CN103301453A - 一种猪繁殖与呼吸综合征冻干疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种猪繁殖与呼吸综合征冻干疫苗,由猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原和保护剂组成,其中保护剂是由如下质量百分比浓度的物质组成的:2~3% NZ-Amine AS、0.1~0.3%谷氨酸单钾盐、10~15%蔗糖、1~2%水解乳蛋白、10~20%水解明胶、0.1~0.2%维生素C;余量为注射用水。本发明的耐热保护剂能最大限度地减少制品在分装及冻干过程中各种理化因素对病毒活性的损伤,使冻干前后病毒的效价损失较少,不超过0.2个滴度;本发明的耐热保护剂活疫苗耐老化程度高,在37℃条件下保存10天病毒的损失率不超过0.5个滴度,在2~8℃条件下保存24个月,疫苗效价降低较少,有效解决了常规疫苗在运输和保存过程中需要严格的冷链条件而带来的能源浪费和储存不便的问题。
Description
技术领域
本发明属于家畜疫苗制备技术领域,具体涉及一种猪繁殖与呼吸综合征冻干疫苗及其制备方法。
背景技术
冻干保护剂可能影响生物制品的质量、效价和稳定性,耐热冻干保护剂有免疫活性而无药理活性,它不仅具有保护制品生物学活性的作用,而且具有赋形剂和抗氧化剂的作用,直接与疫苗的滴度和稳定性相关联,可在冻干和保存时维持疫苗的稳定性,确保制品在2~8℃条件下,保存期可长达24个月,效价无明显下降,即使在37℃条件下也可以保存十天以上,从而解决了常规疫苗在长途运输、长期保存和使用过程中不耐热、储存温度低、保存期短和苛刻的冷冻条件造成大量能源浪费等难题。但国内疫苗企业常用的冻干保护剂组方简单,保护性能差。如果在2~8℃条件下保存,保存期只有短短的3~6个月,大多需要在-15℃条件下保存。这就要求疫苗在保存、运输和使用过程中尽可能在低温条件下进行,否则疫苗的效价就会大打折扣。而在疫苗生产、运输和使用过程中,如果任何一个环节的冷链***控制不当,高温环境就会导致疫苗效力下降,最终因免疫失败而造成疫病流行。因此,提供耐热型的疫苗就具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪繁殖与呼吸综合征冻干疫苗,即一种可以在2~8℃条件下长期保存仍能保持疫苗效价的耐热型猪繁殖与呼吸综合征冻干疫苗。
本发明的猪繁殖与呼吸综合征冻干疫苗,由猪繁殖与呼吸综合征(简称蓝耳病)病毒抗原和保护剂组成,其中保护剂是由如下质量百分比浓度的物质组成的:2~3% NZ-Amine AS、0.1~0.3%谷氨酸单钾盐、10~15%蔗糖、1~2%水解乳蛋白、10~20%水解明胶、0.1~0.2%维生素C;余量为水。
上述的猪繁殖与呼吸综合征冻干疫苗中还加入了青霉素和链霉素,其终浓度分别为青霉素100IU/ml,链霉素80μg/ml。
上述的耐热冻干保护剂,其制备方法如下:
1)首先称取NZ-Amine AS、谷氨酸单钾盐、蔗糖 、维生素C和水解乳蛋白,溶解后过滤除菌制成过滤液; 所使用的微孔滤膜孔径为0.22μm;
2)称取水解明胶加入到70-80℃注射用水中,搅拌直至完全溶解,高压灭菌制成明胶溶液;高压灭菌条件为116℃,20min;
3)将步骤1)制备的过滤液和步骤2)的明胶溶液混合后,制成冻干保护剂。
本发明的耐热保护剂能最大限度地减少制品在分装及冻干过程中各种理化因素对病毒活性的损伤,使冻干前后病毒的效价损失较少,不超过0.2个滴度;
本发明的耐热保护剂活疫苗耐老化程度高,在37℃条件下保存10天病毒的损失率不超过0.5个滴度,在2~8℃条件下保存24个月,疫苗效价降低较少,有效解决了常规疫苗在运输和保存过程中需要严格的冷链条件而带来的能源浪费和储存不便的问题。本发明的耐热冻干保护剂不仅耐热性能好、能有效保护病毒的活性,而且具有配方简单、成本低、适用于大批量生产等优点,降低了生产成本。
具体实施方式
在疫苗的冻干保护剂制备领域中,保护剂组分的选择及配比对疫苗的保存效果具有重要的影响。为了使本发明的猪瘟疫苗能够长期保存,申请人对本发明冻干保护剂的组分进行了长期的研究,并优化了彼此间的配比浓度,从而使各组分之间具有最大的复配效果。
对于本发明冻干保护剂所使用的组分,其性质如下:
1、NZ胺(NZ-Amine AS),又称为酪蛋白的酶促水解物;
2、谷氨酸单钾盐(L-谷氨酸钾盐):是一种表面活性剂,可降低界面的张力,在冻结和脱水过程中既能降低冰、水界面张力所引起的冻结和脱水变形,又能在复水过程中对活性组分起到润湿剂作用。
