CN103316336A

CN103316336A - 一种适于口服的轮状病毒疫苗

Info

Publication number: CN103316336A
Application number: CN2013102150422A
Authority: CN
Inventors: 戈小琴; 王一丁; 王楠; 张晓军; 张博; 韩星; 高强; 董珊珊; 尹卫东
Original assignee: Sinovac Research & Development Co Ltd
Current assignee: Sinovac Research & Development Co Ltd
Priority date: 2013-05-31
Filing date: 2013-05-31
Publication date: 2013-09-25
Anticipated expiration: 2033-05-31
Also published as: CN103316336B

Abstract

本发明提供了一种适于口服的轮状病毒疫苗，含有轮状病毒抗原、糖类、磷酸盐和羧酸盐。本发明提供的适于口服的轮状病毒疫苗能够提高疫苗抗原成分的稳定性、在37℃、2～8℃、25℃均具有很好的稳定性，抗原活性稳定，能增强疫苗成品口服后的抗胃酸能力，并且具有很好的免疫应答刺激能力和良好的安全性。不含其它人源或动物源性蛋白，具有更好的安全性，同时成本更低，适合于产品的产业化生产。

Description

一种适于口服的轮状病毒疫苗

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及适于口服施用的轮状病毒疫苗配方。

背景技术

轮状病毒(Rotavirus，RV)是引起婴幼儿严重腹泻和脱水的主要病因，在发展中国家和发达国家都是一个重要的公共卫生问题，全世界<5岁的儿童每年大约有600,000左右的死亡病例，85%的死亡儿童在发展中国家。轮状病毒腹泻不但造成社会的疾病负担，而且带来了巨大的经济损失。即便在发达国家，婴幼儿轮状病毒感染也是非常常见的。美国的研究发现每年用于轮状病毒感染有关的医疗费用高达3.52～10亿美元。实施计划免疫可以节约0.79亿美元用于卫生保健，4.66亿美元用于社会其他方面。我国大陆的调查显示：在经济水平不同的地区，5岁以下轮状病毒腹泻患儿门诊就诊每次所需费用为64～248元，住院治疗每次所需费用则为658～1920元，初步估计全国轮状病毒腹泻的平均门诊治疗费用100元，平均住院费用约为839元。

到目前为止，轮状病毒感染无特效治疗药物，主要依赖连续几天的补液进行治疗。更为严重的是，轮状病毒的感染与卫生条件没有相关性，即使卫生条件得到改善，仍无法有效控制病毒的传播。目前对于RV腹泻尚无特效药治疗，因此应用疫苗预防被认为是最好的预防措施，疫苗免疫是唯一可行的预防轮状病毒腹泻较高发病率和死亡率的方法。有鉴于此，世界卫生组织在1997年将轮状病毒疫苗的开发列为全球新疫苗研制开发的第一项目，世界各国的有关机构都在积极进行轮状病毒疫苗的研制工作。

口服施用是一种重要的疫苗接种方式，相对注射式的免疫方式有其独特的优点。对某些胃肠道病原菌引起的疾病，采用口服的方式接种免疫能够更加快速、直接的刺激胃肠道粘膜免疫***，从而产生相应的免疫应答使机体具有免疫保护。口服施用的疫苗由于需经受胃部的消化***，故对其配方成分的稳定性、抗酸性和安全性方面具有特殊的要求。首先，疫苗配方必须保证抗原成分的稳定性，确保疫苗在使用时有最大效力。其次，做为口服疫苗，配方须具有良好的抗胃酸能力，以保证抗原的活性。再次，产品的安全性是基础，而产品的安全性来自配方成分的选择。

目前已报道的针对口服类疫苗的配方成分（参见，例如US3783098、US3915794和EP028563），第一种是SPGA，它主要含有牛或人的血清白蛋白、水解酪蛋白或明胶；第二种为任选的谷氨酸的碱金属盐、糖（葡萄糖、蔗糖或葡聚糖）、以及磷酸单盐或双盐，或它们的混合物。这些组合物具有很大的缺陷。首先它们具有潜在的生物学危险，比如化学组成不确定的动物或人源的蛋白质或蛋白质水解产物。此外，本技术领域现有这些组合物未能使减毒活疫苗具有足够的稳定性和抗酸性，使疫苗的贮存条件和效期受到极大的限制，甚至进一步影响疫苗的有效性和安全性。目前未见有适于口服的、稳定性强的轮状病毒疫苗的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种安全、有效的适合口服施用的轮状病毒疫苗配方。

