骤A）具体包括：对野生型小鼠和TRPV3基因敲除型小鼠同时给予多种不同致痒物质中的一种，通过检测野生型小鼠和TRPV3基因敲除型小鼠的搔抓反应，从而从所述多种不同致痒物质中筛选目标致痒物质。

特别是，所述小鼠的种系可以是BAL B/C、ICR、NC/Nga、MRL、lpr中的一种；所述TRPV3基因敲除型小鼠为TRPV3基因第14号和15号外显子部分被PGK-neo基因替换的小鼠；所述多种不同致痒物质为本领域常规的致痒物质，如组胺、化合物48/80、氯喹、α-甲基-5羟色胺、PAR2激活剂SLIGRL、内皮素-1等。

尤其是，所述目标致痒物质理论上包括所有能够对TRPV3通道蛋白起调控作用的物质，进一步包括所有能够激活其GPCR受体并且能够敏化TRPV3通道蛋白的物质；所述目标致痒物质选自化合物48/80、氯喹、α-甲基-5羟色胺、PAR2激活剂SLIGRL中的一种或多种；所述给予致痒物质的方法具体包括：将致痒物质溶解后注射入所述小鼠颈背部皮下；所述调控作用具体表现为敏化或激活作用。

其中，所述步骤B）具体包括：至少对所述野生型小鼠联合给予所述目标致痒物质和多种不同化合物中的一种，通过检测野生型小鼠的搔抓反应来确定所述多种不同化合物对于目标致痒物质对TRPV3通道蛋白功能调控作用所产生的影响，从而从所述多种不同化合物中筛选用于治疗皮肤瘙痒的药物。

特别是，所述化合物选自TRPV3激动剂、TRPV3抑制剂中的一种或多种；其中所述TRPV3激动剂选自2-APB、右旋樟脑（Camphor）、丁香油酚（Eugenol）中的一种或多种；所述TRPV3抑制剂选自钌红、氯化钡中的一种或多种。所述调控作用具体表现为敏化或激活作用。

尤其是，所述步骤B）还可以具体包括：建立包含G蛋白β亚基或γ亚基和TRPV3通道蛋白的BiFC重组荧光细胞，用多种不同化合物中的一种对所述BiFC重组荧光细胞进行处理，通过检测细胞BiFC荧光和/或细胞膜电流来确定所述化合物对于目标致痒物质对TRPV3通道蛋白功能调控作用所产生的影响，从而从所述化合物中筛选用于治疗皮肤瘙痒的药物。

其中，建立BiFC重组荧光细胞具体包括：将G蛋白β或γ亚基的基因***pBiFC-155NC载体构建得到重组质粒pBiFC-155NC-Gβ/γ，将TRPV3基因***到pBiFC-173VN载体构建得到重组质粒pBiFC-173VN-TRPV3，再将pBiFC-155NC-Gβ/γ和pBiFC-173VN-TRPV3共转染HEK293细胞，得到BiFC重组荧光细胞TRPV3-Gγ-HEK293。

特别是，还可以建立仅包含TRPV3通道蛋白的重组细胞（TRPV3-HEK293）作为对照；其具体包括：通过PCR扩增TRPV3基因全序列，经回收后***到pIRES2-EGFP载体，然后转染HEK293细胞，得到重组细胞TRPV3-HEK293。

其中，所述处理具体包括：将多种不同化合物溶于细胞外液，然后灌流所述BiFC重组荧光细胞，其中所述灌流的时间为200秒；采用膜片钳技术检测所述细胞膜电流；所述调控作用为敏化或激活作用。

特别是，用多种不同化合物对所述BiFC重组荧光细胞进行处理时，至少采用两种浓度的化合物进行处理，即不饱和浓度和饱和浓度。其中，所述饱和浓度指的是使化合物处理后的BiFC重组荧光细胞的荧光强度和/或细胞膜电流不再增加时的化合物的最小浓度；所述不饱和浓度指的是低于所述饱和浓度时的浓度。