3、水解乳蛋白又称水解乳清蛋白,是蛋白酶水解浓缩乳清蛋白或乳白蛋白的产物,含足量的必须氨基酸。
4、蔗糖具有渗透作用,能抑制有害微生物生长,延长产品保藏期,具有很好的水溶性。可提高微生物存活率,形成均一悬液,起到水分缓解作用,可防止活性组分变性。
对于本发明冻干保护剂的组分可选用市售的产品,例如NZ-Amine AS、谷氨酸单钾盐、水解明胶均购自SIGMA,水解乳蛋白、维生素C购自GIBCO,蔗糖购自德国默克。
本发明所涉及的猪繁殖与呼吸综合征病毒选用已有的毒株,例如高致病蓝耳病毒株TJM-F92株,或经典毒株CH-1R株。
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
一、冻干保护剂的配制
本发明的冻干保护剂的配比如表1所示。
表1:本发明的耐热冻干保护剂各实施例的配方表
1)A液配制:分别称取NZ-Amine AS、谷氨酸单钾盐、蔗糖、水解乳蛋白、维生素C,将以上成分按顺序分别溶于注射用水中,充分溶解后摇匀,补充注射用水至所需要的量,摇匀,用0.22μm滤膜过滤除菌,37℃温室中保存备用。
2)B液配制:取水解明胶,用800ml 70-80℃的注射用水充分溶解后,补充注射用水搅拌均匀,121℃、15磅高压灭菌20分钟,灭菌后保存在37℃温室中保存备用。
3)将A液和B液=进行配比,混合均匀即为耐热冻干保护剂。
二、制备猪繁殖与呼吸综合征冻干疫苗
1、猪繁殖与呼吸综合征病毒液的制备
①Marc-145细胞的复苏、培养:从液氮中取出冻存的Marc-145细胞冻存管,迅速放在37℃水浴中使其快速融化。将每个冻存管中的细胞转移至盛有5ml细胞生长液的离心管中,500r/min离心5分钟,弃去上清液,用10ml细胞生长液(含10%小牛血清、1%L-谷氨酰胺、100IU/ml青霉素、80ug/ml链霉素的MEM营养液)重悬细胞,将细胞移入一次性进口细胞培养瓶中吹打均匀,置37℃、5%CO2培养箱中静止培养。48~72小时形成良好单层后,弃去生长液,用PBS洗细胞面2次,用细胞消化液(0.25%胰酶-0.02%EDTA)将细胞消化下来,待细胞面出现针尖大小的缝隙时,吸弃细胞消化液,轻拍细胞瓶,细胞沿瓶壁均匀脱落,此时用吸管吸取细胞生长液,轻轻吹打分散细胞,使细胞分散为单个细胞,将分散的细胞悬液按1:3~1:4的比例进行扩大培养。
②病毒的增殖:当细胞长满单层时,将猪繁殖与呼吸综合征病毒接种到细胞单层上,补足细胞维持液(MEM营养液中含2%小牛血清,100IU/ml青霉素、80ug/ml链霉素,pH7.4~7.6)置35℃~36℃培养,每天观察细胞病变,待细胞病变达到75%~80%时,收获猪繁殖与呼吸综合征病毒培养液,冻融一次,-20℃冷库中保存备用。
2、将收获的蓝耳病病毒经无菌检验和病毒含量测定,合格的病毒液一部分与本发明的耐热冻干保护剂按体积比2:1的比例进行混合,另一部分与常规保护剂明胶、蔗糖混合作为常规疫苗对照组,二者采用同一冻干曲线,同柜冻干。
3、将分装好的病毒液装入冻干机箱内,选取预冻温度为-50℃、预冻时低温保持时间为2h、预冻前期控制在-15℃,待产品释放解吸热后快速冷冻:升华阶段产品温度为-33℃、板层温度设定为-8℃、升华时间为11h;解吸温度为26℃、解吸时间为4h,冻干全过程为24h,加塞出箱,得到耐热型猪繁殖与呼吸综合征活疫苗和常规疫苗。
实施例制备的冻干产品的各项指标测试
1、冻干前后病毒含量测定 将疫苗用无血清培养基稀释成每毫升为1头份,再用含2%新生牛血清的培养基进行10倍系列稀释,取10-3、10-4、10-5和10-64个稀释度,接种生长良好的Marc-145细胞单层96孔培养板,每个稀释度接种8孔,每孔0.1ml,同时设正常细胞对照,37℃5%CO2培养4~5日,观察细胞病变(CPE),使用Reed-Muench法计算TCID50。每头份疫苗病毒含量应不低于105.0TCID50,同时与对照组病毒含量作比较。结果见表2。
表2:耐热冻干保护剂活疫苗冻干前后病毒含量(TCID50/头份)变化
组别 | 冻干前 | 冻干后 |
实施例1疫苗组 | 106.0 | 105.9 |
实施例2疫苗组 | 106.1 | 106.0 |
常规疫苗对照组 | 106.0 | 105.7 |
其中的实施例1疫苗组,是指疫苗的冻干保护剂的配比按照表1中实施例1的配比配制的;而实施例2疫苗组是按表1中实施例2的配比配制的。
由表2可见,采用本发明耐热保护剂制备的猪繁殖与呼吸综合征活疫苗冻干前后病毒含量损失少,降低0.1个滴度;而用单纯的明胶蔗糖冻干的常规疫苗病毒含量损失较大,为0.3个滴度。说明本发明耐热保护剂较常规保护剂对蓝耳病病毒有更好的保护作用。
