CN103342698B - 一种非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针的应用 - Google Patents

一种非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针的应用 Download PDF

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Abstract

一种非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针的应用，它涉及一种双荧光团比率荧光分子探针的应用。本发明是要解决现有双荧光团比率荧光分子探针因激发时双荧光团之间能量转移而造成能量损失从而导致此类探针荧光较弱，对于金属离子的选择性和灵敏性不高的技术问题。非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针用于识别Cu2+，Cu2+在474nm处对非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针的荧光峰猝灭，而在波长351nm处的荧光峰强度基本保持不变。本发明可应用于生物组织和细胞微环境中金属离子的荧光成像检测。

Description

一种非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针的应用
技术领域
本发明涉及一种双荧光团比率荧光分子探针的应用。
背景技术
近年来，设计、合成比率型荧光分子探针已引起了人们广泛的兴趣。与传统的检测荧光强度变化的探针分子相比，比率荧光分子探针可以通过测量结合目标分子时自身发射的两个不同波长处荧光峰强度的比值来检测目标分子。由于双荧光峰强度相对变化的自参比作用可以避免许多单荧光峰强度变化中非目标因素诸如探针浓度、激发光强度、检测环境等的影响，因此这类探针分子可以实现定量检测。
人们利用各种方式报道了许多探针分子用于目标分子的比率检测。其中，单荧光团比率荧光分子探针的设计大多是基于分子内电荷转移原理，络合目标分子后探针分子内的推-拉电子体系受到干扰，导致波长发生移动；但在实际应用中，这类比率探针分子的精确度可能会受到干扰。而利用荧光共振能量转移原理设计的双荧光团比率荧光分子探针尽管基本上可以解决这一问题，但由于此类探针分子在激发态时双荧光团之间发生相互作用，不可避免地造成了能量损失，因此与光直接激发化合物相比，该型探针分子的荧光较弱，对于金属离子的选择性和灵敏性不高的问题。
发明内容
本发明是要解决现有双荧光团比率荧光分子探针因激发时双荧光团之间能量转移而造成能量损失从而导致此类探针荧光较弱，对于金属离子的选择性和灵敏性不高的技术问题，从而提供一种非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针的应用。
本发明所述的一种非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针，其结构式为
所述的FL1为或其中所述的R1为-H、甲基、2’-吡啶基或-X，其中X为卤元素；所述的FL2为或其中所述的R2为C1～C4直链烷基、2-羟乙基或2-(2-羟乙氧基)乙基。
上述非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针的制备方法有两种：
第一种制备方法按以下步骤进行：
一、将有机化合物A、无水哌嗪、碘化钾和N,N-二异丙基乙基胺依次加入到乙腈中混合均匀，在氮气保护下回流5h～7h，将反应液旋干，再经过柱色谱分离得到中间体；步骤一中所述的有机化合物A与无水哌嗪的摩尔量比为1:2；步骤一中所述的无水哌嗪与N,N-二异丙基乙基胺的摩尔量比为1:2；步骤一中所述的无水哌嗪的摩尔量与碘化钾的质量比为1mol:(7g～13g)；步骤一中所述的无水哌嗪的摩尔量与乙腈的体积比为1mol:(15L～20L)；
二、将步骤一得到的中间体和有机化合物B依次加入至二氯甲烷中，在室温和氮气保护下搅拌3h～5h，将反应液旋干，再经过柱色谱分离得到非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针；步骤二中所述的步骤一得到的中间体与有机化合物B的摩尔比为3:5；步骤二中所述的步骤一得到的中间体的摩尔量与二氯甲烷的体积比为3mol:(150L～250L)；