本发明的另一目的在于提供一种配制该疫苗的方法。

本发明提供的适于口服的轮状病毒疫苗，含有轮状病毒抗原、糖类、磷酸盐和羧酸盐。

本发明的疫苗，其每1mL含10⁴～10⁸个感染单位的轮状病毒抗原。所述感染单位为CCID₅₀或PFU或FFU或其它可表示具有感染性抗原的单位。

每1mL该疫苗中含有0.1～0.6g的糖类。

每1mL该疫苗中含有0.05～0.5mmol的磷酸根。

每1mL该疫苗中含有0.05～0.5mmol的羧酸盐。

本发明疫苗所述的糖类为蔗糖、乳糖、右旋糖酐、海藻糖、甘露糖、半乳糖、山梨糖醇和/或甘露醇。

优选地，糖类为蔗糖。

本发明疫苗所含的磷酸盐为磷酸二氢钾和磷酸氢二钾的混合物或磷酸二氢钠与磷酸氢二钠的混合物。优选为磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的混合物。

上述磷酸盐混合物中磷酸二氢盐和磷酸氢二盐的摩尔浓度比为1:1～10。优选的二者摩尔浓度比为1:2。

所述羧酸盐具有较好的抗胃酸能力，保持抗原成分的稳定和有效性。本发明优选的羧酸盐为琥珀酸盐或柠檬酸盐。

本发明的口服轮状病毒疫苗，其pH值为5-8。

优选地，具备较好抗酸效果和病毒稳定性的口服疫苗配方包括：

●蔗糖溶液的终浓度为30%（w/v）；

●磷酸钾盐摩尔终浓度为0.1M或0.2M，其中磷酸二氢钾和磷酸氢二钾的摩尔浓度比为1:2；

●羧酸盐琥珀酸钠或者柠檬酸钠的摩尔终浓度为0.1M或0.2M；

●轮状病毒抗原10⁵～10⁷CCID₅₀；

●pH值控制在pH5～8内；

本发明还提供了制备适于口服的轮状病毒疫苗的方法，是无菌条件下，将糖溶液、磷酸盐缓冲液和羧酸盐溶液混合后过滤除菌，加入轮状病毒细胞培养液得到混合溶液，使每1ml混合溶液中含10⁴～10⁸个感染单位的轮状病毒抗原、0.1～0.6g的糖、0.05～0.5mmol的磷酸根、0.05～0.5mmol的羧酸盐，混合溶液pH值为5～8，按照规格分装；所述磷酸盐缓冲溶液为磷酸二氢钾和磷酸氢二钾的混合溶液或磷酸二氢钠与磷酸氢二钠的混合溶液，磷酸二氢盐和磷酸氢二盐的摩尔浓度比为1:1～10；所述羧酸盐为柠檬酸钠溶液或琥珀酸钠溶液。

本发明能够提高疫苗抗原成分的稳定性、增强疫苗成品口服入胃后的抗胃酸能力，并且该配方具有很好的免疫应答刺激能力和良好的安全性。体外抗酸试验表明，该配方具有很好的抗酸性。施用该配方的免疫原性组合物能够很好的中和胃酸，使抗原成分的有效性和活性得以保护。稳定性试验结果表明施用该配方的疫苗，在37℃、2～8℃、25℃具有很好的稳定性，抗原活性稳定。安全性试验表明，施用该配方的疫苗在动物试验中具有很好的安全性。

