CN103347537A - 抗叶酸受体α抗体糖型 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了具有新型N联中性聚糖谱的抗FRA抗体，因为与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较，一种或多种中性聚糖的相对量是增加的或减少的。本发明还提供了在表达FRA的细胞中具有改变的与FRA结合、改变的抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和/或改变的速率和/或内在化效率的抗FRA抗体。在相关方面，本发明提供了包含本发明的抗FRA抗体的细胞培养物、从此类培养物中分离的细胞、包含本发明的抗FRA抗体的试剂盒和组合物、产生本发明的抗FRA抗体的方法以及本发明的抗FRA抗体的诊断和治疗用途。

Description

抗叶酸受体Α抗体糖型
发明背景
膜结合的叶酸受体结合维生素叶酸且将维生素叶酸转运到细胞内。存在膜结合的叶酸受体的三个主要同种型：α、β和γ。“叶酸受体α”、“FRA”或“FR-α”指膜结合的叶酸受体的α同种型。FRA是单链GPI锚定的膜蛋白质（Kelemen（2006）Int.J.Cancer119:243-250）。α和β同种型具有约70%氨基酸序列同一性并且在其对于一些叶酸的立体特异性中显著不同。两种同种型都在胎儿和成人组织中表达，尽管正常组织一般表达低至中等量的FR-β（或FRB）。然而，FRA在正常上皮细胞子集中表达，并且通常在多种癌中显著升高（Ross等人（1994）Cancer73（9）:2432-2443；Rettig等人（1988）Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:3110-3114；Campbell等人（1991）Cancer Res.51:5329-5338；Coney等人（1991）Cancer Res.51:6125-6132；Weitman等人（1992）Cancer Res.52:3396-3401；Garin-Chesa等人（1993）Am.J.Pathol.142:557-567；Holm等人（1994）APMIS102:413-419；Franklin等人（1994）Int.J.Cancer8（Suppl.）:89-95；Miotti等人（1987）Int.J.Cancer39:297-303；和Vegglan等人（1989）Tumori75:510-513）。FRA在超过90%的卵巢癌中过表达（Sudimack和Lee（2000）Adv.Drug Deliv.Rev.41（2）:147-62）。
相应地，需要关于特别是用于治疗FRA介导的疾病，例如FRA介导的癌症的抗FRA抗体。特别地，需要具有不同性质的抗FRA抗体和用于制备此类抗体的方法和关于使抗体的功能特征适合于多种治疗和诊断用途的方法。例如，可以改变抗FRA抗体的结合亲和力、抗体依赖性细胞毒性、内在化效率和/或内在化速率用于所需用途。
发明概述
在一个方面，本发明涉及具有不同N联中性聚糖谱和/或不同性质的抗人FRA单克隆抗体，特别是MORAb-003单克隆抗体，并且涉及通过下述用于制备和使用此类抗体的方法：将葡萄糖替换为半乳糖作为糖源、降低温度、减少溶解氧（DO）水平、增加CO2水平、将CuCl或丁酸钠加入培养基中或增加同渗容摩或在培养不同时间段后收获抗FRA抗体。本发明还涉及具有改变的结合亲和力、抗体依赖性细胞毒性、内在化效率和/或内在化速率的抗人FRA抗体，特别是MORAb-003抗体，并且涉及通过下述用于产生此类抗体的方法：将葡萄糖替换为半乳糖作为糖源、降低温度、减少溶解氧（DO）水平、增加CO2水平、将CuCl或丁酸钠加入培养基中或增加同渗容摩或在培养不同时间段后收获抗FRA抗体。在另一个方面，本发明涉及通过本文描述的任何方法产生的抗人FRA抗体和包含所述抗体的组合物。在另一个方面，本发明涉及改造为表达抗人FRA抗体，特别是MORAb-003抗体的重和轻链的细胞培养物，其中细胞培养条件包含选自下述的参数：半乳糖补充、减少的DO、降低的温度、丁酸钠或氯化铜补充、高同渗容摩和高CO2。本发明还涉及从此类细胞培养物中分离的宿主细胞。
本发明的特定非限制性实施方案在下述编号段落中阐述。
1.用于在宿主细胞中产生具有所需N联中性聚糖谱的抗人叶酸受体α（FRA）抗体的方法，其中所述宿主细胞包含编码所述抗人FRA抗体的核酸，所述方法包括步骤：
（1）使用葡萄糖作为糖源将宿主细胞培养第一个时间段；和（2）使用半乳糖作为糖源将宿主细胞培养第二个时间段。
2.实施方案1的方法，其中所述宿主细胞从培养起始的第0天到第14天使用半乳糖作为糖源进行培养。
3.实施方案1的方法，其中所述第二个时间段在选自从培养起始的第2天到第10天的一天开始。
4.实施方案1的方法，其中所述第二个时间段在选自从培养起始的第5天到第7天的一天开始。
5.用于产生具有减少的结合亲和力的抗人FRA抗体的方法，其包括步骤：使用葡萄糖作为糖源将包含编码抗人FRA抗体的核酸的宿主细胞培养第一个时间段；和随后使用半乳糖作为糖源将所述宿主细胞培养第二个时间段，其中与通过无半乳糖培养所述宿主细胞而产生的抗人FRA抗体的结合亲和力相比较，所述抗人FRA抗体具有减少的结合亲和力。
6.实施方案5的方法，其中所述抗人FRA抗体的结合亲和力减少至少10%。
7.实施方案5的方法，其中所述抗人FRA抗体的结合亲和力减少至少15%。
8.用于产生具有减少的ADCC的抗人FRA抗体的方法，其包括步骤：使用葡萄糖作为糖源将包含编码抗人FRA抗体的核酸的宿主细胞培养第一个时间段；和随后对于第二个时间段使用半乳糖作为糖源，其中与通过无半乳糖培养所述宿主细胞而产生的抗体的ADCC相比较，所述抗人FRA抗体具有减少的ADCC。
9.实施方案8的方法，其中所述抗人FRA抗体的ADCC减少至少5%。
10.实施方案8的方法，其中所述抗人FRA抗体的结合亲和力减少至少65%。
11.实施方案1、5或8中任一项的方法，其中所述宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。
12.实施方案11的方法，其中所述哺乳动物宿主细胞是衍生自GSCHO（中国仓鼠卵巢）细胞系的重组细胞。
13.实施方案1、5或8中任一项的方法，其中所述葡萄糖浓度是1g/L-4g/L。
14.实施方案1、5或8中任一项的方法，其中所述半乳糖浓度是0.01g/L-20g/L。
15.实施方案14的方法，其中所述半乳糖浓度是1g/L-10g/L。
16.实施方案14的方法，其中所述半乳糖浓度是2g/L-4g/L。
17.用于产生抗人FRA抗体的方法，其包括步骤培养包含编码抗体的核酸的宿主细胞，其中培养的至少部分使用半乳糖作为糖源完成。
18.实施方案17的方法，其中使用半乳糖作为糖源完成的培养的部分是从培养起始的第0天到第14天。
19.实施方案17的方法，其中使用半乳糖作为糖源完成的培养的部分在选自从培养起始的第2天到第10天的一天开始。
20.实施方案17的方法，其中使用半乳糖作为糖源完成的培养的部分在选自从培养起始的第3天到第7天的一天开始。
21.实施方案17的方法，其中所述半乳糖浓度是0.01g/L-20g/L。
22.实施方案17的方法，其中所述半乳糖浓度是1g/L-10g/L。
23.实施方案17的方法，其中所述半乳糖浓度是2g/L-4g/L。
24.实施方案1的方法，其中所述抗人FRA抗体的N联中性聚糖谱包含0-6.3%G0、21-68%G0F、24-63%G1F、0-0.8%G2、3-11%G2F、0-0.39%M3N2、0-0.35%M3N2F、和0-5%MAN5。
25.实施方案1的方法，其中所述抗人FRA抗体的N联中性聚糖谱包含以约1：1：1.7：60：20：16：365：370的比率的M3N2：M3N2F：NA2：NA2F：MAN5：NGA2：NA2G1F：NGA2F。
26.实施方案1、5、8或17中任一项的方法，其中所述抗人FRA抗体包括包含SEQ ID NO：1的重链氨基酸序列和包含SEQ ID NO：2或与SEQ ID NO：2有99%相同的序列的轻链氨基酸序列。
27.实施方案1的方法，其中所述N联中性聚糖谱是在CHO中使用抗体获得的谱，所述抗体包括包含SEQ ID NO：1的重链氨基酸序列和包含SEQ ID NO：2或与SEQ ID NO：2有99%相同的序列的轻链氨基酸序列。
28.实施方案5的方法，其中与通过无半乳糖培养所述宿主细胞而产生的抗体的结合亲和力相比较，所述抗人FRA抗体具有81.3-88.3%的相对结合亲和力。
29.实施方案8的方法，其中与通过无半乳糖培养所述宿主细胞而产生的抗体的ADCC相比较，所述抗人FRA抗体诱导在范围39.0-97.4%中的ADCC。
30.用于在宿主细胞中产生具有所需N联中性聚糖谱的抗人FRA抗体的方法，其中所述宿主细胞包含编码所述抗人FRA抗体的核酸，所述方法包括步骤：
（1）在第一个温度培养宿主细胞；和随后（2）在低于第一个温度的第二个温度培养宿主细胞。
31.实施方案30的方法，其中所述宿主细胞在选自从培养起始的第2天到第10天的一天开始在较低温度培养。
32.实施方案30的方法，其中所述宿主细胞在选自从培养起始的第3天到第5天的一天开始在较低温度培养。
33.用于产生具有增加的内在化速率的抗人FRA抗体的方法，其包括步骤：在第一个温度培养包含编码抗人FRA抗体的核酸的宿主细胞；和随后在低于第一个温度的第二个温度培养宿主细胞；其中与通过在第一个温度培养所述宿主细胞产生的抗体的内在化速率相比较，所述抗人FRA抗体具有增加的内在化速率。
34.实施方案33的方法，其中所述抗人FRA抗体的内在化速率增加至少15%。
35.实施方案33的方法，其中所述抗人FRA抗体的内在化速率增加至少25%。
36.用于产生具有增加的内在化效率的抗人FRA抗体的方法，其包括步骤：在第一个温度培养包含编码抗人FRA抗体的核酸的宿主细胞；和随后在低于第一个温度的第二个温度培养宿主细胞；其中与通过在第一个温度培养所述宿主细胞产生的抗体的内在化效率相比较，所述抗体具有减少的内在化效率。
37.实施方案36的方法，其中所述抗人FRA抗体的内在化效率减少至少15%。
38.实施方案36的方法，其中所述抗人FRA抗体的内在化效率减少至少25%。
39.实施方案30、33、36或230中任一项的方法，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
40.实施方案39的方法，其中所述哺乳动物宿主细胞是衍生自GSCHO（中国仓鼠卵巢）细胞系的重组细胞。
41.实施方案30、33、36或230中任一项的方法，其中宿主细胞在其下生长的所述第一个温度是约36-38℃。
42.实施方案30、33、36或230中任一项的方法，其中所述第二个温度是28-35℃。
43.实施方案42的方法，其中所述第二个温度是30-33℃。
44.实施方案42的方法，其中所述第二个温度是30-31℃。
45.用于产生抗人FRA抗体的方法，其包括步骤培养包含编码抗体的核酸的宿主细胞，其中培养的至少部分在低温完成。
46.实施方案45的方法，其中在低温完成的培养的部分是从培养起始的第0天到第14天。
47.实施方案45的方法，其中在低温完成的培养的部分在选自从培养起始的第2天到第10天的一天开始。
48.实施方案45的方法，其中在低温完成的培养的部分在选自从培养起始的第3天到第5天的一天开始。
49.实施方案45的方法，其中低温是28-35℃。
50.实施方案45的方法，其中低温是30-33℃。
51.实施方案45的方法，其中低温是30-31℃。
52.实施方案30的方法，其中所述抗人FRA抗体的N联中性聚糖谱包含0-6.3%G0、21-68%G0F、24-63%G1F、0-0.8%G2、3-11%G2F、0-0.39%M3N2、0-0.35%M3N2F、和0-5%MAN5。
53.实施方案33的方法，其中与通过在所述第一个温度单独产生的抗体的内在化速率相比较，所述抗人FRA抗体以117-143%的速率内在化到靶细胞内。
54.实施方案30、33、36、45或230中任一项的方法，其中所述抗人FRA抗体包括包含SEQ ID NO：1的重链氨基酸序列和包含SEQ IDNO：2或与SEQ ID NO：2的99%相同的序列的轻链氨基酸序列。
55.用于在宿主细胞中产生具有所需N联中性聚糖谱的抗人FRA抗体的方法，其中所述宿主细胞包含编码所述抗人FRA抗体的核酸，所述方法包括步骤：
（1）在正常同渗容摩在细胞培养基中培养宿主细胞；和随后（2）在高同渗容摩细胞培养基中培养宿主细胞。
56.用于产生具有减少的结合亲和力的抗人FRA抗体的方法，其包括步骤:在正常同渗容摩在细胞培养基中培养包含编码抗人FRA抗体的核酸的宿主细胞；和随后在高同渗容摩细胞培养基中培养宿主细胞。
57.实施方案56的方法，其中与通过在正常同渗容摩在培养基中培养所述宿主细胞产生的抗体的结合亲和力相比较，所述抗人FRA抗体的结合亲和力减少至少25%。
58.实施方案56的方法，其中与通过在正常同渗容摩在培养基中培养所述宿主细胞产生的抗体的结合亲和力相比较，所述抗人FRA抗体的结合亲和力减少至少40%。
59.用于产生具有减少的ADCC的抗人FRA抗体的方法，其包括步骤:在正常同渗容摩在细胞培养基中培养包含编码抗人FRA抗体的核酸的宿主细胞；和随后在高同渗容摩细胞培养基中培养宿主细胞。
60.实施方案59的方法，其中与通过在正常同渗容摩在培养基中培养所述宿主细胞产生的抗体的结合亲和力相比较，所述抗人FRA抗体的ADCC减少至少50%。
61.实施方案59的方法，其中与通过在正常同渗容摩在培养基中培养所述宿主细胞产生的抗体的结合亲和力相比较，所述抗人FRA抗体的ADCC减少至少65%。
62.用于产生具有增加的内在化速率的抗人FRA抗体的方法，其包括步骤:在正常同渗容摩在细胞培养基中培养包含编码抗人FRA抗体的核酸的宿主细胞；和随后在高同渗容摩细胞培养基中培养宿主细胞。
63.实施方案62的方法，其中与通过在正常同渗容摩在培养基中培养所述宿主细胞产生的抗体的结合亲和力相比较，所述抗人FRA抗体的内在化速率增加至少5%。
64.实施方案62的方法，其中与通过在正常同渗容摩在培养基中培养所述宿主细胞产生的抗体的结合亲和力相比较，所述抗人FRA抗体的内在化速率增加至少10%。
65.用于产生具有减少的内在化效率的抗人FRA抗体的方法，其包括步骤:在正常同渗容摩在细胞培养基中培养包含编码抗人FRA抗体的核酸的宿主细胞；和随后在高同渗容摩细胞培养基中培养宿主细胞。
66.实施方案65的方法，其中所述抗人FRA抗体的内在化效率减少至少98.6%。
67.实施方案55、56、59、62或65中任一项的方法，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
68.实施方案67的方法，其中所述宿主细胞是衍生自GS CHO（中国仓鼠卵巢）细胞系的重组细胞。
69.实施方案55、56、59、62或65中任一项的方法，其中所述细胞培养基的正常同渗容摩在范围250-350mOsm/L中。
70.实施方案55、56、59、62或65中任一项的方法，其中所述高同渗容摩培养基的同渗容摩是360-800mOsm/L。
71.实施方案70的方法，其中所述高同渗容摩培养基的同渗容摩是400-650mOsm/L。
72.用于产生抗人FRA抗体的方法，其包括步骤:培养包含编码所述抗体的核酸的宿主细胞，其中培养的至少部分在高同渗容摩完成。
73.实施方案72的方法，其中在高同渗容摩完成的培养的部分是从培养起始的第0天到第14天。
74.实施方案72的方法，其中在高同渗容摩完成的培养的部分在选自从培养起始的第2天到第10天的一天开始。
75.实施方案72的方法，其中在高同渗容摩完成的培养的部分在选自从培养起始的第3天到第5天的一天开始。
76.实施方案72的方法，其中所述高同渗容摩是360-800mOsm/L。
77.实施方案72的方法，其中所述高同渗容摩是400-650mOsm/L。
78.实施方案55的方法，其中所述抗人FRA抗体的N联中性聚糖谱包含0-7%G0、49-95%G0F、0-39%G1F、0-0.7%G2、0-6%G2F、0-0.35%M3N2、0.04-0.46%M3N2F、和1.2-5.6%MAN5。
79.实施方案56的方法，其中与通过在正常同渗容摩在细胞培养基中培养所述宿主细胞产生的抗体的结合亲和力相比较，所述抗人FRA抗体具有66.8-78.9%的相对结合亲和力。
80.实施方案62的方法，其中与通过在正常同渗容摩在细胞培养基中培养所述宿主细胞产生的抗体的ADCC相比较，所述抗人FRA抗体诱导在101%的范围中的ADCC。
81.实施方案62的方法，其中与通过在正常同渗容摩在细胞培养基中培养所述宿主细胞产生的抗体的内在化速率相比较，所述抗人FRA抗体以107%的速率内在化到靶细胞内。
82.实施方案65的方法，其中与通过在正常同渗容摩在细胞培养基中培养所述宿主细胞产生的抗体的内在化效率相比较，所述抗人FRA抗体以1.40-1.42%的效率内在化到靶细胞内。
83.实施方案55、56、59、62、65或72中任一项的方法，其中所述抗人FRA抗体包括包含SEQ ID NO：1的重链氨基酸序列和包含SEQ IDNO：2或与SEQ ID NO：2有99%相同的序列的轻链氨基酸序列。
84.用于在宿主细胞中产生抗人FRA抗体的所需N联中性聚糖谱的方法，其中所述宿主细胞包含编码所述抗人FRA抗体的核酸，所述方法包括步骤：
（1）在正常细胞培养基中培养宿主细胞；和随后（2）将丁酸钠加入正常细胞培养基中。
85.用于产生具有减少的结合亲和力的抗人FRA抗体的方法，其包括步骤:在正常细胞培养基中培养包含编码抗人FRA抗体的核酸的宿主细胞；和随后将丁酸钠加入正常细胞培养基中。
86.实施方案85的方法，其中与通过在正常细胞培养基中培养所述宿主细胞产生的抗体的结合亲和力相比较，所述抗人FRA抗体的结合亲和力减少至少40%。
87.实施方案85的方法，其中与通过在正常细胞培养基中培养所述宿主细胞产生的抗体的结合亲和力相比较，所述抗人FRA抗体的结合亲和力减少至少50%。
88.用于产生具有减少的ADCC的抗人FRA抗体的方法，其包括步骤:在正常细胞培养基中培养包含编码抗人FRA抗体的核酸的宿主细胞；和随后将丁酸钠加入正常细胞培养基中。
89.实施方案88的方法，其中与通过在正常细胞培养基中培养所述宿主细胞产生的抗体的ADCC相比较，所述抗人FRA抗体的ADCC减少至少25%。
90.实施方案88的方法，其中与通过在正常细胞培养基中培养所述宿主细胞产生的抗体的ADCC相比较，所述抗人FRA抗体的ADCC减少至少50%。
91.用于产生具有减少的内在化效率的抗人FRA抗体的方法，其包括步骤:培养包含编码抗人FRA抗体的核酸的宿主细胞，在正常细胞培养基中培养宿主细胞；和随后将丁酸钠加入正常细胞培养基中。
92.实施方案91的方法，其中与通过在正常细胞培养基中培养所述宿主细胞产生的抗体的内在化效率相比较，所述抗人FRA抗体的内在化效率减少至少20%。
93.实施方案91的方法，其中与通过在正常细胞培养基中培养所述宿主细胞产生的抗体的内在化效率相比较，所述抗人FRA抗体的内在化效率减少至少50%。
94.实施方案84、85、88或91中任一项的方法，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
95.实施方案94的方法，其中所述宿主细胞是衍生自GS CHO（中国仓鼠卵巢）细胞系的重组细胞。
96.实施方案84、85、88或91中任一项的方法，其中所述正常细胞培养基不含丁酸钠。
97.实施方案84、85、88或91中任一项的方法，其中所述丁酸钠浓度是0.5mM。
98.实施方案84、85、88或91中任一项的方法，其中所述丁酸钠浓度是10mM。
99.用于产生抗人FRA抗体的方法，其包括步骤:培养包含编码抗体的核酸的宿主细胞，其中培养的至少部分在包含丁酸钠的培养基中完成。
100.实施方案99的方法，其中在包含丁酸钠的培养基中完成的培养的部分是从培养起始的第0天到第14天。
101.实施方案99的方法，其中在包含丁酸钠的培养基中完成的培养的部分在选自从培养起始的第2天到第10天的一天开始。
102.实施方案99的方法，其中在包含丁酸钠的培养基中完成的培养的部分在选自从培养起始的第3天到第7天的一天开始。
103.实施方案99的方法，其中所述丁酸钠浓度是0.01mM-90mM。
104.实施方案99的方法，其中所述丁酸钠浓度是0.01mM-16mM。
105.实施方案99的方法，其中所述丁酸钠浓度是0.5mM-10mM。
106.实施方案84的方法，其中所述抗人FRA抗体的N联中性聚糖谱包含0-8%G0、39-86%G0F、9-48%G1F、0-1.0%G2、0-7%G2F、0-0.41%M3N2、0.03-0.45%M3N2F、和0-4.4%MAN5。
107.实施方案85的方法，其中与通过在正常细胞培养基中培养所述宿主细胞产生的抗体的结合亲和力相比较，所述抗人FRA抗体具有59-64%的相对结合亲和力。
108.实施方案85的方法，其中与通过在正常细胞培养基中培养所述宿主细胞产生的抗体的结合亲和力相比较，所述抗人FRA抗体具有44-55%的相对结合亲和力。
109.实施方案88的方法，其中与通过在正常细胞培养基中培养所述宿主细胞产生的抗体的ADCC相比较，所述抗人FRA抗体诱导在范围26-91%中的抗体依赖性细胞毒性。
110.实施方案91的方法，其中与通过在正常细胞培养基中培养所述宿主细胞产生的抗体的内在化效率相比较，所述抗人FRA抗体以45-84%的效率内在化到靶细胞内。
111.实施方案84、85、88、91或99中任一项的方法，其中所述抗人FRA抗体包括包含SEQ ID NO：1的重链氨基酸序列和包含SEQ IDNO：2或与SEQ ID NO：2有99%相同的序列的轻链氨基酸序列。
112.用于在宿主细胞中产生抗人FRA抗体的所需N联中性聚糖谱的方法，其中所述宿主细胞包含编码所述抗人FRA抗体的核酸，所述方法包括步骤：