步骤一中所述的有机化合物A为9-氯甲基蒽或其中所述的R1为-H、甲基、2’-吡啶基或-X，其中X为卤元素；步骤二中所述的有机化合物B为香豆素-3-甲酰氯、4-氯-7-硝基苯并[c][1,2,5]氧杂二唑或其中所述的R2为C1～C4直链烷基、2-羟乙基或2-(2-羟乙氧基)乙基。
第二种制备方法按以下步骤进行：
一、将有机化合物A和无水哌嗪依次加入到二氯甲烷中混合均匀，在室温和氮气的保护下搅拌3h～5h，将反应液旋干，再经过柱色谱分离得到中间体；步骤一中所述的有机化合物A与无水哌嗪的摩尔量比为1:2；步骤一中所述的有机化合物A的摩尔量与二氯甲烷的体积比为1mol:(15L～25L)；
二、将有机化合物B、步骤一得到的中间体、碘化钾和N,N-二异丙基乙基胺依次加入到乙腈中混合均匀，在氮气保护下回流5h～7h，将反应液旋干，再经过柱色谱分离得到非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针；步骤二中所述的步骤一得到的中间体与有机化合物B的摩尔比为1:1.5；步骤二中所述的有机化合物B与N,N-二异丙基乙基胺的摩尔比为1:2；步骤二所述的步骤一得到的中间体的摩尔量与碘化钾的质量比为1mol:25g；步骤二中所述的步骤一得到的中间体的摩尔量与乙腈的体积比为1mol:50L；
步骤一中所述的有机化合物A为香豆素-3-甲酰氯、4-氯-7-硝基苯并[c][1,2,5]氧杂二唑或其中所述的R2为C1～C4直链烷基、2-羟乙基或2-(2-羟乙氧基)乙基；步骤二中所述的有机化合物B为9-氯甲基蒽或其中所述的R1为-H、甲基、2’-吡啶基或-X，其中X为卤元素。
本发明还提供一种非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针的结构，其结构式为
所述的FL1为其中所述的R2为C1～C4直链烷基、2-羟乙基或2-(2-羟乙氧基)乙基；所述的FL2为其中所述的R2为C1～C4直链烷基、2-羟乙基或2-(2-羟乙氧基)乙基；并且，FL1和FL2为不同的官能团。
上述非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针的制备方法按以下步骤进行：
一、将有机化合物A和无水哌嗪依次加入到二氯甲烷中混合均匀，在室温和氮气的保护下搅拌3h～5h，将反应液旋干，再经过柱色谱分离得到中间体；步骤一中所述的有机化合物A与无水哌嗪的摩尔量比为1:2；步骤一中所述的有机化合物A的摩尔量与二氯甲烷的体积比为1mol:(15L～25L)；
二、将步骤一得到的中间体和有机化合物B依次加入至二氯甲烷中，在室温和氮气的保护下搅拌3h～5h，将反应液旋干，再经过柱色谱分离得到非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针；步骤二中所述的步骤一得到的中间体与有机化合物B的摩尔比为3:5；步骤二中所述的步骤一得到的中间体的摩尔量与二氯甲烷的体积比为1mol:50L；
步骤一中所述的有机化合物A为香豆素-3-甲酰氯、4-氯-7-硝基苯并[c][1,2,5]氧杂二唑或其中所述的R2为C1～C4直链烷基、2-羟乙基或2-(2-羟乙氧基)乙基；步骤二中所述的有机化合物B为香豆素-3-甲酰氯、4-氯-7-硝基苯并[c][1,2,5]氧杂二唑或其中所述的R2为C1～C4直链烷基、2-羟乙基或2-(2-羟乙氧基)乙基；并且，步骤一中所述的有机化合物A和步骤二中所述的有机化合物B为不同的有机化合物。
本发明还提供一种非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针的结构，其结构式为
所述的FL1为或其中所述的R1为-H、甲基、2’-吡啶基或-X，其中X为卤元素；所述的FL2为其中所述的R1为-H、甲基、2’-吡啶基或-X，其中X为卤元素；并且，FL1和FL2为不同的官能团。
上述非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针的制备方法按以下步骤进行：
一、将有机化合物A、无水哌嗪、碘化钾和N,N-二异丙基乙基胺依次加入到乙腈中混合均匀，在氮气保护下回流5h～7h，将反应液旋干，再经过柱色谱分离得到中间体；步骤一中所述的有机化合物A与无水哌嗪的摩尔量比为1:2；步骤一中所述的无水哌嗪与N,N-二异丙基乙基胺的摩尔量比为1:2；步骤一中所述的无水哌嗪的摩尔量与碘化钾的质量比为1mol:(7g～13g)；步骤一中所述的无水哌嗪的摩尔量与乙腈的体积比为1mol:(15L～20L)；