做为本发明配方中组分之一的糖类，特定浓度的糖可提高疫苗制剂的稳定性。稳定的疫苗制剂的制备存在巨大的挑战。该制剂的稳定性取决于在该疫苗组合物中合成一体的赋形剂之间的相互作用。抗原表位的蛋白质和糖之间的氢键具有使疫苗稳定的优势。糖和抗原蛋白质有效的接触必须有适当的比例，以保持该疫苗的稳定。在一定的温度下，要求糖浓度有一个临界值，以具有一定数量的蛋白质和糖之间的氢键来保持疫苗能够稳定特定的时间。糖通过替代结构水，能够与磷脂膜和蛋白质形成氢键。糖和蛋白质与缓冲成分的适当组合，可在长的储存期内保存病毒，并且使其具有活性。这些添加剂对悬浮在液体中的抗原给予了结构上的支持。

做为本发明配方中组分之一的磷酸盐缓冲液，其含有的磷酸氢根和磷酸二氢根离子对胃酸具有一定的缓冲能力，以保持抗原成分的有效活性。同时，磷酸盐缓冲液对抗原成分的稳定性和有效性具有一定的作用。

做为本发明配方中组分之一的羧酸盐具有较好的抗酸能力，能够维持抗原成分经受胃液的消化***，稳定抗原，维持抗原成分的有效性。

除上述优势外，本发明和现有技术所提到的配方相比还具有以下的优势：首先，本发明所述的磷酸盐为磷酸二氢盐和磷酸氢二盐的混合缓冲液，和单种磷酸盐相比具有更好的稳定性和缓冲能力；第二，本发明所述的羧酸盐选自柠檬酸盐和琥珀酸盐，上述两类盐均能达到本发明的效果，但通过试验，琥珀酸钠效果在抗酸性和安全性方面更优；第三，本发明所述配方除权利要求中所述成分外不含其它人源或动物源性蛋白，具有更好的安全性，同时成本更低，适合于产品的产业化生产。

附图说明

图1为本发明轮状病毒疫苗在2-8℃存储的稳定性数据。

图2为本发明轮状病毒疫苗在25℃存储的稳定性数据。

图3为本发明轮状病毒疫苗在37℃存储的稳定性数据。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；实施例中所用的试剂为市售商品。

实施例1轮状病毒抗原的制备

由美国国立卫生研究院（National Institute of Health,以下简称NIH）提供给北京科兴中维生物技术有限公司作为疫苗起始原材料毒株的病毒株UK x D株（G1）、UK x DS-1株（G2）、UK x P株（G3）、UK x ST-3株（G4）、UK x AU32株（G9）和UK x Wa株（P1A[8]），以上毒株分别在Vero细胞或MA-104细胞或二倍体细胞中适应生长并连续传代，置37.5±1.0℃培养箱中培养2～5天收获病毒液，澄清过滤后采用CCID₅₀法或荧光定量PCR方法检测病毒滴度值。上述6种血清型轮状病毒最大收获量可达10⁶-10⁸CCID₅₀/ml。纯化后的各血清型轮状病毒原液可用于配制疫苗制剂。

实施例2轮状病毒疫苗的制备

（1）配制3M的磷酸缓冲液（其中磷酸二氢钾和磷酸氢二钾摩尔浓度比例为1:2）和4M琥珀酸钠溶液储备液，过滤除菌，2～8℃保存备用；

（2）将步骤（1）配制的10ml磷酸缓冲液和15ml琥珀酸钠溶液混合；

（3）向（2）中加入60%蔗糖溶液150ml；

（4）向（3）中加入100ml实施例1中的抗原溶液，该抗原溶液为G1、G2、G3、G4、G9、P1A[8]的混合液；

（5）采用不含病毒的无血清MEM培养液补充体积至300ml；疫苗，pH值为5-8；

（6）过滤分装，每剂3ml，共100剂。

本实施例配制的疫苗每剂含以下成分：含上述6种血清型轮状病毒各10⁵-10⁷CCID₅₀，30%的蔗糖，磷酸缓冲液中含磷酸二氢钾和磷酸氢二钾摩尔浓度比例为1:2，磷酸根总浓度为0.1M；琥珀酸钠溶液终浓度为0.2M。

