CN103343115A - 一种磁性固定化细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

一种磁性固定化细胞及其制备方法和应用 Download PDF

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魏东芝
倪克奉
王华磊
赵莉
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Abstract

本发明提供一种磁性固定化细胞及其制备方法和应用，所述磁性固定化细胞的制备方法包括：1）提供邻苯二酚壳聚糖溶液；2）提供一种细胞的菌悬液，向所述菌悬液中加入磁性纳米四氧化三铁，搅拌均匀；3）向步骤2）中制备得到的溶液中加入所述邻苯二酚壳聚糖溶液，调节pH至中性，搅拌均匀，磁性分离获得磁性固定化细胞。根据本发明所提供的磁性固定化产腈水解酶重组大肠杆菌在水相中可连续15批次催化扁桃腈转化为R-(-)-扁桃酸，产率达到100%，ee值为97%，在乙酸乙酯/水两相体系中也能高效催化扁桃腈转化为R-(-)-扁桃酸，并且通过外加磁场即可对细胞有效分离，因此该磁性固定化方法具有广泛的应用前景和实用价值。

Description

一种磁性固定化细胞及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及全细胞固定化领域，更具体地，涉及一种磁性固定化细胞及其制备方法和应用。
背景技术
所谓固定化细胞技术，就是将具有一定生理功能的生物细胞，例如微生物细胞、植物细胞或动物细胞等，用一定的方法将其固定，作为固体生物催化剂而加以利用的一门技术。
相比较于游离的细胞而言，固定化的细胞具有显著的优势。例如固定化可以提高菌体的稳定性，固定化细胞易于分离进而简化产物的分离纯化，此外不同形态的固定化细胞可以应用到不同类型的反应器中。纵观近几年来固定化细胞技术的发展，最普遍的固定化细胞方法是包埋法和吸附法。包埋法是通过一些大分子聚合物将菌体牢牢地固定在载体内，虽然该方法固定化效率较高，但由于菌体被完全包裹，影响底物和转化产物的传递，造成固定化菌的催化效率较低。传统的壳聚糖包埋固定化细胞的方法通常采用具有毒性的戊二醛作为交联剂，对细胞的活性造成影响。吸附法则是利用固定化载体和菌体表面之间的静电、表面张力等作用将菌体固定载体的表面，该方法虽然对菌体的活性影响最小，但固定化效率不高，且菌体与载体之间的弱作用力导致在进行反应时由于搅拌或溶剂的作用等造成菌体脱落，影响固定化菌的重复利用率。
随着固定化细胞技术的发展，越来越多的研究者将目光集中在了大肠杆菌的固定化研究中。大肠杆菌表达***作为目前最常用的外源蛋白表达***之一，具有遗传背景清楚、表达水平高、操作容易和成本低等优点，目前已经广泛地应用在医药中间体合成，能源开发及大宗化学品的生产等领域。
氧化葡萄糖酸杆菌的种名来源于拉丁文oxydans，意思是产生非常酸的物质，该种属于葡萄糖酸杆菌属。氧化葡萄糖酸杆菌也是工业上应用最多的微生物之一，在较低的pH情况下，氧化葡萄糖酸杆菌能把广泛的碳水化合物和醇不完全氧化生成相应的醛、酮或酸而出名。最主要的是它的区域和立体选择性氧化特性，结合化学技术，能应用于复杂的化学合成工艺，这使得氧化葡萄糖酸杆菌广泛应用于工业生产。例如，氧化葡萄糖酸杆菌可用于维生素C的生产、葡萄糖酸和葡萄糖酮酸的生产以及二羟基丙酮的生产。
然而，现有的固定化细胞技术均各有利弊，因此开发出一种新的细胞固定化技术成为本领域技术人员当前研究的热点。
邻苯二酚基团的粘附能力是最近几年研究者通过对海洋贻贝类生物黏附蛋白结构组成的剖析研究而发现，它能在水溶液的环境下与有机体和无机物表面形成强烈的粘连。利用该特性，邻苯二酚相关的衍生物可以用于生物大分子例如酶、DNA、抗体的固定化。但是，直到目前为止，还没有出现将邻苯二酚衍生物应用于细胞固定化中的相关研究。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明旨在提供一种磁性固定化细胞及其制备方法和应用，该制备方法既能改善底物与转化产物之间的传递，提高催化效率，同时又能提高固定化效率以及重复利用率，并且避免有毒交联剂的使用。
本发明提供一种磁性固定化细胞的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：（1）提供邻苯二酚壳聚糖溶液；（2）提供细胞的菌悬液，向所述菌悬液中加入磁性纳米四氧化三铁，搅拌均匀；（3）向步骤（2）中制备得到的溶液中加入所述邻苯二酚壳聚糖溶液，调节pH至中性，搅拌均匀，采用磁性分离获得磁性固定化细胞。
所述邻苯二酚壳聚糖的结构式为：
