CN103338783B - 提供或调节甜味的组合物和方法及其筛选方法 - Google Patents

提供或调节甜味的组合物和方法及其筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了鉴定在口腔内提供或增强甜味的分子的方法和含有所述分子的组合物。所述方法涉及确定多种已知或新化合物对于哺乳动物口腔细胞、味觉细胞或异源细胞中具有ATP-门控K+通道(KATP)活性的葡萄糖-转运蛋白表达或功能活性的影响，所述细胞表达所述蛋白或通道。

Description

提供或调节甜味的组合物和方法及其筛选方法
技术背景
各种甜味化合物包括单糖和二糖(葡萄糖、果糖、蔗糖)、糖醇、小分子无热值甜味剂(糖精、甜蜜素、三氯蔗糖)、二肽(阿斯巴甜、纽甜)、和蛋白甜味剂(莫尼林(monellin)、祝马丁(thaumatin)、甜味蛋白(brazzein))，所述化合物作为食品添加剂存在并且使从牙膏到药物制剂的产品变甜。然而，显然相比多年来开发的人工无热值甜味剂，人偏好天然产生的甜味剂。
在分子鉴定主要的甜味传感器是两个CG蛋白家族偶联受体(GPCR)的异二聚组合T1r2+T1r3(综述参见BachmanovAA，Beauchamp，2007)之前，认为甜味可能依赖于糖转运体或糖门控阳离子通道(sugar-gatedcationchannels)(DeSimoneJA，HeckGL，MiersonS，DesimoneSK．，1984；MiersonS，DeSimoneSK，HeckGL，DeSimoneJA．，1988；SimonSA，LabarcaP，RobbR．，1989；SimonSA，1991)。葡萄糖转运体(GLUT)、钠葡萄糖共转运体(SGLT)和KATP代谢传感器在全身和许多特定器官(例如肠、胰、心、骨骼肌、脑)内的葡萄糖内稳态和代谢中起到重要作用(综述参见ScheepersA，JoostHG，SchürmannA．，2004；McTaggartJS，ClarkRH，AshcroftFM．，2010；NicholsCG．，2006；Zhao和Keating，2007)。然而，味觉细胞中这些重要蛋白的存在与功能很大程度上未知。Liu等，(ActaHistochemica，2010)鉴定了大鼠真菌状味觉细胞中的SUR1(KATP的一种成分)，但是发现SUR1在大鼠轮廓味觉细胞(circumvallatetastecells)中不存在。Liu等没有检测味觉细胞类型特异性表达。Hevezi等，(PLoSOne，2009)鉴定了GLUT8、GLUT9、GLUT10、GLUT13、SLC2A4RG(GLUT4的调节物)和胰岛素受体，其为猕猴味觉细胞／味蕾中潜在表达的基因。然而，这些作者没有证实这些基因在味觉细胞中的表达或者确定其在特定类型味觉细胞中是否表达。
发明内容
一方面，通过筛选测试分子对细胞中葡萄糖转运蛋白表达或活性的影响提供了一种鉴定在口腔内提供或增强甜味的分子的方法。在一个实施方式中，该方法涉及将测试分子与体外培养条件下表达葡萄糖转运蛋白的哺乳动物细胞或细胞系接触；并且测量接触的细胞或细胞系中葡萄糖转运蛋白的表达水平或功能活性。与阳性或阴性对照细胞或细胞系相比，接触测试分子的细胞或细胞系中葡萄糖转运蛋白的蛋白表达或功能活性增加可鉴定出一种提供或增强甜味的测试分子。
在另一个方面，通过筛选测试分子对于哺乳动物细胞或细胞系的效果提供了鉴定一种在口腔内提供或增强甜味的分子的方法，所述哺乳动物细胞或细胞系表达磺酰脲受体(SUR)亚基蛋白和通过ATP门控K+通道(KATP)的内向整流钾通道(Kir)亚基蛋白。在一个实施方式中，该方法涉及将测试分子与体外培养条件下表达磺酰脲受体(SUR)亚基蛋白和通过ATP门控K+通道(KATP)的内向整流钾通道(Kir)亚基蛋白的哺乳动物细胞或细胞系接触，以及测量接触的细胞或细胞系中KATP通道的电生理或功能活性。与阴性对照细胞或细胞系相比，接触测试分子的细胞或细胞系的KATP电生理或功能活性降低或抑制可鉴定提供或增强甜味的测试分子。
在另一方面，通过筛选测试分子对细胞中结合或核定位SUR1蛋白的效果提供了一种鉴定在口腔内提供或增强甜味的分子的方法。在一个实施方式中，该方法涉及将测试分子与体外培养条件下表达磺酰脲受体1(SUR1)蛋白的哺乳动物细胞或细胞系接触；以及检测测试分子与SUR1蛋白在培养中的结合。与阳性或阴性对照细胞或细胞系相比，测试分子与其所接触细胞或细胞系中的SUR1出现大量结合可鉴定一种提供或增强甜味的测试分子。
在另一个方面，提供了所述测试分子以及含有该分子的组合物在口腔内提供或增强甜味中的应用。
从下列发明详述很容易了解本发明的其他方面和优点。
附图简要说明
图1A至1D证明在味觉组织中糖转运体、KATP葡萄糖传感器和胰岛素受体mRNA的表达。图1A的凝胶显微照片是来自从轮廓(CV)味觉组织和缺乏味蕾的“非味觉”(NT)舌上皮组织制备的小鼠cDNA的糖转运体(GLUT2、GLUT4、GLUT8、GLUT9B和SGLT1)、味蛋白(GUST、味觉RNA对照)和GAPDH(组织RNA对照)的PCR扩增(35个循环)。GAPDH在两个cDNA样品中都表达；味蛋白仅在味觉cDNA中表达。GLUT8、GLUT9B和SGLT1在味觉cDNA中更高表达。从已知表达这些基因的组织制备的cDNA作为阳性对照(CTRL)以确定引物能够扩增正确大小的产物。
图1B的凝胶显微照片是来自从CV味觉组织和缺乏味蕾的非味觉NT舌上皮组织制备的小鼠cDNA的KATP亚基(SUR1、SUR2A、SUR2B、Kir6．1、Kir6．2)和胰岛素受体(INSR)的PCR扩增(35个循环)。SUR1、SUR2A、Kir6．1和INSR在味觉cDNA中更高表达。从已知表达这些基因的组织制备的cDNA作为阳性对照(CTRL)以确定引物能够扩增正确大小的产物。
图1C显示用Taqman实时PCR以定量CV(实心条)味觉组织和缺乏味蕾的NT(灰色条)舌上皮组织中糖转运体、KATP亚基和胰岛素受体表达的结果。在味觉cDNA中观察到GLUT8、SGLT1和胰岛素受体的表达提高。每个基因的表达用循环阈值和GAPDH之比的对数作图。
图1D显示用Taqman实时PCR以定量CV(实心条)味觉组织和缺乏味蕾的NT(灰色条)舌上皮组织中糖转运体、KATP亚基表达的结果。在味觉cDNA中观察到GLUT9、SUR1、和Kir6．1的表达提高。每个基因的表达用循环阈值和GAPDH之比的对数作图。
图2A显示在小鼠味觉细胞中存在功能性KATP通道。格列本脲(Glibenclamide)是一种KATP通道的磺酰脲抑制剂，其抑制小鼠真菌状味觉细胞中的外向(K+)电流。每个数据点来自7-16个细胞。
图2B显示格列本脲抑制外向电流(在+40mV)的浓度-反应函数，其根据在小鼠味觉细胞中应用100μM格列本脲所实现的电流抑制来标准化。每个数据点来自7-16个细胞。
发明详述
本文所述的方法和组合物提供了鉴定和开发新型甜味剂的手段。虽然I型味觉受体、T1R2和T1R3的组合被认为是甜味反应中的主要受体，发明人确定某些肠型转运蛋白和内分泌胰腺型代谢葡萄糖传感器在口腔味觉细胞的糖(例如，甜味)感受和由此的甜味反应动力学中起到重要作用。不希望受理论限制，发明人设想通过钠盐增强甜味部分取决于钠依赖性葡萄糖经SGLT1摄入味觉细胞。提出了通过调节T1R3味觉细胞响应味觉细胞代谢中糖反应性变化的激素释放来增强甜味。
I．定义
本文使用的所有科学和技术术语具有对生物学、生物技术和分子生物学领域技术人员而言已知且通常的涵义，并且通过参考已发表的文献，其提供本领域技术人员对于本发明所用许多术语的一般指导。然而，为清楚起见，下列术语如下特别定义：
“提供甜味”表示测试分子单独产生由口腔味觉细胞检测的甜味。
“增强甜味”表示测试分子能够增加由口腔味觉细胞所检测其他甜味剂或其他组合物成分的甜味，所述其他甜味剂或其他组合物成分如天然糖例如葡萄糖或果糖、或人工甜味剂例如糖精、或组合物中的其他成分，其需要甜味，例如药物等。
本文使用的“糖转运蛋白”包括用于在细胞内或穿过细胞主动转运、或提供易化被动转运糖的蛋白，所述糖例如葡萄糖、果糖等。在一个实施方式中，糖转运体是钠-葡萄糖共转运体(SGLT)。在另一个实施方式中，糖转运体是葡萄糖转运体(GLUT)。这两个肠道糖转运体家族据信对于含有T1R3的味觉细胞的甜味反应有贡献。这些转运体理论上涉及甜味反应的动力学，例如，若通过顶部转运体摄入味觉细胞中然后代谢或通过基底侧糖转运体运送到味觉细胞外时，为什么人工甜味剂具有延迟的开始／消失而糖甜味剂具有快速的开始／消失。本发明所述方法中的重要SGLT蛋白是SGLT1或SGLT3。本发明所述方法中的重要GLUT家族蛋白是GLUT1、GLUT2、GLUT3、GLUT4、GLUT8和GLUT9。这些糖转运体的核苷酸和／或蛋白序列为公众所知并且可参见GENBANK例如登录号AAF172491下的鼠SGLT1；人SGLT1，登录号NP_000334．1；人SGLT3，登录号P31636；人GLUT1，登录号NP006507．2，鼠GLUT1，登录号NP0355530．2。其他的在公开数据库中容易获得。
“ATP-门控K+通道(KATP)”是磺酰脲受体(SUR)亚基蛋白和内向整流钾通道(Kir)亚基蛋白的复合物。其在胰腺β细胞的细胞膜中发现并且是通过代谢成ATP的内分泌胰腺型葡萄糖传感器。按照本发明人所述，KATP也涉及味觉细胞中的T1R非依赖性糖感应。当紧张性活化或由另一个分子激活时，该通道控制了细胞膜上钾的激化极化溢出。当通道通过与特定分子作用而受抑制时，超极化流出被抑制，因而造成穿过膜的电势变得更正。在胰腺内分泌细胞中，这个去极化打开了电压门控钙离子通道，造成细胞内钙的上升，能引起胰岛素分泌的增加。相似的功能预期在味觉细胞中存在。
本文使用的术语“测试分子”能指用于测试作为甜味剂或调控甜味的分子的任意已知或新型分子。该分子一般可在已知的分子文库中找到，包括已经预筛选的那些，例如为了在动物中安全使用。合适的测试分子能参见例如AMES文库，并且能从供应商如奥塔瓦(Otava)、提姆泰克(TimTec，Inc．)、ChemBridge公司(ChemBridgeCorp．)等容易获得。参见例如，Bhal等，2007Mol．Pharmaceutics，4(4)：556-560。通过本发明方法鉴定的测试分子／化合物可以是化学化合物、小分子、核酸序列如cDNA、或肽或多肽，其单独提供甜味或调节(按要求增加、增强、或抑制)其他组合物成分的甜味。