实施例3含不同蔗糖浓度配方的轮状病毒疫苗抗酸效果

（1）疫苗制剂的配制

配制4组含不同蔗糖浓度的疫苗：配制4组10ml3M的磷酸盐缓冲液（磷酸二氢钾和磷酸氢二钾摩尔浓度比例为1:2）和15ml4M琥珀酸钠溶液的混合液，向4组混合液中分别添加含30g、90g、150g、180g蔗糖的蔗糖溶液配制成4种含不同浓度蔗糖的保护剂（磷酸盐溶液+琥珀酸钠溶液+蔗糖溶液），分别向4组保护剂中加入实施例1中的100ml抗原组分（同实施例2，为6种血清型混合），采用不含病毒的无血清MEM维持液补齐体积至300ml，过滤除菌，按3ml每剂分装，配制成100剂疫苗制剂。上述疫苗制剂中每剂含各血清型轮状病毒10⁵～10⁷CCID₅₀。磷酸盐缓冲液中含磷酸二氢钾和磷酸氢二钾摩尔浓度比例为1:2，磷酸根总浓度为0.1M；琥珀酸钠溶液终浓度为0.2M；4组疫苗制剂中蔗糖的质量终浓度（质量g/体积100ml）分别为10%、30%、50%、60%。

（2）配方抗酸效果试验

将（1）中4组含不同蔗糖浓度的制剂分别进行抗酸效果试验。配制7组30ml不同pH值（pH=2.5,2.3,2.0,1.8,1.5,1.3,1.0）的盐酸溶液，为“模拟胃液”。将4组不同蔗糖浓度的疫苗制剂分别加入以上7组“模拟胃液”抗酸试验，试验结果如表1所示。

表1含不同蔗糖浓度的配方的抗酸效果

试验结果显示，在磷酸盐缓冲液和羧酸盐浓度一定的条件下，含10%-60%不同蔗糖浓度的配方的抗酸效果无显著差异，均能中和30ml pH1.8的“模拟胃液”，且试验结果在2小时内无显著变化（另注：本发明还发现轮状病毒在pH不低于4.0的溶液中能够维持活性超过5小时）。本实施例结果表明：说明10%-60%的蔗糖质量终浓度均适合本发明配方。

实施例4疫苗配方中磷酸盐缓冲液浓度的确定

（1）疫苗制剂的配制

配制8组含不同磷酸盐浓度的疫苗：将5、10、30、50ml的3M磷酸缓冲液（其中磷酸钾盐为4组分，磷酸二氢钾和磷酸氢二钾摩尔浓度比例为1:2；磷酸钠盐4组分，磷酸二氢钠和磷酸氢二钠摩尔浓度比例为1:2）分别和15ml4M琥珀酸钠溶液的混合，向上述8组混合液中分别添加150ml60%的蔗糖的蔗糖溶液配制成8种含不同磷酸盐浓度的保护剂，分别向8组保护剂中加入实施例1中的100ml抗原组分（同实施例2，为6种血清型混合），采用不含病毒的培养液补齐体积至300ml，过滤除菌，按3ml每剂分装，配制成100剂疫苗制剂。上述疫苗制剂中含各血清型轮状病毒10⁵-10⁷CCID₅₀。蔗糖质量浓度为30%，琥珀酸钠溶液终浓度为0.2M；磷酸盐缓冲液中含磷酸二氢钾和磷酸氢二钾（或含磷酸二氢钠和磷酸氢二钠）摩尔浓度比例为1:2，磷酸根总浓度分别为0.05M、0.1M、0.3M、0.5M。

（2）配方抗酸效果试验

将（1）中8组含不同浓度磷酸盐缓冲液的制剂分别进行抗酸效果试验。配制7组30ml不同pH值（pH=2.5,2.3,2.0,1.8,1.5,1.3,1.0）的盐酸溶液，为“模拟胃液”。将8组（钾盐和钠盐各4组）不同磷酸缓冲液浓度的疫苗制剂分别加入以上7组“模拟胃液”抗酸试验，试验结果如表2、3所示。