二、将有机化合物B、步骤一得到的中间体、碘化钾和N,N-二异丙基乙基胺依次加入到乙腈中混合均匀，在氮气保护下回流5h～7h，将反应液旋干，再经过柱色谱分离得到非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针；步骤二中所述的中间体与有机化合物B的摩尔比为1:1.5；步骤二中所述的有机化合物B与N,N-二异丙基乙基胺的摩尔比为1:2；步骤二所述的步骤一得到的中间体的摩尔量与碘化钾的质量比为1mol:10g；步骤二中所述的步骤一得到的中间体的摩尔量与乙腈的体积比为1mol:20L；
步骤一中所述的有机化合物A为9-氯甲基蒽或其中所述的R1为-H、甲基、2’-吡啶基或-X，其中X为卤元素；步骤二中所述的有机化合物B为9-氯甲基蒽或其中所述的R1为-H、甲基、2’-吡啶基或-X，其中X为卤元素；并且，步骤一中所述的有机化合物A和步骤二中所述的有机化合物B为不同的有机化合物。
本发明制备的非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针具有如下优点：
(1)本发明的荧光分子探针可直接用于水、甲醇、DMSO、DMF溶剂或其混合溶剂中金属离子的荧光比率检测，且具有较高的选择性和灵敏度；
(2)本发明的荧光分子探针合成简单，原料易得，而其具有很高的衍生性，可以非常方便地更换各种功能性基团来调节化合物对不同金属离子的选择性，具有广泛的潜在应用价值；
(3)本发明合成的荧光分子探针也可用于生物组织、细胞微环境中金属离子的荧光成像检测。
附图说明
图1为试验一制备的荧光分子探针在加入金属离子前后的荧光光谱变化图，曲线1为Cu2+；
图2为试验一制备的荧光分子探针对于不同金属离子的在波长为351nm和474nm处的荧光强度比值检测图，1为不加金属离子、2为Na+、3为K+、4为Mg2+、5为Ca2+、6为Cr3+、7为Fe3+、8为Co2+、9为Ni2+、10为Cu2+、11为Zn2+、12为Ag+、13为Cd2+、14为Hg2+和15为Pb2+；
图3为本试验制备的荧光分子探针对不同浓度的Cu2+的荧光光谱变化图，其中，曲线1的Cu2+浓度为0、曲线2的Cu2+浓度为0.1×10-5mol/L、曲线3的Cu2+浓度为0.2×10-5mol/L、曲线4的Cu2+浓度为0.3×10-5mol/L、曲线5的Cu2+浓度为0.4×10-5mol/L、曲线6的Cu2+浓度为0.5×10-5mol/L、曲线7的Cu2+浓度为0.6×10-5mol/L、曲线8的Cu2+浓度为0.7×10-5mol/L、曲线9的Cu2+浓度为0.8×10-5mol/L、曲线10的Cu2+浓度为0.9×10-5mol/L、曲线11的Cu2+浓度为1.0×10-5mol/L、曲线12的Cu2+浓度为1.1×10-5mol/L、曲线13的Cu2+浓度为1.2×10-5mol/L、曲线14的Cu2+浓度为1.3×10-5mol/L、曲线15的Cu2+浓度为1.4×10-5mol/L。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式中一种非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针，其结构式如下：
所述的FL1为其中所述的R1为-H、甲基、2’-吡啶基或-X，其中X为卤元素；所述的FL2为 其中所述的R2为C1～C4直链烷基、2-羟乙基或2-(2-羟乙氧基)乙基。
本实施方式的一种非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针具有如下优点：
(1)本发明的荧光分子探针可直接用于水、甲醇、DMSO、DMF溶剂或其混合溶剂中金属离子的荧光比率检测，且具有较高的选择性和灵敏度；
(2)本发明的荧光分子探针合成简单，原料易得，而其具有很高的衍生性，可以非常方便地更换各种功能性基团来调节化合物对不同金属离子的选择性，具有广泛的潜在应用价值；
(3)本发明合成的荧光分子探针也可用于生物组织、细胞微环境中金属离子的荧光成像检测。
具体实施方式二：具体实施方式一所述的一种非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针的制备方法是按以下步骤进行的：
