CN103308510A - 一种非水相脂肪酶转酯化活力的检测方法 - Google Patents

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郑建永
汪钊
付显锋
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Abstract

本发明提供了一种非水相脂肪酶转酯化活力的检测方法，所述方法是以式（I）所示对硝基苯酚酯和式（II）所示烷基醇为底物，以脂肪酶为催化剂在有机溶剂中进行转酯化生成对硝基苯酚和式（III）所示烷基酯，通过有机溶解稀释后检测反应液310nm处的紫外吸收值变化来确定脂肪酶的转酯化活力；本发明所述非水相脂肪酶转酯化活力的检测方法的有益效果主要体现在：检测方法简单可行，原料成本低，检测耗时少，仪器要求不高，可以用于脂肪酶酯化活性的快速测定，适合常规生化实验室应用。

Description

一种非水相脂肪酶转酯化活力的检测方法
（一）技术领域
本发明涉及一种非水相脂肪酶转酯化活力的检测方法。
（二）背景技术
脂肪酶（Lipase，EC3.1.1.3）即三酰基甘油酰基水解酶，它催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯，也能催化酯化，转酯化，酯交换和胺解等反应。多数脂肪酶活性中心是由丝氨酸、天冬氨酸、组氨酸组成的三联体。脂肪酶分子由亲水部分和疏水部分组成，活性中心靠近分子疏水端。脂肪酶具有特殊的盖子结构，界面活化的性质。随着近20多年的非水相生物催化的飞速发展，脂肪酶的基础理论和应用研究越来越多。脂肪酶已经广泛应用于食品，医药，化工材料和能源等领域。
脂肪酶作为一种生物催化剂，需要对其催化活性进行测定，即酶活力的检测。目前绝大部分脂肪酶的酶活测定方法都是根据其水解活性的特性，比如常见的橄榄油乳化滴定法，以对硝基苯酚酯为底物分光光度计法等。但是脂肪酶的酯化活性与其水解活性并非完全可以对应。随着脂肪酶的非水相酯化反应应用的增加，建立脂肪酶酯化活性的测定方法具有很重要的应用价值和意义。现已报道的脂肪酶酯化活性的测定方法，一般通过GC，HPLC，荧光检测器等大型仪器，存在着检测时间长，仪器要求高，样品昂贵等问题
滕云，徐岩等（1、Yun Teng,Yan Xu.A modified para-nitrophenylpalmitate assay for lipase synthetic activity determination in organicsolvent[J].Analytical Biochemistry,2007,363:297-299；2、徐岩；滕云。一种非水相中脂肪酶合成酶活力的快速测定方法.申请（专利）号:CN200610086243.7）建立了以对硝基苯酚棕榈酸酯和乙醇转酯化反应，通过碱液萃取反应液后410nm检测对硝基苯酚的含量，从而检测脂肪酶的酯化活性。检测过程中涉及到碱液萃取步骤，可能导致对硝基苯酚棕榈酸酯的自发水解和萃取不完全等问题，将会影响检测的准确性。
Goujard等（L.Goujard,P.Villeneuve,B.Barea.A spectrophotometrictransesterification-based assay for lipases in organic solvent[J].Analyticalbiochemistry,385(1):161-167）利用脂肪酶催化乙烯酯和烷基醇的转酯化反应，通过200nm波长检测乙烯酯的含量以测定脂肪酶的酶活力。反应溶剂，底物烷基醇和产物乙烯醇异构化得到的乙醛在200nm处都吸收，因此都会对检测结果存在干扰作用，其中乙醛容易挥发，其反应液中的残留含量难以计算。
（三）发明内容
本发明的目的是为了解决上述方法的不足，建立一种操作简单，仪器要求不高，重复性好的非水相脂肪酶转酯化活力的检测方法。
本发明采用的技术方案是：
一种非水相脂肪酶转酯化活力的检测方法，所述方法是以式（I）所示对硝基苯酚酯和式（II）所示烷基醇为底物，以脂肪酶为催化剂在有机溶剂中进行转酯化生成对硝基苯酚和式（III）所示烷基酯，通过检测反应液310nm处的紫外吸收值变化来确定脂肪酶的转酯化活力；1个酶活力单位定义为每lmin催化1μmol的对硝基苯酚酯转化为对硝基苯酚的酶量；所述有机溶剂为下列之一：正己烷，环己烷，正庚烷；
Figure BDA00003174260400031
式（I）、（II）、（III）中：
R1为C2～C11的烷基；
R2为C1～C6的烷基。
优选的，所述对硝基苯酚酯为对硝基苯酚棕榈酸酯，所述烷基醇为异丙醇，所述有机溶剂为正己烷。
具体的，所述方法如下：
（1）标准曲线绘制：以乙醇为溶剂，配制梯度浓度的对硝基苯酚溶液，检测溶液在310nm处的紫外吸收值，以浓度为横坐标、紫外吸收值为纵坐标绘制标准曲线；
（2）0.1～10mL有机溶剂中，添加对硝基苯酚酯、烷基醇和待测脂肪酶，对硝基苯酚酯添加量为0.01mM～10mM，烷基醇与对硝基苯酚酯摩尔比为5～200：1，待测脂肪酶添加量为0.1～10mg，50～200r/min、10～60℃反应5～60min；反应结束后取0.03ml上清液以异丙醇或乙醇稀释100倍检测310nm处的紫外吸收值，对照标准曲线计算反应的转化率，获得脂肪酶的酶活数据。
优选的，步骤（2）中所述反应在200r/min摇床转速、30℃下进行，反应时间为10min。
对硝基苯酚酯添加量优选为10mM，烷基醇添加量优选为1M，待测脂肪酶样品添加量优选为1mg，有机溶剂体积优选为2mL。
本发明所述的非水相脂肪酶转酯化活力的检测方法，反应液可以通过石英比色皿或者石英96孔板进行紫外吸收值的检测，其中石英比色皿检测时检测体积为2ml，石英96孔板检测时检测体积为0.2ml。
由于酶催化转酯化反应需要排除水分的干扰，所用的试剂和溶剂利用4A分子筛脱水。
非水相脂肪酶转酯化活力检测方法的典型反应：2mL正己烷体系中含有10mM硝基苯酚乙酸酯和1M异丙醇，反应10min，摇床转速200r/min，酶添加量为1mg，反应温度30℃。反应结束后取0.03ml上清液稀释100倍检测310nm处紫外吸收值，对照标准曲线计算反应的转化率。仪器为多功能酶标仪或普通紫外分光光度仪。
本发明所述非水相脂肪酶转酯化活力的检测方法的有益效果主要体现在：检测方法简单可行，原料成本低，检测耗时少，仪器要求不高，可以用于脂肪酶酯化活性的快速筛选，适合常规生化实验室应用。
（四）附图说明
图1为硝基苯酚棕榈酸酯以乙醇为溶剂的全波长扫描图；
图2为对硝基苯酚以乙醇为溶剂的全波长扫描图；
图3为对硝基苯酚以乙醇为溶剂波长310nm的标准曲线；横坐标为浓度（Concentration）；纵坐标为310nm处的吸光度值（Absorbance at310nm）；
图4为对硝基苯酚棕榈酸酯以乙醇为溶剂波长310nm的标准曲线；横坐标为浓度（Concentration）；纵坐标为310nm处的吸光度值（Absorbance at310nm）。
（五）具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：对7种商品化脂肪酶的转酯化活性测定和气相色谱检测验证硝基苯酚棕榈酸酯（pNPP）、对硝基苯酚（pNP）以乙醇为溶剂的全波长扫描图和波长310nm的标准曲线参见图1～4。
2ml正己烷反应体系，pNPP浓度10mM，异丙醇浓度1M，0.01g脂肪酶，30℃、200r/min摇床转速反应10min，取样30μl反应上清液用乙醇稀释100倍后310nm测OD值。对照对硝基苯酚的标准曲线计算反应的转化率，获得脂肪酶的酶活数据。
转化率计算公式：其中A0、A1是空白对照和样品检测的OD310nm，ε1、ε2是pNPP和pNP310nm处的摩尔消光系数。
同时取样利用乙酸乙酯稀释后进行气相色谱分析。高效液相色谱仪法条件：Agilent6890，色谱柱：HP-5柱，柱温温度：150℃，载气流速=1ml/min，分流比：20:1，检测器：FID检测器。取0.1ml稀释乙酸乙酯100倍，检测反应产物对硝基苯酚的峰面积。通过气相色谱分析对硝基苯酚的标准曲线得出反应产物对硝基苯酚的含量，继而计算反应的转化率。
结果如表1所示。
表1
Figure BDA00003174260400052
Figure BDA00003174260400061
由表1可见，对商品化脂肪酶利用本紫外分光光度分析方法的比酯活和气相色谱分析法得到的结果基本一致，因此本发明所述检测方法可行。

