CN103319618B - 桑黄菌丝体活性多糖的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种桑黄菌丝体活性多糖的制备方法，本发明的方法一方面利用木屑和麸皮这些廉价的基质进行固态发酵，成本低，技术简单，一般农户即可进行，易于推广；另一方面，采用本发明的方法能够有效的提高桑黄菌丝体粗多糖的纯度，所获得的桑黄菌丝体粗多糖具有很好的免疫活性。

Description

桑黄菌丝体活性多糖的制备方法

技术领域

本发明涉及食用菌培养及加工领域，具体的涉及一种桑黄菌丝体活性多糖的制备方法。

背景技术

鲍氏针层孔菌(PhellinusbaumiiPilat)，俗称桑黄，是一种多年生、黄褐色的珍贵的药用真菌，有“森林黄金”之美称。因其抗肿瘤效果显著，已经成为国内外研究的热点，风靡于日本及韩国，畅销不衰。

作为珍稀药用真菌，桑黄的主要活性成分是多糖，目前对桑黄的研究较多集中在多糖提取及其抗癌效果研究。大量实验表明，桑黄菌丝体和子实体提取物具有的良好抗肿瘤效果。由于桑黄子实体生长周期比较长，价格昂贵稀少，而菌丝体生长周期短，因此从桑黄菌丝体中提取活性物质是很好的发展方向。提取桑黄活性多糖，需要富集大量的菌丝体；液体发酵需要发酵罐，动力成本较大，技术相对复杂；而固体发酵相对简便易行，基质可采用能食用的农副产物，可进行综合利用。

然而，现有的桑黄的培养成本高，活性多糖的纯度低，影响了其在药学上的进一步应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种桑黄菌丝体活性多糖的制备方法，为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案：

本发明一方面涉及一种桑黄菌丝体活性多糖的制备方法，所述的方法包括如下步骤：

(1)培养菌丝体：将桑黄菌种长于PDA斜面上，生长周期为一周即为桑黄母种；取混合好的木屑培养基高压灭菌，冷却后接桑黄母种于培养基上，27-29℃于恒温培养箱避光培养8-12天即得到桑黄原种；将原种翻接到木屑培养基中，27-29℃于菇房避光培养12-18天扩大培养；将扩大培养的原种接种于木屑培养基上，置于27-29℃菇房中培养，生长周期25-30天；所述的木屑培养基包括50-70重量份木屑、15-25重量份麸皮、0.5-1.5重量份石膏以及适量水；

(3)菌丝体多糖的提取

除去菌袋，将培养好的菌丝体连同培养料一起捣碎，加蒸馏水沸水浴提取1-3h，滤渣重复提取1-3次，合并提取液，在旋转蒸发仪上减压浓缩至物料比1∶8-12；取浓缩液，8000-12000×g离心20-40min去除不溶性杂质，加乙醇沉淀20h以上，分离沉淀，使用与醇沉浓度相同的酒精对沉淀进行洗涤，然后使用水溶解，用3200-3800分子量透析袋透析2-4d，去除小分子物质，冷冻干燥桑黄菌丝体粗多糖，任选地，还包括对桑黄菌丝体粗多糖进行进一步纯化的步骤。

在本发明的一个优选实施方式种，所述的乙醇沉淀时的浓度为30％-80％，优选的，为60-80％。

在本发明的另一个优选实施方式种，所述冷冻干燥的桑黄菌丝体粗多糖的含量在30％以上，优选在33％以上。

在本发明的另一个优选实施方式种，所述的桑黄菌丝体粗多糖包括岩藻糖、鼠李糖、***糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖。

本发明另一方面还涉及采用上述方法所制备得到的桑黄菌丝体粗多糖。

在本发明的另一方面，还涉及上述桑黄菌丝体粗多糖的应用，所述的桑黄菌丝体粗多糖用于提高人或动物体的免疫力。

本发明的方法一方面利用木屑和麸皮这些廉价的基质进行固态发酵，成本低，技术简单，一般农户即可进行，易于推广；另一方面，采用本发明的方法能够有效的提高桑黄菌丝体粗多糖的纯度，所获得的桑黄菌丝体粗多糖具有很好的免疫活性。

具体实施方式

实施例1

(1)配制袋料培养基

配置59％木屑、20％麸皮、1％石膏，用水拌合，保持含水量在65％左右。使用聚丙烯袋子(17cm×33cm×0.0005cm)装料，每袋装木屑培养基湿料1kg，121℃高压灭菌120min。

(2)母种、原种、栽培种及菌丝体的培养

将桑黄菌种长于PDA斜面上，生长周期为一周即为桑黄母种。

取混合好的木屑培养基装500ml的锥形瓶至二分之一，大约制作5瓶(1瓶母种可以制作16袋原种)，高压灭菌120min，冷却后接桑黄母种于培养基上，28℃于恒温培养箱避光培养10天即得到桑黄原种。

将5瓶原种翻接到袋料培养基中，28℃于菇房避光培养15天扩大培养得到80袋栽培种。取上述桑黄菌栽培种接种于实施例1的袋料培养基上，置于28℃菇房中培养，生长周期25-30天。