本文使用的术语“磺酰脲化合物”(SU化合物)指的是有该结构的分子：
这些磺酰脲衍生化合物含有中心S-苯基磺酰脲结构，有苯环上的对位取代(R1)和在脲N末端基团终止的各种基团(R2)。磺酰脲与ATP-门控K+通道(KATP)的SUR亚基结合。用于本文所述方法和组合物的所需磺酰脲分子或衍生物是含有上述活性部分的那些衍生物或化合物，其可功能性地描述为结合SUR1，但不增加胰腺胰岛素生成。相似地，在神经血管组织中发现不上调非选择性ATP-门控阳离子通道的SU可能是需要的化合物。在某些实施方式中，局部作用并且在肠中降解或重吸收的已知SU也可能是本发明方法中使用的化合物。相似地，在结合其他通道亚基或受体中有用的SU可能是需要的增强甜味的化合物，并且可能是通过本文所述的这些方法容易鉴定的一组化合物。在某些实施方式中，R1是卤素，任选取代的C1-C10的-烷基、任选取代的C3-C8环烷基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂环、CN、NO2、任选取代的C2-C10烯基、任选取代的C2-C10炔基、OH、CF3、OCF3、SCF3、任选取代的C1-C10烷氧基、CO2H、C(O)O(任选取代的C1-C6烷基)、C(O)NH2、C(O)NH(任选取代的C1-C6烷基)、C(O)N(任选取代的C1-C6烷基)(任选取代的C1-C6烷基)、NHC(O)(任选取代的C1-C6烷基)、NHC(O)O(任选取代的C1-C6烷基)、NHC(O)NH2、NHC(O)NH(任选取代的C1-C6烷基)、NHSO2(任选取代的C1-C6烷基)、SO2(任选取代的C1-C6烷基)、SO2NH2、SO2NH(任选取代的C1-C6烷基)、或N(任选取代的C1-C6烷基)(任选取代的C1-C6烷基)。
在某些实施方式中，R2是任选取代的C1-C10烷基、任选取代的C3-C8环烷基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂环、任选取代的C2-C8烯基、任选取代的C2-C8炔基、CO2H、C(O)O(任选取代的C1-C6烷基)、C(O)NH2、C(O)NH(任选取代的C1-C6烷基)、C(O)N(任选取代的C1-C6烷基)(任选取代的C1-C6烷基)、SO2(任选取代的C1-C6烷基)、SO2NH2、SO2NH(任选取代的C1-C6烷基)、或N(任选取代的C1-C6烷基)(任选取代的C1-C6烷基)。在一些实施方式中，R2是卤素。
本文使用的术语“烷基”指的是直链和支链的含有1至约10个碳原子的饱和脂族烃基，并且理想地是1至约6个碳原子(例如C1、C2、C3、C4、C5或C6)。
本文使用的术语“环烷基”指如刚才所述，但是结构为环状并且含有3至约8个碳原子。在一个实施方式中，环烷基含有3至约8个碳原子。在另一个实施方式中，环烷基具有约3至约6个碳原子(例如C3、C4、C5或C6)。
本文所用的术语“烯基”指具有一个或多个碳碳双键的直链或支链烷基并且含有约3至约8个碳原子。在一个实施方式中，术语烯基指含有1或2个碳碳双键的烷基。在另一个实施方式中，烯基具有约2至约8个碳原子。在另一个实施方式中，烯基具有约2至约6个碳原子。
本文所用的术语“炔基”指具有一个或多个碳碳三键的直链或支链烷基并且含有约3至约8个碳原子。在一个实施方式中，术语炔基指具有1或2个碳碳三键并且具有约3至约6个碳原子的烷基。
本文所用的术语“芳基”指可包括单个芳环或者多个芳环稠合或连接在一起的芳族体系，其中至少一部分稠合或连接的环形成共轭芳香体系。芳基包括但不限于：苯基、萘基、联苯基、蒽基、四氢萘基、菲基、茚、苯并萘基、芴基和咔唑基。理想地，芳基是任选取代的苯基。
本文所用的术语“杂芳基”指任选取代的单、二、三、或其他多环芳族环体系，其包括至少1个并且理想上1至4个杂原子环成员，所述环成员包括硫、氧和氮。在一个实施方式中，杂芳基可含有约3至约50个碳原子，包括其中碳原子范围和特定数目的所有组合和子组合。在另一个实施方式中，杂芳基可含有约4至约10个碳原子。杂芳基的非限制性例子包括例如吡咯基、呋喃基、吡啶基、1，2，4-噻二唑基、嘧啶基、噻吩基、异噻唑基、咪唑基、四唑基、吡嗪基、嘧啶基、喹啉基、异喹啉基、噻吩基、苯并噻吩基、异苯并呋喃基、吡唑基、吲哚基、嘌呤基、咔唑基、苯并咪唑基、和异恶唑基。
本文所用的术语“杂环”指稳定的4或7元单环或多环杂环，其是饱和或部分不饱和的。杂环在其骨架中具有碳原子和一个或多个杂原子，所述杂原子包括氮、氧和硫原子。理想地，杂环在其环骨架中具有1到约4个杂原子。当杂环在其环骨架中包含氮或硫原子时，氮或硫原子可以被氧化。术语“杂环”也指多环，其中多环与芳环稠合。杂环可以通过杂原子或碳原子与芳环连接，前提是所得的杂环结构具有化学稳定性。各种杂环基在本领域已知，包括但不限于：含氧环、含氮环、含硫环、含混合杂原子环、含稠合杂原子环以及其组合。杂环基选自但不限于，呋喃基、四氢呋喃基、吡喃基、吡喃酮基、二氧芑基(dioxinyl)、吡咯基、吡唑基、咪唑基、***基、吡啶基、哌啶基、2-氧代哌啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、哌嗪基、氮杂卓基(azepinyl)、三嗪基、吡咯烷基、氮杂卓基(azepinyl)、噁硫醇基(oxathiolyl)、噁唑基、噻唑基、噁二唑基、噁***基(oxatriazolyl)、二噁唑基、噁噻唑基、噁硫酚基、噁嗪基、噁噻嗪基、吗啉基、硫吗啉基、硫吗啉基亚砜、氧杂环乙烷基(oxepinyl)、硫环庚三烯基(thiepinyl)、二氮七环基、苯并呋喃基、苯并噻吩、吲哚基、氮茚基、嘌呤啶基、吡喃并吡咯基、异吲唑基、吲哚噁嗪基、苯并噁唑基、邻氨基苯甲酸基(anthranilyl)、苯并吡喃基、喹啉基、异喹啉基、苯并二氮酮基(benzodiazonyl)、萘基吡啶基(napthylridinyl)、苯并噻吩基、吡啶并吡啶基(pyridopyridinyl)、苯并噁嗪基、呫吨基、吖啶基、和嘌呤基环。
本文所用的术语“烷氧基”指O(烷基)基团，其中连接点是通过氧原子，烷基可任选取代。
本文所用的术语“芳氧基”指O(芳基)基团，其中连接点是通过氧原子，芳基可任选取代。
本文所用的术语“烷基羰基”指C(O)(烷基)基团，其中连接点是通过羰基部分的碳原子，烷基可任选取代。
本文所用的术语“烷基羧基”指C(O)O(烷基)基团，其中连接点是通过羧基部分的碳原子，烷基可任选取代。
本文所用的术语“烷基氨基”指仲胺和叔胺，其中连接点是通过氮原子，烷基可任选取代。烷基可以相同或不同。
本文所用的术语“卤素”指Cl、Br、F或I基团。
术语“任选取代”表示基本分子可以在一个或多个碳、氮、氧、或硫原子上发生取代，前提是所得的部分在化学上稳定，取代基包括但不限于卤素、CN、OH、NO2、氨基、芳基、杂环、烷氧基、芳氧基、烷氧基、烷基羰基、烷基羧基或烷基氨基。
本文所述的化合物也包括“代谢物”，其是细胞或对象中通过加工本发明化合物形成的独特产物。理想地，代谢物在体内形成。
本文所用的“味觉细胞”指在哺乳动物口腔味蕾中发现的哺乳动物感觉细胞，包括轮廓乳突和叶状乳突。这些细胞能根据其在光学和电子显微镜下的典型外观鉴定。它们也能通过口腔位置和表达味觉特异性蛋白如α-味蛋白(alpha-gustducin)、T1R1，2，3、T2R、TrpM5、Snap25、GLAST来鉴定。
本文所用的“味觉样细胞”指的是表达已知味觉信号蛋白的任意口腔外部细胞。这些细胞包括在肺和鼻中孤立性化学感应细胞、肠内分泌细胞、胰腺内分泌细胞等。具有这些细胞特征的已知味觉信号蛋白是T1r1、α-味蛋白、T1r2、T1r3、T2R和Trpm5。
使用术语“天然细胞”指天然或内源表达所示mRNA或蛋白的哺乳动物细胞或细胞系。例如，表达天然葡萄糖-转运体的口腔细胞或细胞系是天然表达GLUT的哺乳动物口腔味觉细胞或口腔味觉细胞系。
本文所用的“异源细胞或细胞系”表示建立自非口腔味觉细胞、和／或天然不表达所需mRNA或蛋白的细胞的哺乳动物细胞或细胞系。例如，表达葡萄糖-转运蛋白的异源细胞可以是人肾细胞(HEK)，其通过遗传工程改造成表达所需GLUT蛋白或内分泌细胞或细胞系，其天然不表达葡萄糖-转运蛋白，但不是口腔细胞。在一个实施方式中，有用的内分泌细胞或细胞系是肠道或肠内分泌细胞或细胞系。在另一个实施方式中，内分泌细胞或细胞系是胰腺内分泌细胞或细胞系。其他已知或有用的细胞在下述的方法中提供。
本文所用的“转化的细胞或细胞系”指哺乳动物细胞或细胞系，其通过遗传工程改造成表达天然不表达的所需mRNA或蛋白或天然不以已知量表达。特别需要的细胞或细胞系选自任何哺乳动物物种，包括但不限于A549、WEHI、3T3、10T1／2、HEK293细胞、PERC6、Saos、C2C12、L细胞、HT1080、HepG2以及衍生自哺乳动物的原代成纤维细胞、肝细胞和成肌细胞，所述哺乳动物包括人、猴、小鼠、大鼠、兔和仓鼠。选择提供细胞的哺乳动物物种和哺乳动物细胞类型(即上皮细胞、肿瘤等)都不限制本发明。
“表达水平”指所需蛋白编码序列(例如糖-转运体)的核苷酸序列(例如，mRNA)的定量表达或所需蛋白(例如糖-转运体)自身的定量表达。
“功能活性”指特定mRNA或蛋白或通道在细胞中表达时的预期正常活性。例如，GLUT蛋白的功能活性是被动、易化转运活性，例如摄取或转运葡萄糖进入细胞或穿过细胞膜。例如，SGLT蛋白的功能活性是主动摄入和／或共转运葡萄糖和钠进入细胞或穿过细胞膜。存在已知的试验以证明两种转运类型并且可用于下述方法。合适试验的示例能参见实施例1，小段K和Wilson-O’Brien，Endocrinology，149(3)：917-24(2008)。KATP通道的功能活性是电生理活性，例如细胞的极化和去极化或者K+或其他阳离子流，其通过膜片钳或记录电极测量。例如，参见实施例4中讨论的K+电流测量。测量该活性的另一种方式是通过使用指示剂染料监测去极化，例如Ca++指示剂或特定离子(K+)流。