一、将有机化合物A、无水哌嗪、碘化钾和N,N-二异丙基乙基胺依次加入到乙腈中混合均匀，在氮气保护下回流5h～7h，将反应液旋干，再经过柱色谱分离得到中间体；步骤一中所述的有机化合物A与无水哌嗪的摩尔量比为1:2；步骤一中所述的无水哌嗪与N,N-二异丙基乙基胺的摩尔量比为1:2；步骤一中所述的无水哌嗪的摩尔量与碘化钾的质量比为1mol:(7g～13g)；步骤一中所述的无水哌嗪的摩尔量与乙腈的体积比为1mol:(15L～20L)；
二、将步骤一得到的中间体和有机化合物B依次加入至二氯甲烷中，在室温和氮气保护下搅拌3h～5h，将反应液旋干，再经过柱色谱分离得到非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针；步骤二中所述的步骤一得到的中间体与有机化合物B的摩尔比为3:5；步骤二中所述的步骤一得到的中间体的摩尔量与二氯甲烷的体积比为3mol:(150L～250L)；
步骤一中所述的有机化合物A为9-氯甲基蒽或其中所述的R1为-H、甲基、2’-吡啶基或-X，其中X为卤元素；步骤二中所述的有机化合物B为香豆素-3-甲酰氯、4-氯-7-硝基苯并[c][1,2,5]氧杂二唑或其中所述的R2为C1～C4直链烷基、2-羟乙基或2-(2-羟乙氧基)乙基。
具体实施方式三：具体实施方式一所述的一种非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针的制备方法是按以下步骤进行的：
一、将有机化合物A和无水哌嗪依次加入到二氯甲烷中混合均匀，在室温和氮气的保护下搅拌3h～5h，将反应液旋干，再经过柱色谱分离得到中间体；步骤一中所述的有机化合物A与无水哌嗪的摩尔量比为1:2；步骤一中所述的有机化合物A的摩尔量与二氯甲烷的体积比为1mol:(15L～25L)；
二、将有机化合物B、步骤一得到的中间体、碘化钾和N,N-二异丙基乙基胺依次加入到乙腈中混合均匀，在氮气保护下回流5h～7h，将反应液旋干，再经过柱色谱分离得到非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针；步骤二中所述的步骤一得到的中间体与有机化合物B的摩尔比为1:1.5；步骤二中所述的有机化合物B与N,N-二异丙基乙基胺的摩尔比为1:2；步骤二所述的步骤一得到的中间体的摩尔量与碘化钾的质量比为1mol:25g；步骤二中所述的步骤一得到的中间体的摩尔量与乙腈的体积比为1mol:50L；
步骤一中所述的有机化合物A为香豆素-3-甲酰氯、4-氯-7-硝基苯并[c][1,2,5]氧杂二唑或其中所述的R2为C1～C4直链烷基、2-羟乙基或2-(2-羟乙氧基)乙基；步骤二中所述的有机化合物B为9-氯甲基蒽或其中所述的R1为-H、甲基、2’-吡啶基或-X，其中X为卤元素。
具体实施方式四：本实施方式中一种非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针，其结构式如下：
所述的FL1为其中所述的R2为C1～C4直链烷基、2-羟乙基或2-(2-羟乙氧基)乙基；所述的FL2为其中所述的R2为C1～C4直链烷基、2-羟乙基或2-(2-羟乙氧基)乙基；并且，FL1和FL2为不同的官能团。
具体实施方式五：具体实施方式四所述的一种非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针的制备方法是按以下步骤进行的：
一、将有机化合物A和无水哌嗪依次加入到二氯甲烷中混合均匀，在室温和氮气的保护下搅拌3h～5h，将反应液旋干，再经过柱色谱分离得到中间体；步骤一中所述的有机化合物A与无水哌嗪的摩尔量比为1:2；步骤一中所述的有机化合物A的摩尔量与二氯甲烷的体积比为1mol:(15L～25L)；
二、将步骤一得到的中间体和有机化合物B依次加入至二氯甲烷中，在室温和氮气的保护下搅拌3h～5h，将反应液旋干，再经过柱色谱分离得到非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针；步骤二中所述的步骤一得到的中间体与有机化合物B的摩尔比为3:5；步骤二中所述的步骤一得到的中间体的摩尔量与二氯甲烷的体积比为1mol:50L；