本发明通过研究发现：致痒物质通过G蛋白偶联受体调控TRPV3通道的功能，从而提出一种开发和筛选用于皮肤瘙痒或皮肤相关疾病的药物的方法，其操作简单，快捷，筛选实验是在微量筛选***中完成的，样品用量一般在微克级(μg)，从而节省了样品资源，同时节省了实验材料，降低了单药筛选成本；采用本发明的方法能够提高药物筛选的效率和结果的准确性。

附图说明

图1是TRPV3基因敲除小鼠的基因改造示意图；

图2是野生型小鼠和TRPV3基因敲除小鼠基因鉴定结果；A：野生型小鼠；B：TRPV3基因敲除小鼠；

图3是不同致痒物质与PBS给药后的总搔抓次数结果；A：不同致痒物质；B：PBS；

图4是各不同致痒物质各时间段的搔抓次数结果；A：化合物48/80；B：氯喹；C：α-甲基-5羟色胺；D：PAR2激活剂SLIGRL；

图5是BiFC重组荧光细胞荧光检测结果；A：重组细胞TRPV3-HEK293；B：重组细胞TRPV3-Gγ-HEK293；

图6是2-APB处理BiFC重组荧光细胞的细胞膜电流图谱；A：重组细胞TRPV3-Gγ-HEK293；B：重组细胞TRPV3-HEK293；

图7是2-APB处理BiFC重组荧光细胞的细胞膜电流结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1筛选目标致痒物质

1、材料：

野生型小鼠（简写为WT）：C57BL/6J小鼠，购自购自北京维通利华实验动物技术有限公司；

TRPV3基因敲除小鼠（简写为KO）：TRPV3^-/-小鼠，购自The Jackson Laboratory，其TRPV3基因第14号和15号外显子部分被PGK-neo基因替换（如图1）。

2、基因型鉴定

分别取5mm野生型和TRPV3基因敲除小鼠的鼠尾尖，置于组织裂解缓冲液中（0.5%SDS，0.1M Nacl，0.05mM EDTA，0.01mM Tris，pH8.0，100μg/mL蛋白酶K），56℃过夜消化后，于95℃灭活蛋白酶K15min，于14000r/min离心，取上清液分别利用引物对1（通用引物和WT反向引物）及引物对2（通用引物和KO反向引物）采用常规PCR方法检测基因型，其中PCR引物序列如下（由北京天一辉远公司合成）：

通用引物：5'-GGCCCTCAGAGGAGCC-3'（SEQ ID NO：1）；

WT反向引物：5'-CAGGTACTGTGTCGCCCC-3'（SEQ ID NO：2）；

KO反向引物：5'-TCTATGGCTTCTGAGGCGG-3'（SEQ ID NO：3）；

PCR结果如图2所示，其中2A为以引物对1进行PCR扩增后的电泳图谱，2B为以引物对2进行PCR扩增后的电泳图谱，结果表明：野生型小鼠仅在300bp处出现1条条带，而TRPV3基因敲除小鼠未见条带；以引物对2（即通用引物和TRPV3基因敲除小鼠反向引物）进行PCR扩增后，TRPV3基因敲除小鼠仅在200bp处出现1条条带，而野生型小鼠未见条带。

3、筛选目标致痒物质

选取基因型鉴定合格的野生型和TRPV3基因敲除小鼠进行实验，每种小鼠各6只，性别各半，实验前一天除去实验小鼠颈背部的被毛，分别将50μL PBS和50ul溶于PBS的10μmol组胺、30μg化合物48/80（Compound48/80，简写为CA48/80）、200μg氯喹（Chloroquine，简写为CQ）、30μgα-甲基-5羟色胺（简写为α-Me-5HT）、130μmol PAR2激活剂SLIGRL分别注射入小鼠颈背部皮下；