本文所用的“非特异活性”指通过细胞培养中的测试分子诱导的活性，其是除了主动或被动葡萄糖转运或钠转运或者钾离子特异性通道活性以外的活性。非特异活性可包括在不表达所需mRNA或蛋白的细胞中作用的测试分子。另一种非特异活性是抑制性化合物，其通常抑制需要的功能活性。
“反筛选试验”是能够筛选指定测试化合物的非特异活性的已知试验。
“哺乳动物”主要指人，但也包括常用实验室哺乳动物，例如灵长类、小鼠、大鼠等，其具有天然口腔细胞或味觉细胞，能够从其他味道中区分甜味。
“动物对甜味的生理或行为试验”是取决于生理或行为反应的已知试验，所述反应响应哺乳动物测试动物或人的口腔味觉细胞中所应用化合物的甜味增加或减少。已知试验的例子包括使用味觉计(gustometer)(参见例如Busch等，ChemSenses．2009年5月；34(4)：341-8)、测舔仪(lickometer)(参见例如Fudge等，HormBehav．2009年9月；56(3)：322-31)、条件性味觉厌恶(conditionedtasteaversion)(参见例如Ayestaran，PLoSOne．2010年10月27日；5(10)：e15000)、味觉神经记录分析(gustatorynerverecordingassays)(参见例如Damak等，ChemSenses．2006年3月；31(3)：253-64)和吸吐法味觉试验(sipandspittasteassays)(参见例如Delwiche等，FoodQualityandPreference，1996年3月；7(3-4)293-7)。在另一个实施方式中，这种试验包括电生理反应或钙成像或分离的味觉细胞、分离的味蕾、或味切片(tasteslices)。其他合适的试验为本领域技术人员已知并且可以用于下述方法。
术语“一个”或“一种”指一种或多种，例如，“一种试验”理解成表示一种或多种试验。因此，术语“一个”(或“一种”)、“一种或多种”和“至少一种”在本文中互换使用。如文中所用，术语“约”指相对给定参考值存在10％的差异，除非另外说明。当说明书中的各个实施方式使用“包括”用语时，在其他情况下，相关的实施方式也意在使用“由……组成”或“基本由……组成”用语解读和描述。
II．发明具体方法
在一个实施方式中，鉴定在口腔内提供或增强甜味的分子的方法涉及在体外培养条件下将测试分子与表达糖转运蛋白的哺乳动物细胞或细胞系接触。根据特定试验和所需的终点，合适培养条件包括约37℃的温度；或从约32至40℃的范围。这个温度维持约10分钟至24小时。在一些实施方式中，时间段为至少约20分钟、30分钟、45分钟、1小时、3小时、5小时、10小时、15小时、20小时或更长。评价测试分子对于基因产物的表达水平或表达蛋白的功能活性的影响并且通过上面就测量表达水平所述的任何合适方法定量。
与阴性对照细胞或细胞系相比，接触测试分子的细胞或细胞系中糖转运蛋白的蛋白表达增加或糖转运蛋白的功能活性增加可鉴定出一种提供或增强甜味的测试分子。即，测试分子改变糖转运蛋白正常表达或活性的效果与其对提供或增强甜味的影响有关。所述效果是测试分子允许保持正常表达水平或相比对照增加糖转运蛋白的水平时，该测试分子表现为有用的潜在新型甜味化合物或用于增强最终组合物中其他成分甜味的化合物，例如食品、药物等。所述效果是测试分子减少糖转运蛋白的表达水平或功能活性时，该测试分组表现出在组合物中存在时有潜在抑制甜味的影响。
本方法所用的阴性对照通常是与对照分子接触的相同细胞或细胞系，其已知不会在口腔内提供或增强甜味。在另一个实施方式中，该方法使用的阴性对照一般是不与测试或对照分子接触的相同细胞或细胞系。因而，该方法中的测试分子效果比较能鉴定与提供或增强甜味相关的结果。
理想地，该方法中使用的细胞或细胞系是表达糖转运蛋白的天然口腔味觉细胞或建立的口腔味觉细胞系。在另一个实施方式中，细胞系或细胞培养可以是异源(非口腔，非味觉)细胞或细胞系。在其他实施方式中，细胞或细胞系是异源细胞或细胞系，其经转化表达糖转运体。
在该方法的实施中，糖转运体优选是SGLT。在一个实施方式中，所述转运体是SGLT1。在另一实施方式中，所述转运体是SGLT3。SGLT是表达的糖转运体时，功能活性是主动共转运葡萄糖和钠。
在本发明的另一个实施方式中，本方法的实施中，糖转运体优选是GLUT。在一个实施方式中，所述转运体是GLUT2。在另一实施方式中，所述转运体是GLUT4。在另一实施方式中，所述转运体是GLUT8。在另一实施方式中，所述转运体是GLUT9。在另一实施方式中，所述转运体是GLUT1。在另一实施方式中，所述转运体是GLUT3。在另一些实施方式中，表达GLUT家族转运体的组合并且测量表达水平和／或功能活性。GLUT转运体是表达的糖转运体时，功能活性是被动、易化葡萄糖转运。
在另一些实施方式中，实施所述方法以检测和定量其他糖转运体的活性表达，例如，果糖糖转运体。
在另一些实施方式中，实施所述方法以检测相同细胞或细胞系中的不同糖转运体组合，例如不同的GLUT、或一种SLGT和一种GLUT。
该方法还使用针对测试分子的相反筛选试验以排除所测试细胞或细胞系中测试分子的非特异活性。另外，该方法还可包括通过使测试分子接受用于甜味的动物生理反应、电生理反应、或行为试验或经分离味觉细胞、经分离味蕾或味切片的钙成像来筛选测试分子，以证实测试分子提供或增强甜味。
下面提供的示例证明了用于该方法的多种方法和试验。
另一种鉴定在口腔内提供或增强甜味的分子的方法涉及将测试分子与体外培养环境下通过ATP-门控K+通道(KATP)表达磺酰脲受体(SUR，如SUR1)亚基和内向整流钾通道(Kir，如KIR6．1)亚基的哺乳动物细胞或细胞系接触。在经过合适培养条件后，例如37℃持续约10分钟至24小时，如前所提示，测试分子对KATP功能活性的影响通过任意合适的方式评价和定量。
在一个实施方式中，所接触细胞或细胞系中KATP通道的电生理或功能活性通过电极测量。在一个实施方式中，电生理活性是特定钙离子指示剂或钾离子流的变化。在一个实施方式中，电生理活性是细胞或细胞系的极化或去极化。在一个实施方式中，测量所接触细胞或细胞系中KATP通道的电生理或功能活性以检测细胞膜上钾离子超极化流出的增加或减少。
例如，与阴性对照细胞或细胞系相比，接触测试分子的细胞或细胞系的KATP电生理或功能性活性降低或抑制可鉴定提供或增强甜味的测试分子。即，测试分子改变跨细胞膜的正常钾超极化流出的效果与提供或增强甜味有关。所述效果是测试分子能维持正常KATP通道活性或相比对照增加通量时，该效果表示测试分子不是有用的潜在新型甜味化合物。或者，结果表明测试分子在组合物中存在时具有潜在甜味抑制效果。所述效果是测试分子减少功能活性超出对照时，测试分子表现出对增强最终组合物中其他成分的甜味有用，例如食品、药品等。
在一个实施方式中，本方法使用的阴性对照通常是与对照分子接触的相同细胞或细胞系，其已知不会在口腔内提供或增强甜味。在另一个实施方式中，该方法使用的阴性对照一般是不与测试或对照分子接触的相同细胞或细胞系。因而，该方法中的测试分子效果比较能鉴定与提供或增强甜味相关的结果。
理想地，该方法使用的细胞或细胞系是表达ATP-门控K+通道的天然口腔味觉细胞或细胞系。在另一个实施方式中，细胞系或细胞培养物可以是异源(非口腔、非味觉)细胞或细胞系，例如，胰腺细胞或细胞系或者内分泌细胞或细胞系。在另一个实施方式中，细胞或细胞系是异源细胞或细胞系，其经转化表达ATP-门控K+通道。
该方法还使用针对测试分子的相反筛选试验以排除在所测试细胞或细胞系中由测试分子调节的的非特异活性，例如，排除非特异性K+电生理活性。另外，该方法还可包括通过使测试分子接受用于甜味的动物生理反应、电生理反应、或行为试验或者经分离味觉细胞、经分离味蕾或味切片的钙成像来筛选测试分子，以证实提供或增强甜味的测试分子。
下面提供的示例证明了用于该方法的多种方法和试验。
在另一个方面，一种鉴定在口腔内提供或增强甜味的分子的方法涉及将测试分子在体外培养条件下与表达磺酰脲受体1(SUR1)的哺乳动物细胞或细胞系接触。在经过之前方法的上述合适培养条件后，例如37℃持续约10分钟至24小时，评价细胞培养以检测培养中测试分子与SUR1的结合。检测结合可以通过多种常规结合测试完成。与阴性对照细胞或细胞系相比，测试分子与其所接触细胞或细胞系中的SUR1出现大量结合可鉴定一种提供或增强甜味的测试分子。
根据本方法，阴性对照包括与对照分子接触的相同细胞或细胞系，对照分子已知与SUR1结合但不在口腔内提供或增强甜味。或者，阴性对照包括不与测试或对照分子接触或与不结合SUR1的对照分子接触的相同细胞或细胞系。
理想地，在一个实施方式中，细胞或细胞系是口腔味觉细胞或口腔味觉细胞系。或者，细胞或细胞系是表达SUR1的异源细胞。在另一个实施方式中，细胞或细胞系是遗传工程改造成表达SUR1的转化细胞或细胞系。在某些实施方式中，细胞或细胞系是内分泌细胞系，如前所述。
在一个实施方式中，测试分子与SUR1受体亚基之间的结合通过结合试验使用结合于测试分子的标签来检测。使用常规标签的常规结合测试可用于本测试。常规检测标签可包括酶、荧光团、发光或化学发光物质、或放射性物质。结合这些标签与测试分子的方法为本领域技术人员已知。因而为了检测SUR1与测试分子的结合，在一个实施方式中，表达SUR1的哺乳动物细胞或细胞系与标记有检测标签的测试分子或化合物接触。所述细胞然后进行洗涤以去除任何非结合的经标记测试分子或化合物。然后分析细胞以通过测定检测标签来检测结合的测试分子-SUR1复合物的存在。
该方法还使用针对测试分子的相反筛选试验以排除所测试细胞或细胞系中测试分子的非特异活性，例如，排除非SUR1结合活性。相反筛选测试同时实施，其中用不表达SUR1的哺乳动物细胞或细胞系实施相同的方法步骤。相反筛选测试作为阴性对照并且能检测结合已表达SUR1的测试化合物。
另外，该方法还可包括通过使测试分子接受用于甜味的动物生理反应、电生理反应、或行为试验或者经分离味觉细胞、经分离味蕾或味切片的钙成像来筛选测试分子，以证实提供或增强甜味的测试分子。
下面提供的示例证明了用于该方法的多种方法和试验。