步骤一中所述的有机化合物A为香豆素-3-甲酰氯、4-氯-7-硝基苯并[c][1,2,5]氧杂二唑或其中所述的R2为C1～C4直链烷基、2-羟乙基或2-(2-羟乙氧基)乙基；步骤二中所述的有机化合物B为香豆素-3-甲酰氯、4-氯-7-硝基苯并[c][1,2,5]氧杂二唑或其中所述的R2为C1～C4直链烷基、2-羟乙基或2-(2-羟乙氧基)乙基；并且，步骤一中所述的有机化合物A和步骤二中所述的有机化合物B为不同的有机化合物。
具体实施方式六：本实施方式中一种非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针，其结构式如下：
所述的FL1为其中所述的R1为-H、甲基、2’-吡啶基或-X，其中X为卤元素；所述的FL2为其中所述的R1为-H、甲基、2’-吡啶基或-X，其中X为卤元素；并且，FL1和FL2为不同的官能团。
具体实施方式七：具体实施方式六所述的一种非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针的制备方法是按以下步骤进行的：
一、将有机化合物A、无水哌嗪、碘化钾和N,N-二异丙基乙基胺依次加入到乙腈中混合均匀，在氮气保护下回流5h～7h，将反应液旋干，再经过柱色谱分离得到中间体；步骤一中所述的有机化合物A与无水哌嗪的摩尔量比为1:2；步骤一中所述的无水哌嗪与N,N-二异丙基乙基胺的摩尔量比为1:2；步骤一中所述的无水哌嗪的摩尔量与碘化钾的质量比为1mol:(7g～13g)；步骤一中所述的无水哌嗪的摩尔量与乙腈的体积比为1mol:(15L～20L)；
二、将有机化合物B、步骤一得到的中间体、碘化钾和N,N-二异丙基乙基胺依次加入到乙腈中混合均匀，在氮气保护下回流5h～7h，将反应液旋干，再经过柱色谱分离得到非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针；步骤二中所述的中间体与有机化合物B的摩尔比为1:1.5；步骤二中所述的有机化合物B与N,N-二异丙基乙基胺的摩尔比为1:2；步骤二所述的步骤一得到的中间体的摩尔量与碘化钾的质量比为1mol:10g；步骤二中所述的步骤一得到的中间体的摩尔量与乙腈的体积比为1mol:20L；
步骤一中所述的有机化合物A为9-氯甲基蒽或其中所述的R1为-H、甲基、2’-吡啶基或-X，其中X为卤元素；步骤二中所述的有机化合物B为9-氯甲基蒽或其中所述的R1为-H、甲基、2’-吡啶基或-X，其中X为卤元素；并且，步骤一中所述的有机化合物A和步骤二中所述的有机化合物B为不同的有机化合物。
通过以下试验验证本发明的有益效果：
试验一：一种非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针的制备方法，具体是按以下步骤完成：
一、将有机化合物A、无水哌嗪、碘化钾和N,N-二异丙基乙基胺依次加入到乙腈中混合均匀，在氮气保护下回流6h，将反应液旋干，再经过柱色谱分离得到中间体；步骤一中所述的有机化合物A与无水哌嗪的摩尔量比为1:2；步骤一中所述的无水哌嗪与N,N-二异丙基乙基胺的摩尔量比为1:2；步骤一中所述的无水哌嗪的摩尔量与碘化钾的质量比为1mol:10g；步骤一中所述的无水哌嗪的摩尔量与乙腈的体积比为1mol:20L；
二、将步骤一得到的中间体和有机化合物B依次加入至二氯甲烷中，在室温和氮气保护下搅拌3h，将反应液旋干，再经过柱色谱分离得到非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针；步骤二中所述的步骤一得到的中间体与有机化合物B的摩尔比为3:5；步骤二中所述的步骤一得到的中间体的摩尔量与二氯甲烷的体积比为3mol:200L；
步骤一中所述的有机化合物A为2-(2’-吡啶基)-8-(α-氯乙酰基)喹啉；步骤二中所述的有机化合物B为香豆素-3-甲酰氯。
本试验的反应式如下：
本试验所得的非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针的核磁分析数据如下：
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):11.40(CONH,s,1H),8.83(m,2H),8.78(d,J＝8.8Hz,1H),8.65(d,J＝8.4Hz,1H),8.57(d,J＝8.8Hz,1H),8.24(s,1H),8.11(t,J＝7.8Hz,1H),7.80(d,J＝9.2Hz,1H),7.74(d,J＝9.6Hz,1H),7.67(t,J＝7.0Hz,1H),7.64(m,2H),7.46(d,J＝8.4Hz,1H),7.42(t,J＝8.0Hz,1H),3.81(COCH2,s,2H),3.63(CON(CH2CH2)2N,s,2H),3.40(CON(CH2CH2)2N,s,2H),2.72(CON(CH2CH2)2N,s,2H),2.68(CON(CH2CH2)2N,s,2H)。
