CN103298947A - 含氨基糖的葡聚糖,其制备方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的是提供含葡糖胺的葡聚糖、其改性产物和其结合物。本发明的含葡糖胺的葡聚糖是这样的含葡糖胺的葡聚糖,其中该葡聚糖具有多个非还原端,并且至少一个葡糖胺残基与支链α-1,4-葡聚糖的2个或更多个非还原端的每一个通过α-1,4-键结合,但在除了该支链α-1,4-葡聚糖的非还原端以外的位置没有葡糖胺残基存在,其中该葡聚糖的聚合度为15或更大且4x105或更小。本发明的含葡糖胺的葡聚糖可以通过使α-葡聚糖磷酸化酶作用于含支链α-1,4-葡聚糖和葡糖胺-1-磷酸的水溶液来提供。
Description
技术领域
本发明涉及在至少1个非还原端的每一个上具有至少1个(优选2个或更多个)氨基单糖残基的葡聚糖,其改性产物和结合物,以及其制备方法和其用途。更优选地,本发明涉及在至少1个非还原端的每一个上具有至少1个(优选2个或更多个)葡糖胺残基的葡聚糖,其改性产物和结合物,以及其制备方法和其用途。本发明的葡聚糖、其改性产物和结合物可具有与核酸非共价结合以提高核酸的表观分子量的功能。
背景技术
药物的药效成分正在从化学合成的稳定的低分子量化合物向容易在血液中降解的不稳定的物质,如蛋白质、抗体和核酸迅速转变。因此,有必要使这些不稳定的药效成分稳定,以便更长时间保持药效成分的高血药浓度。此外,为了减少药物的副作用,将药物有效传递到靶组织的必要性在增加。在这样的背景下,已正式使用所谓的药物传递***(DDS)技术(非专利文献1-4)。DDS技术是指使药效成分以所需的量作用于所需的位点所需的一段时间,即用理想的药代动力学控制药物以最大化发挥效果的技术和***。
在DDS技术中,药效成分的改性材料是重要的。本说明书中的术语“药效成分的改性材料”是指通过与药效成分共价结合或通过非共价型相互作用改性药效成分的材料。通过使用改性材料,可以改变药效成分的各种性质(例如,药代动力学(如吸收、分布、代谢和***)、药理作用、稳定性等)。作为以前被用作药效成分改性材料的物质,有各种物质,最普遍地是大分子材料。例如,合成大分子聚乙二醇(PEG)及其衍生物被广泛用作药效成分的改性材料。已经开发了许多在PEG链的末端具有药效成分结合用官能团的药效成分改性材料,并且这种改性材料被实际用于制备药物。具体应用实例包括聚乙二醇化干扰素α(商品名:派罗欣(PEGASYS))。由于干扰素α分子量小且容易被***到尿中,存在其在血液中半衰期短的问题。然而,通过将干扰素α与分子量40,000的PEG链共价结合形成高分子量的干扰素α结合物,成功地显著提高了在血液中的半衰期。如上所述,验证了利用大分子材料改性药效成分或用于DDSs纳米微粒载体的显著效果。
然而,另一方面,指出了一个问题。例如,当向血液给予在生物体内不降解且不受肾小球滤过的高分子量合成大分子时,存在该大分子在特定器官内蓄积的风险和发生由于蓄积引起的副作用的风险。原因是血液中存在的分子量几万或更小的分子经受肾小球滤过而被迅速***到尿中,但是分子量几万或更大的分子不经受肾小球滤过并限制其***到尿中。因此,期待能安全使用的药效成分改性材料。
此外,当PEG被用作载体时,PEG通常通过共价键与药效成分连接。虽然共价键具有优异的稳定性,但是由于药效成分的一部分结构发生改变,存在药效成分的生理活性变化的问题。此外,当药效成分具有多个官能团时,存在合成具有不同PEG链结合位置和结合数的组的问题。这样的问题在生物药物中,特别是蛋白质药物和肽药物中成为致命的问题。原因是可重现地制备相同质量的产品是非常困难的。为了将PEG分子与特定的氨基酸残基共价结合需要化学创造力和独创性,并且存在可能需要特定的氨基酸序列、可能限制药效成分的种类等各种问题。