另一种鉴定在口腔内提供或增强甜味的分子的方法包括将测试分子与体外培养环境下通过ATP-门控K+通道(KATP)表达磺酰脲受体(SUR，如SUR)亚基和内向整流钾通道(Kir，如KIR6．1)亚基的哺乳动物细胞或细胞系接触。在经过合适的培养条件后，例如，37℃持续约10分钟至约24小时，通过任意合适方法，如实施例1和2中描述的间接免疫荧光共聚焦显微镜评价、测量和／或定量测试分子对所接触细胞或细胞系中SUR1核定位的影响。所接触细胞或细胞系中的SUR1核定位相对于阴性对照细胞或细胞系中SUR1核定位的变化指示提供或调节甜味的测试分子。
在一个实施方式中，本方法使用的阴性对照通常是与对照分子接触的相同细胞或细胞系，其已知不会在口腔内提供或增强甜味。在另一个实施方式中，该方法使用的阴性对照一般是不与测试或对照分子接触的相同细胞或细胞系。因而，该方法中的测试分子效果比较能鉴定与提供或增强甜味相关的结果。
理想地，该方法使用的细胞或细胞系是表达ATP-门控K+通道的天然口腔口腔味觉细胞或细胞系。在另一个实施方式中，细胞系或细胞培养物可以是异源(非口腔、非味觉)细胞或细胞系，例如，胰腺细胞或细胞系或者内分泌细胞或细胞系。在另一个实施方式中，细胞或细胞系是异源细胞或细胞系，其经转化表达ATP-门控K+通道。
该方法还使用针对测试分子的相反筛选试验以排除所测试细胞或细胞系中测试分子调节的非特异活性，例如，排除非特异性核定位或具有不需要性质的测试分子。另外，该方法还可包括通过使测试分子接受用于甜味的动物生理反应、电生理反应、或行为试验或者经分离味觉细胞、经分离味蕾或味切片的钙成像来筛选测试分子，以证实提供或增强甜味的测试分子。
III．在方法实施中有用的一般方法／测试
下面提供的示例证明了用于该方法的多种方法和试验。在上述特定方法中有用的常规方法是多种测量表达水平的方式。基因产物的表达水平可以用包括通过蛋白或核酸测量在内的常规方法测量。表达蛋白的表达水平测量可以用针对所表达蛋白的任何合适配体，例如抗体(或任意第二生物标记的抗体)来检测蛋白。这些抗体可以在本领域中存在或商用或通过免疫学领域现在常用的技术开发。相似地，配体可以与能够提供检测信号的试剂进行标记或标签，这取决于使用的试验形式。这种标签能够单独或与其他组合物或化合物协同提供检测信号。超过一种配体在诊断方法中使用时，例如在夹心ELISA中，标签需要互相作用以产生检测信号。更理想地，标签是可视检测的，例如比色。
其他可用于本发明方法的标签***能通过其他方式检测，例如有色乳胶微粒(印第安纳州邦斯实验室公司(BangsLaboratories，Indiana))，其中染料是包埋的，在适合的试验中可用于取代酶以提供指示所得蛋白-配体复合物存在的可视信号。其他标签包括荧光化合物、放射性化合物或元素。其他检测生物样品中蛋白的试剂，例如肽模拟物、能够检测SE-CAD的合成化学化合物可用于其他试验模式以定量检测生物样品中的SE-CAD蛋白，例如高压液相色谱(HPLC)、免疫组织化学等。
测量表达的核酸水平可以使用本领域已知的常规技术。这种方法包括基于多核苷酸杂交分析的方法、基于多核苷酸测序的方法、基于蛋白质组学的方法或免疫化学技术。本领域已知定量样品中mRNA表达的最常用方法包括northern印迹和原位杂交；RNA酶保护试验；和基于PCR的方法，如逆转录、实时聚合酶链式反应(RT-PCR)或qPCR。或者，可以使用能识别特定DNA-蛋白质双链体的抗体。本文所述方法不受选定用于实施它们的特定技术限制。
相似地，本文所述的任意方法可以使用高通量筛选试验，所述试验鉴定在口腔内提供或调节甜味的测试分子。在一个实施方式中，这种测试涉及在多孔板的每个单独孔中将不同的选定测试分子(例如核苷酸序列、氨基酸序列、小分子等)与表达特异糖转运蛋白的哺乳动物口腔细胞或细胞系接触。在一个实施方式中，细胞用一种表达***(启动子、蛋白、标记基因)转染，所述表达***在所述细胞表达糖转运蛋白时仅表达萤光素酶(或另一个标记基因)。在化合物在合适的培养条件下暴露于表达细胞后，标记基因(或发光)的水平按照常规测量。由任意测试分子引起的细胞中所正常表达特异糖转运蛋白的表达水平变化与每个孔中标记的表达或缺失表达相关。
也存在其他常规试验和技术用于本文所述方法，所述方法描述于本文引用的出版物。这些其他试验模式可以使用并且本文所述的试验模式不构成限制。
具有与本文所鉴定测试分子相似结构的化合物也可通过一系列步骤的方法进行计算机评价和设计，其中化学实体或片段根据它们结合或模仿已知化合物或测试分子的能力进行筛选和选择，例如本文所述的已知SU或GLUT激活剂或SLGT1激活剂。本领域技术人员可以使用多种方法之一以根据它们模仿这些肽的能力筛选化学实体或片段并且能够更特定地鉴定与SUR1受体结合的结构。这个方法可以通过目测检查，例如计算机屏幕上的三维结构开始。然后选定片段或化学实体可在推定的受体结合位点内以各个方向放置以确定结构相似性，或停驻。
特定的计算机程序也可以协助基于这些由本文方法鉴定的测试分子来设计新测试分子的方法，所述程序包括获自英国牛津的牛津大学的GRID程序(P．J．Goodford，，J．Med．Chem．，198528：849-857)；获自马萨诸塞州伯灵顿的分子模拟公司(MolecularSimulations)的MCSS程序(A．Miranker和M．Karplus，Proteins：Structure，FunctionandGenetics(《蛋白：结构、功能和基因组》)，199111：29-34)；获自加利福尼亚州拉霍亚的斯克里普斯研究所(ScrippsResearchInstitute)的AUTODOCK程序(D．S．Goodsell和A．J．Olsen，Proteins：Structure，Function，andGenetics(《蛋白：结构、功能和基因组》)，19908：195-202)；和获自加利福尼亚州旧金山的加州大学的DOCK程序(I．D．Kuntz等，J．Mol．Biol．，1982161：269-288)，和诸如Quanta和Sybyl的软件，然后是能量最小化和用标准分子力学力场的分子动力学，如CHARMM和AMBER。其他用于小分子化合物的市售可得计算机数据库包括剑桥结构数据库(CambridgeStructuralDatabase)、精细化学品数据库(FineChemicalDatabase)、和CONCORD数据库(综述参见Rusinko，A．，1993，Chem．Des．Auto．News，8：44-47．)。
一旦选出合适的化学实体或片段，它们能够组装成单一化合物。组装可以通过目测检查计算机屏幕上所展示与受体结构有关的三维图像上片段相互之间的关系来进行。有用的辅助本领域技术人员结合单独化学实体或片段的程序包括CAVEAT程序(P．A．Bartlett等，”CAVEAT：AProgramtoFacilitatetheStructure-DerivedDesignofBiologicallyActiveMolecules(CAVEAT：促进生物活性分子的结构驱动设计的程序)”，收录于MolecularRecognitioninChemicalandBiologicalProblems(《化学和生物问题中的分子识别》)”，特别出版物．，RoyalChem．Soc．78，第182-196页(1989))，其获自加利福尼亚州伯克利的加州大学；3D数据库***如MACCS-3D数据库(加利福尼亚州圣莱安德罗的MDL信息***公司(MDLInformationSystems，SanLeandro，CA))(参见例如Y．C．Martin，J．Med．Chem．，199235：2145-2154)；和HOOK程序，获自马萨诸塞州伯灵顿的分子模拟公司。
模仿文中所述测试分子的化合物可以作为整体设计或“从头”设计，使用方法如LUDI程序(H．-J．Bohm，J．Comp．Aid．Molec．Design，19926：61-78)，获自加利福尼亚州圣地亚哥的生物***技术公司(BiosymTechnologies)；LEGEND程序(Y．Nishibata和A．Itai，Tetrahedron，199147：8985)，获自马萨诸塞州伯灵顿的分子模拟公司；和LeapFrog程序，获自密苏里州圣路易斯的卓普斯联合公司(TriposAssociates)。也可以使用其他分子建模技术。参见例如N．C．Cohen等，J．Med．Chem．，199033：883-894。也参见M．A．Navia和M．A．Murcko，CurrentOpinionsinStructuralBiology，19922：202-210。例如，测试化合物的结构已知时，测试化合物的模型可叠加在目标受体的模型上。在本领域中已知有很多方法和技术用于实现这个步骤，可以使用其中任意一种。参见，例如P．S．Farmer，DrugDesign(《药物设计》)，Ariens，E．J．，编，卷10，第119-143页(美国纽约的学术出版社(AcademicPress)，1980)；美国专利号5，331，573；美国专利号5,500,807；C．Verlinde，Structure，19942：577-587；和I．D．Kuntz，Science，1992257：1078-1082。本文所述的建模技术和计算机评价***不作为限制。
因而，使用这些计算机评价***，大量的化合物能够快速简便地进行检测并且避免昂贵和冗长的生物测试。另外，有效消除对实际合成许多化合物的需求。
IV．组合物
一旦通过建模技术构建，由本文所述任意方法鉴定的所建议新型测试分子，或显示其鉴定在这些方法中具有新用途的已知分子可以进一步测试生物活性和相容性。这类试验和其他最终组合物组分一起使用标准技术进行，如样品的体外试验。本文所用的合适试验包括但不限于下文实施例中所示的试验。可以使用其他试验模式并且试验模式的选择不对方法构成限制。
例如，在本发明的某些实施方式中，显示提供甜味或增强甜味的测试分子是磺酰脲(SU)化合物或衍生物或具有相同三维形状的对结合SUR1受体必需的肽或蛋白。例如，磺酰脲化合物或衍生物已知在局部作用或在肠内降解或重吸收，其提供了一类有用的测试分子。或者，也预期治疗糖尿病或心脏疾病活性有限的SU成为本发明组合物的有用测试分子。能够结合其他通道或受体的相似SU衍生物可能同样有用。