将本试验制备的非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针溶于含有三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、DMSO和水的混合溶液中得到荧光分子探针溶液；其中，非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针的浓度为1.0×10-5mol/L，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的浓度为0.01mol/L，DMSO和水的体积比为1:1。向荧光分子探针溶液中加入浓度均为5.0×10-5mol/L的Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cr3+、Fe3+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Ag+、Cd2+、Hg2+和Pb2+。
图1为本试验制备的荧光分子探针在加入金属离子前后的荧光光谱变化图，曲线1为Cu2+，其它曲线为未加金属离子、加入Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cr3+、Fe3+、Co2+、Ni2+、Zn2+、Ag+、Cd2+、Hg2+和Pb2+的曲线；从图中可以看出非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针在没加入金属离子之前在波长351nm和和474nm处发射双荧光峰；向荧光分子探针溶液中加入浓度均为5.0×10-5mol/L的Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cr3+、Fe3+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Ag+、Cd2+、Hg2+和Pb2+，结果Cu2+使探针分子在波长474nm处的荧光峰猝灭，而在波长351nm处的荧光峰强度基本保持不变；其它金属离子对溶液荧光光谱的影响不显著。由此可见本发明的荧光分子探针对Cu2+具有良好的选择性识别性能。
图2为本试验制备的荧光分子探针对于不同金属离子在波长为351nm和474nm处的荧光强度比值检测图，1为不加金属离子、2为Na+、3为K+、4为Mg2+、5为Ca2+、6为Cr3+、7为Fe3+、8为Co2+、9为Ni2+、10为Cu2+、11为Zn2+、12为Ag+、13为Cd2+、14为Hg2+和15为Pb2+；从其中可以看出本试验制备的荧光分子探针对于Cu2+具有很强的选择性和灵敏度。
图3为本试验制备的荧光分子探针对不同浓度的Cu2+的荧光光谱变化图，其中，曲线1的Cu2+浓度为0、曲线2的Cu2+浓度为0.1×10-5mol/L、曲线3的Cu2+浓度为0.2×10-5mol/L、曲线4的Cu2+浓度为0.3×10-5mol/L、曲线5的Cu2+浓度为0.4×10-5mol/L、曲线6的Cu2+浓度为0.5×10-5mol/L、曲线7的Cu2+浓度为0.6×10-5mol/L、曲线8的Cu2+浓度为0.7×10-5mol/L、曲线9的Cu2+浓度为0.8×10-5mol/L、曲线10的Cu2+浓度为0.9×10-5mol/L、曲线11的Cu2+浓度为1.0×10-5mol/L、曲线12的Cu2+浓度为1.1×10-5mol/L、曲线13的Cu2+浓度为1.2×10-5mol/L、曲线14的Cu2+浓度为1.3×10-5mol/L、曲线15的Cu2+浓度为1.4×10-5mol/L；从图中可以看出随着Cu2+浓度的增加，本试验制备的荧光分子探针溶液在波长474nm处的荧光峰强度逐渐下降，而在波长351nm处的荧光峰强度基本保持不变，可以说明本试验制备的本试验制备的荧光分子探针溶液可以在水溶液中对Cu2+进行荧光比率检测。
试验二：一种非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针的制备方法，具体是按以下步骤完成：