表2含不同浓度磷酸缓冲液（钾盐）的配方的抗酸效果

表3含不同浓度磷酸缓冲液（钠盐）的配方的抗酸效果

（3）磷酸缓冲液中两种磷酸盐不同比例抗酸效果试验

采用与上述试验相同的方法，将磷酸缓冲液中磷酸根总浓度设定为0.1M，将两种磷酸盐摩尔浓度比设置4个不同比例，即KH₂PO₄：K₂HPO₄=1:10、1:5、1:2、1:1，分别检测其抗酸效果。

试验结果显示；采用上述4种磷酸盐比例的疫苗制剂在抗酸效果上均能够使30ml的“模拟胃液”PH值缓冲至5.0以上并维持2小时稳定。

本实施例结果表明：在蔗糖质量浓度和羧酸盐浓度一定的条件下，含0.05M-0.5M不同浓度磷酸缓冲液的配方的抗酸效果无显著差异，均能中和30ml PH1.8的“模拟胃液”，且试验结果在2小时内稳定；且试验发现，磷酸缓冲液中磷酸二氢盐和磷酸氢二盐摩尔浓度比例为1:10-1:1均可满足制剂需求。试验结果均符合要求，适合于本发明配方。

实施例5疫苗配方中羧酸盐浓度的确定

（1）疫苗制剂的配制

配制4组含不同琥珀酸钠浓度的疫苗：将3.75ml、7.5ml、22.5ml、37.5ml的4M琥珀酸钠溶液分别和10ml3M磷酸盐缓冲液溶液（磷酸二氢钾和磷酸氢二钾摩尔浓度比例为1:2）的混合，向上述4组混合液中分别添加150ml60%的蔗糖的蔗糖溶液配制成4种含不同琥珀酸钠浓度的保护剂，分别向4组保护剂中加入实施例1中的100ml抗原组分（同实施例2，为6种血清型混合），采用不含病毒的MEM培养液补齐体积至300ml，过滤除菌，按3ml每剂分装，配制成100剂疫苗制剂。上述疫苗制剂中含各血清型轮状病毒10⁵-10⁷CCID₅₀。蔗糖质量浓度为30%，磷酸盐缓冲液中含磷酸二氢钾和磷酸氢二钾摩尔浓度比例为1:2，磷酸根总浓度为0.1M；琥珀酸钠溶液终浓度分别为0.05M、0.1M、0.3M、0.5M。

（2）配方抗酸效果试验

将（1）中4组含不同琥珀酸钠浓度的制剂分别进行抗酸效果试验。配制7组30ml不同pH值（pH=2.5,2.3,2.0,1.8,1.5,1.3,1.0）的盐酸溶液，为“模拟胃液”。将4组不同羧酸盐浓度的疫苗制剂分别加入以上7组“模拟胃液”抗酸试验，试验结果如表4所示。

采用相同的方法，将配方中的琥珀酸钠采用柠檬酸钠代替，进行本实施例试验，试验结果如表5所示。

表4含不同琥珀酸钠浓度的配方的抗酸效果

表5含不同柠檬酸钠浓度的配方的抗酸效果

本实施例结果表明：在蔗糖质量浓度和磷酸缓冲液浓度一定的条件下，含0.05M-0.5M不同羧酸盐浓度的配方的抗酸效果均能中和30ml pH1.8的“模拟胃液”，满足病毒存活条件需求，且试验结果在2小时内无显著变化。说明0.05M-0.5M的琥珀酸盐或柠檬酸盐浓度均适合本发明配方。

实施例6配方中糖类的选择

下列实施例是为了更好的说明本发明所述配方的稳定性，但该配方的施用范围不仅限于下列举例实施例。

本实施例验证含不同糖类的配方在37℃温度下对抗原的稳定性。

将实施例1中收获的G1血清型轮状病毒原液用来制备本实施例的疫苗样品，方法参照实施例2。样品制备后于37℃放置2周，用于加速的热稳定性研究采用CCID₅₀方法检测G1血清型轮状病毒滴度值。