小鼠搔抓行为观察按照Kuraishi方法：实验前，将实验小鼠分别放入观察盒(18cm×24cm×30cm)中适应性活动1小时，实验开始后，给药小鼠立即放入观察盒，保持室内安静无人，摄像机录像30分钟，实验结束后，回放录像进行搔抓行为观察；其中，小鼠后肢反复搔抓颈后注射部位皮肤代表小鼠皮肤的瘙痒反应，因为搔抓速度较快，将小鼠抬起后爪搔抓注射部位/邻近部位，直至后爪放回地面为止记为一次搔抓反应，由2名不参加实验的工作人员记数，以每5分钟作为1个时间段记录小鼠30分钟的搔抓次数，组间比较采用非配对T检验和ANOVA两因素方差分析，结果见图3、图4；

图3-4结果表明：给药PBS后，野生型小鼠和TRPV3基因敲除小鼠的总搔抓次数均在10次以下，且无统计学差异（P＞0.05）；给药组胺后，野生型小鼠和TRPV3基因敲除小鼠的搔抓次数无统计学差异（P＞0.05）；给药CA48/80、CQ、α-Me-5HT、SLIGRL后，TRPV3基因敲除小鼠的搔抓反应明显少于野生型小鼠，且具有统计学差异（P分别小于0.01、0.05、0.005和0.05），因此筛选到CA48/80、CQ、α-Me-5HT、SLIGRL为本发明的目标致痒物质。

实施例2目标致痒物质对TRPV3通道蛋白调控作用的机制研究

1、构建BiFC重组荧光细胞

将Venus荧光蛋白在第173位点切开，形成不发荧光的N和C端两个多肽，即N片段(N-fragment)和C片段(C-fragment)，将TRPV3通道蛋白与Venus荧光蛋白的N片段相连，将G蛋白亚基与Venus荧光蛋白的C片段相连，从而构建BiFC体系，具体步骤如下：

根据TRPV3通道蛋白基因序列（Genebank登录号：NM_001258205），设计引物如下：

上游序列：5'-ACGTAGGTACCAATGAAAGCCCACCCCAAGACGTAGGTACCAATGAAAGCCCACCCCAAG-3'（SEQ ID NO：4）；

下游序列：5'-ATTGCTCTAGACACCGAGGTTTCCGGGAATTCCTCGACTATTGCTCTAGACACCGAGGTTTCCGGGAATTCCTCGACT-3'（SEQ ID NO：5）；

通过PCR扩增TRPV3基因的全序列，经回收后***到pIRES2-EGFP载体（来源于Clontech），然后转染HEK293细胞（来源于NIH），得到重组细胞TRPV3-HEK293；

根据G蛋白γ亚基基因序列（Genebank登录号：NM_001044318.1），设计引物如下：

上游序列：5'–ATGGCCAGCAACAACACCGCC-3'（SEQ ID NO：6）；

下游序列：5'–TTAAAGGATGGCACAGAAAAACTTCTTCTCC-3'（SEQ IDNO：7）；

通过PCR扩增G蛋白γ亚基的基因全序列，经回收后***到pBiFC-155NC载体（来源于addgene）构建得到重组质粒pBiFC-155NC-Gγ；将TRPV3基因***到pBiFC-173VN载体（来源于addgene）构建得到重组质粒pBiFC-173VN-TRPV3，然后将pBiFC-155NC-Gγ和pBiFC-173VN-TRPV3共转染HEK293细胞，得到重组细胞TRPV3-Gγ-HEK293；

2、转染细胞培养

将重组细胞TRPV3-HEK293和TRPV3-Gγ-HEK293分别培养于含有10%胎牛血清，100U/ml青霉素和50U/ml链霉素的DMEM培养液中，用胰酶消化传代后，将重组细胞铺于12mm的圆形盖玻片上，于24孔板中进行培养；

3、荧光检测

重组细胞培养12小时后，弃掉DMEM培养液，用荧光显微镜进行观察，结果如图5所示，结果表明：重组细胞TRPV3-HEK293不产生荧光（图5A），而重组细胞TRPV3-Gγ-HEK293中产生荧光（图5B），表明G蛋白γ亚基可以与TRPV3通道蛋白直接结合形成复合体。