(3)菌丝体多糖的提取及总糖含量的测定

除去菌袋，将培养好的菌丝体连同培养料一起捣碎，加蒸馏水沸水浴提取2h，滤渣重复提取2次，合并提取液，在旋转蒸发仪上减压浓缩至物料比1∶10；取浓缩液，10000×g离心30min去除不溶性杂质，分别加无水乙醇至酒精终浓度为30％、50％、70％，静止24h，10000×g离心30min。然后分别用对应酒精终浓度的乙醇反复洗涤沉淀。最后用去离子水洗出沉淀，水浴锅上挥醇，用3500分子量透析袋(MD34，截留分子量3500)透析3d，去除小分子物质，冷冻干燥仪冻干得到桑黄菌丝体粗多糖。用硫酸-苯酚测定多糖含量，30％、50％、70％不同浓度的酒精醇沉之后透析得到粗多糖中多糖含量分别为16.10％，33.18％，37.83％。

(4)桑黄菌丝体多糖体外免疫活性研究

桑黄菌丝体粗多糖来源同实施例4中；测定桑黄菌丝体粗多糖的抗氧化活性，主要进行体外刺激巨噬细胞RAW264.7释放NO量的试验。

NO在体内很容易被氧化，并且形成亚硝酸盐，Griess法测定培养上清液中亚硝酸盐的浓度，可以间接反映巨噬细胞NO释放量。

具体操作步骤：取出超低温冰箱冻存的细胞，1000rpm离心3min，去除冻存液，收集细胞，平均分配到装有DMEM完全培养基的小培养瓶中，在37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养，定期换液，待细胞覆盖培养瓶瓶底80～90％时，用37℃加热的0.25％胰酶溶液消化，消化液于1000rpm离心3min，收集细胞，用无色1640完全培养基将细胞稀释至5×105个/mL，计算好所需孔数，向96孔细胞培养板中每孔加入180μL细胞稀释液，然后加入20μL待测样品，每个样品浓度设置3个复孔，以LPS(10μg/mL)为阳性对照，PBS为阴性对照，将96孔板置于37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养48h，然后吸取每孔上清液100μL，加入50μLGriess试剂，放置10min，543nm测定吸光度值。

结果表明，100ug/ml的酒精终浓度为30％、50％、70％醇沉得到桑黄菌丝体粗多糖刺激巨噬细胞RAW264.7释放NO量分别为32.05％、30.16％、49.16。所以我们选取70％的选取70％的酒精终浓度进行醇沉，获得的粗多糖活性较好，接近阳性对照LPS的释放量52.64％。

(5)桑黄菌丝体单糖组成成分的分析

样品前处理：取桑黄粗多糖样品，用万分之一天平准确称取2mg左右于具塞试管中，按照(3mL∶2mg)的比例加入2mol/L的TFA，110℃水解4h，冷却，用旋蒸仪低温减压蒸干水解液，接着加入3mL甲醇，减压蒸干，重复操作4-5次，以除去残留的三氟乙酸，将水解产物用去离子水清洗定容至50mL，上样量为20μL，以单糖标准品Gal，Glu，Ara，Fuc，Rha，Man，Xyl，Fru，Rib，GluA和GalA为对照，用高效阴离子色谱(HPAEC)测定单糖的组成和摩尔比。

结果表明，桑黄菌丝体粗多糖的主要单糖组成成分为岩藻糖、鼠李糖、***糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖，且单糖组分比为4.1∶1∶8.8∶11.3∶12.3∶15.1∶6.3。

以上所述是本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种桑黄菌丝体活性多糖的制备方法，所述的方法包括如下步骤：

1)培养菌丝体：将桑黄菌种长于PDA斜面上，生长周期为一周即为桑黄母种；取混合好的木屑培养基高压灭菌，冷却后接桑黄母种于培养基上，27-29℃于恒温培养箱避光培养8-12天即得到桑黄原种；将原种翻接到木屑培养基中，27-29℃于菇房避光培养12-18天扩大培养；将扩大培养的原种接种于木屑培养基上，置于27-29℃菇房中培养，生长周期25-30天；所述的木屑培养基包括50-70重量份木屑、15-25重量份麸皮、0.5-1.5重量份石膏以及适量水；

2)菌丝体多糖的提取

除去菌袋，将培养好的菌丝体连同培养料一起捣碎，加蒸馏水沸水浴提取1-3h，滤渣重复提取1-3次，合并提取液，在旋转蒸发仪上减压浓缩至物料比1∶8-12；取浓缩液，8000-12000×g离心20-40min去除不溶性杂质，加乙醇沉淀20h以上，分离沉淀，使用与醇沉浓度相同的酒精对沉淀进行洗涤，然后使用水溶解，用3200-3800分子量透析袋透析2-4d，去除小分子物质，冷冻干燥桑黄菌丝体粗多糖，任选地，还包括对桑黄菌丝体粗多糖进行进一步纯化的步骤。

2.根据权利要求1所述的制备方法，所述的乙醇沉淀时的浓度为30％-80％。

3.根据权利要求2所述的制备方法，所述的乙醇浓度为60-80％，所述冷冻干燥的桑黄菌丝体粗多糖的含量在30％以上。

4.根据权利要求3所述的制备方法，所述的桑黄菌丝体粗多糖包括岩藻糖、鼠李糖、***糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖。

5.权利要求1-4任意一项制备方法所制备得到的桑黄菌丝体粗多糖。

6.权利要求5所述的桑黄菌丝体粗多糖的应用，所述的桑黄菌丝体粗多糖用于提高人或动物体的免疫力。