一、将有机化合物A和无水哌嗪依次加入到二氯甲烷中混合均匀，在室温和氮气的保护下搅拌3h，将反应液旋干，再经过柱色谱分离得到中间体；步骤一中所述的有机化合物A与无水哌嗪的摩尔量比为1:2；步骤一中所述的有机化合物A的摩尔量与二氯甲烷的体积比为1mol:20L；
二、将有机化合物B、步骤一得到的中间体、碘化钾和N,N-二异丙基乙基胺依次加入到乙腈中混合均匀，在氮气保护下回流6h，将反应液旋干，再经过柱色谱分离得到非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针；步骤二中所述的步骤一得到的中间体与有机化合物B的摩尔比为1:1.5；步骤二中所述的有机化合物B与N,N-二异丙基乙基胺的摩尔比为1:2；步骤二所述的步骤一得到的中间体的摩尔量与碘化钾的质量比为1mol:25g；步骤二中所述的步骤一得到的中间体的摩尔量与乙腈的体积比为1mol:50L；
步骤一中所述的有机化合物A为4-氯-7-硝基苯并[c][1,2,5]氧杂二唑；步骤二中所述的有机化合物B为8-(α-氯乙酰基)喹啉。
本试验的反应式如下：
本试验所得的非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针的核磁分析数据如下：
1H-NMR(400MHz,CDCl3):11.28(CONH,s,1H),8.86(d,J＝6.0Hz,1H),8.81(d,J＝8.8Hz,1H),8.49(d,J＝8.0Hz,1H),8.22(d,J＝9.6Hz,1H),7.58(m,2H),7.50(m,1H),6.72(d,J＝8.0Hz,1H),4.37(NBD-N(CH2CH2)2N,s,4H),3.53(COCH2,s,2H),3.22(NBD-N(CH2CH2)2N,s,4H)。
试验三：一种非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针的制备方法，具体是按以下步骤完成：
一、将有机化合物A和无水哌嗪依次加入到二氯甲烷中混合均匀，在室温和氮气的保护下搅拌3h，将反应液旋干，再经过柱色谱分离得到中间体；步骤一中所述的有机化合物A与无水哌嗪的摩尔量比为1:2；步骤一中所述的有机化合物A的摩尔量与二氯甲烷的体积比为1mol:20L；
二、将步骤一得到的中间体和有机化合物B依次加入至二氯甲烷中，在室温和氮气的保护下搅拌3h，将反应液旋干，再经过柱色谱分离得到非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针；步骤二中所述的步骤一得到的中间体与有机化合物B的摩尔比为3:5；步骤二中所述的步骤一得到的中间体的摩尔量与二氯甲烷的体积比为1mol:50L；
步骤一中所述的有机化合物A为4-氯-7-硝基苯并[c][1,2,5]氧杂二唑；步骤二中所述的有机化合物B为3,6-二硝基-4-溴-N-丁基-1,8-萘酰亚胺。
本试验的反应式如下：
本试验所得的非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针的核磁分析数据如下：
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):9.42(s,1H),9.07(s,1H),8.79(s,1H),8.57(d,J＝9.2Hz,1H),6.84(d,J＝9.2Hz,1H),4.52(NBD-N(CH2CH2)2N,s,4H),4.07(CH2CH2CH2CH3,t,J＝7.2Hz,2H),3.64(NBD-N(CH2CH2)2N,s,4H),1.64(CH2CH2CH2CH3,m,2H),1.36(CH2CH2CH2CH3,m,2H),0.93(CH3,t,J＝7.4Hz,3H)。
试验四：一种非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针的制备方法，具体是按以下步骤完成：
一、将有机化合物A、无水哌嗪、碘化钾和N,N-二异丙基乙基胺依次加入到乙腈中混合均匀，在氮气保护下回流6h，将反应液旋干，再经过柱色谱分离得到中间体；步骤一中所述的有机化合物A与无水哌嗪的摩尔量比为1:2；步骤一中所述的无水哌嗪与N,N-二异丙基乙基胺的摩尔量比为1:2；步骤一中所述的无水哌嗪的摩尔量与碘化钾的质量比为1mol:7g；步骤一中所述的无水哌嗪的摩尔量与乙腈的体积比为1mol:18L；