Figure BDA00003511948000021
所述邻苯二酚壳聚糖溶液是通过将邻苯二酚壳聚糖溶解在2wt%乙酸溶液中制得。
步骤（2）中所述菌悬液的浓度为1-10mg/mL，加入所述磁性纳米四氧化三铁至占所述菌悬液的浓度为0.04-1mg/mL，步骤（3）中加入所述邻苯二酚壳聚糖溶液至邻苯二酚壳聚糖的最终浓度为0.01-0.2mg/mL。
所述磁性纳米四氧化三铁采用以下方法制备：将FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O在氮气保护下溶解于超纯水中，滴加NaOH溶液调节pH至9.0，搅拌并磁性分离获得所述磁性纳米四氧化三铁。
所述细胞是产腈水解酶重组大肠杆菌或氧化葡萄糖酸杆菌。
本发明还提供一种根据上述制备方法制得的磁性固定化细胞，所述磁性固定化细胞是磁性固定化产腈水解酶重组大肠杆菌或磁性固定化氧化葡萄糖酸杆菌。
本发明还提供一种如上所述的磁性固定化细胞的应用，所述磁性固定化细胞是磁性固定化产腈水解酶重组大肠杆菌，被用来催化扁桃腈转化为R-(-)-扁桃酸。
所述磁性固定化产腈水解酶重组大肠杆菌在水相中能连续15批次催化扁桃腈转化为R-(-)-扁桃酸，产率达到100%。
所述磁性固定化产腈水解酶重组大肠杆菌在乙酸乙酯/水两相体系中高效催化扁桃腈转化为R-(-)-扁桃酸。
本发明提出了一种在温和的条件下制备磁性固定化细胞的方法。主要的原理是通过邻苯二酚壳聚糖的粘附能力将细胞和磁性颗粒交联在一起实现固定化，壳聚糖支架的加入改善了载体的生物相容性同时提高了固定化细胞的机械强度。本发明采用的邻苯二酚壳聚糖具有良好的生物相容性，交联的方法能改善传质，避免了现有技术中通常使用的具有毒性的戊二醛。
本发明提供的磁性固定化产腈水解酶重组大肠杆菌的固定化率达到95.8%，活力回收率达到83.5%，能够在水相中连续15批次催化扁桃腈转化为R-(-)-扁桃酸，且产率都能达到100%，ee值为97%，相比游离菌催化效率大大提高，并且在乙酸乙酯/水两相体系中也能高效催化高浓度的扁桃腈转化为R-(-)-扁桃酸。
本发明提供的磁性固定化方法既克服了现有技术中包埋法固定化的催化效率偏低，同时又克服了吸附法固定化的固定化效率不高，重复利用率低的缺陷。此外，该磁性固定化细胞通过外加的磁场即可得到简便有效的分离，简化操作过程，因此该固定化方法具有广泛的应用前景和实用价值。
附图说明
图1是根据本发明的制备方法制备出的磁性固定化产腈水解酶重组大肠杆菌在水相中连续16批次催化扁桃腈生成R-(-)-扁桃酸的结果示意图；
图2是根据本发明的制备方法制备出的磁性固定化产腈水解酶重组大肠杆菌在乙酸乙酯/水两相体系中催化扁桃腈生成R-(-)-扁桃酸的反应进程曲线。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应当理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
实施例1邻苯二酚壳聚糖的合成及表征
称取0.1g壳聚糖溶解在20ml1%（质量分数）的乙酸溶液中，将0.3g3,4-二羟基苯甲醛溶解在5ml二甲基甲酰胺中后加入到壳聚糖溶液中，室温搅拌反应6小时后，加入80ml乙醇沉淀得到中间产物。将上述中间产物悬浮在20ml去离子水中，加入0.3g氰基硼氢化钠，室温搅拌反应6小时，加入80ml乙醇沉淀得到邻苯二酚壳聚糖，产物用去离子水和乙醇清洗后真空干燥得到淡黄色粉末。
将产物溶解在含有1%氘代氯仿的重水中用于1H-NMR的分析，通过测定产物中苯环氢的含量计算出邻苯二酚基团的取代度为52.2%。
实施例2磁性纳米四氧化三铁的制备
称取2.7g FeCl3·6H2O和0.99g FeCl2·4H2O在氮气保护下溶解在250ml超纯水中，通过加入5M NaOH调节pH至9左右，40℃搅拌2小时，通过磁铁分离得到纳米四氧化三铁颗粒。然后将其溶解于超纯水中配置成1mg/ml的磁性纳米四氧化三铁溶液。
实施例3产腈水解酶重组大肠杆菌的固定化
本实施例所选用的产腈水解酶重组大肠杆菌为本实验室构建（关于该菌株，可参见Wang,H.,Sun,H.,Wei,D.,(2013)Discovery and characterization of ahighly efficient enantioselective mandelonitrile hydrolase from Burkholderiacenocepacia J2315by phylogeny-based enzymatic substrate specificity prediction.BMC biotechnology13,14.）。