本实施例制造一批样品以获得本发明的组合物。

（1）样品分成7组，每组10剂，每剂含下述共同成分：6.2LgCCID₅₀G1血清型轮状病毒、0.1M磷酸缓冲液（含磷酸二氢钾和磷酸氢二钾摩尔浓度比例为1:2）、0.2M琥珀酸钠溶液。7组样品糖类分别为30%蔗糖、30%乳糖、30%右旋糖酐、30%海藻糖、30%半乳糖、30%山梨糖醇、30%甘露醇。

将该样品置37℃两周，检测抗原含量。

（2）试验结果

本实施例样品配制完成后各组分别取样检测滴度值，结果如表6所示。

表6配方中含不同糖类的样品的稳定性

本实施例结果表明：当疫苗配方中糖类选自蔗糖、乳糖、右旋糖酐、海藻糖、半乳糖、山梨糖醇或甘露醇时，37℃下该疫苗配方均能够使抗原具有很好的稳定性。可见蔗糖、乳糖、右旋糖酐、海藻糖、半乳糖、山梨糖醇或甘露醇均适合本发明的配方。

实施例7使用该配方的轮状病毒疫苗制剂的稳定性

本实施例在不同的温度2-8℃、25℃和37℃下，测定不同血清型轮状病毒在本发明配方中的稳定性。

将实施例1中收获的各血清型轮状病毒原液按照实施例2的方法制备本实施例的疫苗样品。该样品随后分别在25℃放置18周、37℃放置2周，用于加速的稳定性研究；对于实时的稳定性研究，样品在2-8℃放置12个月；定期采用荧光定量PCR方法检测各血清型轮状病毒滴度值。

本实施例制造一批样品以获得本发明的组合物。

（1）样品1每剂含下述成分：30%蔗糖、0.1M磷酸缓冲液（含磷酸二氢钾和磷酸氢二钾摩尔浓度比例为1:2）、0.2M琥珀酸钠溶液、轮状病毒抗原（各血清型轮状病毒含量：G15.6LgCCID₅₀，G26.6LgCCID₅₀，G35.6LgCCID₅₀，G47.2LgCCID₅₀，G96.6LgCCID₅₀，P1A[8]6.0LgCCID₅₀）。将该样品分别置2-8℃、25℃和37℃一定时间，检测各血清型抗原含量。

结果：该样品2-8℃放置12个月，病毒滴度值：G15.5LgCCID₅₀，G26.5LgCCID₅₀，G35.6LgCCID₅₀，G47.2LgCCID₅₀，G96.4LgCCID₅₀，P1A[8]6.0LgCCID₅₀，六种血清型轮状病毒滴度无明显下降趋势。如图1所示。

该样品25℃放置18周，病毒滴度值：G15.5LgCCID₅₀，G26.4LgCCID₅₀，G35.4LgCCID₅₀，G47.0LgCCID₅₀，G96.3LgCCID₅₀，P1A[8]5.8LgCCID₅₀，六种血清型轮状病毒滴度下降不高于0.3LgCCID₅₀。如图2所示。

该样品37℃放置2周，病毒滴度值：G15.4LgCCID₅₀，G26.4LgCCID₅₀，G35.3LgCCID₅₀，G47.1LgCCID₅₀，G96.6LgCCID₅₀，P1A[8]5.8LgCCID₅₀，六种血清型轮状病毒滴度下降不高于0.3LgCCID₅₀。如图3所示。

（2）样品2每剂含下述成分：10%蔗糖、0.05M磷酸缓冲液（含磷酸二氢钾和磷酸氢二钾摩尔浓度比例为1:2）、0.05M琥珀酸钠溶液、各血清型轮状病毒抗原5-6LgCCID₅₀。该样品在2-8℃12个月、25℃18周和37℃2周后每剂中各血清型病毒滴度下降幅度均不高于0.3LgCCID₅₀。

（3）样品3每剂含下述成分：60%蔗糖、0.5M磷酸缓冲液（含磷酸二氢钾和磷酸氢二钾摩尔浓度比例为1:2）、0.5M琥珀酸钠溶液、各血清型轮状病毒抗原5-6LgCCID₅₀。该样品在2-8℃12个月、25℃18周和37℃2周后每剂中各血清型病毒滴度下降幅度均不高于0.2LgCCID₅₀。本实施例结果表明：本发明的适于口服的轮状病毒疫苗具有很好的稳定性。