（1）在第一个溶解氧（DO）浓度培养宿主细胞；和随后（2）在低于第一个DO浓度的第二个DO浓度培养宿主细胞。
113.用于产生具有减少的结合亲和力的抗人FRA抗体的方法，其包括步骤:在第一个DO浓度培养包含编码所述抗人FRA抗体的核酸的宿主细胞；和随后在低于第一个DO浓度的第二个DO浓度培养宿主细胞。
114.实施方案113的方法，其中与通过在第一个DO浓度培养所述宿主细胞产生的抗体的结合亲和力相比较，所述抗人FRA抗体的结合亲和力减少至少30%。
115.实施方案113的方法，其中与通过在第一个DO浓度培养所述宿主细胞产生的抗体的结合亲和力相比较，所述抗人FRA抗体的结合亲和力减少至少50%。
116.用于产生具有增加的ADCC的抗人FRA抗体的方法，其包括步骤:在第一个DO浓度培养包含编码所述抗人FRA抗体的核酸的宿主细胞；和随后在低于第一个DO浓度的第二个DO浓度培养宿主细胞。
117.实施方案116的方法，其中与通过在第一个DO浓度培养所述宿主细胞产生的抗体的ADCC相比较，所述抗人FRA抗体的ADCC增加至少25%。
118.实施方案116的方法，其中与通过在第一个DO浓度培养所述宿主细胞产生的抗体的ADCC相比较，所述抗人FRA抗体的ADCC增加至少50%。
119.用于产生具有减少的内在化效率的抗人FRA抗体的方法，其包括步骤:在第一个DO浓度培养包含编码所述抗人FRA抗体的核酸的宿主细胞；和随后在低于第一个DO浓度的第二个DO浓度培养宿主细胞。
120.实施方案119的方法，其中与通过在第一个DO浓度培养所述宿主细胞产生的抗体的内在化效率相比较，所述抗人FRA抗体的内在化效率减少至少30%。
121.实施方案119的方法，其中与通过在第一个DO浓度培养所述宿主细胞产生的抗体的内在化效率相比较，所述抗人FRA抗体的内在化效率减少至少60%。
122.实施方案112、113、116或119中任一项的方法，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
123.实施方案122的方法，其中所述宿主细胞是衍生自GS CHO（中国仓鼠卵巢）细胞系的重组细胞。
124.实施方案112、113、116或119中任一项的方法，其中宿主细胞可以在其下生长的所述第一个溶解氧浓度是30%-100%。
125.实施方案112、113、116或119中任一项的方法，其中所述第二个DO浓度是0%-25%。
126.用于产生抗人FRA抗体的方法，其包括步骤:培养包含编码抗体的核酸的宿主细胞，其中培养的至少部分在低DO完成。
127.实施方案126的方法，其中在低DO完成的培养的部分是从培养起始的第0天到第14天。
128.实施方案126的方法，其中在低DO完成的培养的部分在选自从培养起始的第2天到第10天的一天开始。
129.实施方案126的方法，其中在低DO完成的培养的部分在选自从培养起始的第3天到第7天的一天开始。
130.实施方案126的方法，其中低DO是0%-30%。
131.实施方案130的方法，其中低DO是5%-25%。
132.实施方案130的方法，其中低DO是5%-10%。
133.实施方案112的方法，其中所述抗人FRA抗体的N联中性聚糖谱包含2-11%G0、32-79%G0F、12-52%G1F、0-1.0%G2、0-7%G2F、0-0.28%M3N2、0.01-0.43%M3N2F、和0.1-4.4%MAN5。
134.实施方案113的方法，其中与通过在第一个DO浓度培养所述宿主细胞产生的抗体的结合亲和力相比较，所述抗人FRA抗体具有50-63%的相对结合亲和力。
135.实施方案116的方法，其中与通过在第一个DO浓度培养所述宿主细胞产生的抗体的ADCC相比较，所述抗人FRA抗体诱导在大于100%到大于或等于200%的范围中的抗体依赖性细胞毒性。
136.实施方案119的方法，其中与通过在第一个DO浓度培养所述宿主细胞产生的抗体的内在化效率相比较，所述抗人FRA以39-64%的效率内在化到靶细胞内。
137.实施方案112、113、116、119或126中任一项的方法，其中所述抗人FRA抗体包括包含SEQ ID NO：1的重链氨基酸序列和包含SEQID NO：2或与SEQ ID NO：2有99%相同的序列的轻链氨基酸序列。
138.用于在宿主细胞中产生抗人FRA抗体的所需N联中性聚糖谱的方法，其中所述宿主细胞包含编码所述抗人FRA抗体的核酸，所述方法包括步骤：
（1）在第一个CO2浓度培养宿主细胞；和随后（2）在高于第一个CO2浓度的第二个CO2浓度培养宿主细胞。
139.用于产生具有减少的结合亲和力的抗人FRA抗体的方法，其包括步骤:在第一个CO2浓度培养包含编码所述抗人FRA抗体的核酸的宿主细胞；和随后在高于第一个CO2浓度的第二个CO2浓度培养宿主细胞。
140.实施方案139的方法，其中与通过在第一个CO2浓度培养所述宿主细胞产生的抗体的结合亲和力相比较，所述抗人FRA抗体的结合亲和力减少至少25%。
141.实施方案139的方法，其中与通过在第一个CO2浓度培养所述宿主细胞产生的抗体的结合亲和力相比较，所述抗人FRA抗体的结合亲和力减少至少50%。
142.用于产生具有减少的ADCC的抗人FRA抗体的方法，其包括步骤:在第一个CO2浓度培养包含编码所述抗人FRA抗体的核酸的宿主细胞；和随后在高于第一个CO2浓度的第二个CO2浓度培养宿主细胞。
143.实施方案142的方法，其中与通过在第一个CO2浓度培养所述宿主细胞产生的抗体的ADCC相比较，所述抗人FRA抗体的ADCC减少至少50%。
144.实施方案142的方法，其中与通过在第一个CO2浓度培养所述宿主细胞产生的抗体的ADCC相比较，所述抗人FRA抗体的ADCC减少至少65%。
145.用于产生具有增加的内在化速率的抗人FRA抗体的方法，其包括步骤:在第一个CO2浓度培养包含编码所述抗人FRA抗体的核酸的宿主细胞；和随后在高于第一个CO2浓度的第二个CO2浓度培养宿主细胞。
146.实施方案145的方法，其中与通过在第一个CO2浓度培养所述宿主细胞产生的抗体的内在化速率相比较，所述抗人FRA抗体的内在化速率增加至少5%。
147.实施方案145的方法，其中与通过在第一个CO2浓度培养所述宿主细胞产生的抗体的内在化速率相比较，所述抗人FRA抗体的内在化速率增加至少25%。
148.用于产生具有减少的内在化效率的抗人FRA抗体的方法，其包括步骤:在第一个CO2浓度培养包含编码所述抗人FRA抗体的核酸的宿主细胞；和随后在高于第一个CO2浓度的第二个CO2浓度培养宿主细胞。
149.实施方案148的方法，其中与通过在第一个CO2浓度培养所述宿主细胞产生的抗体的内在化效率相比较，所述抗人FRA抗体的内在化效率减少至少25%。
150.实施方案148的方法，其中与通过在第一个CO2浓度培养所述宿主细胞产生的抗体的内在化效率相比较，所述抗人FRA抗体的内在化效率减少至少50%。
151.实施方案138、139、142、145或148中任一项的方法，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
152.实施方案151的方法，其中所述宿主细胞是衍生自GS CHO（中国仓鼠卵巢）细胞系的重组细胞。
153.实施方案138、139、142、145或148中任一项的方法，其中所述第一个CO2浓度是约5%或更少。
154.实施方案138、139、142、145或148中任一项的方法，其中所述更高的CO2浓度是10%-30%。
155.用于产生抗人FRA抗体的方法，其包括步骤培养包含编码抗体的核酸的宿主细胞，其中培养的至少部分在高CO2浓度完成。
156.实施方案155的方法，其中在高CO2浓度完成的培养的部分是从培养起始的第0天到第14天。
157.实施方案155的方法，其中在高CO2浓度完成的培养的部分在选自从培养起始的第2天到第10天的一天开始。
158.实施方案155的方法，其中在高CO2浓度完成的培养的部分在选自从培养起始的第3天到第7天的一天开始。
159.实施方案155的方法，其中高CO2浓度是10%-30%。
160.实施方案155的方法，其中高CO2浓度是20%。
161.实施方案138的方法，其中所述抗人FRA抗体的N联中性聚糖谱包含0-7%G0、50-97%G0F、0-39%G1F、0-0.7%G2、0-6%G2F、0-0.46%M3N2、0.06-0.48%M3N2F、和0-3.8%MAN5。
162.实施方案139的方法，其中与通过在第一个CO2浓度培养所述宿主细胞产生的抗体的结合亲和力相比较，所述抗人FRA抗体具有45-56%的相对结合亲和力。
163.实施方案142的方法，其中与通过在第一个CO2浓度培养所述宿主细胞产生的抗体的ADCC相比较，所述抗人FRA抗体诱导在23-89%的范围中的ADCC。
164.实施方案145的方法，其中与通过在第一个CO2浓度培养所述宿主细胞产生的抗体的内在化效率相比较，所述抗人FRA抗体以105-125%的效率内在化到靶细胞内。
165.实施方案148的方法，其中与通过在第一个CO2浓度培养所述宿主细胞产生的抗体的内在化效率相比较，所述抗人FRA抗体以40-68%的效率内在化到靶细胞内。
166.实施方案138、139、142、145、148或155中任一项的方法，其中所述抗人FRA抗体包括包含SEQ ID NO：1的重链氨基酸序列和包含SEQ ID NO：2或与SEQ ID NO：2有99%相同的序列的轻链氨基酸序列。
167.用于在宿主细胞中产生抗人FRA抗体的所需N联中性聚糖结构的方法，其中所述宿主细胞包含编码所述抗人FRA抗体的核酸，所述方法包括步骤：
（1）在正常细胞培养基中培养宿主细胞；和随后（2）将氯化铜加入正常细胞培养基中。
168.用于产生具有减少的结合亲和力的抗人FRA抗体的方法，其包括步骤:培养包含编码抗人FRA抗体的核酸的宿主细胞，在宿主细胞可以在其中生长的正常细胞培养基中培养宿主细胞；和随后将氯化铜加入正常细胞培养基中。
169.实施方案168的方法，其中与通过在正常细胞培养基中培养所述宿主细胞产生的抗体的结合亲和力相比较，所述抗人FRA抗体的结合亲和力减少至少40%。
170.实施方案168的方法，其中与通过在正常细胞培养基中培养所述宿主细胞产生的抗体的结合亲和力相比较，所述抗人FRA抗体的结合亲和力减少至少50%。
171.用于产生具有减少的ADCC的抗人FRA抗体的方法，其包括步骤:在正常细胞培养基中培养包含编码抗人FRA抗体的核酸的宿主细胞；和随后将氯化铜加入正常细胞培养基中。
172.实施方案171的方法，其中与通过在正常细胞培养基中培养所述宿主细胞产生的抗体的ADCC相比较，所述抗人FRA抗体的ADCC减少至少20%。
173.实施方案171的方法，其中与通过在正常细胞培养基中培养所述宿主细胞产生的抗体的ADCC相比较，所述抗人FRA抗体的ADCC减少至少80%。
174.用于产生具有减少的内在化效率的抗人FRA抗体的方法，其包括步骤:在正常细胞培养基中培养包含编码抗人FRA抗体的核酸的宿主细胞；和随后将氯化铜加入正常细胞培养基中。
175.实施方案174的方法，其中与通过在正常细胞培养基中培养所述宿主细胞产生的抗体的内在化效率相比较，所述抗人FRA抗体的内在化效率减少至少30%。
176.实施方案174的方法，其中与通过在正常细胞培养基中培养所述宿主细胞产生的抗体的内在化效率相比较，所述抗人FRA抗体的内在化效率减少至少60%。
177.实施方案167、168、171或174中任一项的方法，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
178.实施方案177的方法，其中所述宿主细胞是衍生自GS CHO（中国仓鼠卵巢）细胞系的重组细胞。
179.实施方案167、168、171或174中任一项的方法，其中所述正常细胞培养基不含氯化铜。
180.实施方案167、168、171或174中任一项的方法，其中所述氯化铜浓度是0.01μM-0.5mM。
181.用于产生抗人FRA抗体的方法，其包括步骤：培养包含编码抗体的核酸的宿主细胞，其中培养的至少部分在包含氯化铜的培养基中完成。
182.实施方案181的方法，其中在包含氯化铜的培养基中完成的培养的部分是从培养起始的第0天到第14天。
183.实施方案181的方法，其中在包含氯化铜的培养基中完成的培养的部分在选自从培养起始的第2天到第10天的一天开始。
184.实施方案181的方法，其中在包含氯化铜的培养基中完成的培养的部分在选自从培养起始的第3天到第6天的一天开始。
185.实施方案181的方法，其中所述氯化铜浓度是0.01μM-0.5mM。
186.实施方案181的方法，其中所述氯化铜浓度是0.01mM-0.5mM。
187.实施方案181的方法，其中所述氯化铜浓度是0.5mM。
188.实施方案167的方法，其中所述抗人FRA抗体的N联中性聚糖谱包含0-8%G0、34-81%G0F、13-53%G1F、0-0.7%G2、0-7%G2F、0.07-0.61%M3N2、0.16-0.58%M3N2F、和0-4.3%MAN5。
189.实施方案的方法，其中与通过在正常细胞培养基中培养所述宿主细胞产生的抗体的结合亲和力相比较，所述抗人FRA抗体具有41-56%的相对结合亲和力。
190.实施方案171的方法，其中与通过在正常细胞培养基中培养所述宿主细胞产生的抗体的ADCC相比较，所述抗人FRA抗体诱导在21-87%的范围中的抗体依赖性细胞毒性。
191.实施方案174的方法，其中与通过在正常细胞培养基中培养所述宿主细胞产生的抗体的内在化效率相比较，所述抗人FRA抗体以41-71%的效率内在化到靶细胞内。
192.实施方案167、168、171、174或181中任一项的方法，其中所述抗人FRA抗体包括包含SEQ ID NO：1的重链氨基酸序列和包含SEQID NO：2或与SEQ ID NO：2有99%相同的序列的轻链氨基酸序列。
193.改变选自下述的抗人FRA抗体的一种或多种性质的方法：
a）抗人FRA抗体的N联中性聚糖谱；
b）结合亲和力；
c）ADCC；
d）内在化速率；和
e）内在化效率；
其包括步骤：培养包含编码所述抗人FRA抗体的核酸的宿主细胞，并且在培养起始后小于13天或超过15天的时间收获产生抗人FRA抗体的宿主细胞。
194.实施方案193的方法，其中与通过在培养起始后13-15天收获的细胞产生的抗体的结合亲和力相比较，抗人FRA抗体的结合亲和力是减少的。
195.实施方案193的方法，其中与通过在培养起始后13-15天收获的细胞产生的抗体的结合亲和力相比较，抗人FRA抗体的结合亲和力减少至少25%。
196.实施方案193的方法，其中与通过在培养起始后13-15天收获的细胞产生的抗体的结合亲和力相比较，抗人FRA抗体的结合亲和力减少至少50%。
197.实施方案193的方法，其中与在培养起始后13-15天时收获的抗体相比较，抗人FRA抗体的ADCC是减少的。
198.实施方案194的方法，其中与在培养起始后13-15天时收获的抗体相比较，抗人FRA抗体的ADCC减少至少50%。
199.实施方案195的方法，其中与在培养起始后13-15天时收获的抗体相比较，抗人FRA抗体的ADCC减少至少65%。
200.实施方案193的方法，其中与在培养起始后13-15天时收获的抗体相比较，抗人FRA抗体的内在化速率是增加的。
201.实施方案193的方法，其中与在培养起始后13-15天时收获的抗体相比较，抗人FRA抗体的内在化速率增加至少5%。
202.实施方案193的方法，其中与在培养起始后13-15天时收获的抗体相比较，抗人FRA抗体的内在化速率增加至少25%。
203.实施方案193的方法，其中与在培养起始后13-15天时收获的抗体相比较，抗人FRA抗体的内在化效率是减少的。
204.实施方案193的方法，其中与在培养起始后13-15天时收获的抗体相比较，抗人FRA抗体的内在化效率减少至少25%。
205.实施方案193的方法，其中与在培养起始后13-15天时收获的抗体相比较，抗人FRA抗体的内在化效率减少至少50%。
206.用于产生抗人FRA抗体的方法，其包括步骤：培养包含编码抗体的核酸的宿主细胞，其中宿主细胞在从培养开始13天前的时间或15天后的时间收获。
207.实施方案193或206的方法，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
208.实施方案207的方法，其中所述哺乳动物宿主细胞是衍生自GS CHO（中国仓鼠卵巢）细胞系的重组细胞。
209.实施方案193或206的方法，其中所述收获时间选自：在培养起始后240小时-312小时的时间和在培养起始后360小时-480小时的时间。
210.实施方案209的方法，其中所述收获时间是在培养起始后240小时。
211.实施方案209的方法，其中所述收获时间是在培养起始后408小时。
212.实施方案209的方法，其中所述收获时间是在培养起始后480小时。
213.实施方案193或206的方法，其中所述抗人FRA抗体包括包含SEQ ID NO：1的重链氨基酸序列和包含SEQ ID NO：2或与SEQ IDNO：2有99%相同的序列的轻链氨基酸序列。
214.包含改造为表达抗人FRA抗体的重和轻链的真核宿主细胞的细胞培养物，其中细胞培养条件包含选自下述的参数：半乳糖补充、减少的溶解氧（DO）、降低的温度、丁酸钠、氯化铜、高同渗容摩和高CO2。
215.实施方案214的细胞培养物，其中所述DO水平是0%-约25%。
216.实施方案214的细胞培养物，其中所述CO2浓度是约10%-约30%。
217.实施方案214的细胞培养物，其中所述温度是：28℃-约35℃。
218.实施方案214的细胞培养物，其中所述半乳糖浓度是0.01g/L-20g/L。
219.实施方案214的细胞培养物，其中所述丁酸钠浓度是0.5mM-10mM。
220.实施方案214的细胞培养物，其中所述氯化铜浓度是0.01μM-0.5mM。
221.实施方案214的细胞培养物，其中所述细胞培养物的同渗容摩是360-800mOsm/L。
222.实施方案214的细胞培养物，其中所述真核宿主细胞是CHO细胞。
223.实施方案222的细胞培养物，其中所述CHO细胞是CHO-K1细胞。
224.实施方案214的细胞培养物，其中所述抗人FRA抗体包含IgG1同种型的人重链恒定区。
225.实施方案214的细胞培养物，其中所述抗人FRA抗体包括包含SEQ ID NO：1的重链氨基酸序列和包含SEQ ID NO：2或与SEQ IDNO：2有99%相同的序列的轻链氨基酸序列。
226.从实施方案214的细胞培养物中分离的宿主细胞。
227.通过实施方案1、5、8、17、30、33、36、45、55、56、59、62、65、72、85、88、91.99、113、116、119、126、139、142、145、148、155、168、171、174、181、206或230中任一项的方法产生的抗人FRAα抗体或所述抗体的抗原结合部分。
228.组合物，其包含实施方案227的抗人FRA抗体和药学可接受的载体。
229.实施方案228的组合物，其还包含另外的治疗剂。
230.用于产生具有增加的ADCC的抗人FRA抗体的方法，其包括步骤：在第一个温度培养包含编码抗人FRA抗体的核酸的宿主细胞；和随后在低于第一个温度的第二个温度培养宿主细胞。
231.从实施方案225的细胞培养物中分离的宿主细胞。
232.实施方案227的抗人FRAα抗体，其中所述抗人FRA抗体包括包含SEQ ID NO：1的重链氨基酸序列和包含SEQ ID NO：2或与SEQID NO：2有99%相同的序列的轻链氨基酸序列。
233.组合物，其包含实施方案232的抗人FRA抗体和药学可接受的载体。
附图简述
图1A-1H显示从抗FRA抗体中回收的中性N联抗体聚糖结构的图解。该图描述了部分加工的聚糖结构M3N2（图1A）、M3N2F（图1B）、MAN5（图1C），以及完全加工的聚糖结构NGA2（G0）（图1D）、NGA2F（G0F）（图1E）、NA2G1F（G1F）（图1F）、NA2（G2）（图1G）和NA2F（G2F）（图1H）。
图2是显示从通过在多个条件下培养的宿主细胞产生的抗FRA抗体中回收的中性N联抗体聚糖结构分布的图表。“阳性对照”代表通过在表3中作为“阳性对照”列出的条件下培养的宿主细胞产生的抗FRA抗体。“MORAb-003参考标准”代表具有包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的重链氨基酸序列和包含SEQ ID NO：7中的氨基酸序列的轻链氨基酸序列的抗FRA抗体，其在如本文定义的“参考培养条件”下产生，并且由外部制造商供应。对应于“半乳糖补充”、“低温”、“高同渗容摩”、“0.5mM丁酸钠”、“低DO”、“高CO2”、“10mM丁酸钠”、“CuCl补充”、“第10天收获”、“第14天收获”、“第17天收获”和“第20天收获”的宿主细胞培养条件在实施例1中描述。
图3是显示从通过在多个条件下培养的宿主细胞产生的抗FRA抗体中回收的中性N联抗体聚糖结构分布的表。“MORAb-003参考标准”是如与图2结合描述的抗体。
图4是显示通过在多个条件下培养的宿主细胞产生的抗FRA抗体的FRA结合亲和力的表。
图5是显示通过在多个条件下培养的宿主细胞产生的抗FRA抗体的ADCC的表。
图6是在ADCC（y轴）和抗FRA抗体中的聚糖NGA2（G0）的相对浓度（%）（x轴）之间的关联的杠杆曲线图。
图7是在ADCC（y轴）和抗FRA抗体中的非岩藻糖化聚糖的相对浓度（%）（x轴）之间的关联的杠杆曲线图。
图8是在ADCC（y轴）和抗FRA抗体中的聚糖M3N2F的相对浓度（%）（x轴）之间的关联的杠杆曲线图。
图9是显示测量抗FRA抗体的内在化的实验结果的曲线图。抗FRA抗体的内在化通过使用抗人次级免疫毒素根据FRA表达细胞增殖的抑制进行测量。OD540显示在y轴上。抗FRA抗体的浓度显示在x轴上。“参考标准”指与图2结合描述的MORAb-003抗体。
图10是显示导致FRA表达细胞增殖的50%抑制（IC50）的抗FRA抗体浓度计算的表。“参考标准”指与图2结合描述的MORAb-003抗体。