2、疫苗保存期试验 将三个实施例中制备的疫苗连同常规疫苗分别放置于37℃、2~8℃、-15℃条件下保存,定期取出几瓶,测定其性状、真空度、剩余水分和病毒含量。详细结果见表3。
表3 :冻干样品37℃保存不同时间性状、真空度、剩余水分、效价检测结果
由表3可知,本发明耐热冻干保护剂冻干的疫苗置37℃保存7日,效价下降不超过0.2个滴度,而常规疫苗下降0.5个滴度;保存10日,效价下降不超过0.5个滴度,而常规疫苗下降0.9个滴度。由此可见,本发明耐热保护剂冻干的疫苗能更好地保护疫苗免受高温的影响。
表4:冻干样品2~8℃保存不同时间性状、真空度、剩余水分、效价检测结果
由表4可知,本发明耐热保护剂冻干的疫苗置2~8℃保存12个月,效价下降仅0.1个滴度,常规苗下降0.8个滴度;保存18个月,耐热苗效价几乎不变化,常规苗下降1.2个滴度;保存24个月,耐热苗效价下降不超过0.4个滴度,常规苗效价下降1.6个滴度。可见本发明的耐热保护剂冻干的疫苗比常规疫苗在2~8℃条件下能保存更长的时间,且仍能保持很好的效价。
表5:冻干样品-15℃保存不同时间性状、真空度、剩余水分、效价检测结果
由表5可知,本发明耐热苗放置于-15℃12个月,效价无变化,常规苗效价降低0.2个滴度;保存18个月,耐热苗效价降低0.1个滴度,常规苗效价降低0.3个滴度;保存24个月,耐热苗效价降低0.2个滴度,常规苗效价降低0.7滴度。
从以上试验结果可以看出,本发明的耐热冻干保护剂对猪繁殖与呼吸综合征病毒有很好的保护作用,在不同温度条件下保存,疫苗的性状、剩余水分、真空度和效价几个方面保护效果均明显优于用普通保护剂冻干的常规疫苗。
3、疫苗对仔猪的安全性试验 用4~5周龄猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、抗体阴性健康仔猪10头,随机分成2组,每组5头。将两种保护剂冻干的疫苗稀释至每毫升106.0TCID50,颈部肌肉注射,每头猪注射1ml,连续观察14日,每日测温,做好记录。
表6:两种疫苗对仔猪安全性试验结果
试验结果表明,用本发明的耐热保护剂冻干的疫苗与常规苗对仔猪均具良好的安全性。
4、免疫攻毒保护试验 用4~5周龄猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、抗体阴性健康仔猪15头,随机分为3组,每组5头,其中2组颈部肌肉注射保存于2~8℃24个月的耐热疫苗和常规疫苗各1ml(1头份),另1组5头注射生理盐水作为对照,相同条件隔离饲养。28日后所有猪用效检用强毒攻毒,每头猪滴鼻接种2ml(≥103.8 TCID50/ml),每日测量体温,观察21日,记录试验猪发病及死亡数量,具体结果如表7。
表7:保存于2~8℃24个月的两种疫苗对仔猪免疫攻毒保护试验结果
试验结果表明,本发明耐热保护剂在2~8℃条件下保存24个月,仍然有很好的免疫原性,能够保护仔猪抵抗强毒的攻击。这是常规疫苗所无法比拟的。
综上所述,本发明耐热保护剂对病毒的保护效果明显高于普通冻干保护剂,具有很好的应用推广前景。
Claims (5)
1.一种冻干保护剂,由如下质量百分比浓度的物质组成的:2~3% NZ-Amine AS、0.1~0.3%谷氨酸单钾盐、10~15%蔗糖、1~2%水解乳蛋白、10~20%水解明胶、0.1~0.2%维生素C;余量为水。
2.一种猪繁殖与呼吸综合征冻干疫苗,由猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原和保护剂组成,其中保护剂为权利要求1所述的冻干保护剂。
3.如权利要求2所述的疫苗,其特征在于还加入了青霉素和链霉素,其终浓度分别为青霉素100IU/ml,链霉素80μg/ml。
4.如权利要求2所述的疫苗,其特征在所述的保护剂,其制备方法如下:
1)首先称取NZ-Amine AS、谷氨酸单钾盐 、蔗糖 、维生素C和水解乳蛋白,溶解后过滤除菌制成过滤液; 所使用的微孔滤膜孔径为0.22um。
2)称取水解明胶加入到70-80℃注射用水中,搅拌直至完全溶解,高压灭菌制成明胶溶液;高压灭菌条件为116℃,20min。
3)将步骤1)制备的过滤液和步骤2)的明胶溶液混合后,制成冻干保护剂。
5.权利要求2所述的疫苗用于预防猪繁殖与呼吸综合征病。
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