在其他实施方式中，显示提供甜味或增强甜味的测试分子是GLUT已知激活剂的衍生物。所述已知化合物是氧化磷酸化的抑制剂，如特定氰化物和叠氮化物样化合物(Shetty等，1993JBiolChem，268(23)：17225-17232)；或TNFα、佛波酯、冈田酸(okadaicacid)和8-溴-cAMP(Stephens等，1992JBiolChem，267(12)：8336-41)；HIF-1和葡萄糖。
在另一个实施方式中，显示提供甜味或增强甜味的测试分子是SGLT-1已知激活剂的衍生物，如异丙基肾上腺素或间羟叔丁肾上腺素(terbutaline)(Aschenbach等，2002，J．Nutrition，132：1254-57)、脂多糖或葡萄糖。
本文所述的化合物以及磺酰脲化合物或衍生物通过这些方法鉴定为有用的并且如上述，其可以包括本文所提供结构的互变异构体形式，特征是绘制结构的生物活性。另外，本文所述的化合物能以衍生自药理学或生理学可接受的酸、碱、碱金属和碱土金属的盐形式使用。药理学上可接受的盐可从有机和无机酸形成，所述有机和无机酸包括例如乙酸、丙酸、乳酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、丙二酸、扁桃酸、苹果酸、邻苯二甲酸、盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸、硫酸、甲磺酸、萘磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸、樟脑磺酸、和相似的已知可接受的酸。盐也可形成自无机碱，理想地是碱金属盐，包括例如钠、锂、或钾，和形成自有机碱，如铵盐，单、二和三甲基铵，单、二和三乙基铵，单、二和三丙基铵(异或正)，乙基-二甲基铵、苄基二甲基铵、环己基铵、苄基铵、二苄基铵、哌啶鎓、吗啉、吡咯烷鎓、哌嗪鎓、1-甲基哌啶鎓、4-乙基吗啉、1-异丙基吡咯烷鎓、1，4-二甲基哌嗪鎓、1-正丁基哌啶鎓、2-甲基-哌啶鎓、1-乙基-2-甲基哌啶鎓、单、二和三乙醇铵、乙基二乙醇铵、正丁基单乙醇铵、三(羟基甲基)甲基铵、苯基单乙醇铵等。
生理学可接受的碱金属盐和碱土金属盐可包括但不限于，酯和氨基甲酸酯形式的钠、钾、钙和镁盐。
这些盐以及其他本文所述的化合物能够以酯、氨基甲酸酯和其他常规“前药”形式存在，其以该形式给药时转化为体内活性部分。在一个实施方式中，前药是酯。参见，例如Testa和J．Caldwell，“ProdrugsRevisited：The“AdHoc”ApproachasaComplementtoLigandDesign(前药重温：作为配体设计补充的“特殊”方法)”，MedicinalResearchReviews，16(3)：233-241，约翰威利父子公司(JohnWiley&Sons)编(1996)。
如本文所述，文中所述的化合物和／或其盐、前药或互变异构体如本文所述在治疗或预防目的的方案中递送。
本文所述的化合物对本领域技术人员而言易从市售可得的原料或用文献方法制备的原料制备。
上述分子／化合物包括本文所提供结构的互变异构体形式，特征为绘制结构的生物活性。另外，该化合物还可以衍生自药理学或生理学可接受的酸、碱、碱金属和碱土金属的盐形式使用。
本文所述的组合物可以根据其用途配制成纯净物或和一种或多种赋形剂一起配制用于给药。本领域技术人员能够容易确定向该组合物中添加合适的额外成分。不仅组合物可以是固体或液体，而且可包含额外固体和／或液体载体。载体可以是干燥或液体形式并且必须摄取安全和／或药理学上可接受。
在一个实施方式中，通过这些方法鉴定的测试分子自身作为甜味剂是有用的。或者，这些测试分子可能增强其他已知天然或人工甜味剂的甜味，使得这些甜味剂对于人类消费者更加具有吸引力。其他可添加测试分子的组合物包括需要增添甜味的食物、食物添加剂、饮料、和其他产品，如口服给药的药物产品。本发明的化合物预期可用于现在使用天然或人工甜味剂的任意组合物(例如甜味剂、食物添加剂、饮料、或药物产品)。通过上述方法鉴定的这些组合物(新的或已知分子或化合物)可用于通过使哺乳动物味觉细胞体内接触上述组合物而在口腔内提供或调节甜味的任意方法。
以下实施例仅仅是说明性的，并不意在限制本发明。
V．实施例
我们检测了T1r非依赖性甜味的本质并且观察到味觉细胞中存在除了T1r以外的多种糖转运体和糖感应分子。我们想要确定味觉细胞是否表达葡萄糖转运体和代谢传感器，其在其他组织中作为糖传感器。通过RT-PCR、qPCR、原位杂交和免疫组织化学，我们确定味觉细胞确实表达数种葡萄糖转运体(GLUT2、GLUT4、GLUT8和GLUT9)、钠-葡萄糖共转运体(SGLT1)、两种KATP代谢传感器(SUR1和Kir6．1)组分和胰岛素受体，其在味觉细胞中选择性表达。与在甜味中的作用一致，发现GLUT4、SGLT1和SUR1在T1r3-阳性味觉细胞中优先、选择性或专一表达。
电生理记录确定几乎20％的小鼠真菌状味觉细胞总外向电流由磺酰脲可抑制的KATP通道组成。因为绝大多数表达T1r3的味觉细胞也表达SUR1，反之亦然，发明者设想KATP通道构成味觉细胞的T1r3亚基中大部分的K+通道。味觉细胞表达的葡萄糖传感器和KATP因而用作味觉细胞甜反应亚组中糖的T1r非依赖性甜味调节剂。
实施例1：材料和方法
A．试剂
合成的寡核苷酸购自Genelink(纽约州霍桑市)。质粒和DNA片段纯化的试剂盒来自凯杰公司(Qiagen)(加利福尼亚州巴伦西亚)。限制性内切酶来自新英格兰生物实验室公司(NewEnglandBiolabs)(马萨诸塞州贝弗利)。分散酶和胶原酶A来自罗氏公司(Roche)(印第安纳州印第安纳波利斯)。抗SNAP-25抗体由PaulBreslin博士赠予；抗SGLT1抗体由SorayaShirazi-Beechey博士赠予。
B．野生型和转基因小鼠
所有的实验在NIH实验动物管理和使用指南下实施，并且得到莫奈尔或犹他州立大学实验动物照料和使用委员会的批准(InstitutionalAnimalCareandUseCommitteeofMonellorofUtahStateUniversity)。用于本研究的所有小鼠是C57BL／6J背景。如前所述生成在T1r3(T1r3-GFP)和TrpM5(TrpM5-GFP)启动子下表达GFP的转基因小鼠(ClappTR等．，2006)。
C．总RNA的分离和逆转录
两只成年(2-10月龄)C57BL／6小鼠通过颈脱位法处死并且切下舌头，置于含有2mMEGTA的PBS溶液中，并且小心剥去含有CV乳突的上皮以尽量减少下面肌肉组织的污染。不含味蕾的非味觉舌上皮用相似的方式从舌的腹侧面分离。总RNA用来自英杰公司(Invitrogen)(目录号12183018A)的Pure-LinkRNA小型试剂盒按照制造商的说明分离。在RNA分离中，受污染的基因组DNA在柱中使用Pure-LinkDNA酶(目录号12185-010)消化。RNA浓度用NanoDrop设备(ND-1000，赛默飞世尔科技公司(ThermoScientific))测量。约500ng的总RNA用来自英杰公司(目录号11752-050)用于qRT-PCR的SuperScriptIII第一链合成SuperMix进行逆转录。
D．RT-PCR和qPCR
每个研究基因的表达用来自英杰公司(目录号10572014)的PCRSuperMix进行PCR验证。引物使用Primer3设计(http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／tools／primer-blast／)。所有引物对选择成每个引物来自不同的外显子。用于各基因的引物在表1中提供。
表1：RT-PCR引物对
使用逆转录酶(RT)-PCR与GAPDH引物来确认成功的mRNA分离和RT反应。使用有味蛋白引物的RT-PCR来确认味觉和非味觉RNA的特异性。来自组织的cDNA被用作阳性对照，其中所调查的基因已知得到表达。PCR产物在1．5％琼脂糖胶上分离并且用溴化乙锭染色在UV照射下观察。
每个基因的表达用TaqMan基因表达试验(应用生物***公司(AppliedBiosystems))通过qPCR定量，使用FAM染料作为报告，小沟结合部分在5’末端，非荧光淬灭剂染料在3’末端，并且ROX作为参比荧光标准。TaqmanFAST定制平板和GAPDH一起用作内部对照并且18srRNA作为生产控制。每个基因的Taqman探针和引物组合按照应用生物***公司网页(www．appliedbiosystems.com)选择并且在表2中提供。
表2：TaqMan探针
基因名称 Taqman探针序号
GUSTDUCIN Gnat3-Mm01165313_m1
GAPDH Gapdh-Mm99999915_g1
GLUT4 Slc2a4-Mm01245502_m1
GLUT8 Slc2a8-Mm00444634_m1
GLUT9 Slc2a9-Mm01211147_m1
SGLT1 Slc5a1-Mm01218040_m1
SUR1 Abcc8-Mm00803450_m1
SUR2 Abcc9-Mm00441638_m1
KIR6．1 Kc nj8-Mm00434620_m1
KIR6．2 Kcnj11-Mm00440050_s1
INSR Insr-Mm01211875_m1
T1R3 Tas1r3-Mm00473459_g1
PKD2L1 Pkd211-Mm00619572_m1
CV或NT样品的预混液用2XTaqMan快速通用预混试剂(应用生物***公司，部件号：4444557)、不含核酸酶的水和cDNA(0．8μl／反应)制备。在运行StepOne2．1软件的StepOnePlus机器中进行10μ1反应。每个基因通过在每次运行中重复三次反应定量，并且来自两种小鼠的CV和NT样品重复运行三次。使用MSEXCEL进行数据分析。就CV和NT组织对每个基因的log10平均δCt(GAPDH和每个基因Ct值的差异)绘图。
E．RNA探针