图11是显示测量抗FRA抗体的内在化活性的FACS结合实验结果的直方图。“参考标准”指与图2结合描述的MORAb-003抗体。阴影面积（P1群体）对应于与FITC缀合的抗人IgG抗体一起温育的细胞。P2群体（0%对照）对应于与作为对照的无关人IgG和FITC缀合的抗人IgG抗体一起温育的细胞。P3群体对应于与抗FRA抗体和FITC缀合的抗人IgG抗体一起温育且用酸性甘氨酸缓冲液洗涤的细胞。P4群体（100%对照）对应于与抗FRA抗体和FITC缀合的抗人IgG抗体一起温育伴随PBS缓冲液洗涤的细胞。
图12是显示测量抗FRA抗体的内在化活性的FACS结合实验结果的曲线图，所述抗FRA抗体在如本文定义的“参考培养条件”下产生，并且由外部制造商供应。通过FRA表达细胞群体的流式细胞术测量的平均荧光强度（MFI）百分比（y轴）描述为相对于在每个时间点的总结合的时间（x轴）的函数。
图13是显示测量表4中所述的抗FRA抗体以及对照抗FRA抗体的内在化活性的FACS结合实验结果的曲线图。通过FRA表达细胞群体的流式细胞术测量的MFI百分比（y轴）描述为相对于在每个时间点的总结合的时间（x轴）的函数。“MORAb-003参考标准”指与图2结合描述的MORAb-003抗体。
图14是根据时间的抗FRA抗体内在化百分比的拟合模型，其中Log（激动剂）与应答-可变斜率比较。“参考标准”指与图2结合描述的MORAb-003抗体。
图15是概括实施例5中所述的FACS内在化研究的结果的表。
图16是概括与抗FRA抗体的结合亲和力、ADCC、内在化速率和内在化效率有关的数据的表。“MORAb-003参考标准”指与图2结合描述的MORAb-003抗体。
发明详述
本发明部分基于令人惊讶的发现：通过改变用于抗FRA抗体特别是MORAb-003抗FRA单克隆抗体的重组生产的特定细胞培养条件，可以改变抗体的N联中性聚糖谱，并且在一些情况下，改变抗FRA抗体的一种或多种性质。特别地，本发明人已发现可以通过下述改变抗FRA抗体的N联中性聚糖谱：将葡萄糖替换为半乳糖作为糖源、降低温度、减少溶解氧（DO）水平、增加CO2水平、将CuCl或丁酸钠加入培养基中、增加同渗容摩或在培养不同时间段后收获抗FRA抗体，并且前述培养条件各自改变N联中性聚糖谱。即，相对于在如本文定义的参考条件下产生的抗FRA抗体谱中所述聚糖的量，构成谱的一种或多种中性聚糖以增加或减少的量存在。具有改变的N联中性聚糖的抗FRA单克隆抗体例如MORAb-003抗体用作备选治疗分子，因为此类分子可以具有一种或多种期望性质，包括但不限于改变的pK和或pD、改变的半衰期、改善的可溶性、减少的免疫原性或减少的副作用。本发明人进一步发现在这些条件中的任何下产生抗FRA抗体改变抗FRA抗体的结合亲和力、ADCC、内在化速率和/或内在化效率。
相应地，在一个方面，本发明提供了具有新型N联中性聚糖谱的抗FRA抗体，因为与在如本文定义的参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较，一种或多种中性聚糖的相对量是增加的或减少的。本发明还提供了在表达FRA的细胞中具有改变（一般减少）的与FRA结合、改变的抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和/或改变的内在化速率和/或内在化效率的抗FRA抗体。在多个实施方案中，抗FRA抗体包含SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：5的重链氨基酸序列或至少95%等同的序列，和SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的轻链氨基酸序列或至少95%等同的序列。在特定实施方案中，抗体包含SEQ ID NO：1的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO：2的轻链氨基酸序列99%相同的轻链氨基酸序列，SEQ ID NO：1的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：6的轻链氨基酸序列，或SEQ ID NO：5的重链氨基酸序列、SEQ ID NO：7的轻链氨基酸序列，或与上述序列至少95%等同的序列（Ebel等人，（2007）Cancer Immunity，7:6）。在一些实施方案中，抗FRA抗体具有与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的重链氨基酸序列，和与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，抗FRA抗体包含由SEQ ID NO：8的核苷酸序列编码的重链（连同或不连同编码引导序列的核苷酸）和由SEQ ID NO：9的核苷酸序列编码的轻链（连同或不连同编码引导序列的核苷酸）。在一些实施方案中，重链氨基酸序列缺乏C末端赖氨酸。在多个实施方案中，本发明的抗FRA抗体具有通过细胞系产生的抗体的氨基酸序列或缺乏重链C末端赖氨酸的此类序列，所述细胞系于2006年4月24日在保藏号PTA-7552下根据布达佩斯条约条款保藏于美国典型培养物中心（ATCC），10801University Blvd.，Manassas，VA20110-2209。
在相关方面，本发明提供了包含本发明的抗FRA抗体的细胞培养物，从此类培养物中分离的细胞以及包含本发明的抗FRA抗体的试剂盒和组合物。
在另一个方面，本发明提供了通过改变细胞培养条件用于产生抗FRA抗体的方法，所述改变选自：使用半乳糖作为糖源、降低温度、减少溶解氧（DO）水平、增加CO2水平、将CuCl或丁酸钠加入培养基中、增加同渗容摩或在培养不同时间段后收获抗FRA抗体，和通过该方法产生的抗FRA抗体。本发明还提供了通过在本文描述的改变培养条件下培养表达抗FRA抗体的宿主细胞，用于改变抗FRA抗体的N联中性聚糖谱和/或一种或多种性质或用于产生具有所需N联中性糖型谱或性质的抗FRA抗体的方法。
在再进一步方面，本发明提供了使用本发明的抗FRA抗体的方法。在一些实施方案中，抗体用于在体外或体内检测FRA的存在或定量FRA或表达FRA的细胞。在其他实施方案中，本发明的抗FRA抗体单独或与一种或多种另外的治疗剂组合用于治疗。
本发明的抗体与人叶酸受体α（FRA）特异性结合。如本文使用的，特异性结合FRA的抗体（在本文中也称为抗FRA抗体）不与非FRA的蛋白质显著结合。当解离常数（KD）是≤1mM、≤100nM或≤10nM时，抗体被说成特异性结合抗原。在特定实施方案中，KD是1pM-500pM。在其他实施方案中，KD是500pM-1μM、1μM-100nM或100mM-10nM。在优选实施方案中，FRA是人FRA，例如包含SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO：4中的核苷酸序列编码的氨基酸序列的人FRA。
在本发明的一些实施方案中，抗FRA抗体是包含两条重链和两条轻链的四链抗体（也称为免疫球蛋白）。本发明的抗FRA抗体的重链由重链可变结构域（VH）和轻链恒定区（CH）组成。轻链由轻链可变结构域（VL）和轻链恒定结构域（CL）组成。为了本申请的目的，成熟重链和轻链可变结构域各自包含在四个构架区（FR1、FR2、FR3和FR4）内的三个互补决定区（CDR1、CDR2和CDR3），从N末端到C末端这样排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。在本文中对于每个结构域的氨基酸指定依照Kabat、Sequences of Proteins ofImmunological Interest（National Institutes of Health、Bethesda、Md.（1987和1991））、Chothia&Lesk（1987）J.Mol.Biol.196:901-917或Chothia等人，Nature（1989）342:878-883的定义。
本发明的抗体是具有人κ轻链的人免疫球蛋白G亚型1（IgG1）。
术语“抗体”可以指个别抗体分子或多个抗体分子，如对于上下文合适的。本领域技术人员应当理解例如中性聚糖谱指多个抗体分子。
在多个实施方案中，本发明提供了具有在图3中所示或下文“培养条件”部分中所述的任何N联中性聚糖谱的抗FRA抗体。在一些实施方案中，本发明的抗FRA抗体具有这样的N联中性聚糖谱，与在参考培养条件下产生的抗体的谱相比较，其包含增加量的M3N2、NA2、NA2F、MAN5和NA2G1F和减少的NGA2F。在一些实施方案中，与在参考培养条件下产生的抗体的谱相比较，抗FRA抗体的N联中性聚糖谱具有增加量的NGA2，例如NGA2中的至少两倍或至少三倍增加。在一些实施方案中，抗FRA抗体包含约9%的非岩藻糖基化糖型。本发明还提供了具有N联中性聚糖谱的抗FRA抗体，与在参考培养条件下产生的抗体的谱相比较，其包含增加量的NA2、NGA2F和MAN5和减少量的NA2G1F。在一些实施方案中，抗FRA抗体具有这样的N联中性聚糖谱，与在参考培养条件下产生的抗体的谱相比较，其包含增加量的M3N2和NA2。在一些实施方案中，抗FRA抗体具有这样的N联中性聚糖谱，与在参考培养条件下产生的抗体的谱相比较，其包含增加量的NA2和NGA2。在一些实施方案中，抗FRA抗体具有这样的N联中性聚糖谱，与在参考培养条件下产生的抗体的谱相比较，其包含增加量的M3N2和NA2和减少量的NA2F。在一些实施方案中，抗FRA抗体具有这样的N联中性聚糖谱，与在参考培养条件下产生的抗体的谱相比较，其包含增加量的M3N2F、NA2和MAN5。在一些实施方案中，抗FRA抗体具有这样的N联中性聚糖谱，与在参考培养条件下产生的抗体的谱相比较，其包含增加量的M3N2、M3N2F和NA2。
在此类谱中，M3N2、M3N2F和MAN5可以增加至少约2倍或更多。NA2可以增加至少约10倍或更多。NA2F可以增加至少约2倍或更多。NA2F可以减少至少约40%或更多，或可以增加至少约2倍或更多。NA2G1F可以减少至少约25%或30%或更多，并且NGA2F可以减少至少约10%或15%或更多。
在特定实施方案中，抗FRA单克隆抗体是MORAb-003单克隆抗体。“MORAb-003”指包含SEQ ID NO：5的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：7的轻链氨基酸序列的抗FRA抗体，并且在参考培养条件下产生且由外部制造商供应。在MORAb-003抗体参考标准和纯化的FR-α之间的动力学和稳态结合常数已通过表面等离振子共振光谱法进行测定。结合速率（ka）测定为（2.25.+-.0.02）M-1s-1，并且解离速率（kd）测定为（5.02.+-.0.08）s-1。稳态解离常数（KD）已测定为2.23nM（美国专利申请20050232919）。
在多个实施方案中，本发明提供了与在参考培养条件下产生的抗FRA抗体相比较，具有减少的结合亲和力、增加或减少的ADCC、减少的内在化效率和/或增加的内在化速率的抗FRA抗体。
如本文使用的，N联中性聚糖附着至保守糖基化位点或相应位置（SEQ ID NO：5中的Asn299）。如本文使用的，抗FRA抗体的“N联中性聚糖谱”包含图1中所示的中性聚糖结构。此类结构包括部分加工的聚糖M3N2、M3N2F和MAN5，以及完全加工的聚糖NGA2（G0）、NGA2F（G0F）、NA2G1F（G1F）、NA2（G2）和NA2F（G2F）。为了本发明的目的，“G0”指无半乳糖化的聚糖，“G1”指单半乳糖化的聚糖，并且“G2”指二半乳糖化的聚糖。
本发明的抗体的聚糖谱可以如实施例2中所述进行测定。简言之，附着至抗体重链的N联聚糖使用肽-N-糖苷酶F（PNGase F）进行酶促去除，并且通过凝胶过滤色谱法纯化。所得到的聚糖混合物使用例如2-氨基苯甲酰胺（2-AB）进行荧光标记，并且通过正相HPLC分辨。荧光标记的聚糖通过荧光进行定量。来自在分离过程中出现的峰的聚糖的鉴定通过线内质谱检测完成。复合N联聚糖可以在酶促去除后进行标记，使用任何合适的荧光团（例如2-氨基苯甲酸（2-AA）、2-氨基苯甲酰胺（2-AB）、2-氨基吡啶（2-AP）、8-氨基萘-1,3,6-三磺酸（ANTS）、2-氨基吖啶酮（AMAC）、或9-氨基芘-1,3,6-三磺酸（APTS）），或使用放射性同位素，或使用自身可以使用其他方法检测的小化学标签（例如生物素）。无论是标记还是未标记的，复合聚糖随后可以通过多种方法进行分离，包括HPLC（反相、正相、阴离子交换）、和基于凝胶或毛细管电泳方法，并且可以通过荧光、脉冲安培、折光指数、蒸发光散射或质谱技术进行计数。
根据本发明的方法，本发明的抗FRA抗体通过培养表达抗体的细胞产生。在一些实施方案中，将编码重链、轻链或两者的核酸***表达载体内，并可以与表达控制序列例如转录和翻译控制序列可操作地连接。
“可操作地连接的”序列包括与目的基因邻接的表达控制序列，和反式或隔一段距离作用以控制目的基因的表达控制序列。如本文使用的术语“表达控制序列”意指影响它们与之连接的编码序列表达和加工的多核苷酸序列。表达控制序列可以包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；RNA加工信号例如剪接和多腺苷酸化信号；稳定化细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列（即Kozak共有序列）；增强蛋白质稳定性的序列；和需要时，增强蛋白质分泌的序列。此类控制序列的性质取决于宿主生物而不同；在真核生物中，一般地，此类控制序列包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”意欲最低限度包括其存在是表达和加工所需的所有组分，并且还可以包括其存在是有利的另外组分，例如引导序列和融合配偶体序列。
表达载体包括质粒、逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒（AAV）、EBV衍生的附加体等。在一些情况下，编码本发明的抗体、抗体链或抗原结合片段的核酸这样连接到载体内，从而使得在载体内的转录和翻译控制序列发挥其调节抗体基因的转录和翻译的预期功能。如技术人员众所周知的，表达载体和表达控制序列选择为与所需表达水平、使用的表达宿主细胞等相容。编码抗体轻链或片段和抗体重链或片段的核酸可以***分开的载体或相同的表达载体内。核酸通过标准方法***表达载体内（例如在抗体编码核酸和载体上的互补限制位点的连接，或如果不存在限制位点，那么平端连接）。
用作表达用宿主的哺乳动物细胞系是本领域众所周知的，并且包括可从美国典型培养物中心（ATCC）获得的许多永生化细胞系。这些尤其包括中国仓鼠卵巢（CHO）细胞（例如CHO-K1细胞）、NS0细胞、SP2细胞、HEK-293T细胞、NIH-3T3细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾（BHK）细胞、非洲绿猴肾细胞（COS）、人肝细胞癌细胞（例如Hep G2）、A549细胞、和许多其他细胞系。特别优先的细胞系通过测定何种细胞系具有高表达水平进行选择。在一个实施方案中，细胞不是温度敏感性突变细胞系。在另一个实施方案中，细胞是温度敏感性突变细胞系。在一些实施方案中，宿主细胞是CHO细胞、CHO-K1细胞或GS CHO-K1细胞。
在一些实施方案中，将编码抗体的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞内，并且通过将宿主细胞培养足够时间段以允许抗体在宿主细胞中表达或抗体分泌到宿主细胞在其中生长的培养基内产生抗体。抗体可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收。
进一步地，来自生产细胞系的表达可以使用许多已知技术得到增强。例如，谷氨酰胺合成酶基因表达***（GS***）是用于在特定条件下增强表达的普通方法。GS***与通过引用整体合并入本文的欧洲专利号216846、256055、323997和338841结合整体或部分讨论。
在一个方面，本发明提供了使用多种细胞培养条件用于产生抗FRA抗体的方法。如本文使用的，“参考培养条件”指在180rpm在CD-CHO（Invitrogen）培养基中在2L搅拌槽生产生物反应器中培养的细胞。参考细胞培养的pH在6.9-7.1的范围中。例如，pH可以是7.0。参考细胞培养的葡萄糖浓度是1g/L-4g/L、或1g/L-3g/L。参考细胞培养的温度是约36-38℃。例如，温度可以是36.5℃。CO2浓度是约5%。细胞培养基的参考同渗容摩在250-350mOsm/L的范围中。参考细胞培养基不含丁酸钠或氯化铜。参考细胞培养基的溶解氧张力（DO）在30-100%的范围中。例如，参考细胞培养基的DO是30%-40%。在参考细胞培养条件下培养的抗体的收获时间可以是在细胞培养开始后13-15天，例如14天（即，336小时），其预期是在其下培养活力是50%的时间。图中所述的“MORAb-003参考标准”、“MORAb-003参考标准”和“参考标准”样品包含SEQ ID NO：5中的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：7中的轻链氨基酸序列，并且通过在先前描述的参考培养条件下培养的细胞产生且由外部制造商供应。
在一些实施方案中，培养条件在生长期和/或对数期过程中改变。分批培养物是在封闭***中生长的细胞群体。在分批培养物中的细胞群体的一般生长曲线包含对数期、指数期、静止期和死亡期。对数期指当群体从旧生长环境取到新环境时，生长周期的第一个阶段，其中细胞适合于新营养素来源；合成RNA、蛋白质和其他分子但仍未***。这个时期的长度可以是短暂或延长的，取决于培养历史和生长条件。
例如，本发明提供了通过对于至少部分培养时间使用半乳糖作为糖源培养能够表达抗体的细胞，用于产生抗FRA抗体的方法。在一些实施方案中，半乳糖从第0天向前用作糖源，其中第0天是接种当天。在其他实施方案中，细胞使用葡萄糖作为糖源培养第一个时间段，并且使用半乳糖作为糖源培养第二个时间段。例如，根据本发明的方法，本发明的抗FRA抗体通过在对数期中使用葡萄糖作为糖源和在生长期中使用半乳糖作为糖源的细胞培养产生。在一些实施方案中，从第0天到第14天，或从第2天到第10天的任何天起始，或优选从第3天、第4天、第5天、第6天或第7天起始，使用半乳糖作为糖源培养细胞。对于任何上述方法，半乳糖浓度可以是0.01g/L-20g/L、优选1g/L-10g/L、或更优选2g/L-4g/L。在一些实施方案中，半乳糖浓度可以是2g/L。
根据本发明，通过使用半乳糖作为糖源培养的细胞产生的抗FRA抗体具有这样的N联中性聚糖谱，与抗FRA抗体参考标准相比较，其包含增加的M3N2、NA2、NA2F、MAN5和NA2G1F和减少的NGA2F。在一些实施方案中，通过使用半乳糖作为糖源培养的细胞产生的抗FRA抗体具有这样的N联中性聚糖谱，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB810-10），其包含减少的M3N2F和/或增加的NA2F和/或增加的NA2G1F和/或减少的NGA2F。在一些实施方案中，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB810-10），通过使用半乳糖作为糖源培养的细胞产生的抗FRA抗体中的M3N2F糖型的量可以减少至少30%。在一些实施方案中，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB810-10），通过使用半乳糖作为糖源培养的细胞产生的抗FRA抗体中的NA2F糖型的量可以增加到至少两倍。在一些实施方案中，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB810-10），通过使用半乳糖作为糖源培养的细胞产生的抗FRA抗体中的NA2G1F糖型的量可以增加至少40%。在一些实施方案中，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB810-10），通过使用半乳糖作为糖源培养的细胞产生的抗FRA抗体中的NGA2F糖型的量可以减少25%。在一些实施方案中，通过使用半乳糖作为糖源培养的细胞产生的抗FRA抗体具有N联中性聚糖谱，其包含约1：1：1.7：60：20：16：365：370的M3N2：M3N2F：NA2：NA2F：MAN5：NGA2：NA2G1F：NGA2F比。在一些实施方案中，通过使用半乳糖作为糖源培养的细胞产生的抗FRA抗体具有约0.12%M3N2、0.14%M3N2F、0.2%NA2、7.06%NA2F、2.42%MAN5、1.9%NGA2、43.73%NA2G1F和44.43%NGA2F的N联中性聚糖谱。在一些实施方案中，通过使用半乳糖作为糖源培养的细胞产生的抗FRA抗体中的至少6%或7%中性聚糖可以具有NA2F糖型。在一些实施方案中，通过使用半乳糖作为糖源培养的细胞产生的抗FRA抗体具有约4.64%非岩藻糖基化糖型和95.36%岩藻糖基化糖型的N联中性聚糖谱。
本发明还提供了通过对于至少部分培养时间在低温培养能够表达抗体的细胞，用于产生抗FRA抗体的方法。在一些实施方案中，从第0天向前在低温培养细胞，其中第0天是接种当天。在其他实施方案中，细胞在第一个温度培养第一个时间段，并且在更低的温度培养第二个时间段。例如，根据本发明的方法，本发明的抗FRA抗体通过在对数期中使用第一个温度和在生长期中使用更低的温度的细胞培养产生。第一个温度可以是约36-38℃。更低的温度可以约28-35℃、或约30-33℃、或约30-31℃，并且可以是约28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃。在一些实施方案中，细胞在36.5℃的温度培养第一个时间段，并且在30℃培养第二个时间段。从第0天到第14天，或从第2天到第10天的任何天起始，或优选从第3天、第4天或第5天起始，可以在更低的温度培养细胞。