二、将有机化合物B、步骤一得到的中间体、碘化钾和N,N-二异丙基乙基胺依次加入到乙腈中混合均匀，在氮气保护下回流6h，将反应液旋干，再经过柱色谱分离得到非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针；步骤二中所述的中间体与有机化合物B的摩尔比为1:1.5；步骤二中所述的有机化合物B与N,N-二异丙基乙基胺的摩尔比为1:2；步骤二所述的步骤一得到的中间体的摩尔量与碘化钾的质量比为1mol:10g；步骤二中所述的步骤一得到的中间体的摩尔量与乙腈的体积比为1mol:20L；
步骤一中所述的有机化合物A为9-氯甲基蒽；步骤二中所述的有机化合物B为8-(α-氯乙酰基)喹啉。
本试验的反应式如下：
本试验所得的非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针的核磁分析数据如下：
1H-NMR(400MHz,CDCl3):11.32(CONH,s,1H),8.74(d,J＝7.6Hz,1H),8.58(d,J＝4.0Hz,1H),8.42(d,J＝7.2Hz,2H),8.30(s,1H),7.94(d,J＝8.0Hz,1H),7.88(d,J＝6.0Hz,2H),7.47(t,J＝8.0Hz,1H),7.37(m,3H),7.29(t,J＝5.0Hz,2H),7.20(m,1H),4.52(An-CH2-N,s,2H),4.12(COCH2,s,2H),3.11(COCH2N(CH2CH2)2N,s,4H),2.93(COCH2N(CH2CH2)2N,s,4H)。

Claims (1)

1.一种非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针的应用，其特征在于非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针用于识别Cu2+，Cu2+在474nm处对非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针的荧光峰猝灭，而在波长351nm处的荧光峰强度基本保持不变；
所述的非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针是按以下步骤制备的：
一、将有机化合物A、无水哌嗪、碘化钾和N,N-二异丙基乙基胺依次加入到乙腈中混合均匀，在氮气保护下回流6h，将反应液旋干，再经过柱色谱分离得到中间体；步骤一中所述的有机化合物A与无水哌嗪的摩尔量比为1:2；步骤一中所述的无水哌嗪与N,N-二异丙基乙基胺的摩尔量比为1:2；步骤一中所述的无水哌嗪的摩尔量与碘化钾的质量比为1mol:10g；步骤一中所述的无水哌嗪的摩尔量与乙腈的体积比为1mol:20L；
二、将步骤一得到的中间体和有机化合物B依次加入至二氯甲烷中，在室温和氮气保护下搅拌3h，将反应液旋干，再经过柱色谱分离得到非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针；步骤二中所述的步骤一得到的中间体与有机化合物B的摩尔比为3:5；步骤二中所述的步骤一得到的中间体的摩尔量与二氯甲烷的体积比为3mol:200L；
步骤一中所述的有机化合物A为2-(2’-吡啶基)-8-(α-氯乙酰基)喹啉；步骤二中所述的有机化合物B为香豆素-3-甲酰氯；步骤一中所述的中间体为
所述的非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针用于识别Cu2+的方法为：
将步骤二得到的非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针溶于含有三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、DMSO和水的混合溶液中得到荧光分子探针溶液；其中，非荧光共振能量转移的双荧光团比率荧光分子探针的浓度为1.0×10-5mol/L，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的浓度为0.01mol/L，DMSO和水的体积比为1:1；向荧光分子探针溶液中加入浓度为5.0×10-5mol/L的Cu2+。
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