用于GLUT2(Slc2a2，克隆序列BC034675．1)、GLUT4(Slc2a4，克隆序列BC014282．1)、GLUT9(Slc2a9，克隆序列BC006076)和SGLT1(Slc5a1，克隆序列BC003845)的市售可得小鼠哺乳动物基因集合验证的全长cDNA购自开放生物***公司(OpenBiosystems)(阿拉巴马州亨茨维尔)；SUR1(Abcc8，克隆序列BC141411．1)购自伊美基公司(imaGenes)(德国柏林)。各母液生长于液体培养基和用加凯杰公司质粒小抽试剂盒(利福尼亚州巴伦西亚)纯化的质粒DNA。来自开放生物***公司的构建体在pCMV-SPORT6载体中得到并且来自伊美基公司的pYX-Asc载体。上述克隆得到的质粒DNA用Quiagen质粒中提试剂盒纯化并且通过染料终止剂方法在宾夕法尼亚大学DNA测序机构用ABI96-毛细管3730XL测序仪测序。对于反义探针，克隆的DNA用SalI消化并且通过T7或T3RNA聚合酶转录，或对于正义探针，克隆的DNA用NotI消化并且通过Sp6RNA聚合酶转录。用DIGRNA标记试剂盒(印第安纳州印第安纳波利斯的罗氏公司)产生探针并且用ProbeQuantG-50微柱(新泽西州皮斯卡特维的阿莫仙生物科学公司(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)纯化。浓度和经标记RNA探针的A260／A280光密度用NanoDrop读数仪(ND-1000，赛默飞世尔科技公司)检测。
F．组织制备
成年雄性C57BL／6、转基因T1r3-GFP、和转基因TrpM5-GFP小鼠(2-10月龄)通过颈脱位法处死，然后胰腺、骨骼肌、小肠和含有轮廓、叶状和真菌状乳突的舌部分迅速移除并且在冰冷的PBS中简单冲洗。对于原位杂交，组织在Tissue-TekO．C．T．封片剂(加利福尼亚州托兰斯的樱花公司(Sakura))中用100％乙醇干冰浴新鲜冷冻，然后在1小时内切片。对于免疫组织化学，组织在4％多聚甲醛／1xPBS中4℃过夜固定1小时并且在20％蔗糖／1xPBS中4℃冷冻保护过夜，然后O．C．T．中包埋。用低温恒温器CM3050S(德国韦茨拉尔的莱卡微***公司(LeicaMicrosystems))制备8至12微米厚的切片并且在预先涂覆的显微切片(正电荷防脱载玻片(Superfrostplus)，宾西法尼亚州匹兹堡的飞世尔科技公司(FisherScientific))上使用。切片在40℃下干燥20分钟并且立即用于原位杂交或在-80℃保存，以用于免疫组织化学。
G．原位杂交
新鲜切片在4％多聚甲醛／1xPBS中固定10分钟，在含有10μg／ml蛋白酶K(德国宝灵曼公司(BoehringerMannheim，Germany))的1MTris-HCl(pH8．0)／0．5MEDTA中37℃孵育10分钟来透化，固定后在4％多聚甲醛／1xPBS中持续10分钟，然后乙酰化10分钟。所有的步骤之后是三次5分钟的经DEPC处理1xPBS洗涤。载玻片然后在含有50％去离子甲酰胺、5x盐水／柠檬酸钠(SSC)溶液、5x登哈特溶液(Denhardts)、500μg／ml鲑鱼精DNA、250μl／ml酵母tRNA、2．5MEDTA的DEPC处理水的混合物中室温预杂交1小时。对于杂交，等份混合物在85℃加热10分钟使酵母tRNA变性并且加入DIG-标记的RNA探针以产生需要的浓度。下列浓度用于每个RNA探针：0．5μg／mlGLUT2、0．25μg／mlGLUT4、0．25μg／mlGLUT9、0．5μg／mlSGLT1和0．3μg／mlSUR1。RNA探针混合物在85℃加热3分钟以使探针变性，然后立即在冰上冷冻。在杂交期间，用Hybrislip塑料盖玻片(英杰公司)防止切片变干并且载玻片置于潮湿培养箱中，在潮湿的大自封袋中密封并且65℃过夜孵育。塑料盖玻片通过在预热至65℃的5xSSC中浸泡来移出。载玻片在0．2xSSC中洗涤三次，每次30分钟，并且在含有0．1X曲通(Triton)X-100的PBS(PBST)中洗涤一次，持续10分钟。酪胺信号放大加DNP-AP试剂盒(马萨诸塞州沃森姆的帕金埃尔默公司(Perkin-Elmer，BostonMA))按照制造商的操作方案使用以从GLUT2、GLUT4、GLUT9和SUR1的RNA探针放大信号。在舌部和肠组织中，SGLT1探针杂交的载玻片在没有扩增步骤的情况下展现出显著的mRNA标记。这些载玻片在室温下用10％热灭活的正常山羊血清封闭1小时，然后在封闭液中用抗DIG-碱性磷酸酶(1：1000，柏林格尔(Boehringer))室温孵育3小时。碱金属磷酸盐标记通过在室温下与含有左旋咪唑(密苏里州圣路易斯的西格玛公司(Sigma，StLouisMO))的NBT+BICP(硝基蓝四唑+5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸)混合物(罗氏公司)避光过夜孵育检测。在PBST中洗涤载玻片，在水中冲洗，用增加的ETOH系列脱水，用Histoclear(佐治亚州亚特兰大市的国家诊断公司(NationalDiagnostics，AtlantaGA))进行清除，并且使用Permount(飞世尔科技公司(Fisher))盖上盖玻片。反义和正义RNA探针在等同浓度下使用并且在相同的实验中平行运行以确保相等的条件。在原位杂交中的每个实验中，对味觉组织完成有T1r3或味蛋白反义探针的阳性对照以保证杂交操作适当。另外，对阳性对照组织进行原位杂交以确定RNA探针的量和特异性。检测反义RNA探针在已知表达感兴趣基因的组织中的阳性表达，而正义RNA探针用作对照。反义探针显示胰腺中的GLUT2、GLUT9和SUR1适度表达，而正义探针显示胰腺中的GLUT2、GLUT9和SUR1较低非特异性杂交。反义探针显示骨骼肌中的GLUT4适度表达，而正义探针显示骨骼肌中的GLUT4较低非特异性杂交。反义探针显示肠中的SGLT1适度表达，而正义探针显示肠中的SGLT1较低非特异性杂交。数据未显示。
H．免疫组化
使用标准免疫组织化学技术。简要地，冷冻切片用PBS再水化。在室温下用封闭缓冲液(含3％牛血清白蛋白、0．3％曲通X-100、2％山羊或驴血清的1xPBS)阻断非特异性结合1-2小时。切片用针对以下的一抗在潮湿培养箱中4℃孵育过夜：兔抗GLUT2(1：150，圣克鲁兹的圣克鲁兹生物技术公司(SantaCruzBiotechnology)，sc-9117)；兔抗GLUT4(1：150，马萨诸塞州剑桥的Abcam，ab33780)；兔抗Kir6．1(1：100，Abcam，ab80972)；兔抗SGLT1(1：150，Abcam，ab14686)；兔抗SUR1(1：150，圣克鲁兹生物技术公司，sc-25683)；山羊抗T1R3(1：250，诺伟斯生物公司(NovusBiological)，NBP1-46466)；山羊抗GLAST1(1：250，圣克鲁兹生物技术公司，sc-7757)；或小鼠抗SNAP-25(1：250，马萨诸塞州比莱瑞卡的开米康公司(Chemicon)，MAB331)。在三次15分钟的PBST洗涤之后，切片用溶于封闭缓冲液的下列荧光二抗(1：500)之一室温孵育1小时：Alexa448驴抗兔(俄勒冈州尤金市的分子探针公司(MolecularProbes))用于兔一抗的免疫荧光；Alexa594驴抗兔(分子探针公司)用于兔一抗的免疫荧光，有来自T1R3-GFP小鼠的切片。所有双重免疫荧光标记用下列二抗组合完成：Alexa488驴抗山羊、Alexa488驴抗小鼠、Alexa594驴抗山羊、或Alexa594驴抗兔(1：500，分子探针公司)和DAPI(1：1000，分子探针公司)一起标记细胞核。阴性对照包括省略一抗。葡萄糖转运体抗体也在阳性对照组织上测试。在使用含有切片的味蕾之前，测试所有抗体在已知表达感兴趣基因的组织中的阳性表达。抗体显示胰腺中适度表达：GLUT2、SUR1；骨骼肌中适度表达：GLUT4；和小肠中适度表达：SGLT1(数据未显示)。一抗的省略证明这些组织中二抗的较低非特异性背景(数据未显示)。
I．成像
亮场图像用配有尼康Eclipse80i显微镜的尼康DXM1200C数码照相机观察并且用尼康NIS-ElementF3．00软件或用配有尼康SAMicrophot显微镜的SPOT数码照相机(诊断仪器公司(DiagnosticInstruments))捕捉和用Image-ProPlus图像分析软件(美国马里兰州银泉市的MediaCybernetics公司(MediaCyberneticsInc．))进行最少处理。就用正义和反义探针的原位杂交而言采集参数保持恒定。荧光图像使用UV、Ar、GeNe和HeNe激光以及合适激发光谱通过LeicaTCSSP2光谱共聚焦显微镜(德国曼海姆的莱卡微***公司)捕捉。LeicaScanware软件用于获得以0．25-0．35μm步长捕捉的z-系列堆栈。图像在512x512像素模式下扫描；扫描线两次平均并且框架扫描3次。采集参数(例如，增益、偏差、和PMT设置)在抗体实验中保持恒定并且减去抗体对照。数码图像用PhotoshopCS(加利福尼亚州圣何塞的奥多比***公司(AdobeSystems，Inc．))裁减和排列。相关的反义和正义图像在相同的亮度和反差下调节。图片中的荧光图像调节亮度和反差以使背景标准化。
J．细胞计数
进行定量测量以测定共表达GLUT4或SUR1的单一或双重标记II型(T1r3)和III型(SNAP-25)味觉细胞百分比。含有味蕾的切片在40倍物镜下于Lecia共聚焦显微镜中扫描并且放大产生100-150μm2的区域，其中单个味觉细胞能够容易区分；仅计数能够观察到完整细胞体的味觉细胞。对于每种味觉细胞，计数完整CV乳突的一部分和来自叶状乳突的三分之二部分。
K．SGLT-1的糖摄入试验
味觉细胞与测试化合物在有低或高葡萄糖的细胞培养基中孵育24小时。糖摄入使用C14-标记的糖探针α-MG(美国新泽西州皮斯卡特维的阿莫仙生物科学公司)通过放射性试验测量，其对于SGLT-1是选择性的并且不会通过其他葡萄糖转运体转运(Kimmich&Randles，Am．J．Physiol．1981年11月；241(5)：C227-32；Turner等．，J．Biol．Chem．1996年3月29；271(13)：7738-44)。α-MG摄入在15分钟-至少2小时是线性的。初步研究已证实通过SGLT-1摄入α-MG糖探针是选择性的，使用放射性标记探针存在情况下加入的0．5mM根皮苷(西格玛)。