根据本发明，通过在低温培养的细胞产生的抗FRA抗体具有这样的N联中性聚糖谱，与抗FRA抗体参考标准相比较，其包含增加的NGA2。根据本发明，通过在更低的温度培养的细胞产生的抗FRA抗体具有这样的N联中性聚糖谱，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB810-10），其包含增加的NGA2和/或减少的NG2GIF。在一些实施方案中，通过在低温培养的细胞产生的抗FRA抗体具有这样的N联中性聚糖谱，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB810-10），其包含增加的非岩藻糖基化糖型。在一些实施方案中，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB810-10），通过在低温培养的细胞产生的抗FRA抗体中的NGA2糖型的量可以增加到至少两倍。在一些实施方案中，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB810-10），通过在低温培养的细胞产生的抗FRA抗体中的NA2G1F糖型的量可以减少至少30%。在一些实施方案中，在低温培养的细胞产生的抗FRA抗体具有N联中性聚糖谱，其包含约1：13：2.5：70：100：350：1050：3500的M3N2：M3N2F：NA2：NA2F：MAN5：NGA2：NA2G1F：NGA2F比。在一些实施方案中，通过在低温培养的细胞产生的抗FRA抗体具有约0.02%M3N2、0.25%M3N2F、0.05%NA2、1.36%NA2F、2.04%MAN5、6.98%NGA2、68.52%NA2G1F和90.92%NGA2F的N联中性聚糖谱。在一些实施方案中，通过在低温培养的细胞产生的抗FRA抗体中的至少6%或7%中性聚糖可以具有NGA2糖型。在一些实施方案中，通过在低温培养的细胞产生的抗FRA抗体可以包含约9%非岩藻糖基化糖型。在一些实施方案中，通过在低温培养的细胞产生的抗FRA抗体具有约9.09%非岩藻糖基化糖型和90.92%岩藻糖基化糖型的N联中性聚糖谱。
本发明还提供了通过对于至少部分培养时间在高同渗容摩培养能够表达抗体的细胞，用于产生抗FRA抗体的方法。在一些实施方案中，从第0天向前在高同渗容摩培养细胞，其中第0天是接种当天。在其他实施方案中，细胞在参考同渗容摩培养第一个时间段，并且在更高的同渗容摩培养第二个时间段。例如，根据本发明的方法，本发明的抗FRA抗体通过在对数期中使用参考同渗容摩和在生长期中使用更高的同渗容摩的细胞培养产生。参考同渗容摩可以在250-350mOsm/L的范围中。更高的同渗容摩可以是360-800mOsm/L、或400-650mOsm/L。在一些实施方案中，细胞在约450mOsm/L、475mOsm/L、500mOsm/L、525mOsm/L、550mOsm/L、575mOsm/L、600mOsm/L、625mOsm/L或650mOsm/L培养。在一些实施方案中，细胞在250-350mOsm/L培养第一个时间段，并且在600mOsm/L培养第二个时间段。从第0天到第14天，或从第2天到第10天的任何天起始，优选从第3天到第5天的任何天起始，即如本文描述的在更高的同渗容摩培养细胞，从第2天、第3天、第4天或第5天起始，可以在更高的同渗容摩培养细胞。
根据本发明，通过在高同渗容摩培养的细胞产生的抗FRA抗体具有这样的N联中性聚糖谱，与抗FRA抗体参考标准相比较，其包含增加的NA2、MAN5和NGA2F和减少的NA2G1F。根据本发明，通过在高同渗容摩培养的细胞产生的抗FRA抗体具有这样的N联中性聚糖谱，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB810-10），其包含增加的MAN5和/或减少的NA2G1F和/或增加的NGA2F。在一些实施方案中，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB810-10），通过在高同渗容摩培养的细胞产生的抗FRA抗体中的MAN5糖型的量可以增加至少40%。在一些实施方案中，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB810-10），通过在高同渗容摩培养的细胞产生的抗FRA抗体中的NA2G1F糖型的量可以减少至少30%。在一些实施方案中，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB810-10），通过在高同渗容摩培养的细胞产生的抗FRA抗体中的NGA2F糖型的量可以增加至少15%。在一些实施方案中，在高同渗容摩培养的细胞产生的抗FRA抗体具有N联中性聚糖谱，其包含约1：3：3：15：43：33：250：900的M3N2：M3N2F：NA2：NA2F：MAN5：NGA2：NA2G1F：NGA2F比。在一些实施方案中，通过在高同渗容摩培养的细胞产生的抗FRA抗体具有约0.08%M3N2、0.25%M3N2F、0.23%NA2、1.23%NA2F、3.4%MAN5、2.63%NGA2、19.57%NA2G1F和72.6%NGA2F的N联中性聚糖谱。在一些实施方案中，通过在高同渗容摩培养的细胞产生的抗FRA抗体中的至少3%或4%中性聚糖可以具有MAN5糖型。在一些实施方案中，通过在高同渗容摩培养的细胞产生的抗FRA抗体具有约6.34%非岩藻糖基化糖型和93.65%岩藻糖基化糖型的N联中性聚糖谱。
本发明还提供了通过对于至少部分培养时间在丁酸钠的存在下培养能够表达抗体的细胞，用于产生抗FRA抗体的方法。在一些实施方案中，从第0天向前在丁酸钠的存在下培养细胞，其中第0天是接种当天。在其他实施方案中，细胞在不存在丁酸钠的情况下培养第一个时间段，并且在丁酸钠的存在下培养第二个时间段。例如，根据本发明的方法，本发明的抗FRA抗体通过在对数期中在不存在丁酸钠的情况下和在生长期中在丁酸钠的存在下的细胞培养产生。在一些实施方案中，丁酸钠可以以0.01mM-90mM、或0.01mM-16mM浓度使用。在一些实施方案中，丁酸钠可以以0.5mM或10mM浓度使用。在一些实施方案中，在培养起始后第6天时加入丁酸钠。从第0天到第14天，或从第2天到第10天的任何天起始，优选从第3天、第4天、第5天、第6天或第7天起始，可以在丁酸钠的存在下培养细胞。
根据本发明，通过在丁酸钠的存在下培养的细胞产生的抗FRA抗体具有这样的N联中性聚糖谱，与抗FRA抗体参考标准相比较，其包含增加的M3N2和NA2。在一些实施方案中，通过在丁酸钠的存在下培养的细胞产生的抗FRA抗体具有这样的N联中性聚糖谱，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB809-65），其包含减少的MAN5。在其他实施方案中，通过在丁酸钠的存在下培养的细胞产生的抗FRA抗体具有这样的N联中性聚糖谱，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB809-65），其包含减少的M3N2和/或增加的M3N2F和/或减少的NA2和/或增加的MAN5。在一些实施方案中，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB809-65），通过在丁酸钠的存在下培养的细胞产生的抗FRA抗体中的MAN5糖型的量可以减少至少25%。在一些实施方案中，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB809-65），通过在丁酸钠的存在下培养的细胞产生的抗FRA抗体中的MAN5糖型的量可以增加至少30%。在一些实施方案中，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB809-65），通过在丁酸钠的存在下培养的细胞产生的抗FRA抗体中的M3N2糖型的量可以减少至少75%。在一些实施方案中，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB809-65），通过在丁酸钠的存在下培养的细胞产生的抗FRA抗体中的M3N2F糖型的量可以减少至少70%。在一些实施方案中，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB809-65），通过在丁酸钠的存在下培养的细胞产生的抗FRA抗体中的NA2糖型的量可以减少至少75%。在一些实施方案中，在丁酸钠的存在下培养的抗FRA抗体具有N联中性聚糖谱，其包含约1：1.7：3：18：16：23：200：450的M3N2：M3N2F：NA2：NA2F：MAN5：NGA2：NA2G1F：NGA2F比。在其他实施方案中，在丁酸钠的存在下培养的抗FRA抗体具有这样的N联中性聚糖谱，其包含约1：8：3：40：80：55：500：1500的M3N2：M3N2F：NA2：NA2F：MAN5：NGA2：NA2G1F：NGA2F比。在一些实施方案中，通过在丁酸钠的存在下培养的细胞产生的抗FRA抗体具有约0.14%M3N2、0.24%M3N2F、0.47%NA2、2.49%NA2F、2.19%MAN5、3.26%NGA2、28.66%NA2G1F和62.55%NGA2F的N联中性聚糖谱。在一些实施方案中，通过在丁酸钠的存在下培养的细胞产生的抗FRA抗体具有约0.05%M3N2、0.4%M3N2F、0.13%NA2、1.83%NA2F、4.11%MAN5、2.77%NGA2、25.33%NA2G1F和65.38%NGA2F的N联中性聚糖谱。在一些实施方案中，通过在丁酸钠的存在下培养的细胞产生的抗FRA抗体中的至少4%或5%中性聚糖可以具有MAN5糖型。在一些实施方案中，通过在丁酸钠的存在下培养的细胞产生的抗FRA抗体具有约6.06%非岩藻糖基化糖型和93.94%岩藻糖基化糖型的N联中性聚糖谱。在一些实施方案中，通过在丁酸钠的存在下培养的细胞产生的抗FRA抗体具有约7.06%非岩藻糖基化糖型和92.94%岩藻糖基化糖型的N联中性聚糖谱。
本发明还提供了通过对于至少部分培养时间在低溶解氧张力（DO）培养能够表达抗体的细胞，用于产生抗FRA抗体的方法。在一些实施方案中，从第0天向前在低DO培养细胞，其中第0天是接种当天。在其他实施方案中，细胞在参考DO培养第一个时间段，并且在更低的DO培养第二个时间段。例如，根据本发明的方法，本发明的抗FRA抗体通过在对数期中使用参考DO和在生长期中使用更低的DO的细胞培养产生。参考DO可以在30-100%的范围中。例如，参考细胞培养基的DO可以是30%-40%。更低的DO可以是0%-25%、或5%-25%，优选5%-20%、5%-15%、5%-10%，例如约5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%或15%的DO。在一些实施方案中，细胞在30%的DO张力培养第一个时间段，并且在5%的DO张力培养第二个时间段。从第2天到第10天的任何天起始，优选第3天到第7天，例如在第3天、第4天、第5天、第6天或第7天起始，可以在低DO培养细胞。
根据本发明，通过在低DO培养的细胞产生的抗FRA抗体具有这样的N联中性聚糖谱，与在如本文定义的“参考培养条件”下产生的抗FRA抗体相比较，其包含增加的NA2和NGA2。在一些实施方案中，通过在低DO培养的细胞产生的抗FRA抗体具有这样的N联中性聚糖谱，与在如本文定义的“参考培养条件”下产生的抗FRA抗体相比较，其包含增加的NA2和M3N2。在一些实施方案中，通过在低DO培养的细胞产生的抗FRA抗体具有这样的N联中性聚糖谱，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB859-25），其包含减少的M3N2和/或减少的MAN5和/或增加的NGA2和/或增加的NA2G1F和/或减少的NGA2F。在一些实施方案中，通过在低DO培养的细胞产生的抗FRA抗体具有这样的N联中性聚糖谱，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB809-65），其包含增加的非岩藻糖基化糖型。在一些实施方案中，通过在低DO培养的细胞产生的抗FRA抗体具有这样的N联中性聚糖谱，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB809-65），其包含减少的M3N2。在一些实施方案中，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB809-65），通过在低DO培养的细胞产生的抗FRA抗体中的M3N2糖型的量可以减少至少95%。在一些实施方案中，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB809-65），通过在低DO培养的细胞产生的抗FRA抗体中的MAN5糖型的量可以减少至少25%。在一些实施方案中，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB809-65），通过在低DO培养的细胞产生的抗FRA抗体中的NGA2糖型的量可以增加至少2倍。在一些实施方案中，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB809-65），通过在低DO培养的细胞产生的抗FRA抗体中的非岩藻糖基化糖型的量可以增加至少40%。在一些实施方案中，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB809-65），通过在低DO培养的细胞产生的抗FRA抗体中的NA2G1F糖型的量可以增加至少20%。在一些实施方案中，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB809-65），通过在低DO培养的细胞产生的抗FRA抗体中的NGA2F糖型的量可以减少至少15%。在一些实施方案中，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB859-25），通过在低DO培养的细胞产生的抗FRA抗体中的M3N2糖型的量可以减少至少80%。在一些实施方案中，在低DO培养的抗FRA抗体具有N联中性聚糖谱，其包含约1：20：50：280：220：650：3200：5500的M3N2：M3N2F：NA2：NA2F：MAN5：NGA2：NA2G1F：NGA2F比。在其他实施方案中，在低DO培养的抗FRA抗体具有这样的N联中性聚糖谱，其包含约1：8：30：40：55：80：550：1800的M3N2：M3N2F：NA2：NA2F：MAN5：NGA2：NA2G1F：NGA2F比。在一些实施方案中，通过在低DO培养的细胞产生的抗FRA抗体具有约0.01%M3N2、0.22%M3N2F、0.48%NA2、2.8%NA2F、2.22%MAN5、6.53%NGA2、31.98%NA2G1F和55.75%NGA2F的N联中性聚糖谱。在一些实施方案中，通过在低DO培养的细胞产生的抗FRA抗体具有约0.04%M3N2、0.31%M3N2F、0.3%NA2、1.59%NA2F、2.23%MAN5、3.17%NGA2、21.9%NA2G1F和70.46%NGA2F的N联中性聚糖谱。在一些实施方案中，通过在低DO培养的细胞产生的抗FRA抗体中的至少6%或7%中性聚糖可以具有NGA2糖型。在一些实施方案中，通过在低DO培养的细胞产生的抗FRA抗体具有约9%或10%非岩藻糖基化糖型。在一些实施方案中，通过在低DO培养的细胞产生的抗FRA抗体具有约9.24%非岩藻糖基化糖型和90.75%岩藻糖基化糖型的N联中性聚糖谱。在一些实施方案中，通过在低DO培养的细胞产生的抗FRA抗体具有约5.74%非岩藻糖基化糖型和94.26%岩藻糖基化糖型的N联中性聚糖谱。
本发明还提供了通过对于至少部分培养时间在高CO2浓度培养能够表达抗体的细胞，用于产生抗FRA抗体的方法。在一些实施方案中，从第0天向前在高CO2浓度培养细胞，其中第0天是接种当天。优选地，CO2浓度在对数期后增加。在其他实施方案中，细胞在参考CO2浓度培养第一个时间段，并且在高CO2浓度培养第二个时间段。例如，根据本发明的方法，本发明的抗FRA抗体通过在对数期中使用参考CO2浓度和在生长期中使用高CO2浓度的细胞培养产生。参考CO2浓度可以是约5%。高CO2浓度可以是10%-30%、或10%-20%，即约10%、约11%、约12%、约13%、约14%、约15%、约16%、约17%、约18%、约19%、约20%、约21%、约22%、约23%、约24%、约25%、约26%、约27%、约28%、约29%或约30%。在一些实施方案中，细胞在约5%的CO2浓度培养第一个时间段，并且在高达20%的CO2浓度培养第二个时间段。从第2天到第10天的任何天起始，即在第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天或第10天起始，可以在高CO2浓度培养细胞。
根据本发明，通过在高CO2浓度培养的细胞产生的抗FRA抗体具有这样的N联中性聚糖谱，与抗FRA抗体参考标准相比较，其包含增加的M3N2和NA2和减少的NA2F。根据本发明，通过在高CO2浓度培养的细胞产生的抗FRA抗体具有这样的N联中性聚糖谱，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB809-65），其包减少的NA2和/或减少的MAN5。在一些实施方案中，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB809-65），通过在高CO2浓度培养的细胞产生的抗FRA抗体中的NA2糖型的量可以减少至少60%。在一些实施方案中，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB809-65），通过在高CO2浓度培养的细胞产生的抗FRA抗体中的MAN5糖型的量可以减少至少40%。在一些实施方案中，在高CO2浓度培养的细胞产生的抗FRA抗体具有N联中性聚糖谱，其包含约1：1.5：1：7：8：16：100：400的M3N2：M3N2F：NA2：NA2F：MAN5：NGA2：NA2G1F：NGA2F比。在一些实施方案中，通过在高CO2浓度培养的细胞产生的抗FRA抗体具有约0.19%M3N2、0.27%M3N2F、0.23%NA2、1.34%NA2F、1.61%MAN5、3.04%NGA2、19.51%NA2G1F和73.81%NGA2F的N联中性聚糖谱。在一些实施方案中，通过在高CO2浓度培养的细胞产生的抗FRA抗体具有约5.07%非岩藻糖基化糖型和94.93%岩藻糖基化糖型的N联中性聚糖谱。
本发明还提供了通过对于至少部分培养时间在氯化铜（CuCl）的存在下培养能够表达抗体的细胞，用于产生抗FRA抗体的方法。在一些实施方案中，从第0天向前在CuCl的存在下培养细胞，其中第0天是接种当天。在其他实施方案中，细胞在不存在CuCl的情况下培养第一个时间段，并且在CuCl的存在下培养第二个时间段。例如，根据本发明的方法，本发明的抗FRA抗体通过在对数期中在不存在CuCl的情况下和在生长期中在CuCl的存在下的细胞培养产生。CuCl可以以0.01μM-0.5mM、或0.01mM-0.5mM的任何浓度使用。在一些实施方案中，CuCl以0.5mM浓度使用。在一些实施方案中，可以在培养起始后第0天到第14天的任何天起始加入CuCl。在一些实施方案中，在培养起始后第6天时加入CuCl。
根据本发明，通过在CuCl的存在下培养的细胞产生的抗FRA抗体具有这样的N联中性聚糖谱，与抗FRA抗体参考标准相比较，其包含增加的M3N2、M3N2F和NA2。根据本发明，通过在CuCl的存在下培养的细胞产生的抗FRA抗体具有这样的N联中性聚糖谱，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB809-65），其包含增加的M3N2和/或增加的M3N2F和/或减少的NA2和/或减少的MAN5和/或增加的NA2G1F和/或减少的NGA2F。在一些实施方案中，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB809-65），通过在CuCl的存在下培养的细胞产生的抗FRA抗体中的M3N2糖型的量可以增加至少50%。在一些实施方案中，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB809-65），通过在CuCl的存在下培养的细胞产生的抗FRA抗体中的M3N2F糖型的量可以增加至少60%。在一些实施方案中，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB809-65），通过在CuCl的存在下培养的细胞产生的抗FRA抗体中的NA2糖型的量可以减少至少75%。在一些实施方案中，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB809-65），通过在CuCl的存在下培养的细胞产生的抗FRA抗体中的MAN5糖型的量可以减少至少25%。在一些实施方案中，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB809-65），通过在CuCl的存在下培养的细胞产生的抗FRA抗体中的NA2G1F糖型的量可以增加至少30%。在一些实施方案中，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB809-65），通过在CuCl的存在下培养的细胞产生的抗FRA抗体中的NGA2F糖型的量可以减少至少10%。在一些实施方案中，在CuCl的存在下培养的抗FRA抗体具有N联中性聚糖谱，其包含约2：2：1：17：14：25：220：400的M3N2：M3N2F：NA2：NA2F：MAN5：NGA2：NA2G1F：NGA2F比。在一些实施方案中，通过在CuCl的存在下培养的细胞产生的抗FRA抗体具有约0.34%M3N2、0.37%M3N2F、0.15%NA2、2.6%NA2F、2.16%MAN5、3.88%NGA2、33.03%NA2G1F和57.46%NGA2F的N联中性聚糖谱。在一些实施方案中，通过在CuCl的存在下培养的细胞产生的抗FRA抗体具有约6.53%非岩藻糖基化糖型和93.46%岩藻糖基化糖型的N联中性聚糖谱。