Claims (4)

1.一种非水相脂肪酶转酯化活力的检测方法，所述方法是以式（I）所示对硝基苯酚酯和式（II）所示烷基醇为底物，以脂肪酶为催化剂在有机溶剂中进行转酯化生成对硝基苯酚和式（III）所示烷基酯，通过检测反应液310nm处的紫外吸收值变化来确定脂肪酶的转酯化活力；1个酶活力单位定义为每lmin催化1μmol的对硝基苯酚酯转化为对硝基苯酚的酶量；所述有机溶剂为下列之一：正己烷，环己烷，正庚烷；
Figure FDA00003174260300011
式（I）、（II）、（III）中：
R1为C2～C11的烷基；
R2为C1～C6的烷基。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述对硝基苯酚酯为对硝基苯酚棕榈酸酯，所述烷基醇为异丙醇，所述有机溶剂为正己烷。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述方法如下：
（1）标准曲线绘制：以乙醇为溶剂，配制梯度浓度的对硝基苯酚溶液，检测溶液在310nm处的紫外吸收值，以浓度为横坐标、紫外吸收值为纵坐标绘制标准曲线；
（2）0.1～10mL有机溶剂中，添加对硝基苯酚酯、烷基醇和待测脂肪酶，对硝基苯酚酯添加量为0.01mM～10mM，烷基醇与对硝基苯酚酯摩尔比为5～200：1，待测脂肪酶添加量为0.1～10mg，50～200r/min、10～60℃反应5～60min；反应结束后取0.03ml上清液以异丙醇或乙醇稀释100倍检测310nm处的紫外吸收值，对照标准曲线计算反应的转化率，获得脂肪酶的酶活数据。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（2）中所述反应在200r/min摇床转速、30℃下进行，反应时间为10min。
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