细胞用含有25mMD-甘露醇的无葡萄糖汉克斯平衡盐溶液(甘露醇-HBSS)温和洗涤，然后在37℃、5％CO2和96％湿度下与含有2μCi/ml(6．65μM)14C标记α-MG的0．2ml甘露醇-HBSS溶液孵育30分钟。在4℃下，细胞用HBSS洗涤并且用0．1MNaOH溶解。裂解物混合到液体闪烁混合物(liquidscintillationcocktail)中。糖摄入的水平用β-闪烁计数器测量。数值表示为nmol／cm2表面积。
L.电生理学
来自野生型C57BL／6小鼠的真菌状乳突的味蕾用完善的过程分离(参见例如BaqueroAF，GilbertsonTA2010AmJPhysioldoi：10．1152／ajpcell．00318．2010)。在填充有葡萄糖酸钾(K-gluconate)，140mM；CaCl2，1mM；MgCl2，2mM；HEPES，10mM；EGTA，11mM；pH为7．2的标准细胞内溶液时，味蕾中的单个细胞通过常规全细胞膜片钳条件记录，硼硅酸盐膜片钳拉制到4-10MΩ电阻。含有葡萄糖酸钠，140mM；KCl，5mM；MgCl2，1mM；HEPES，10mM；葡萄糖，10mM；丙酮酸钠，10mM，和河豚毒素，0．5mM的标称无Ca2+胞外溶液用于在0．4s电压阶跃中以10mV增量从-80至+40mV分离外向K+电流。将格列本脲(0．1-100μM，西格玛)加入该溶液中并且以流速约4ml／min应用的浴允许小于5秒的溶液变化。串联电阻和电容在记录之前优化补偿并且没有记录漏电扣除(norecordswereleaksubtracted)。记录电流数据并且用pClamp软件递送指令电位(v．8-10)。该软件与AxoPatch200B放大器和Digidata1322A数据采集***(加利福尼亚州萨尼维尔的分子仪器公司(MolecularDevices，))接口。
M．Ca-成像确定的味觉细胞对不同味觉刺激的反应
使用的味觉细胞如实施例1所述分离并在1类大鼠尾部胶原包被的盖玻片上培养几个小时至1周或2个月。参见，例如BaqueroAF，GilbertsonTA2010AmJPhysioldoi：10．1152／ajpcell．00318．2010。
Ca-成像如下实施。盖玻片用溶于改良MHNK林格氏溶液(MHNKringer'ssolution)(80mMNaCl、5mMKCl、1mMMgCl2、1mMCaCl2、1mM丙酮酸钠，和20mMHepes-Na、pH7．2，渗透压用5MNaCl调节至300-310)的钙敏感染料孵育15-30分钟，补充有1mMFura-2AM(俄勒冈州尤金的分子探针有限公司(MolecularProbes，Inc．，Eugene，Oreg))和20mg／mlPLURONICF127(分子探针有限公司)。钙敏感染料fura-2AM被切割成fura-2，其是荧光的并且可以被检测。
在孵育之后，盖玻片置于记录室中并且用改良MHNK林格氏溶液连续浴处理，其用作灌流。
通过切换灌流到刺激溶液而将刺激(苯酸苄铵酰胺(Denatoniumbenzoate)2mM和0．5mM、乙酰泛舒钾250ppm、谷氨酸单钠(MSG)3mM、环己酰亚胺25μM、甘氨酸125mM、和高钾缓冲液(改良MHNK林格氏溶液，有5mMNaCl、80mMKCl、1mMMgCl2、1mMCaCl2、1mM丙酮酸钠、和20mMHepes-Na、pH7．2，渗透压用5MNaCl调节至300-310)施加到盖玻片，这允许所述室中的电解液在10秒内完全变化。
用标准成像技术实施钙成像记录，描述于RestrepoD．，M．Zviman和N．E．Rawson，“Themeasurementofintracellularcalciuminchemosensorycells(在化学感觉细胞中测量胞内钙)”，收录于：MethodsinChemosensoryResearch(《化学感受研究方法》)，A．Spielman和J．Brand编．CRC出版社(CRCPress)，1995。使用偶联显微镜的LSRSPECTRAMASTER单色仪提供照明。细胞中来自fura-2的发射光在200倍放大下于510nm过滤并且用冷却型CCD相机记录(Olympix，马里兰州贝塞斯达的帕金埃尔默生命科学公司(PerkinElmerLifeSciences))。使用宽带滤光片时，激发波长是340-380nm并且发射波长是510nm。图像使用Merlin影像工作站(帕金埃尔默生命科学公司)来数字化，所述工作站控制照明器、相机和采集，并且实施图像比值和展现伪彩色图像。在引入记录设置后，细胞存活超过2天并且能一次性在2小时内连续成像，其没有染料漂白的可视效果。
刺激在改良MHNK林格氏溶液中稀释并且通过重力流灌流设备应用约10-60秒，其取决于所述刺激。如所选至少一种细胞的Fura-2AM的阳性信号所示，细胞能够被所有测试的刺激所刺激。一般测试几种细胞。
实施例2：葡萄糖转运体和代谢传感器在味觉细胞中表达
为了确定在肠和／或其他组织中已知存在的葡萄糖转运体或在胰腺中涉葡萄糖感受的代谢传感器是否也在味觉细胞中存在，我们首先检测了它们在味觉组织和非味觉组织中的mRNA表达。cDNA从小鼠轮廓(CV)乳突和没有味觉细胞的舌上皮细胞(“非味觉”(NT)阴性对照)分离的味蕾中制备，然后用对应以下的cDNA特异性引物进行聚合酶链式反应(PCR)：GLUT2、GLUT4、GLUT8、GLUT9B、SGLT1、SUR1、SUR2A、SUR2B、Kir6．1、Kir6．2、和胰岛素受体。通过PCR，我们发现GLUT8、GLUT9B、SGLT1、SUR1、SUR2A、Kir6．1和胰岛素受体在来自味觉组织的cDNA中的表达水平高于非味觉组织(参见图1A和1B)。PCR显示GLUT2、GLUT4、SUR2B和Kir6．2的mRNA在味觉组织中相比非味觉组织没有以更高量表达(图1A和1B)。
通过实时PCR定量评价证实在味觉组织cDNA中GLUT8、GLUT9、SGLT1、SUR1、Kir6．1和胰岛素受体表达提高(图1C和1D)。然而，定量RT-PCR没有发现GLUT4和SUR2在味觉组织cDNA中有更高的表达(图1C和1D)。对于这些在味觉细胞中更高表达的基因，味觉组织中mRNA表达绝对水平最高的是GLUT8、SGLT1和胰岛素受体。然而，最大的表达差异在SUR1和胰岛素受体中发现：味觉组织中的mRNA表达各约10倍高于非味觉组织。
PCR实验的cDNA模版来源于含有味觉细胞和周围上皮和结缔细胞的CV味觉组织、或不含味觉细胞的对照非味觉组织。为了确定这些基因的mRNA是否在味觉细胞中自身选择性表达，我们用反义和正义(对照)探针进行原位杂交。对含有来自小鼠轮廓(CV)和叶状乳突的组织的味蕾的原位杂交用地高辛标记的RNA探针完成。对含有味蕾切片的原位杂交表明GLUT2、GLUT4、GLUT9、SGLT1和SUR1的mRNA在小鼠CV和叶状乳突的味觉细胞中选择性表达。味觉细胞与味觉细胞内部和周围的正义探针对照杂交指示非特异性背景一般低于相应的反义探针。数据未显示。
在对照实验中，这些探针各用组织切片验证，所述组织切片已知表达这些mRNA：胰腺中的GLUT2、GLUT9和SUR1；骨骼肌中的GLUT4；小肠中的SGLT1(数据未显示)。然后，对含有小鼠轮廓(CV)、叶状和真菌状味觉乳突部分的味蕾使用针对糖转运体(GLUT2、GLUT4和SGLT1)或KATP亚基(SUR1、Kir6．1)的特异性多克隆抗体进行免疫荧光共聚焦显微分析。免疫荧光显示在CV细胞中观察到GLUT2、GLUT4、SLGT1、SUR1、和Kir6．1的表达(数据未显示)。免疫荧光显示在叶状细胞中观察到GLUT2、GLUT4、SLGT1、SUR1，和Kir6．1的表达(数据未显示)。免疫荧光显示在真菌状细胞中观察到GLUT2、GLUT4、SLGT1、SUR1、和Kir6．1的表达(数据未显示)。
在小鼠CV、叶状和真菌状乳突的味觉细胞中观察到GLUT2、GLUT4、SGLT1、SUR1和Kir6．1的免疫反应性(数据未显示)。有趣的是，许多SUR1免疫荧光看来聚集在测试细胞的细胞核内(数据未显示)。对含有来自小鼠轮廓(CV)和叶状味觉乳突部分的味蕾的间接免疫荧光共聚焦显微分析用核染料DAPI(4’，6-二眯基-2-苯基吲哚)(图7A，7D，7G)或抗KATP亚基SUR1的抗体实施。SUR1的核染色图由DAPI染色确认(数据未显示)。更高倍数的放大显示SUR1在核质中存在(数据未显示)。验证所有一抗检测组织中合适免疫反应性的能力，所述组织已知表达感兴趣蛋白：胰腺中的GLUT2和SUR1；骨骼肌中的GLUT4；小肠中的SGLT1(数据未显示)。另外，二抗显示在减去有胰腺和小肠的主要对照中没有非特异性免疫反应性(数据未显示)。
实施例3：GLUT4、SGLT1和SUR1在T1r3-阳性味觉细胞中选择性表达。
通过多种独立技术得到的上述数据表明葡萄糖转运体和KATP亚基在味觉细胞中存在。如果这些葡萄糖转运体或细胞内葡萄糖代谢的感受器在感应葡萄糖的味觉细胞中发挥功能，它们最可能在已知检测葡萄糖和其他甜味化合物的味觉细胞中发现，例如II型味觉细胞的T1r2+T1r3阳性亚基。为了检测这种可能性，我们用抗转运体或KATP亚基的抗体双染色味觉细胞以及观察来自T1r3-GFP转基因小鼠的T1r3表达味觉细胞中绿色荧光蛋白的固有荧光(ClappTR,等，2006)。通过这种方式，发现GLUT4、SGLT1和SUR1在T1r3-阳性味觉细胞中优先表达。双染色使用作为来自T1r3启动子的转基因而表达的绿色荧光蛋白(GFP)的固有荧光。重叠图像指示T1r3与GLUT4、SGLT1和SUR1频繁共表达(数据未显示)。如上所述的SUR1核染色再次在来自叶状和轮廓乳突的味觉细胞中观察到(数据未显示)。