根据本发明，抗FRA抗体可以在细胞培养开始后约10天（240小时）、13天、14天（336小时）、15天、17天（408小时）或20天（480小时）时收获。
根据本发明，通过在10天时收获的细胞产生的抗FRA抗体具有这样的N联中性聚糖谱，与抗FRA抗体参考标准相比较，其包含增加的M3N2和NA2。根据本发明，通过在17天时收获的细胞产生的抗FRA抗体具有这样的N联中性聚糖谱，与在如本文定义的“参考培养条件”下产生的抗FRA抗体相比较，其包含增加的M3N2、NA2和MAN5。根据本发明，通过在20天时收获的细胞产生的抗FRA抗体具有这样的N联中性聚糖谱，与在如本文定义的“参考培养条件”下产生的抗FRA抗体相比较，其包含增加的M3N2和NA2。
根据本发明，通过在10天时收获的细胞产生的抗FRA抗体具有这样的N联中性聚糖谱，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB859-25），其包含减少的M3N2和/或减少的M3N2F和/或减少的MAN5。在一些实施方案中，通过在10天时收获的细胞产生的抗FRA抗体具有这样的N联中性聚糖谱，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB859-25），其包含减少的非岩藻糖基化糖型。在一些实施方案中，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB859-25），通过在10天时收获的细胞产生的抗FRA抗体中的M3N2糖型的量可以减少至少80%。在一些实施方案中，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB859-25），通过在10天时收获的细胞产生的抗FRA抗体中的M3N2F糖型的量可以减少至少25%。在一些实施方案中，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB859-25），通过在10天时收获的细胞产生的抗FRA抗体中的MAN5糖型的量可以减少至少50%。在一些实施方案中，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB859-25），通过在10天时收获的细胞产生的抗FRA抗体中的非岩藻糖基化糖型的量可以减少至少25%。在一些实施方案中，在10天时收获的抗FRA抗体具有N联中性聚糖谱，其包含约1：6：8：40：30：70：550：1800的M3N2：M3N2F：NA2：NA2F：MAN5：NGA2：NA2G1F：NGA2F比。在一些实施方案中，在10天时收获的抗FRA抗体具有约0.04%M3N2、0.24%M3N2F、0.31%NA2、1.48%NA2F、1.28%MAN5、2.64%NGA2、22.33%NA2G1F和71.68%NGA2F的N联中性聚糖谱。在一些实施方案中，在10天时收获的抗FRA抗体具有约4.27%非岩藻糖基化糖型和95.73%岩藻糖基化糖型的N联中性聚糖谱。
根据本发明，通过在17天时收获的细胞产生的抗FRA抗体具有这样的N联中性聚糖谱，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB859-25），其包含增加的NA2。在一些实施方案中，与在参考细胞培养条件下产生的抗FRA抗体相比较（批号NB859-25），通过在17天时收获的细胞产生的抗FRA抗体中的NA2糖型的量可以增加至少50%。在一些实施方案中，在17天时收获的抗FRA抗体具有N联中性聚糖谱，其包含约1：2：3：13：20：18：170：440的M3N2：M3N2F：NA2：NA2F：MAN5：NGA2：NA2G1F：NGA2F比。在一些实施方案中，在17天时收获的抗FRA抗体具有约0.15%M3N2、0.34%M3N2F、0.51%NA2、1.9%NA2F、3.16%MAN5、2.77%NGA2、24.87%NA2G1F和66.3%NGA2F的N联中性聚糖谱。在一些实施方案中，通过在第17天时收获的细胞产生的抗FRA抗体中的至少3%或4%中性聚糖可以具有MAN5糖型。在一些实施方案中，在17天时收获的抗FRA抗体具有约6.59%非岩藻糖基化糖型和93.41%岩藻糖基化糖型的N联中性聚糖谱。
在一些实施方案中，在20天时收获的抗FRA抗体具有N联中性聚糖谱，其包含约1：1.8：2.5：10：19：17：140：430的M3N2：M3N2F：NA2：NA2F：MAN5：NGA2：NA2G1F：NGA2F比。在一些实施方案中，在20天时收获的抗FRA抗体具有约0.16%M3N2、0.29%M3N2F、0.4%NA2、1.66%NA2F、2.96%MAN5、2.64%NGA2、22.43%NA2G1F和69.45%NGA2F的N联中性聚糖谱。在一些实施方案中，在20天时收获的抗FRA抗体具有约6.16%非岩藻糖基化糖型和93.83%岩藻糖基化糖型的N联中性聚糖谱。
本发明包含使用上文描述的任何一种或多种条件产生抗FRA抗体的方法。
在一个实施方案中，相对于抗FRA参考标准，本发明的抗FRA抗体对于人FRA具有改变的结合亲和力。在一些实施方案中，结合亲和力与MORAb-003参考标准相比较可以是减少的，并且在如本文定义的参考培养条件下产生的抗体（阳性对照）相比较是减少的。此类抗体可以通过下述培养表达抗FRA抗体的宿主细胞产生：使用半乳糖作为糖源，在低温，在高同渗容摩，在丁酸钠的存在下，在低DO，在高CO2浓度下，在氯化铜的存在下，或通过在培养起始后10、17或20天收获表达抗FRA抗体的细胞，如本文描述的。在使用半乳糖作为糖源的实施方案中，可以在培养起始后5天时加入2g/L半乳糖。在使用低温的实施方案中，培养温度可以在培养起始后5天时从36.5℃转变为30℃。在使用增加的同渗容摩的实施方案中，通过在培养起始后7天时加入NaCl，培养物的同渗容摩可以增加至600mOsm/L。在使用减少的溶解氧张力（DO）的实施方案中，DO可以在培养起始后6天时从30%变为5%。在使用丁酸钠的实施方案中，可以在培养起始后6天时加入0.5mM或10mM丁酸钠。在使用氯化铜的实施方案中，可以在培养起始后6天时加入0.5mM氯化铜。在其他实施方案中，培养基中的CO2浓度在培养起始后5天时增加至20%。
在任何前述实施方案中，培养物可以由CHO细胞组成，例如包含核酸的CHO-K1细胞，所述核酸编码SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5的重链氨基酸序列或编码至少95%等同的序列，和SEQ ID NO：2或SEQID NO：6或SEQ ID NO：7的轻链氨基酸序列或编码至少95%等同的序列。特别地，细胞可以包含编码下述的核酸：SEQ ID NO：1的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO：2的轻链氨基酸序列99%相同的轻链氨基酸序列，SEQ ID NO：1的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：6的轻链氨基酸序列，或SEQ ID NO：5的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：7的轻链氨基酸序列，或与上文提及的序列至少95%等同的编码序列。在一些实施方案中，编码重链的核酸包含SEQ ID NO：8的核苷酸序列连同或不连同编码引导序列的核苷酸，和编码轻链的核酸包含SEQ ID NO：9的核苷酸序列连同或不连同编码引导序列的核苷酸。在多个实施方案中，抗FRA抗体包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5的重链氨基酸序列或至少95%等同的序列，和SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的轻链氨基酸序列或至少95%等同的序列。在特定实施方案中，抗体包含SEQ ID NO：1的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO：2的轻链氨基酸序列99%相同的轻链氨基酸序列，SEQ ID NO：1的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：6的轻链氨基酸序列，或SEQ ID NO：5的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：7的轻链氨基酸序列，或与上文提及的序列至少95%等同的序列。
抗FRA抗体的结合亲和力可以通过ELISA、RIA、流式细胞术或表面等离振子共振例如
Figure BDA00003070676900451
进行测量。如本文使用的，术语“表面等离振子共振”指允许通过检测生物传感器基质内的蛋白质浓度中的改变来分析实时生物特异性相互作用的光学现象，例如使用
Figure BDA00003070676900452
***（Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden and Piscataway，N.J.）。关于进一步描述，参见Jonsson U.等人，Ann.Biol.Clin.51:19-26（1993）；Jonsson U.等人，Biotechniques11:620-627（1991）；Jonsson B.等人，J.Mol.Recognit.8:125-131（1995）；和Johnsson B.等人，Anal.Biochem.198:268-277（1991）。
相对于在如本文定义的“参考培养条件”下产生的抗FRA抗体，抗FRA抗体的结合亲和力可以减少至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%。在多个实施方案中，与人FRA具有减少的结合的本发明的抗FRA抗体包含SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：5的重链氨基酸序列或至少95%等同的序列，和SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的轻链氨基酸序列或至少95%等同的序列。特别地，抗体包含SEQ ID NO：1的重链氨基酸序列和与SEQ IDNO：2的轻链氨基酸序列99%相同的轻链氨基酸序列，SEQ ID NO：1的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：6的轻链氨基酸序列，或SEQ ID NO：5的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：7的轻链氨基酸序列，或与上文提及的序列至少95%等同的序列。
对于人FRA具有减少的结合亲和力的抗FRA单克隆抗体用于治疗癌症。不希望受理论束缚，减少的结合亲和力可以允许更深地渗透到肿瘤内，以允许靶向内部肿瘤团块。参见，Adams等人，“High AffinityRestricts the Localization and Tumor Penetration of Single-Chain FvAntibody Molecules,”Cancer Res61:4750-4755（2001年6月15日）。
在一些实施方案中，相对于在如本文定义的“参考培养条件”下产生的抗FRA抗体，本发明的抗FRA抗体可以具有改变的抗体依赖性细胞毒性（ADCC）。在一些实施方案中，ADCC与抗FRA抗体参考标准相比较是增加的。在一些实施方案中，与在参考条件下产生的抗体（阳性对照）相比较，通过在改变的培养条件下培养产生的抗体也具有增加的ADCC。在其他实施方案中，ADCC与阳性对照相比较是增加的，但与抗体参考标准相比较是减少的。在另外其他实施方案中，ADCC与阳性对照和抗体参考标准相比较是减少的。具有增加的ADCC的抗FRA单克隆抗体对于其中作用方式是引发针对FRA表达靶细胞的免疫效应子功能的疗法是有用的，例如以治疗其中希望杀死FRA表达细胞的疾病和病状。具有减少的ADCC的抗FRA单克隆抗体在其中作用方式是使用抗体作为靶向试剂将细胞毒性有效负荷递送给靶细胞的疗法中是有用的。不受理论束缚，可以期望减少ADCC活性，以使抗体缀合物的局部浓度以及抗体的内在化效率达到最大。如对于ADCC所需的，抗体与免疫效应细胞的相互作用将预测减少抗体缀合物在细胞表面上的可用度，并且减少抗体缀合物的功效。
如本文使用的，ADCC是抗体的免疫效应活性。ADCC可以通过效应细胞上的Fc受体介导，所述效应细胞包括但不限于细胞毒性T细胞、自然杀伤（NK）细胞或巨噬细胞，导致FRA表达靶细胞的细胞裂解和/或死亡。本发明的抗FRA抗体的ADCC可以使用本领域已知的标准测定法进行测量（参见例如通过引用整体合并的美国专利申请公开号2006/0239911）。例如，FRA表达细胞可以暴露于多个浓度的抗FRA抗体（或阴性对照，例如无抗体或对照Ig）和活化效应细胞，例如外周血单核细胞（PBMCs）。ADCC可以通过在FRA表达细胞的细胞裂解后发生的乳酸脱氢酶（LDH）释放进行监控。LDH的活性可以通过分光光度计测定法进行测量。ADCC还可以通过用羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯（CFDA SE）标记FRA表达细胞进行测量。标记的细胞随后与抗FRA抗体的稀释物和衍生自PBMCs的未标记的效应细胞混合。在温育后，通过流式细胞术就剩余活的、标记的FRA表达细胞评分细胞群体。
在多个实施方案中，相对于在如本文定义的“参考培养条件”下产生的抗FRA抗体（即，抗体参考标准和/或阳性对照）发生的那种，本发明的抗FRA抗体可以引发高至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的ADCC。在其他实施方案中，相对于在如本文定义的“参考培养条件”下产生的抗FRA抗体发生的那种，本发明的抗FRA抗体可以引发低至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的ADCC。
根据本发明的方法，通过如本文描述的在低温或低DO培养表达抗体的宿主细胞，可以增加抗FRA抗体的ADCC。在一些实施方案中，低温可以是在培养起始后5天时从36.5℃到30℃的转变。在一些实施方案中，DO可以在培养起始后6天时从30%变为5%。根据其他方法，通过从培养开始早于13天或晚于15天的培养物中收获抗体，可以减少ADCC。
在任何前述实施方案中，培养物可以由CHO细胞组成，例如包含核酸的CHO-K1细胞，所述核酸编码SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5的重链氨基酸序列或编码至少95%等同的序列，和SEQ ID NO：2或SEQID NO：6或SEQ ID NO：7的轻链氨基酸序列或编码至少95%等同的序列。特别地，细胞可以包含编码下述的核酸：SEQ ID NO：1的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO：2的轻链氨基酸序列99%相同的轻链氨基酸序列，SEQ ID NO：1的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：6的轻链氨基酸序列，或SEQ ID NO：5的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：7的轻链氨基酸序列，或与上文提及的序列至少95%等同的编码序列。在一些实施方案中，编码重链的核酸包含SEQ ID NO：8的核苷酸序列连同或不连同编码引导序列的核苷酸，和编码轻链的核酸包含SEQ ID NO：9的核苷酸序列连同或不连同编码引导序列的核苷酸。
依照本发明，增加的ADCC与抗FRA抗体中增加量的NGA2（G0）聚糖或非岩藻糖基化聚糖关联，并且与抗FRA抗体中的M3N2F聚糖量反相关。
在一些实施方案中，本发明的抗FRA抗体在与细胞表面上的FRA结合后在细胞中内在化。此类内在化抗体可以缀合至化学治疗剂，例如免疫毒素、放射性核素或细胞毒素或细胞生长抑制剂。在一些实施方案中，相对于在参考培养条件下产生的抗体，本发明的抗FRA抗体可以具有改变的内在化效率或内在化速率。在这个背景下，内在化效率指由于其抗FRA抗体可以保留在靶细胞内的能力，而内在化速率指在其下抗FRA抗体可以穿过靶细胞的细胞膜的速率。本领域已知的标准测定法可以用于监控在FRA表达细胞中本发明的抗FRA抗体的内在化（参见例如过引用整体合并的美国专利申请公开号2006/0239911）。例如，第二种免疫毒素例如Hum-ZAP测定法（Advanced Targeting Systems，SanDiego，CA，USA）可以用于监控本发明的抗FRA抗体的内在化。第二种免疫毒素是次级抗体的缀合物，例如山羊抗人IgG，和核糖体灭活蛋白质，皂草素。此类第二种免疫毒素可以这样选择，使得它们与本发明的抗FRA抗体结合。如果抗FRA抗体是内在化的，那么皂草素将抑制蛋白质合成且促使细胞死亡。暴露于本发明的抗FRA抗体和第二种免疫毒素（或阴性对照）的FRA表达细胞的细胞活力可以用标准细胞活力测定法进行测量，例如通过分光光度法阅读活细胞数目的那些。
在一些实施方案中，本发明的抗FRA抗体可以显示出高于在如本文定义的“参考培养条件”下产生的抗FRA抗体至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少99%或至少99.9%的内在化速率。具有增加的内在化速率的抗FRA单克隆抗体对于例如抗体缀合物是有用的，而更快速的内在化可以等于更好的药效学，和潜在更不频繁或更低的给药。另外，对于其中希望通过抗体-抗原复合物的内在化从细胞表面去除抗原的疗法，更快的内在化速率将预期导致抗原从细胞表面去除的增加效率。例如，在靶向涉及癌细胞死亡的FRA介导的发信号途径的疗法中，抗FRA抗体通过经由内在化从细胞表面去除受体来减少受体发信号。
在其他实施方案中，本发明的抗FRA抗体显示出低于在如本文定义的“参考培养条件”下产生的抗FRA抗体至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的内在化速率。
当治疗作用方式涉及细胞内机制和效应子功能时，具有减少的内在化速率的抗FRA单克隆抗体可以是有用的。不希望受理论束缚，更缓慢地内在化的抗FRA抗体保留在细胞表面上且对于效应活性包括ADCC和CDC具有增加的机会。在一些实施方案中，本发明的抗FRA抗体可以具有约57分钟或58分钟的半最大内在化常数。在一些实施方案中，本发明的抗FRA抗体具有约36分钟、37分钟、41分钟、42分钟、45分钟或46分钟的半最大内在化常数。半最大内在化常数可以通过本文描述的内在化测定法包括FACS分析进行测定。
在一个实施方案中，与在如本文定义的“参考培养条件”下产生的抗FRA抗体的内在化效率相比较，本发明的抗FRA抗体可以显示出减少的内在化效率。具有减少的内在化效率的抗FRA抗体用于增加抗体对于免疫***的可用度，并且还使ADCC或补体依赖性细胞毒性（CDC）成为可能。在一些实施方案中，本发明的抗FRA抗体可以显示出低于在如本文定义的“参考培养条件”下产生的抗FRA抗体至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的内在化效率。在一些实施方案中，本发明的抗FRA抗体可以具有1632ng/mL或990ng/mL的内在化IC50。在一些实施方案中，本发明的抗FRA抗体具有1632ng/mL或990ng/mL的内在化IC50。IC50和EC50可以通过本文描述的内在化测定法进行测定。
如本文描述的通过在低DO培养表达抗FRA抗体的宿主细胞或通过在培养起始后17或20天收获抗FRA抗体，可以增加内在化速率。在一些实施方案中，DO可以在培养起始后6天时从30%变为5%。
在任何前述实施方案中，培养物可以由CHO细胞组成，例如包含核酸的CHO-K1细胞，所述核酸编码SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5的重链氨基酸序列或编码至少95%等同的序列，和SEQ ID NO：2或SEQID NO：6或SEQ ID NO：7的轻链氨基酸序列或编码至少95%等同的序列。特别地，细胞可以包含编码下述的核酸：SEQ ID NO：1的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO：2的轻链氨基酸序列99%相同的轻链氨基酸序列，SEQ ID NO：1的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：6的轻链氨基酸序列，或SEQ ID NO：5的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：7的轻链氨基酸序列，或与上文提及的序列至少95%等同的编码序列。在一些实施方案中，编码重链的核酸包含SEQ ID NO：8的核苷酸序列连同或不连同编码引导序列的核苷酸，和编码轻链的核酸包含SEQ ID NO：9的核苷酸序列连同或不连同编码引导序列的核苷酸。
药物组合物
