CN103319626A - 一种透明质酸与含异硫氰基的有机分子共价连接的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种透明质酸与含异硫氰基的有机分子共价连接的方法，包括如下步骤：(1):透明质酸与己二酸二酰肼反应，合成透明质酸-己二酸二酰肼衍生物，(2):将透明质酸-己二酸二酰肼衍生物与含异硫氰基的有机分子进行反应，得到透明质酸与含异硫氰基的有机分子共价连接衍生物。本发明方法反应条件温和，步骤简单，成本低廉。本发明方法制得的产物用于检测人血清中透明质酸的含量。
Description
技术领域
本发明属于有机化学合成技术领域，特别涉及一种透明质酸与含异硫氰基的有机分子共价连接的方法，用于使用含异硫氰基的有机分子标记透明质酸分子，该方法得到的产物作为检测人肝脏纤维化试剂盒的标记物。
背景技术
透明质酸广泛存在于人和动物的结缔蛆织、眼球的玻璃体、某些细胞间质、关节滑膜液、粘膜上皮、角膜、恶性肿瘤组织及细菌壁中其存在形式有游离和形成结合蛋白两种。人和动物的许多器官都富含透明质酸，如雄鸡冠、人的脐带、牛、羊眼玻璃体，鲨鱼、猪和婴儿的皮肤，牛和鲸的软骨以及鸡胚等。
透明质酸虽早在六十年代前就已发现，由于缺乏足够敏感特异的测定方法面限制了它的临床应用研究，随着各种测定方法的不断涌现，使透明质酸含量测定达到精确的程度，并清楚地反映出类风湿性关节炎、肝病、某些肿瘤和硬皮病患者样品内透明质酸均明显增高，尤其透明质酸测定在肝硬化诊断上优于所有常规肝功试验，肝硬化患者血清透明质酸较正常人升高10-100倍。国内有人报告在慢性肝病、肝硬化组透明质酸增高幅度大于Ⅲ型前胶原肽和板层素(LamP1，)在慢性活动性肝炎组中透明质酸增高大于Ⅲ型前胶原肽，在迁延性肝炎中则与对照组无差别。由此可见，透明质酸测定是一项极有价值的肝病诊断指标。
透明质酸为一链状聚合物，由（1-β-4)D-葡糖醛酸(1-β-3)N-乙酰基-D-氨基葡糖的双糖单位重复连接组成。
本发明的目的是提供一种将含异硫氰基的有机分子连接到透明质酸分子上的方法，含异硫氰基的有机分子标记的透明质酸可以用来测定人体内透明质酸的含量。
透明质酸分子上含有羧基，可以与己二酸二酰肼的酰肼基进行反应，反应后还可以保留一个酰肼基，这个酰肼基可以与含异硫氰基的有机分子上的异硫氰基反应，相当于将含异硫氰基的有机分子连接到透明质酸分子上。
含异硫氰基的有机分子标记的透明质酸可以用来测定人体内透明质酸的含量，主要原理是：其反应体系是先将透明质酸结合蛋白抗体固定在微孔板上，再加入透明质酸结合蛋白、含异硫氰基的有机分子标记的透明质酸、人血清样本，含异硫氰基的有机分子标记的透明质酸和人血清样本中的透明质酸竞争结合透明质酸结合蛋白，再结合到透明质酸结合蛋白抗体上，复合物固定在微孔板上，测定含异硫氰基的有机分子的荧光计数即可测定人血清中透明质酸的含量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种透明质酸与含异硫氰基的有机分子共价连接的方法，该方法制得的产物用于测定人血清中透明质酸的含量。
本发明采用的技术方案为：
一种透明质酸与含异硫氰基的有机分子共价连接的方法，包括如下步骤：
(1):透明质酸与己二酸二酰肼反应，合成透明质酸-己二酸二酰肼衍生物，
(2):将透明质酸-己二酸二酰肼衍生物与含异硫氰基的有机分子进行反应，得到透明质酸与含异硫氰基的有机分子共价连接衍生物。
进一步，所述步骤(1)为：取透明质酸，溶于双蒸水中，加入10倍透明质酸质量的己二酸二酰肼，搅拌，调节pH值4.0-5.5(用0.1M的HCl调节)，加入5倍透明质酸质量的EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐），调节pH值使之维持在4.0-5.5（用0.1M的HCl调节），反应2小时后，调节pH值至7.0(用1M的NaOH调节)，将反应后产物用双蒸水透析，透析后冷冻干燥，得透明质酸-己二酸二酰肼衍生物。
进一步，所述步骤(2)为：取步骤(1)所得透明质酸-己二酸二酰肼衍生物，溶于双蒸水中，溶解后加入与透明质酸-己二酸二酰肼衍生物等质量的含异硫氰基的有机分子，然后加入双蒸水体积半量的0.01M pH=8.0-10.0碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，避光室温放置36小时，反应结束后，反应后将产物使用琼脂糖凝胶（Sepharose6B）过滤或使用透析袋进行透析除去未反应的含异硫氰基的有机分子，收集终产物（获得的终产物为澄清透明液体）。
进一步，所述含异硫氰基的有机分子为N1-（对-异硫氰基苄基）-二乙三胺-N1，N2，N3，N4–四乙酸铕钠或异硫氰酸荧光素。
本发明还提供一种透明质酸与含异硫氰基的有机分子共价连接衍生物，由权利要求1-4任一项的方法制备得到。
本发明的有益效果：
本发明方法反应条件温和，步骤简单，成本低廉。本发明方法制得的产物用于检测人血清中透明质酸的含量。
附图说明
图1：透明质酸一级结构图。
图2：透明质酸与己二酸二酰肼反应示意图。