实施例8疫苗配方的动物安全性试验

将实施例7中疫苗样品通过口服施用的方式在兔、小鼠和豚鼠中进行安全性评价。

取实施例7中疫苗样品1、2、3分别进行本实施例试验，将样品3次免疫兔、BalB/C小鼠和豚鼠，初免和第二次免疫间隔2周，第三次免疫间隔1周。试验用兔5只，BalB/C小鼠10只，豚鼠5只。从初免至试验结束期间每日观察记录试验用动物生理状态，包括存活数量、精神状态、食欲、粪便、体重，3免1周后对其进行解剖观察脏器病变情况。

本实施例试验结果表明：实施例7中的疫苗样品三免兔、BalB/c小鼠和豚鼠后在异常毒性和急性毒性方面均合格，未出现试验用动物死亡和脏器病变情况，兔、BalB/C小鼠和豚鼠精神状态良好，食欲和粪便正常，体重正常上升，无任何异常。说明本发明的适于口服的轮状病毒疫苗具有良好的安全性。

实施例9轮状病毒疫苗的动物免疫原性实验

通过对Balb/c乳鼠免疫轮状病毒疫苗来评估疫苗的免疫原性。Balb/c乳鼠按照10只每组的规格进行口服免疫。疫苗按照人用剂量的三分之一倍比稀释进行，共配成5组疫苗。表7描述了实验分组和免疫剂量情况：

表7乳鼠免疫原性实验分组与免疫剂量情况

乳鼠口服初次免疫2周后加强一次，加强免疫2周后进行采血，用病毒回滴实验检测中和抗体效价。中和用病毒分别选用G1、G2、G3、G4、G9和P1A[8]型，各型的滴度均为100CCID₅₀。阳性对照细胞选择Vero细胞。中和试验在37℃进行7天，并观察细胞病变。结果显示各组乳鼠血清均有对G1、G2、G3、G4、G9和P1A[8]型轮状病毒的中和作用，说明该疫苗在乳鼠上具有良好的免疫原性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种适于口服的轮状病毒疫苗，其特征在于，含有轮状病毒抗原、糖类、磷酸盐和羧酸盐。

2.如权利要求1所述的轮状病毒疫苗，其特征在于，每1mL该疫苗中含10⁴～10⁸个感染单位的轮状病毒抗原。

3.如权利要求1所述的轮状病毒疫苗，其特征在于，每1mL该疫苗中含有0.1～0.6g的糖类。

4.如权利要求1所述的轮状病毒疫苗，其特征在于，每1mL该疫苗中含有0.05～0.5mmol的磷酸盐。

5.如权利要求1所述的轮状病毒疫苗，其特征在于，每1mL该疫苗中含有0.05～0.5mmol的羧酸盐。

6.如权利要求1～5任一所述的轮状病毒疫苗，其特征在于，所述糖类为蔗糖、乳糖、右旋糖酐、海藻糖、半乳糖、山梨糖醇和/或甘露醇。

7.如权利要求1～5任一所述的轮状病毒疫苗，其特征在于，所述磷酸盐为磷酸二氢钾和磷酸氢二钾的混合物或磷酸二氢钠与磷酸氢二钠的混合物。

8.如权利要求7所述的轮状病毒疫苗，其特征在于，磷酸盐混合物中磷酸二氢盐和磷酸氢二盐的摩尔浓度比为1:1～10。

9.如权利要求1～5任一所述的轮状病毒疫苗，其特征在于，其pH值为5-8。

10.制备权利要求1～9任一所述轮状病毒疫苗的方法，其特征在于，无菌条件下，将糖溶液、磷酸盐缓冲液和羧酸盐溶液混合后过滤除菌，加入轮状病毒细胞培养液得到混合溶液，按照规格分装；所述磷酸盐缓冲溶液为磷酸二氢钾和磷酸氢二钾的混合溶液或磷酸二氢钠与磷酸氢二钠的混合溶液；所述羧酸盐为柠檬酸钠溶液或琥珀酸钠溶液。