在进一步方面，本发明提供了组合物，其包含具有本文描述的一种或多种改变特征的本发明的抗FRA抗体，特别是MORAb-003抗体，和药学可接受的载体或赋形剂。“药学可接受的载体”可以是生理学相容的溶剂、分散介质、涂层、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。仅作为举例说明，药学可接受的载体的一些例子是水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等，及其组合。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂例如糖、多元醇例如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。药学可接受的物质的另外例子是增强抗体的贮存期限或有效性的湿润剂或小量辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂。
包含本发明的抗FRA抗体的组合物可以以任何合适的形式用于施用于受试者，例如液体、半固体和固体剂型，例如液体溶液（例如可注射和可输注溶液）、分散体或悬浮液、气溶胶、片剂、丸剂、粉末、脂质体和栓剂。如技术人员应当理解的，形式取决于预期施用方式和治疗应用。在一些实施方案中，本发明的抗FRA抗体以可注射或可输注溶液的形式，例如组合物可以类似于用于人的被动免疫接种的那些。优选施用方式是例如通过静脉内输注或注射的肠胃外的（例如静脉内、皮下、腹膜内、肌内），但还考虑了通过肌内或皮下注射、经口和鼻途径的施用。由本发明考虑的其他施用方式包括支气管内、经粘膜、脊柱内、滑膜内、主动脉内、眼、耳、局部和颊和瘤内。
在一些实施方案中，用于治疗用途的抗FRA抗体组合物在制造和贮存条件下是无菌和稳定的。本发明包括配制为溶液、微乳剂、分散体、脂质体或适合于高药物浓度的其他有序结构的组合物。本发明的无菌可注射溶液可以通过下述进行制备：将抗FRA抗体与上文列举的成分之一或组合以所需量掺入合适溶剂中，需要时，随后为过滤灭菌。包含本发明的抗FRA抗体的分散体可以通过将活性化合物掺入无菌媒介物内进行制备，所述无菌媒介物含有基础分散介质和来自上文列举那些的所需其他成分。在用于制备包含本发明抗FRA抗体的无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其获得来自其先前无菌过滤溶液的活性成分加上任何另外所需成分的粉末。溶液的适当流动性可以例如通过下述得到维持：使用涂层例如卵磷脂，在分散体的情况下维持所需粒子大小和使用表面活性剂。本领域技术人员应当理解为了延长本发明的可注射组合物的吸收，可以在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶。
在特定实施方案中，本发明的抗FRA抗体可以用载体进行制备，所述载体将保护抗体不受快速释放，即作为控制释放制剂，包括埋植剂、经皮贴剂和装入微胶囊的递送***。可以使用生物可降解、生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的许多方法是本领域技术人员一般已知的。参见例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems（J.R.Robinson，编辑，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978）。
在一些实施方案中，包含本发明的抗FRA抗体的组合物还包含另外的活性化合物。在特定实施方案中，本发明的抗FRA抗体与一种或多种另外的治疗、诊断或预防试剂共配制和/或共施用。治疗剂包括但不限于具有不同精细特异性的抗FRA抗体、结合其他靶的抗体、非类固醇抗炎剂、镇痛剂、抗癌剂、类固醇、抗过敏药、化学治疗剂、抗肿瘤药和细胞毒素剂。
根据本发明，本发明的抗FRA抗体可以与已知抑制肿瘤或癌细胞增殖的抗体或其他试剂共配制，例如抑制erbB2受体、E-选择素、EGF-R、CD20、VEGF（例如
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（贝伐珠单抗）、
Figure BDA00003070676900522
（雷珠单抗）和
Figure BDA00003070676900523
（培加尼布））、VEGF受体1（VEGFR1）、VEGF受体2（VEGFR2）或VEGF受体3（VEGFR3）的抗体或试剂。
化学治疗剂的例子包括但不限于（伊马替尼）、（西妥昔单抗）、L-天冬酰胺酶、
Figure BDA00003070676900533
（吉非替尼）、
Figure BDA00003070676900534
（埃罗替尼）和
Figure BDA00003070676900535
（硼替佐米）等。
更具体而言，本发明的抗FRA抗体可以与烷化剂共配制。有用的烷化剂的例子包括但不限于六甲蜜胺（六甲三聚氰胺）、白消安、卡铂、卡莫司汀（BCNU）、苯丁酸氮芥、顺铂、
Figure BDA00003070676900536
（环磷酰胺）、达卡巴嗪（DTIC）、异环磷酰胺、洛莫司汀、二氯甲基二乙胺（氮芥）、美法仑、奥沙利铂（oxalaplatin）、链佐星、
Figure BDA00003070676900537
（替莫唑胺）和噻替派等。
本发明的抗FRA抗体可以与抗代谢药共配制。有用的抗代谢药的例子包括但不限于5-氟尿嘧啶（5-FU）、6-巯嘌呤（6-MP）、
Figure BDA00003070676900538
（卡培他滨）、
Figure BDA00003070676900539
（阿糖胞苷）、氟达拉滨、
Figure BDA000030706769005310
（吉西他滨）、氨甲蝶呤和（培美曲塞）等。
本发明的抗FRA抗体可以与拓扑异构酶I和II抑制剂共配制，包括但不限于
Figure BDA000030706769005312
（伊立替康HCl）、SN-38、喜树碱、
Figure BDA000030706769005313
（拓扑替康）、依托泊苷、替尼泊苷、
Figure BDA000030706769005314
（表柔比星）、（多柔比星）、伊达比星、米托蒽醌、片螺素D和HU-331（通过引用合并入本文的Kogan等人（2007）MolecularCancer Therapeutics6:173-183）等。
在一些实施方案中，本发明的抗FRA抗体可以与抗肿瘤抗生素例如放线菌素-D、博来霉素和丝裂霉素-C等共配制。
在一些实施方案中，本发明的抗FRA抗体可以与有丝***抑制剂共配制。有用的有丝***抑制剂的非限制性例子包括
Figure BDA000030706769005316
（雌氮芥）、
Figure BDA000030706769005317
（依沙比酮）、
Figure BDA000030706769005318
（多西他赛）、（紫杉醇）、
Figure BDA000030706769005320
（长春碱）、
Figure BDA000030706769005321
（长春新碱）、和
Figure BDA000030706769005322
（长春瑞滨）等。
在一些实施方案中，本发明的抗FRA抗体可以与分化剂共配制。有用的分化剂的非限制性例子包括三氧化二砷、视黄素、维甲酸和
Figure BDA00003070676900541
（贝沙罗汀）等。
在一些实施方案中，本发明的抗FRA抗体可以与类固醇化合物例如***、甲泼尼龙和***等共配制。
在一些实施方案中，本发明的抗FRA抗体可以与激素相关化合物共配制。有用的激素相关化合物的非限制性例子包括***、孕激素（例如
Figure BDA00003070676900542
（乙酸甲地孕酮））、
Figure BDA00003070676900543
（氟维司群）、它莫西芬、托瑞米芬、
Figure BDA00003070676900544
（亮丙瑞林）、
Figure BDA00003070676900545
（戈舍瑞林）、（阿那曲唑）、
Figure BDA00003070676900547
（来曲唑）、（依西美坦）、
Figure BDA00003070676900549
（比卡鲁胺）、
Figure BDA000030706769005410
（氟他胺）和
Figure BDA000030706769005411
（尼鲁米特）。
在一些实施方案中，本发明的抗FRA抗体可以与COX-II（环氧合酶II）抑制剂共配制。有用的COX-II抑制剂的非限制性例子包括
Figure BDA000030706769005412
（塞来昔布）、伐地考昔和罗非昔布等。
在一些实施方案中，本发明的抗FRA抗体可以与免疫治疗剂共配制。有用的免疫治疗剂的非限制性例子包括干扰素（例如干扰素-α）、BCG、白细胞介素-2（IL-2）、沙立度胺、来那度胺、
Figure BDA000030706769005413
（阿仑珠单抗）和
Figure BDA000030706769005414
（利妥昔单抗）等。
在一些实施方案中，本发明的抗FRA抗体可以与MMP抑制剂共配制。例如，抗FRA抗体可以与抗血管生成剂例如MMP-2（基质金属蛋白酶2）抑制剂或MMP-9（基质金属蛋白酶9）抑制剂共配制。优选的MMP抑制剂是并未证实关节痛的那些。更优选的是相对于其他基质金属蛋白酶（即MMP-1、MMP-3、MMP-4、MMP-5、MMP-6、MMP-7、MMP-8、MMP-10、MMP-11、MMP-12和MMP-13），选择性抑制MMP-2和/或MMP-9的那些。在本发明中有用的MMP抑制剂的一些具体例子是AG-3340、RO32-3555、RS13-0830和在下述列表中所述的化合物：3-[[4-（4-氟-苯氧基）-苯磺酰]-（1-羟基氨基甲酰基-环戊基）-氨基]-丙酸；3-外-3-[4-（4-氟-苯氧基）-苯磺酰氨基]-8-氧杂-二环[3.2.1]辛烷-3-羧酸羟基酰胺；（2R，3R）1-[4-（2-氯-4-氟-苯甲氧基）-苯磺酰-]-3-羟基-3-甲基-哌啶-2-羧酸羟基酰胺；4-[4-（4-氟-苯氧基）-苯磺酰氨基]-四氢-吡喃-4-羧酸羟基酰胺；3-[[4-（4-氟-苯氧基）-苯磺酰]-（1-羟基-氨甲酰基-环丁基）-氨基]-丙酸；4-[4-（4-氯-苯氧基）-苯磺酰氨基]-四氢-吡喃-4-羧酸羟基酰胺；（R）3-[4-（4-氯-苯氧基）-苯磺酰氨基]-四氢-吡喃-3-羧酸羟基酰胺；（2R、3R）1-[4-（4-氟-2-甲基-苯甲氧基）-苯磺酰]-3-羟基-3-甲基-哌啶-2-羧酸羟基酰胺；3-[[4-（4-氟-苯氧基）-苯磺酰]-（1-羟基氨基甲酰基-1-甲基-乙基）-氨基]-丙酸；3-[[4-（4-氟-苯氧基）-苯磺酰]-（4-羟基氨甲酰基-四氢-吡喃-4-基）-氨基]-丙酸；3-外-3-[4-（4-氯-苯氧基）-苯磺酰氨基]-8-氧杂-i环[3.2.1]辛烷-3-羧酸羟基酰胺；3-内-3-[4-（4-氟-苯氧基）-苯磺酰氨基]-8-氧杂-i环[3.2.1]辛烷-3-羧酸羟基酰胺；和（R）3-[4-（4-氟-苯氧基）-苯磺酰氨基]-四氢-呋喃-3-羧酸羟基酰胺等；和所述化合物的药学可接受的盐和溶剂化物。
在一些实施方案中，抗FRA抗体可以与整联蛋白抑制剂共配制。整联蛋白抑制剂包括但不限于obtustatin、rhodocetin、Vitaxin（MedImmune）、西仑吉肽（EMD121974；Merck）、S137（Pfizer）、S247（Pfizer）和JSM6427（Jerini）（参见例如，Brown等人（2008）International Journal of Cancer123：2195-2203；Stupp等人（2007）Journal of Clinical Oncology25：1637-1638；Eble等人（2003）BiochemJ.376：77-85，都通过引用合并入本文）。
本发明的组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量的”本发明的抗FRA抗体。“治疗有效量”指在所需剂量和时间段有效达到所需治疗结果的量。抗体或抗体部分的治疗有效量可以根据因素而改变，例如个体的疾病状态、年龄、性别和重量，和抗体或抗体部分在个体中引发所需应答的能力。治疗有效量还是其中抗体或抗体部分的任何毒性或有害效应由治疗有利效应超过的量。“预防有效量”指在所需剂量和时间段有效达到所需预防结果的量。一般地，因为预防剂量在疾病之前或在疾病早期用于受试者中，所以预防有效量可以小于治疗有效量。
可以调整剂量方案以提供最佳所需应答（例如治疗或预防应答）。例如，可以施用单次推注，可以随着时间过去施用几个分份剂量，或可以如通过治疗情况的紧迫指示的按比例减少或增加剂量。以剂量单位形式配制肠胃外组合物是尤其有利的用于容易施用和剂量的均匀性。如本文使用的剂量单位形式指适合作为用于待治疗的哺乳动物受试者的单位剂量的物理上不连续的单位；每个单位含有与所需药物载体结合的计算为产生所需疗效的预定数量的活性化合物。关于本发明的剂量单位形式的规格由下述指示且直接依赖于下述：（a）抗FRA抗体的独特特征和待达到的具体治疗或预防效应，和（b）例如用于治疗个体中的敏感性的抗体的配药法中固有的局限性。
关于本发明的抗FRA抗体的治疗或预防有效量的示例性、非限制性范围是0.025-50mg/kg、0.1-50mg/kg、0.1-25mg/kg、0.1-10mg/kg或0.1-3mg/kg。在一个实施方案中，抗FRA抗体在制剂中作为无菌水溶液施用，所述无菌水溶液具有范围为约5.0-约6.5的pH，且包含约1mg/ml-约200mg/ml抗体，约1毫摩尔-约100毫摩尔Tween，约0.01mg/ml-约10mg/ml聚山梨糖醇80或聚山梨糖醇20，约100毫摩尔-约400毫摩尔选自但不限于海藻糖或蔗糖的非还原糖，约0.01毫摩尔-约1.0毫摩尔二钠EDTA二水化物，且任选包含药学可接受的抗氧化剂加上螯合剂。合适的抗氧化剂包括但不限于甲硫氨酸、硫代硫酸钠、过氧化氢酶和铂。例如，组合物可以含有以范围为1mM-约100mM，且特别是约27mM浓度的甲硫氨酸。在一些实施方案中，制剂含有在20mM柠檬酸钠，pH5.5，140mM NaCl和0.2mg/ml聚山梨醇酯80缓冲液中的5mg/ml抗体。应当指出剂量值可以随着待减轻的病状的类型和严重性而改变。还应当理解对于任何具体受试者，具体剂量方案应随着时间过去根据个体需要和施用或监督组合物施用的个人的专业判断进行调整，并且本文所述的剂量方案仅是示例性的，并且不预期限制请求保护的组合物的范围或实践。
本发明的另一个方面提供了包含本发明的抗FRA抗体或包含此类抗FRA抗体的药物组合物的试剂盒。除了抗体或药物组合物外，试剂盒可以包括诊断或治疗剂。试剂盒还可以包括关于在诊断或治疗方法中使用的说明书，以及包装材料，例如但不限于冰、干冰、泡沫聚苯乙烯、泡沫、塑料、赛璐玢、收缩包装、水泡包装、卡纸板和淀粉花生。在一个实施方案中，试剂盒包括抗体或包含抗体和诊断试剂的药物组合物，所述诊断试剂可以在本文描述的方法中使用。在另外一个实施方案中，试剂盒包括抗体或包含抗体和一种或多种治疗剂的药物组合物，所述治疗剂可以在本文描述的方法中使用。
本发明还涉及用于抑制哺乳动物中的癌症的组合物和试剂盒，其包含与化学治疗剂的量组合的本发明抗体的量，其中化合物、盐、溶剂化物或药物前体和化学治疗剂的量一起在抑制异常细胞生长中有用。许多化学治疗剂是本领域目前已知的。在一些实施方案中，化学治疗剂选自有丝***抑制剂、烷化剂、抗代谢药、嵌入抗生素、趋化因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、生物应答改性剂、抗激素例如抗雄激素、和抗血管生成剂。
诊断方法
本发明的抗FRA抗体可以用于在体外或体内检测生物样品中的FRA或FRA表达细胞。抗FRA抗体可以用于常规免疫测定法中，包括但不限于ELISA、RIA、流式细胞术、免疫细胞化学、组织免疫组织化学、蛋白质印迹或免疫沉淀。本发明的抗FRA抗体可以用于检测来自人的FRA。
在另一个方面，本发明提供了用于检测生物样品中的FRA的方法。该方法包括使生物样品与本发明的抗FRA抗体接触且检测结合的抗体。抗FRA抗体可以用可检测标记直接标记或可以是未标记的。如果使用未标记的抗体，那么标记的可以结合抗FRA抗体的第二种抗体或其他分子用于检测与FRA结合的抗体。如本领域技术人员众所周知的，选择能够特异性结合第一种抗体的特定物种和类别的第二种抗体。例如，如果抗FRA抗体包含人IgG，那么次级抗体可以是标记的抗人IgG抗体。可以与抗体结合的其他分子包括但不限于蛋白质A和蛋白质G，两者都例如从Pierce Chemical Co商购可得。
用于抗体或次级分子的合适标记已得到公开，并且包括多种酶、辅基、荧光材料、发光材料、磁性试剂和放射性材料。合适酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、O-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适辅基复合物的例子包括链霉亲和素生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适荧光材料的例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的例子包括鲁米诺；磁性试剂的例子包括钆；并且合适的放射性材料的例子包括125I、131I、35S或3H。
本发明的抗FRA抗体可以用于测定组织或衍生自组织的细胞例如发育不良细胞中FRA的存在和/或水平。组织可以是患病组织例如肿瘤或其活组织检查。细胞可以是例如卵巢、胰腺、***或肺癌细胞。检测可以在组织样品中或在体内。本发明的抗FRA抗体可以通过上文讨论的方法根据本发明用于检测和/或定量组织中的FRA、FRA的细胞表面水平或FRA的定位。
本发明的抗体尤其是人源化抗体还可以在体内用于检测组织和器官例如FRA表达肿瘤中的FRA。对于FRA的体内检测，将标记的抗FRA抗体施用于需要此类诊断测试的患者，并且对患者实施成像分析以便测定FRA表达组织的定位。成像分析是医学领域众所周知的，并且包括但不限于x射线分析、磁共振成像（MRI）或计算机体层摄影术（CE）。在该方法的另一个实施方案中，肿瘤或组织活组织检查得自患者，以测定它是否表达FRA。对于成像，抗FRA抗体可以用可以在患者中成像的可检测试剂进行标记。例如，用可以用于x射线分析的造影剂例如钡，或可以用于MRI或CE的磁性造影剂例如钆螯合物，可以标记抗FRA抗体。其他标记试剂包括但不限于放射性同位素例如99Tc。根据本发明，抗FRA抗体还可以是未标记的，并且成像是通过施用可检测且可以结合抗FRA抗体的第二种抗体或其他分子。
治疗方法
在另一个方面，本发明提供了使用本发明的抗FRA抗体用于治疗的方法。本发明的方法包括在体外或体内减少FRA表达细胞的生长、增殖或存活。本发明还提供了用于治疗有此需要的受试者中的癌症的方法，其包括步骤：给受试者施用本发明的抗FRA单克隆抗体。在多个实施方案中，癌症是卵巢、乳腺、肾、结肠直肠、肺、子宫内膜、脑、输卵管或子宫癌或白血病。本发明还提供了用于减少与有此需要的受试者中增加的FRA表达相关的发育不良细胞的生长的方法，其包括步骤：给受试者施用本发明的抗FRA单克隆抗体。在多个实施方案中，发育不良细胞是卵巢、乳腺、肾、结肠直肠、肺、子宫内膜、脑、输卵管、子宫癌细胞或白血病细胞。在优选实施方案中，受试者是人。
在一个实施方案中，本发明提供了用于抑制FRA活性的方法，其包括使表达FRA的细胞与抗FRA抗体接触或使表达FRA的细胞暴露于抗FRA抗体。在一些实施方案中，将抗FRA抗体施用于有此需要的受试者。受试者可以患有特征在于FRA的发育不良或增加表达的疾病或病状。非限制性例子包括癌症、肿瘤生长和过度增生病症。受试者可以是人受试者或兽医受试者，包括人疾病的非人动物模型。抗FRA抗体可以用于制造用于治疗特征在于FRA的发育不良或增加表达的疾病或病状的药物。
根据本发明的方法，本发明的抗FRA抗体可以净施用，或可以掺入适合于施用于受试者的药物组合物内。药物组合物可以包含药学可接受的载体，例如生理学相容的溶剂、分散介质、涂层、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。仅作为举例说明，药学可接受的载体的例子包括但不限于水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等中的一种或多种，及其组合。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂例如糖、多元醇例如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。药学可接受的物质例如增强抗体或抗体部分的贮存期限或有效性的湿润剂或小量辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂。
抗FRA抗体可以施用一次或多次。当使用多次施用时，它们可以是每天、每周或每月一次，或任何合适的时候，定期地包括多个日剂量。施用可以按照计划表，例如每天三次、每天两次、每天一次、每两天一次、每三天一次、每周一次、每两周一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次和每六个月一次。抗FRA抗体还可以例如经由微型泵连续施用。抗FRA抗体可以例如经由粘膜、颊、鼻内、可吸入、静脉内、皮下、肌内、肠胃外或瘤内途径施用。抗FRA抗体可以施用一次、至少两次或至少直至病状治疗、姑息或治愈的时间段。抗FRA抗体一般施用病状存在之久或更久以预防病状的复发。抗FRA抗体一般作为如上所述的药物组合物的部分施用。抗FRA抗体的剂量一般在0.1-100mg/kg、更优选0.5-50mg/kg、更优选1-20mg/kg、和甚至更优选1-10mg/kg的范围中。抗FRA抗体的血清浓度可以通过本领域已知的任何方法进行测量。
在另一个实施方案中，抗FRA抗体可以与另一种治疗剂包括另一种抗FRA抗体共施用。另外的治疗剂还可以是通过RNA干扰减少FRA表达的寡核苷酸，包括单链或双链核酸分子。在患有过度增生病症例如癌症或肿瘤的受试者的情况下，另外的治疗剂可以是抗肿瘤药。在一个方面，本发明涉及用于治疗有此需要的受试者中的过度增生病症的方法，其包括给所述受试者施用与选自但不限于下述的抗肿瘤剂组合的治疗有效量的本发明的抗FRA抗体：有丝***抑制剂、烷化剂、抗代谢药、嵌入剂、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、生物应答改性剂、抗激素、激酶抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂、基因治疗、抗雄激素、抗肿瘤药和细胞毒素剂。在另一个优选实施方案中，抗FRA抗体或组合疗法连同放射疗法、化学疗法、光动力学疗法、手术或其他免疫疗法一起施用。