图3：透明质酸-己二酸二酰肼衍生物与含异硫氰基的有机分子反应示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但不限定本发明的保护范围。
实施例1
一种使用N1-（对-异硫氰基苄基）-二乙三胺-N1，N2，N3，N4–四乙酸铕钠标记透明质酸分子的方法，包括如下步骤：
（1）透明质酸-己二酸二酰肼衍生物的制备：称取100毫克的透明质酸，溶于50毫升双蒸水中，加入1克己二酸二酰肼，搅拌，用0.1M的HCl调节pH值4.5，加入0.5克的EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐），用0.1M的HCl调节pH值，使之维持在4.5，反应2小时后，用1M的NaOH调节pH值至7.0，将反应后产物用双蒸水透析，透析后冷冻干燥，得透明质酸-己二酸二酰肼衍生物。
（2）透明质酸与N1-（对-异硫氰基苄基）-二乙三胺-N1，N2，N3，N4–四乙酸铕钠共价连接衍生物的制备：称取0.5毫克冷冻干燥后的透明质酸-己二酸二酰肼衍生物，加入250微升双蒸水中，溶解后加入0.5毫克的N1-（对-异硫氰基苄基）-二乙三胺-N1，N2，N3，N4–四乙酸铕钠，再加入125微升的0.01M，pH=9.0的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，避光室温反应36小时，反应后将产物使用琼脂糖凝胶（Sepharose6B）过滤，收集产物。即得：透明质酸与N1-（对-异硫氰基苄基）-二乙三胺-N1，N2，N3，N4–四乙酸铕钠共价连接衍生物，获得的产物为无色透明液体。
应用实施例1
利用N1-（对-异硫氰基苄基）-二乙三胺-N1，N2，N3，N4–四乙酸铕钠标记的透明质酸分子（即实施例1制得的透明质酸与N1-（对-异硫氰基苄基）-二乙三胺-N1，N2，N3，N4–四乙酸铕钠共价连接衍生物）检测人血清中透明质酸的含量：步骤如下：
（1）包被透明质酸结合蛋白抗体：取一定量的透明质酸结合蛋白抗体，溶于0.01MpH=5.6的磷酸盐缓冲液中，浓度5微克/毫升，将溶液加入透明微孔板中，每孔中加入200微升，室温放置48小时后，倒掉孔中溶液，使用0.01M pH=5.6的磷酸盐缓冲液洗板2次，300微升/孔，然后加入含1%蔗糖，2%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液封闭微孔板，室温放置2小时后倒掉封闭液，干燥。
（2）将透明质酸与N1-（对-异硫氰基苄基）-二乙三胺-N1，N2，N3，N4–四乙酸铕钠（N1-（对-异硫氰基苄基）-DTTAEuNa）共价连接衍生物稀释100倍，取100微升，与50微升人血清，50微升透明质酸结合蛋白溶液一同加入按步骤(1)制备的微孔板中，室温震荡反应2小时，反应后倒掉混合液，用缓冲液洗板6次，加入200微升含β-萘甲酰三氟丙酮（β-NTA）的增强液，室温震荡5分钟，使用时间分辨仪测定荧光计数，根据标准曲线可以计算出人血清中透明质酸的含量。
Claims (5)
1.一种透明质酸与含异硫氰基的有机分子共价连接的方法，其特征是：包括如下步骤：
(1):透明质酸与己二酸二酰肼反应，合成透明质酸-己二酸二酰肼衍生物，
(2):将透明质酸-己二酸二酰肼衍生物与含异硫氰基的有机分子进行反应，得到透明质酸与含异硫氰基的有机分子共价连接衍生物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述步骤(1)为：取透明质酸，溶于双蒸水中，加入10倍透明质酸质量的己二酸二酰肼，搅拌，调节pH值4.0-5.5，加入5倍透明质酸质量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，调节pH值，使之维持在4.0-5.5，反应2小时后，调节pH值至7.0，将反应后产物用双蒸水透析，透析后冷冻干燥，得透明质酸-己二酸二酰肼衍生物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是：所述步骤(2)为：取步骤(1)得到的透明质酸-己二酸二酰肼衍生物，溶于双蒸水中，溶解后加入与透明质酸-己二酸二酰肼衍生物等质量的含异硫氰基的有机分子，然后加入双蒸水体积半量的0.01M pH=8.0-10.0碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，避光室温放置36小时，反应结束后，将产物使用琼脂糖凝胶（Sepharose6B）过滤或使用透析袋进行透析除去未反应的含异硫氰基的有机分子，收集终产物。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征是：所述含异硫氰基的有机分子为N1-（对-异硫氰基苄基）-二乙三胺-N1，N2，N3，N4–四乙酸铕钠或异硫氰酸荧光素。
5.一种透明质酸与含异硫氰基的有机分子共价连接衍生物，其特征在于：由权利要求1-4任一项的方法制备得到。
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