培养后，取0.1g（湿重）大肠杆菌菌泥将其悬浮于20ml生理盐水中，加入5ml实施例2中配置的磁性纳米四氧化三铁溶液（1mg/ml），磁力搅拌均匀。配制10ml2%（质量分数）的乙酸溶液，并向其中缓慢加入实施例2中制备的10mg邻苯二酚壳聚糖，搅拌溶解制得邻苯二酚壳聚糖溶液（1mg/ml）。取1ml邻苯二酚壳聚糖溶液缓慢加入到上述已混合磁性纳米四氧化三铁溶液的菌悬液中，菌体和磁性纳米四氧化三铁颗粒在邻苯二酚壳聚糖的作用下逐渐交联沉淀。用1M NaOH溶液调节上述溶液的pH至7左右，室温搅拌30分钟后，用磁铁进行磁性分离，通过在烧杯附近放置一块强力磁铁，静置一段时间后，具有磁性的固定化细胞被磁铁吸引，小心倾倒去除上清，采用去离子水对下层固定化细胞清洗数次后得到磁性固定化重组大肠杆菌。通过如下的公式计算得出，该磁性固定化重组大肠杆菌的固定化率为95.8%。其中，OD600（固定化前）是指固定化之前对溶液测定的600nm处的OD值，OD600（固定化后）是指在固定化后采用磁铁分离之后对溶液测定的600nm处的OD值。
Figure BDA00003511948000051
固定化重组大肠杆菌的活性通过测定其腈水解酶的酶活来检测，具体的反应体系如下：1ml磷酸缓冲液（pH8.0，100mM）含有20mM扁桃腈以及适量的重组大肠杆菌或相应的固定化菌。在30℃反应10分钟后加入0.1ml1M HCl终止反应。产物R-(-)-扁桃酸的浓度通过HPLC检测。结果表明该固定化菌的活力回收率为83.5%。
实施例4氧化葡萄糖酸杆菌的固定化
取0.1g（湿重）氧化葡萄糖酸杆菌（关于该菌株，可参见Guodong Wei，Xuepeng Yang，Tula Gan，Wenyu Zhou，Jinping Lin，Dongzhi Wei.High celldensity fermentation of Gluconobacter oxydans DSM2003for glycolic acidproduction，J Ind Microbiol Biotechnol(2009)36:1029–1034）菌泥悬浮在20ml生理盐水中，加入5ml实施例2中配置的磁性纳米四氧化三铁溶液（1mg/ml），磁力搅拌均匀。按照实施例3所述方法配置得到邻苯二酚壳聚糖溶液。取1ml邻苯二酚壳聚糖溶液缓慢加入到上述已混合磁性纳米四氧化三铁溶液的菌悬液中，菌体和磁性纳米四氧化三铁颗粒在邻苯二酚壳聚糖的作用下逐渐交联沉淀。用1M NaOH溶液调节上述溶液的pH至7左右，室温搅拌30分钟后，用磁铁进行磁性分离，通过在烧杯附近放置一块强力磁铁，静置一段时间后，具有磁性的固定化细胞被磁铁吸引，小心倾倒去除上清，采用去离子水对下层固定化细胞清洗数次后得到磁性固定化氧化葡萄糖酸杆菌。通过实施例3中的公式计算氧化葡萄糖酸杆菌的固定化率为63.7%。
通过利用氧化葡萄糖酸杆菌转化甘油生成2-羟基丙酮检测固定化细胞的活性。取0.5g甘油溶于10ml pH=6.5的磷酸盐缓冲液中，加入上述固定化细胞或相应游离的氧化葡萄酸杆菌反应两小时。产物2-羟基丙酮的产量通过HPLC检测。结果表明该固定化菌的活力回收率为76%。
应当理解，上述实施例仅仅是为了示出根据本发明的优选实施例的一种磁性固定化细胞的制备方法，该制备方法并不仅限于上述实施例。
实施例5磁性固定化产腈水解酶重组大肠杆菌的重复使用性
利用实施例3中制备的固定化产腈水解酶重组大肠杆菌连续多批次催化扁桃腈生成R-(-)-扁桃酸，反应的体系为100ml，其中底物扁桃腈的浓度为100mM，反应的温度为30℃，通过自动补加1M NaOH溶液维持反应过程pH在8.0左右。反应体系中所添加生物催化剂的量为10g游离菌或相应的固定化菌。每批次反应时间为1小时，反应结束后游离菌通过离心分离，固定化菌通过磁铁分离并用去离子水清洗三次后用于后一批的反应。
反应总共进行了16批，结果如图1所示，相对于游离菌而言，固定化菌具有更好的稳定性，其催化前15批次反应R-(-)-扁桃酸的产率都能达到100%，ee值为97%。而游离菌则只能催化前10批反应达到100%收率。
实施例6利用磁性固定化产腈水解酶重组大肠杆菌在乙酸乙酯/水两相反应体系中催化高浓度扁桃腈转化为R-(-)-扁桃酸
两相反应所采用的有机相溶剂为乙酸乙酯，其在两相中所占的体积比例为30%。反应的总体系为100ml，其中底物扁桃腈浓度为1M，将10g游离菌固定化后用于催化反应。反应过程中通过补加1M NaOH维持体系的pH在8.0左右，反应温度为30℃。在反应过程中通过不断取样，利用HPLC检测来追踪反应的进程。
结果如图2所示，在反应4小时之后，产物R-(-)-扁桃酸的产率达到了99.2%，ee值为95%。
以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