根据本发明，本发明的抗FRA抗体可以与已知抑制肿瘤或癌细胞增殖的抗体或其他试剂施用，例如抑制erbB2受体、E-选择素、EGF-R、CD20、VEGF（例如
Figure BDA00003070676900601
（贝伐珠单抗）、（雷珠单抗）和
Figure BDA00003070676900603
（培加尼布））、VEGF受体1（VEGFR1）、VEGF受体2（VEGFR2）或VEGF受体3（VEGFR3）等的抗体或试剂。
本发明的抗FRA抗体可以与化学治疗剂共施用，所述化学治疗剂包括但不限于
Figure BDA00003070676900604
（伊马替尼）、
Figure BDA00003070676900605
（西妥昔单抗）、L-天冬酰胺酶、
Figure BDA00003070676900606
（吉非替尼）、（埃罗替尼）和（硼替佐米）等。
更具体而言，本发明的抗FRA抗体可以与烷化剂共施用。有用的烷化剂的例子包括但不限于六甲蜜胺（六甲三聚氰胺）、白消安、卡铂、卡莫司汀（BCNU）、苯丁酸氮芥、顺铂、
Figure BDA00003070676900611
（环磷酰胺）、达卡巴嗪（DTIC）、异环磷酰胺、洛莫司汀、二氯甲基二乙胺（氮芥）、美法仑、奥沙利铂（oxalaplatin）、链佐星、
Figure BDA00003070676900612
（替莫唑胺）、噻替派等。
本发明的抗FRA抗体可以与抗代谢药共施用。有用的抗代谢药的例子包括但不限于5-氟尿嘧啶（5-FU）、6-巯嘌呤（6-MP）、
Figure BDA00003070676900613
（卡培他滨）、
Figure BDA00003070676900614
（阿糖胞苷）、氟达拉滨、
Figure BDA00003070676900615
（吉西他滨）、氨甲蝶呤、
Figure BDA00003070676900616
（培美曲塞）等。
本发明的抗FRA抗体可以与拓扑异构酶I和II抑制剂共施用，包括但不限于
Figure BDA00003070676900617
（伊立替康HCl）、SN-38、喜树碱、
Figure BDA00003070676900618
（拓扑替康）、依托泊苷、替尼泊苷、
Figure BDA00003070676900619
（表柔比星）、（多柔比星）、伊达比星、米托蒽醌、片螺素D、HU-331（Kogan等人（2007）Molecular Cancer Therapeutics6:173-183）等。
在一些实施方案中，本发明的抗FRA抗体可以与抗肿瘤抗生素例如放线菌素-D、博来霉素和丝裂霉素-C等共施用。
在一些实施方案中，本发明的抗FRA抗体可以与有丝***抑制剂共施用。有用的有丝***抑制剂的非限制性例子包括
Figure BDA000030706769006111
（雌氮芥）、
Figure BDA000030706769006112
（依沙比酮）、
Figure BDA000030706769006113
（多西他赛）、
Figure BDA000030706769006114
（紫杉醇）、
Figure BDA000030706769006115
（长春碱）、
Figure BDA000030706769006116
（长春新碱）、
Figure BDA000030706769006117
（长春瑞滨）等。
在一些实施方案中，本发明的抗FRA抗体可以与分化剂共施用。有用的分化剂的非限制性例子包括三氧化二砷、视黄素、维甲酸和
Figure BDA000030706769006118
（贝沙罗汀）等。
在一些实施方案中，本发明的抗FRA抗体可以与类固醇化合物例如***、甲泼尼龙、***等共施用。
在一些实施方案中，本发明的抗FRA抗体可以与激素相关化合物共施用。有用的激素相关化合物的非限制性例子包括***、孕激素（例如
Figure BDA000030706769006119
（乙酸甲地孕酮））、
Figure BDA000030706769006120
（氟维司群）、它莫西芬、托瑞米芬、
Figure BDA00003070676900621
（亮丙瑞林）、
Figure BDA00003070676900622
（戈舍瑞林）、（阿那曲唑）、（来曲唑）、
Figure BDA00003070676900625
（依西美坦）、
Figure BDA00003070676900626
（比卡鲁胺）、
Figure BDA00003070676900627
（氟他胺）、
Figure BDA00003070676900628
（尼鲁米特）等。
在一些实施方案中，本发明的抗FRA抗体可以与COX-II（环氧合酶II）抑制剂共施用。有用的COX-II抑制剂的非限制性例子包括
Figure BDA00003070676900629
（塞来昔布）、伐地考昔、罗非昔布等。
在一些实施方案中，本发明的抗FRA抗体可以与免疫治疗剂共施用。有用的免疫治疗剂的非限制性例子包括干扰素（例如干扰素-α）、BCG、白细胞介素-2（IL-2）、沙立度胺、来那度胺、
Figure BDA000030706769006210
（阿仑珠单抗）、（利妥昔单抗）。
在一些实施方案中，本发明的抗FRA抗体可以与MMP抑制剂共施用。例如，抗FRA抗体可以与抗血管生成剂例如MMP-2（基质金属蛋白酶2）抑制剂或MMP-9（基质金属蛋白酶9）抑制剂共施用。优选的MMP抑制剂是并未证实关节痛的那些。更优选的是相对于其他基质金属蛋白酶（即MMP-1、MMP-3、MMP-4、MMP-5、MMP-6、MMP-7、MMP-8、MMP-10、MMP-11、MMP-12和MMP-13），选择性抑制MMP-2和/或MMP-9的那些。在本发明中有用的MMP抑制剂的一些具体例子是AG-3340、RO32-3555、RS13-0830和在下述列表中所述的化合物：3-[[4-（4-氟-苯氧基）-苯磺酰]-（1-羟基氨基甲酰基-环戊基）-氨基]-丙酸；3-外-3-[4-（4-氟-苯氧基）-苯磺酰氨基]-8-氧杂-二环[3.2.1]辛烷-3-羧酸羟基酰胺；（2R，3R）1-[4-（2-氯-4-氟-苯甲氧基）-苯磺酰-]-3-羟基-3-甲基-哌啶-2-羧酸羟基酰胺；4-[4-（4-氟-苯氧基）-苯磺酰氨基]-四氢-吡喃-4-羧酸羟基酰胺；3-[[4-（4-氟-苯氧基）-苯磺酰]-（1-羟基-氨甲酰基-环丁基）-氨基]-丙酸；4-[4-（4-氯-苯氧基）-苯磺酰氨基]-四氢-吡喃-4-羧酸羟基酰胺；（R）3-[4-（4-氯-苯氧基）-苯磺酰氨基]-四氢-吡喃-3-羧酸羟基酰胺；（2R、3R）1-[4-（4-氟-2-甲基-苯甲氧基）-苯磺酰]-3-羟基-3-甲基-哌啶-2-羧酸羟基酰胺；3-[[4-（4-氟-苯氧基）-苯磺酰]-（1-羟基氨基甲酰基-1-甲基-乙基）-氨基]-丙酸；3-[[4-（4-氟-苯氧基）-苯磺酰]-（4-羟基氨甲酰基-四氢-吡喃-4-基）-氨基]-丙酸；3-外-3-[4-（4-氯-苯氧基）-苯磺酰氨基]-8-氧杂-i环[3.2.1]辛烷-3-羧酸羟基酰胺；3-内-3-[4-（4-氟-苯氧基）-苯磺酰氨基]-8-氧杂-i环[3.2.1]辛烷-3-羧酸羟基酰胺；和（R）3-[4-（4-氟-苯氧基）-苯磺酰氨基]-四氢-呋喃-3-羧酸羟基酰胺；和所述化合物的药学可接受的盐和溶剂化物。
在一些实施方案中，抗FRA抗体可以与整联蛋白抑制剂共施用。整联蛋白抑制剂包括但不限于obtustatin、rhodocetin、Vitaxin（MedImmune）、西仑吉肽（EMD121974；Merck）、S137（Pfizer）、S247（Pfizer）和JSM6427（Jerini）（参见例如，Brown等人（2008）International Journal of Cancer123：2195-2203；Stupp等人（2007）Journal of Clinical Oncology25：1637-1638；Eble等人（2003）BiochemJ.376：77-85，都通过引用合并入本文）。
本发明的抗FRA抗体与另外的治疗剂的共施用（组合疗法）包含施用包含抗FRA抗体和另外的治疗剂的药物组合物以及施用两种或多种分离的药物组合物：一种包含抗FRA抗体并且另一种包含另外的治疗剂。进一步地，共施用或组合疗法包括同时或顺次或两者施用的抗FRA抗体和另外的治疗剂。例如，抗FRA抗体可以每三天施用一次，而另外的治疗剂与抗FRA抗体同时或在不同时间每天施用一次。抗FRA抗体可以在用另外的治疗剂治疗前或后施用。类似地，本发明的抗FRA抗体的施用可以是治疗方案的部分，所述治疗方案包括其他治疗模式，包括辐射、手术、锻炼、光疗法包括激光疗法和饮食补充。可以施用组合疗法以预防病状的复发。优选地，将组合疗法施用多次。组合疗法可以从每天三次施用到每六个月一次。施用可以按照计划表，例如每天三次、每天两次、每天一次、每两天一次、每三天一次、每周一次、每两周一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次和每六个月一次，或可以例如经由微型泵连续施用。组合疗法可以例如经由经口、粘膜、颊、鼻内、可吸入、静脉内、皮下、肌内或肠胃外途径施用。
在一个实施方案中，抗FRA抗体在制剂中作为无菌水溶液施用，所述无菌水溶液具有范围为约5.0-约8.0、优选约6.5-约7.5、和更优选约7.0-约7.2的pH。制剂可以包含约1mg/ml-约200mg/ml、约5mg/ml-约50mg/ml、或约10mg/ml-约25mg/ml抗体。制剂可以包含约1毫摩尔-约100毫摩尔Tween，约0.01mg/ml-约10mg/ml聚山梨糖醇80，约100毫摩尔-约400毫摩尔海藻糖，和约0.01毫摩尔-约1.0毫摩尔二钠EDTA二水化物。在优选实施方案中，抗体在10mM磷酸钠、150mM氯化钠，pH7.2、0.01%USP Tween80中的5.0±0.5mg/mL抗体的制剂中施用。
在再进一步的实施方案中，抗FRA抗体用放射性标记、免疫毒素或毒素进行标记，或是包含细胞毒性肽的融合蛋白。抗FRA抗体或抗FRA抗体融合蛋白将放射性标记、免疫毒素、毒素或毒性肽导向FRA表达肿瘤或癌细胞。在优选实施方案中，放射性标记、免疫毒素、毒素或毒性肽在抗FRA抗体与肿瘤或癌细胞表面上的FRA结合后内在化。
应当理解本文描述的实施例和实施方案仅用于举例说明目的，并且根据其的多种修饰或改变对于本领域技术人员将是显而易见的，并且应包括在本发明的真正范围内，并且可以不背离本发明的真正范围而作出。
实施例
实施例1：在不同条件下培养的抗FRA抗体的培养和纯化
从低温保存恢复产生抗FRA抗体的CHO-K1细胞，并且在表1中所示的条件下亚培养，所述抗FRA抗体包含SEQ ID NO：5的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:7的轻链氨基酸序列。接种物扩增和亚培养在125mL和500mL摇瓶中执行。
表1：低温保存的细胞原种恢复和亚培养条件
参数 值/范围
培养基 CD-CHO（Invitrogen）
温育温度（℃） 37℃±0.5
振荡速度（rpm） 120±5
顶空平衡气体 在95%空气中的5%CO2
复苏接种活细胞浓度（106/mL） 0.30
在复苏和第一次亚培养之间的天数 3
系列亚培养接种活细胞浓度（106/mL） 0.2
在第一次和后续亚培养之间的天数 4
在恢复和亚培养后，细胞在2L搅拌槽生产生物反应器（B-DCU，Sartorius）分批补料培养中进行培养，具有多种实验细胞培养条件变化和阳性对照（表2和3）。
表2：用于操作2L搅拌槽生产生物反应器分批补料培养的条件。
表3：生物反应器条件变化的表。
参数 值/范围
1 阳性对照 T=36.5℃，pH=7.0，DO=30%，1.00-3.00g/L的葡萄糖浓度
2 半乳糖补充 在培养起始后5天的2g/L弹丸添加
3 低温 在培养起始后5天从36.5℃到30℃的转变
4 高同渗容摩 在培养起始后7天加入NaCl以达到600mOsm/L
5 0.5mM丁酸钠 在培养起始后6天的弹丸添加
6 低溶解氧（DO） DO在培养起始后6天时从30%变为5%
7 高CO2 在培养起始后5天使培养基中的CO2累积达到高达20%
8 10mM丁酸钠 在培养起始后6天的弹丸添加
9 氯化铜 在培养起始后6天的0.5mM弹丸添加
10 时间点 在第10、14、17和20天收获样品
如下纯化MORAb-003抗FRA抗体培养物。通过离心（10,000g，20分钟）澄清来自分泌MORAb-003的细胞的条件培养基（对于每种条件1.5L）。将所得到的上清液通过0.22mm膜过滤。在条件培养基中的MORAb-003抗体通过蛋白质A亲和色谱法进行纯化，借助于AktaExplorer100A（GE Healthcare）。简言之，用PBS（0.02M磷酸钾、0.15M氯化钠，pH7.2）平衡由ProSep vA（目录#113115830，Millipore）填充的20mL柱床体积柱。在澄清后，将含MORAb-003条件培养基以5.0mL/分钟的速率装载到柱上。将树脂用PBS洗涤12柱体积（CV），随后为结合的MORAb-003抗体的洗脱，使用3.5CV的洗脱缓冲液（10mM乙酸、100mM甘氨酸，pH3.8）。将树脂用2CV6M盐酸胍净化。在除了装载外的所有步骤中的流速是7.0mL/分钟。合并的洗脱馏分针对2L PBS在4℃透析约15小时，使用10kDa截断SnakeSkinPleated Dialysis Tubing（Prod#68100，Thermo Scientific）。
实施例2：在不同条件下培养的抗FRA抗体的聚糖谱
在如实施例1中所述培养且纯化MORAb-003抗FRA抗体后，如下去除、分离、鉴定且定量在抗体上发现的中性、N联复杂碳水化合物结构。指定至在不同条件下培养的抗FRA抗体样品的批号在表4中显示。MORAb-003抗体重链中的N联聚糖使用肽-N-糖苷酶F（PNGase F）酶促去除，并且通过凝胶过滤色谱法纯化。所得到的聚糖混合物使用例如2-氨基苯甲酰胺（2-AB）进行荧光标记，并且通过正相HPLC使用TosohTSK-Gel80-酰胺柱分辨。荧光标记的聚糖通过荧光（Ex330nm/Em420nm）进行定量。来自在分离过程中出现的峰的聚糖的鉴定通过线内质谱检测完成，使用以总离子色谱图或提取离子色谱图模式的AgilentESI-TOF质谱仪。回收的聚糖结构的图解显示于图1中。
表4：对应于抗FRA抗体培养条件的批号。
客户批次# 生物反应器 循环 参数
NB810-10 BR5 1 阳性对照；在培养起始后14天收获
NB810-11 BR6 1 半乳糖补充；在培养起始后14天收获
NB810-12 BR7 1 低温；在培养起始后14天收获
NB810-13 BR8 1 高同渗容摩；在培养起始后14天收获
NB809-65 BR1 2 阳性对照；在培养起始后13天收获
NB809-66 BR3 2 0.5mM丁酸钠；在培养起始后13天收获
NB809-67 BR4 2 低DO；在培养起始后13天收获
NB809-68 BR5 2 高CO2；在培养起始后13天收获
NB809-69 BR7 2 10mM丁酸钠；在培养起始后13天收获
NB809-70 BR8 2 CuCl补充；在培养起始后13天收获
客户批次# 生物反应器 循环 参数
NB859-24 BR1 3 在培养起始后10天收获
NB859-25 BR1 3 在培养起始后14天收获
NB859-26 BR1 3 在培养起始后17天收获
NB859-27 BR1 3 在培养起始后20天收获
NB859-28 BR2 3 低DO；在培养起始后14天收获
批次NB859-25衍生自在用于阳性对照批次NB810-10和NB809-65的那些的条件下生长的培养物。批次NB859-25指定为阳性对照用于与第3轮中产生的其他批次的实验结果比较的目的。
MORAb-003抗FRA抗体样品中的主要中性N联聚糖分布的初步结果显示于图2中。MORAb-003抗FRA抗体样品中的中性聚糖分布的另外结果显示于图3中。“MORAb-003参考标准”是在如本文定义的“参考培养条件”下产生，并且由外部制造商供应的MORAb-003抗FRA抗体。
实施例3：抗FRA抗体的结合亲和力与抗体培养条件和聚糖结构的关联
通过表面等离振子共振光谱法测定MORAb-003抗FRA抗体样品的相对结合亲和力。经由胺偶联将重组人叶酸受体α（FRA）（SEQ ID NO：3）固定到研究级别CM5芯片的表面上。在表面上系列注射MORAb-003抗FRA抗体参考标准或变体样品制剂跨越0.02-44mg/mL的稀释物，所述MORAb-003抗FRA抗体参考标准在如本文定义的“参考培养条件”下产生且由外部制造商供应，并且在允许结合进行40秒后测量结合水平。在循环之间通过用10mM甘氨酸pH2.0冲洗来再生表面。使用BiaEvaluation4.1（GE Healthcare），对于参考样品和所有样品标绘根据MORAb-003浓度的结合水平。将数据拟合至五参数逻辑曲线拟合，并且使用STATLIA版本3.2（Brendan Technologies），通过平行线分析测定与参考样品相比较的每种样品的相对结合效力。结果显示于图4中。为了计算在“测量效力”列中的结果，将参考标准的结合效力设为100%。与在如本文定义的“参考培养条件”下产生且由外部制造商供应的MORAb-003抗FRA抗体相比较，所有培养条件包括阳性对照具有更低的结合亲和力。
实施例4：抗FRA抗体的ADCC与抗体培养条件和聚糖结构的关联
如下测量通过MORAb-003抗FRA抗体样品介导的体外抗体依赖性细胞毒性（ADCC）。用羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯（CFDA SE）标记FRA表达IGROV-1人卵巢腺癌细胞（Bernard,等人（1985）CancerRes4：4970-4979）。标记的细胞与MORAb-003抗FRA抗体样品的稀释物和衍生自人外周血单核细胞（PBMC）的未标记的效应细胞混合。在4小时温育后，通过流式细胞术就剩余活的、标记的IGROV-1细胞评分细胞群体。用MORAb-003抗FRA抗体的变体样品批次处理后的剩余细胞馏分与用相等浓度的MORAb-003抗FRA抗体参考标准制剂处理的细胞的那种相比较，所述MORAb-003抗FRA抗体参考标准制剂在如本文定义的“参考培养条件”下产生，并且由外部制造商供应。结果显示于图5中。为了计算在“测量效力”列中的结果，将参考标准的ADCC设为100%。为了计算在“相对效力”列中的结果，将两个阳性对照的测量ADCC的平均值设为100%。
低温和低DO细胞培养条件产生具有高百分比的NGA2（G0）聚糖的MORAb-003抗FRA抗体同种型。NGA2（G0）聚糖的存在与增加的ADCC关联（图6）。这种关联是统计上显著的。
非岩藻糖基化聚糖的存在与增加的ADCC关联（图7）。这种关联是统计上显著的。
M3N2F聚糖的存在与增加的ADCC反相关（图8）。
实施例5：抗FRA抗体的内在化活性与抗体培养条件和聚糖结构的关联
使用抗人次级免疫毒素，通过FRA表达细胞的杀死程度评分MORAb-003抗FRA抗体样品的内在化活性。将MORAb-003抗FRA抗体样品的稀释物和缀合至细胞毒性植物蛋白质皂草素（Hum-ZAP，Advanced Targeting Systems，Inc.）的固定量的山羊抗人IgG次级抗体加入含有2,000细胞/孔的人FRA表达IGROV-1细胞的96孔组织培养处理的微量滴定板的孔中。在抗原结合后MORAb-003-Hum-ZAP复合物的内在化导致细胞毒素以MORAb-003依赖性方式释放到IGROV-1细胞内。内在化的MORAb-003抗FRA抗体馏分因此可以基于IGROV-1细胞的杀死程度进行评分。使用SpectraMax190微板阅读器（MolecularDevices Corp.），通过剩余活细胞的Sulforhodamine Blue染色测量IGROV-1细胞增殖。将数据（OD540与MORAb-003抗FRA抗体的浓度相比较）拟合至5参数逻辑曲线拟合算法。由对于每个曲线测量的曲线拟合参数计算导致IGROV-1细胞的50%杀死（IC50）的MORAb-003抗FRA抗体浓度（参见图9和图10）。
还通过FACS测量MORAb-003抗FRA抗体样品的内在化活性。使人FRA表达IGROV-1细胞在4℃与1μg/mL MORAb-003抗FRA抗体样品温育30分钟，并且用PBS洗涤。细胞随后在4℃与40μg/mL FITC缀合的抗人IgG抗体温育30分钟，并且用PBS洗涤。细胞随后在37℃温育给定时间段，以起始内在化。细胞在4℃用酸性甘氨酸缓冲液洗涤，以去除所有膜结合的抗体。在酸性甘氨酸缓冲液洗涤后，在4℃对细胞执行流式细胞术。在所有实验中，内在化定义为平均荧光强度（MFI）中的时间依赖性增加，因为仅在质膜内内在化的抗体将得到保留且在酸性洗涤后产生荧光信号。
图11显示用MORAb-003抗FRA抗体参考标准执行的FACS结合实验结果的直方图，所述MORAb-003抗FRA抗体参考标准在如本文定义的“参考培养条件”下产生，并且由外部制造商供应。阴影面积（P1群体）对应于与FITC缀合的抗人IgG抗体一起温育的细胞。P2群体（0%对照）对应于与作为对照的无关人IgG和FITC缀合的抗人IgG抗体一起温育的细胞。P3群体对应于与抗FRA抗体和FITC缀合的抗人IgG抗体一起温育且用酸性甘氨酸缓冲液洗涤的细胞。P4群体（100%对照）对应于与抗FRA抗体和FITC缀合的抗人IgG抗体一起温育伴随PBS缓冲液洗涤的细胞。
如下由相对荧光强度计算MORAb-003抗FRA抗体内在化百分比：
（（MFI[样品]-MFI[0%对照]）/（MFI[100%对照]-MFI[0%对照]））x100