4、细胞膜电流检测

将培养的重组细胞等份分别传代于2个培养皿中，然后分别用含有30μM和300μM（饱和浓度）2-APB的细胞外液（130mM氯化钠，3mM HEPES，pH7.4）灌流重组细胞TRPV3-Gγ-HEK293和重组细胞TRPV3-HEK293各200秒，并利用膜片钳技术记录两种重组细胞的细胞膜电流，其中：膜片钳放大器采用HEKA-EPC10；微电极抛光后，灌充电极内液，控制电阻值在2～4MΩ；记录重组细胞所用电极内外液为（mM）：NaCl130，HEPES5，EGTA0.3，用NaOH调pH至7.4；微电极与细胞膜形成巨阻封接后，钳制在0mV等待5-10min后开始按照不同的刺激程序进行电流记录，结果如图6和图7所示，结果表明：在共表达G蛋白γ亚基的重组细胞TRPV3-Gγ-HEK293上，TRPV3对于30μM的2-APB激活时的所产生的电流（相对于饱和浓度2-APB，图6A）比重组细胞TRPV3-HEK293的TRPV3对于30μM的2-APB激活时所产生的电流（相对于饱和浓度2-APB，图6B）有显著地增大，从而表明G蛋白γ亚基可以敏化/激活TRPV3对于激活剂2-APB的反应。

Claims

1.一种用于治疗皮肤瘙痒药物的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

A）筛选对TRPV3通道蛋白功能具有调控作用的目标致痒物质；

2.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述调控作用具体包括：目标致痒物质通过激活其GPCR受体，释放G蛋白βγ二聚体，G蛋白βγ二聚体作用于TRPV3通道蛋白，从而调控所述TRPV3通道蛋白的功能。

3.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，通过调控以下途径的一种或多种来筛选用于治疗皮肤瘙痒的药物：

1）目标致痒物质激活GPCR受体的途径；

2）GPCR受体释放G蛋白βγ二聚体的途径；

3）G蛋白βγ二聚体作用于TRPV3通道蛋白的途径。

4.如权利要求2或3所述的筛选方法，其特征在于，所述G蛋白βγ二聚体作用于TRPV3通道蛋白具体表现为G蛋白βγ二聚体直接结合于TRPV3通道蛋白。

5.如权利要求1-4中任一所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤A）具体包括：对野生型小鼠和TRPV3基因敲除型小鼠同时给予多种不同致痒物质中的一种，通过检测野生型小鼠和TRPV3基因敲除型小鼠的搔抓反应，从而从所述多种不同致痒物质中筛选目标致痒物质。

6.如权利要求1-5中任一所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤B）具体包括：至少对所述野生型小鼠联合给予所述目标致痒物质和多种不同化合物中的一种，通过检测野生型小鼠的搔抓反应来确定所述多种不同化合物对于目标致痒物质对TRPV3通道蛋白功能调控作用所产生的影响，从而从所述多种不同化合物中筛选用于治疗皮肤瘙痒的药物。

7.如权利要求1-5任一所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤B）具体包括：建立包含G蛋白β亚基或γ亚基和TRPV3通道蛋白的BiFC重组荧光细胞，用多种不同化合物中的一种对所述BiFC重组荧光细胞进行处理，通过检测细胞BiFC荧光和/或细胞膜电流来确定所述化合物对于目标致痒物质对TRPV3通道蛋白功能调控作用所产生的影响，从而从所述化合物中筛选用于治疗皮肤瘙痒的药物。

8.如权利要求1-7任一所述的筛选方法，其特征在于，所述调控作用为敏化或激活作用。

9.如权利要求5或6所述的筛选方法，其特征在于，所述TRPV3基因敲除型小鼠为TRPV3基因第14号和15号外显子部分被PGK-neo基因替换的小鼠。

10.如权利要求5或6所述的筛选方法，其特征在于，所述目标致痒物质选自化合物48/80、氯喹、α-甲基-5羟色胺、PAR2激活剂SLIGRL中的一种或多种；所述化合物选自TRPV3激动剂、TRPV3抑制剂中的一种或多种。