Claims (10)

1.一种磁性固定化细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
（1）提供邻苯二酚壳聚糖溶液；
（2）提供一种细胞的菌悬液，向所述菌悬液中加入磁性纳米四氧化三铁，搅拌均匀；
（3）向步骤（2）中制备得到的溶液中加入所述邻苯二酚壳聚糖溶液，调节pH至中性，搅拌均匀，磁性分离获得磁性固定化细胞。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述邻苯二酚壳聚糖的结构式为：
Figure FDA00003511947900011
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述邻苯二酚壳聚糖溶液是通过将邻苯二酚壳聚糖溶解在2wt%乙酸溶液中制得。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述细胞的菌悬液的浓度为1-10mg/mL，加入所述磁性纳米四氧化三铁至占所述菌悬液的浓度为0.04-1mg/mL，步骤（3）中加入所述邻苯二酚壳聚糖溶液至邻苯二酚壳聚糖的终浓度为0.01-0.2mg/mL。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述磁性纳米四氧化三铁采用以下方法制备：
将FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O在氮气保护下溶解于超纯水中，滴加NaOH溶液调节pH至9.0，搅拌并磁性分离获得所述磁性纳米四氧化三铁。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述细胞是产腈水解酶重组大肠杆菌或氧化葡萄糖酸杆菌。
7.一种根据权利要求6所述的制备方法制得的磁性固定化细胞，所述磁性固定化细胞是磁性固定化产腈水解酶重组大肠杆菌或磁性固定化氧化葡萄糖酸杆菌。
8.一种根据权利要求7所述的磁性固定化细胞的应用，所述磁性固定化细胞是磁性固定化产腈水解酶重组大肠杆菌，被用来催化扁桃腈转化为R-(-)-扁桃酸。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述磁性固定化产腈水解酶重组大肠杆菌在水相中能连续15批次催化扁桃腈转化为R-(-)-扁桃酸，产率达到100%。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述磁性固定化产腈水解酶重组大肠杆菌在乙酸乙酯/水两相体系中高效催化扁桃腈转化为R-(-)-扁桃酸。
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