图12描述在时间和MORAb-003抗FRA抗体参考标准通过IGROV-1细胞的内在化之间的关系，所述MORAb-003抗FRA抗体参考标准在如本文定义的“参考培养条件”下产生，并且由外部制造商供应。y轴代表相对于在每个时间点的总结合随着时间过程（x轴）通过IGROV-1细胞群体的流式细胞术测量的MFI百分比。图13描述在时间和表4中所述的MORAb-003抗FRA抗体样品以及MORAb-003抗FRA抗体参考标准通过IGROV-1细胞的内在化之间的关系，所述MORAb-003抗FRA抗体参考标准在如本文定义的“参考培养条件”下产生，并且由外部制造商供应。其中标记“MORAb-003参考标准”的三种样品代表在FACS实验的不同运行中使用的相同抗体分批。图14描述图13中的数据通过非线性回归拟合至四参数逻辑曲线。所得到的EC50曲线拟合参数用于填充（populate）图15。
图15概括FACS MORAb-003抗FRA抗体样品内在化研究的结果且提供EC50值。更低的EC50值指示更快速的内在化。在如本文定义的“参考培养条件”下产生，并且由外部制造商供应MORAb-003抗FRA抗体参考标准在约2小时（120分钟）时达到内在化峰。样品NB859-26和NB859-27（17和20天培养产物）具有更低的EC50值，指示比阳性对照更快速的内在化过程。样品NB859-28（用低溶解氧处理的培养物）也证实比阳性对照更快速的内在化过程。
图16概括在实施例3、4和5中所述的活性数据。
除非本文另有定义，与本发明结合使用的科学和技术术语应具有由本领域普通技术人员通常理解的含义。进一步地，除非上下文另有需要，单独术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。一般地，与本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交结合使用的命名法及其技术是本领域众所周知且通常使用的那些。
本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知和如本说明书自始至终引用且讨论的各种一般和更具体的参考文献中描述的常规方法执行，除非另有说明。参见例如，通过引用合并入本文的Sambrook J.&RussellD..Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.（2000）；Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods fromCurrent Protocols in Molecular Biology，Wiley，John&Sons，Inc.（2002）；Harlow和Lane Using Antibodies：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.（1998）；和Coligan等人，Short Protocols in Protein Science，Wiley，John&Sons，Inc.（2003）。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书执行，如本领域通常完成或如本文描述的。与本文描述的分析化学、合成有机化学、以及医学和药物化学结合使用的命名法，及其实验室程序和技术是本领域众所周知且通常使用的那些。
本文引用的所有出版物、专利、专利申请或其他文件为了所有目的在此通过引用整体合并，其程度与每个个别出版物、专利、专利申请或其他文件个别指出为了所有目的通过引用合并相同。
本说明书和实施方案自始至终，单词“包含”应理解为暗示包括所述整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。
表5：序列表
引导序列是斜体的。CDRs是有下划线的。
抗FRA抗体重链氨基酸序列
MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCSASGFTFSGYGLSWVRQAP
GKGLEWVAMISSGGSYTYYADSVKGRFAISRDNAKNTLFLQMDSLRPEDTGVYFCARHGD
DPAWFAYWGQGTPVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN
SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS
CDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV
DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA
KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD
SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO：1）
EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCSASGFTFSGYGLSWVRQAPGKGLEWVAMISSGGSYTYYADSVKGRFAISRDNAKNTLFLQMDSLRPEDTGVYFCARHGDDPAWFAYWGQGTPVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO：5）
抗FRA抗体轻链氨基酸序列
MGWSCIILFLVATATGVHSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSISSDNLHWYQQKP
GKAPKPWIYGTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSYPYMYTF
GQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGN
SQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（SEQ ID NO：2）
MGWSCIILFLVATATGVHSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSISSNNLHWYQQKPGKAPKPWIYGTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSYPYMYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（SEQ ID NO：6）
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSISSNNLHWYQQKPGKAPKPWIYGTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQ WSSYPYMYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（SEQ IDNO：7）
抗FRA抗体重链核苷酸序列
atgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagctacaggtgtccactccgaggtccaactggtggagagcggtggaggtgttgtgcaacctggccggtccctgcgcctgtcctgctccgcatctggcttcaccttcagcggctatgggttgtcttgggtgagacaggcacctggaaaaggtcttgagtgggttgcaatgattagtagtggtggtagttatacctactatgcagacagtgtgaagggtagatttgcaatatcgcgagacaacgccaagaacacattgttcctgcaaatggacagcctgagacccgaagacaccggggtctatttttgtgcaagacatggggacgatcccgcctggttcgcttattggggccaagggaccccggtcaccgtctcctcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcttatattcaaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctcccgggaaatga（SEQ ID NO：8）
抗FRA抗体轻链DNA序列
atgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagctacaggtgtccactccgacatccagctgacccagagcccaagcagcctgagcgccagcgtgggtgacagagtgaccatcacctgtagtgtcagctcaagtataagttccaacaacttgcactggtaccagcagaagccaggtaaggctccaaagccatggatctacggcacatccaacctggcttctggtgtgccaagcagattcagcggtagcggtagcggtaccgactacaccttcaccatcagcagcctccagccagaggacatcgccacctactactgccaacagtggagtagttacccgtacatgtacacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttaa（SEQ ID NO：9）
人FRA氨基酸序列
MAQRMTTQLLLLLVWVAVVGEAQTRIAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRPWRKNACCSTNTSQEAHKDVSYLYRFNWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKEDCEQWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQPFHFYFPTPTVLCNEIWTHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYAAAMSGAGPWAAWPFLLSLALMLLWLLS（SEQ ID NO：3）
人FRA核苷酸序列
atggctcagcggatgacaacacagctgctgctccttctagtgtgggtggctgtagtaggggaggctcagacaaggattgcatgggccaggactgagcttctcaatgtctgcatgaacgccaagcaccacaaggaaaagccaggccccgaggacaagttgcatgagcagtgtcgaccctggaggaagaatgcctgctgttctaccaacaccagccaggaagcccataaggatgtttcctacctatatagattcaactggaaccactgtggagagatggcacctgcctgcaaacggcatttcatccaggacacctgcctctacgagtgctcccccaacttggggccctggatccagcaggtggatcagagctggcgcaaagagcgggtactgaacgtgcccctgtgcaaagaggactgtgagcaatggtgggaagattgtcgcacctcctacacctgcaagagcaactggcacaagggctggaactggacttcagggtttaacaagtgcgcagtgggagctgcctgccaacctttccatttctacttccccacacccactgttctgtgcaatgaaatctggactcactcctacaaggtcagcaactacagccgagggagtggccgctgcatccagatgtggttcgacccagcccagggcaaccccaatgaggaggtggcgaggttctatgctgcagccatgagtggggctgggccctgggcagcctggcctttcctgcttagcctggccctaatgctgctgtggctgctcagctag（SEQ ID NO：4）

Claims (40)

1.一种特异性结合叶酸受体α（FRA）的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5中的重链氨基酸序列，连同或不连同C末端赖氨酸，并且还包含选自下述的轻链氨基酸序列：与SEQ ID NO：2中的氨基酸序列99%相同的氨基酸序列；SEQ ID NO：6的氨基酸序列；或SEQ ID NO：7的氨基酸序列，并且其中与在参考培养条件下制备时的单克隆抗体的ADCC相比较，所述单克隆抗体具有改变的抗体依赖性细胞毒性（ADCC）。
2.权利要求1的单克隆抗体，其中所述ADCC是增加的。
3.权利要求1的单克隆抗体，其中所述ADCC是减少的。
4.权利要求2的单克隆抗体，其中与在参考培养条件下制备的单克隆抗体的内在化速率相比较，其具有增加的内在化速率。
5.一种特异性结合叶酸受体α（FRA）的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5中的重链氨基酸序列，连同或不连同C末端赖氨酸，并且还包含选自下述的轻链氨基酸序列：与SEQ ID NO：2中的氨基酸序列99%相同的氨基酸序列；SEQ ID NO：6的氨基酸序列；或SEQ ID NO：7的氨基酸序列，并且其中与在参考培养条件下制备时的单克隆抗体的内在化速率相比较，所述单克隆抗体具有改变的内在化速率。
6.权利要求5的单克隆抗体，其中所述内在化速率是增加的。
7.权利要求5的单克隆抗体，其中所述内在化速率是减少的。
8.一种特异性结合叶酸受体α（FRA）的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5中的重链氨基酸序列，连同或不连同C末端赖氨酸，并且还包含选自下述的轻链氨基酸序列：与SEQ ID NO：2中的氨基酸序列99%相同的氨基酸序列；SEQ ID NO：6的氨基酸序列；或SEQ ID NO：7的氨基酸序列，并且其中与在参考培养条件下制备时的单克隆抗体的N联中性聚糖谱相比较，所述单克隆抗体具有改变的N联中性聚糖谱。
9.权利要求8的单克隆抗体，其中所述改变的N联中性聚糖谱包含下述中的一种或多种：
a）增加的或减少的M3N2；
b）增加的或减少的M3N2F；
c）增加的NA2；
d）增加的或减少的NA2F；
e）增加的或减少的MAN5；
f）增加的NGA2；
g）增加的或减少的NGA2F；或
h）增加的或减少的NA2G1F。
10.一种特异性结合叶酸受体α（FRA）的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5中的重链氨基酸序列，连同或不连同C末端赖氨酸，并且还包含选自下述的轻链氨基酸序列：与SEQ ID NO：2中的氨基酸序列99%相同的氨基酸序列；SEQ ID NO：6的氨基酸序列；或SEQ ID NO：7的氨基酸序列，并且其中与在参考培养条件下制备时的单克隆抗体相比较，所述单克隆抗体具有增加的ADCC，且具有包含增加的NGA2和增加的总非岩藻糖基化糖型的N联中性聚糖谱。
11.权利要求10的单克隆抗体，其中所述抗体还具有增加的内在化速率。
12.一种特异性结合叶酸受体α（FRA）的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5中的重链氨基酸序列，连同或不连同C末端赖氨酸，并且还包含选自下述的轻链氨基酸序列：与SEQ ID NO：2中的氨基酸序列99%相同的氨基酸序列；SEQ ID NO：6的氨基酸序列；或SEQ ID NO：7的氨基酸序列，并且其中与在参考培养条件下制备时的单克隆抗体的内在化效率相比较，所述单克隆抗体具有减少的内在化效率。
13.权利要求12的单克隆抗体，其中所述内在化效率是28ng/ml或更低。
14.权利要求13的单克隆抗体，其中所述内在化效率是990ng/ml或更低。
15.权利要求13的单克隆抗体，其中所述内在化效率是1632ng/ml或更低。
16.一种特异性结合叶酸受体α（FRA）的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5中的重链氨基酸序列，连同或不连同C末端赖氨酸，并且还包含选自下述的轻链氨基酸序列：与SEQ ID NO：2中的氨基酸序列99%相同的氨基酸序列；SEQ ID NO：6的氨基酸序列；或SEQ ID NO：7的氨基酸序列，并且其中与在参考培养条件下制备时的单克隆抗体的结合亲和力相比较，所述单克隆抗体具有改变的结合亲和力。
17.权利要求16的单克隆抗体，其中所述结合亲和力是增加的。
18.权利要求16的单克隆抗体，其中所述结合亲和力是减少的。
19.权利要求17的单克隆抗体，其中所述结合亲和力增加10%或更多。
20.权利要求18的单克隆抗体，其中所述结合亲和力减少10%或更多。
21.一种组合物，其包含根据权利要求1-20中任一项的抗体。
22.权利要求21的组合物，其进一步包含另外的活性剂。
23.一种包含真核宿主细胞的细胞培养物，所述宿主细胞包含编码SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5中的氨基酸和编码选自下述的氨基酸序列的核酸：与SEQ ID NO：2中的氨基酸序列99%相同的氨基酸序列；SEQ ID NO：6的氨基酸序列；或SEQ ID NO：7的氨基酸序列，其中细胞培养条件包含选自下述的参数：半乳糖、减少的溶解氧张力、降低的温度、丁酸钠、氯化铜、高同渗容摩和高CO2。
24.权利要求23的细胞培养物，其还包含根据权利要求1-20中任一项的抗体。
25.权利要求23的细胞培养物，其中所述真核宿主细胞是CHO细胞。
26.一种宿主细胞，其从权利要求24的细胞培养物中分离。
27.一种单克隆抗体，其特异性结合从权利要求24的细胞培养物中分离的叶酸受体α（FRA）。
28.一种用于产生特异性结合FRA的单克隆抗体的方法，其中所述单克隆抗体包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5中的重链氨基酸序列，连同或不连同C末端赖氨酸，并且还包含选自下述的轻链氨基酸序列：与SEQ ID NO：2中的氨基酸序列99%相同的氨基酸序列；SEQ ID NO：6的氨基酸序列；或SEQ ID NO：7的氨基酸序列，并且其中与在参考培养条件下制备时的单克隆抗体的ADCC相比较，所述单克隆抗体具有改变的ADCC，所述方法包括步骤在包含选自下述的参数的细胞培养条件中培养包含编码重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列的核酸的CHO细胞：半乳糖、减少的溶解氧张力、降低的温度、丁酸钠、氯化铜、高同渗容摩和高CO2。
29.权利要求28的方法，其中所述ADCC是增加的，并且所述培养条件选自减少的溶解氧张力和降低的温度。
30.权利要求29的方法，其中所述抗体还具有增加的内在化速率。
31.一种用于产生特异性结合FRA的单克隆抗体的方法，其中所述单克隆抗体包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5中的重链氨基酸序列，连同或不连同C末端赖氨酸，并且还包含选自下述的轻链氨基酸序列：与SEQ ID NO：2中的氨基酸序列99%相同的氨基酸序列；SEQ ID NO：6的氨基酸序列；或SEQ ID NO：7的氨基酸序列，并且其中与在参考培养条件下制备时的单克隆抗体的内在化速率相比较，所述单克隆抗体具有改变的内在化速率，所述方法包括步骤在包含选自下述的参数的细胞培养条件中培养包含编码重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列的核酸的CHO细胞：半乳糖、减少的溶解氧张力、降低的温度、丁酸钠、氯化铜、高同渗容摩、高CO2、在小于13或超过15天收获。
32.权利要求31的方法，其中所述内在化速率是增加的，并且所述培养条件选自减少的溶解氧张力或在小于13或超过15天收获。
33.一种通过根据权利要求28-32中任一项的方法制备的特异性结合叶酸受体α（FRA）的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包含SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：5中的重链氨基酸序列，连同或不连同C末端赖氨酸，并且还包含选自下述的轻链氨基酸序列：与SEQ ID NO：2中的氨基酸序列99%相同的氨基酸序列；SEQ ID NO：6的氨基酸序列；或SEQ ID NO：7的氨基酸序列。
34.一种减少与有此需要的受试者中增加的FRA表达相关的发育不良细胞的生长的方法，其包括步骤给所述受试者施用根据权利要求1-20、27或33中任一项的单克隆抗体。
35.权利要求34的方法，其中所述发育不良细胞是卵巢、乳腺、肾、结肠直肠、肺、子宫内膜、脑、输卵管、子宫癌细胞或白血病细胞。
36.权利要求34的方法，其中所述受试者是人。
37.一种用于治疗有此需要的受试者中的癌症的方法，其包括步骤给所述受试者施用根据权利要求1-20、27或33中任一项的单克隆抗体。
38.权利要求37的方法，其中所述癌症选自卵巢、乳腺、肾、结肠直肠、肺、子宫内膜或脑癌。
39.一种用于检测表达FRA的细胞的方法，其包括步骤使所述细胞与根据权利要求1-20、27或33中任一项的抗体接触且检测结合。
权利要求39的方法，其中所述细胞是发育不良细胞。
40.一种用于检测生物样品中的FRA的方法，其包括步骤使所述生物样品与根据权利要求1-20、27或33中任一项的抗体接触且检测结合。
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