味觉细胞就GLUT4和T1r3、SUR1和T1r3、或SUR1和SNAP-25进行双染色，然后计数轮廓(A)和叶状(B)味觉乳突中的单个或双重标记细胞。结果示于下表3。分子是同时表达基因1和基因2的味觉细胞的数量。分母是表达基因1的味觉细胞的数量。同时表达基因1和基因2的味觉细胞占表达基因1的细胞的百分比在括号内显示。ND，未测定。共表达GLUT4或SUR1与T1r3的味觉细胞的定量证明：(1)90-92％的GLUT-4表达味觉细胞表达T1r3，而13-20％的T1r3细胞不表达GLUT4；和(2)80-85％的SUR1表达味觉细胞表达T1r3而11-24％的T1r3细胞不表达SUR1。共表达SUR1和Snap-25的CV味觉细胞的定量证实17％的SUR1表达味觉细胞表达Snap-25。总之，大多数SUR1表达味觉细胞是II型T1r3表达细胞，其余可能是III类Snap-25表达III型细胞。
表3在小鼠味觉细胞中GLUT4和SUR1与T1R3或SNAP25的共表达
用I型(GLAST)或III型(Snap-25)味觉细胞标记的GLUT4表达味觉细胞的双染色显示GLUT4在任一味觉细胞亚型中都不存在(数据未显示)。对含有来自小鼠轮廓(CV)味觉乳突部分的味蕾的间接免疫荧光共聚焦显微分析用抗GLUT4和SUR1的抗体进行(数据未显示)。完成双染色，用抗体标记I型味觉细胞(抗GLAST)、III型味觉细胞(抗SNAP-25)或用GFP标记II型味觉细胞(TrpM5-GFP)。重叠图像显示CV味觉细胞中没有GLUT4和GLAST或SNAP-25的共表达，或SUR1和GLAST的共表达以及稀少的SUR1和SNAP-25的共表达(数据未显示)。相反，CV味觉细胞中的SUR1主要在表达TrpM5的II型味觉细胞(数据未显示)中。表达SUR1的细胞用I型、II型和III型细胞标记双染色显示SUR1主要在II型味觉细胞(TrpM5)中存在(数据未显示)，但不在I型(GLAST)味觉细胞中存在(数据未显示)，并且少量的III型(Snap-25)细胞表达SUR1(数据未显示)。初步的定量显示(1)大多数表达T1r3的II型味觉细胞表达GLUT4和SUR1，(2)所有表达GLUT4的味觉细胞表达T1r3，和(3)大多数表达SUR1的味觉细胞表达T1r3。
实施例4：小鼠味觉细胞具有功能性KATP通道
来自上述电生理试验的数据显示KATP亚基Kir6．1和SUR1在味觉细胞中存在，而SUR1大多数在T1r3-表达的味觉细胞中发现。如果功能性KATP通道在小鼠味觉细胞中存在，我们会预期它们受到磺脲类化合物如结合SUR1的格列本脲抑制。事实上，格列本脲确实在小鼠真菌状味觉细胞中抑制外向(K+)电流(图2A和2B)。
从C57B1／6小鼠的真菌状乳突中分离的67个味觉细胞中18个(26．9％)显示出受到20μM格列本脲的显著、可逆抑制。平均来说(n=18)，20μM格列本脲抑制18．70±4．32％的真菌状味觉细胞总体外向电流，例如KATP通道包括显著百分比的总味觉K+通道。考虑到T1r3味觉细胞中SUR1的优势表达，在表达T1r3的味觉细胞中可能发现总KATP通道中更高百分比的格列本脲可抑制K+通道。
不希望受理论限制，发明人建立下列功能的理论：KATP通道在含有T1r3的味觉细胞中发挥功能。胰腺中的KATP通道是自发活性的，随着β细胞葡萄糖上升并且代谢，细胞内ATP与ADP之比也上升，引起KATP通道关闭，细胞去极化并且释放胰岛素。我们关于格列本脲可抑制K+电流的记录用未特异鉴定为T1r3阳性或非性的一般真菌状味觉细胞库进行。考虑到绝大多数表达SUR1的味觉细胞也表达T1r3(反之亦然)，可能磺酰脲抑制的KATP电导贡献了超过20％的T1r3阳性味觉细胞总外向电流。含有T1r3的味觉细胞中的KATP通道能够提供调节这些细胞活性的稳健方式，根据用于舌部的可代谢糖溶液的局部含量或通过血糖或循环激素传递到味觉细胞的一般生物体代谢状态。如果T1r3味觉细胞的KATP通道位于顶端，则通过磺酰脲或升高的ATP抑制该K+电流会使这些细胞去极化。通过T1r2+T1r3作用于启动第二信使信号级联的无热量甜味剂组合可能会提供与任一甜味剂单独所实现相比增强的甜味感受，所述级联去极化甜味觉细胞和热量甜味剂如葡萄糖，其在代谢时促进T1r3味觉细胞KATP通道的关闭。
相反地，在低葡萄糖／低代谢条件下，T1r3细胞中KATP通道的紧张活性会使这些味觉细胞超极化，使甜味剂激活T1r2+T1r3不太可能去极化味觉细胞，因而与甜味感受相反。可以想象，T1r3细胞KATP通道的调节可能是按照代谢需要改变味觉细胞对甜味化合物敏感性的生理方式。在T1r3-阳性味觉细胞中，GLUT和SGLT1转运体与KATP通道共表达会造成通过转运体摄入糖，当其代谢时会增加味觉细胞的ATP水平，激活KATP并且超极化这些味觉细胞。此外，味觉细胞的KATP可能根据味觉细胞代谢变化调节T1r3味觉细胞释放的激素和／或神经递质。如胰腺β细胞KATP的激活进促胰岛素的释放，味觉细胞KATP的激活促进味觉细胞释放激素。
在味觉细胞中SUR1的核质定位是明显的并且说明其通过核定位信号或通过与另一种含有该序列的蛋白结合靶向。之前，SUR1和功能性KATP通道在胰腺β细胞的核被膜中观察到(Quesada,等．2002)。在T1r3味觉细胞中的该核定位可能用于隔离磺酰脲受体和质膜，因而减少处于K+电流静息期的味觉细胞的KATP组分或使其对于格列本脲和其他磺酰脲不敏感。另一种可能性是在核被膜或核质中的KATP通道影响味觉细胞T1r3自身的转录或其他味觉信号成分。对于转录的这种影响会改变对于甜味的长时间的反应，并且使味觉受体的表达与膳食成分相关。
本说明书中引用的所有出版物和美国临时申请系列号61／435,904通过引用纳入本文。虽然本发明参考具体的实施方式进行了描述，但是显然可以在不偏离本发明的精神的前提下对本发明进行各种修改。这些修改在所附权利要求书的范围内。
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Claims (15)

1.一种鉴定在口腔内提供或增强甜味的分子的方法，所述方法包括：
(a)
(i)将测试分子与体外培养条件下通过ATP-门控K+通道(KATP)表达磺酰脲受体(SUR)和选自Kir6.1与Kir6.2的内向整流钾通道(Kir)的哺乳动物细胞或细胞系接触；
(ii)在接触的细胞或细胞系中测量KATP通道的电生理或功能活性；其中，与阴性对照细胞或细胞系相比，接触测试分子的细胞或细胞系中KATP的电生理或功能性活性降低或抑制可鉴定提供或增强甜味的测试分子；
(b)
(i)将测试分子与体外培养条件下表达糖转运体的哺乳动物细胞或细胞系接触；和
(ii)测量接触的细胞或细胞系中糖-转运体的表达水平或功能活性；其中，与阴性对照细胞或细胞系相比，接触测试分子的细胞或细胞系中糖-转运体表达增加可鉴定提供或增强甜味的测试分子；或
(c)
(i)将测试分子与体外培养条件下表达磺酰脲受体1(SUR1)蛋白的哺乳动物细胞或细胞系接触；和
(ii)检测在培养中测试分子与SUR1蛋白的结合；其中，与阴性对照细胞或细胞系相比，测试分子与其所接触细胞或细胞系中SUR1出现显著量的结合可鉴定提供或增强甜味的测试分子；或
(d)
(i)将测试分子与体外培养条件下通过ATP-门控K+通道(KATP)表达磺酰脲受体(SUR)和选自Kir6.1与Kir6.2的内向整流钾通道(Kir)的哺乳动物细胞或细胞系接触；和
(ii)测量或检测在所接触细胞或细胞系中SUR1的核定位；其中，在接触的细胞或细胞系中SUR1的核定位相比阴性对照细胞或细胞系中SUR核定位的变化指示提供或调节甜味的测试分子。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述SUR是SUR1。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Kir是KIR6.1。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于,所述细胞或细胞系是口腔味觉细胞或口腔味觉细胞系、异源细胞、转化的细胞或内分泌细胞，或表达味觉信号蛋白的细胞系。
5.如权利要求1(a)所述的方法，其特征在于，所述电生理活性是细胞或细胞系的极化或去极化或者特定离子指示剂或通量的变化。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括一种或多种下述步骤：
(iii)对测试分子进行相反筛选测试以排除测试分子介导的非特异活性或结合；和
(iv)使测试分子接受用于甜味的动物生理反应试验、电生理反应试验、或行为试验或者经分离味觉细胞、经分离味蕾或味切片的钙成像。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阴性对照包括与已知在口腔内不提供或增强甜味的对照分子接触；或不与测试或对照分子接触的相同细胞或细胞系。
8.如权利要求1(b)所述的方法，其特征在于，所述表达水平是糖-转运体mRNA或蛋白的水平。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述功能活性选自：主动转运活性、被动的易化转运活性、葡萄糖的摄入和转运以及钠的摄入或转运。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述糖-转运体选自下组：SGLT1、SGLT3、GLUT2、GLUT4、GLUT8、GLUT9、GLUT1和GLUT3。
11.如权利要求1(c)所述的方法，其特征在于，所述结合使用结合到测试分子的标签通过结合试验检测。
12.一种在口腔内提供或增强甜味的组合物，所述组合物包括如前述权利要求中任一项所述方法鉴定的测试分子。
13.如权利要求12所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括磺酰脲类(SU)化合物或SU衍生物。
14.一种在口腔内提供或调节甜味的方法，所述方法包括
将哺乳动物味觉细胞与权利要求12或13中任一项所述的组合物体内接触。
15.一种如权利要求12或13所述的组合物，其特征在于，所述组合物是甜味剂、食品添加剂、饮料或药物产品。
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