另一方面,近年来在进行诸如SiRNA和RNA适体的核酸药物的开发。由于核酸药物组分DNA和RNA分别容易被DNA降解酶和RNA降解酶降解,需要使用合适的载体防止降解。此外,在核酸药物包含低分子量核酸药效成分的情况下,需要将其与大分子载体结合以延长血液中滞留时间。而且,优选这些核酸用大分子载体在必要时被赋予靶向功能。寻求安全的、具有核酸结合性的以及能解决这些问题的大分子载体。
多糖长期被用作食品原料,而近年来,作为环境友好的大分子材料、作为具有生物相容性的安全材料和进一步作为功能性材料开始被关注。天然存在的多糖可以分类为以淀粉、纤维素和糊精为代表的中性多糖,和以海藻酸和透明质酸为代表的酸性多糖。另一方面,不存在天然碱性多糖。人工制备碱性多糖的方法,包括将甲壳素化学脱乙酰化的方法,甲壳素是天然来源的多糖,即N-乙酰基葡糖胺的均聚物。这种多糖通常被称为壳聚糖,是工业上可应用的唯一的碱性多糖。
壳聚糖分子内有多个氨基,并且与核酸牢固结合形成被称为聚电解质复合物(polyplex)的非常巨大的壳聚糖:核酸缔合物。存在这种聚阴离子和聚阳离子之间的键太牢固以至于它们难以解离的问题。
通过例如在浓碱溶液中煮沸甲壳素,使甲壳素骨架中2位碳上的乙酰胺基团转换为游离伯氨基的方法制备壳聚糖。然而,在该方法中,通过甲壳素主链的裂解,壳聚糖被降解为更低分子量的分子,而且难以严格控制完全的脱乙酰化,因此,多糖中大量葡糖胺和N-乙酰基葡糖胺随机排列。该多糖分子中葡糖胺的数目不能严格控制。此外,在该方法中,不可能选择性地仅对该多糖的非还原端脱乙酰化,而制备其中葡糖胺只结合到非还原端的多糖。即在该方法中,不可能控制壳聚糖和核酸之间键的强度和解离的难易程度。此外,甲壳素和壳聚糖不能在体内迅速降解。因此,分子量不小于肾小球滤过分离尺寸的甲壳素和壳聚糖有在体内蓄积的风险。如上所述,虽然唯一的阳离子多糖壳聚糖具有核酸结合性,但是它作为核酸药物载体的用处有限。
自然界中还未发现其中氨基糖残基仅结合到非还原端的含氨基糖的葡聚糖。甚至用化学方法,也不可能合成其中氨基糖残基仅结合到非还原端的含氨基糖的葡聚糖,而且没有公开化学合成其中氨基糖残基仅结合到非还原端的含氨基糖的葡聚糖。此外,还不知道其中结合的氨基糖残基的数目能被严格控制的多糖。
非专利文献5公开了通过2-叠氮-2-脱氧吡喃葡萄糖-1-磷酸的化学还原反应可以合成葡糖胺-1-磷酸(GlcN-1-P),和通过使源自马铃薯的α-葡聚糖磷酸化酶作用于葡糖胺-1-磷酸和麦芽低聚糖的混合物制备在非还原端具有葡糖胺残基的麦芽低聚糖。然而,非专利文献5没有公开或提示将类似的方法用于高分子量葡聚糖和支链葡聚糖。它没有公开葡聚糖分子中葡糖胺残基的数目可以被控制。而且,它没有公开或提示控制葡聚糖分子中葡糖胺残基的数目对与诸如核酸的带负电荷的物质结合的强度和形式有重要影响。非专利文献5没有公开或提示在非还原端具有一个葡糖胺残基的葡聚糖具有与诸如核酸的带负电荷的物质的结合性,以及这种葡糖胺具有提高诸如核酸的带负电荷的物质的表观分子量的功能。此外,当通过非专利文献5所述的方法获得含葡糖胺的葡聚糖时,不可能从含葡糖胺的葡聚糖产物中分离出用于反应的葡糖胺-1-磷酸。由于药材不允许混入杂质,因此含有未除去的葡糖胺-1-磷酸的含葡糖胺的葡聚糖具有不能用作药物的致命的缺点。
[现有技术文献]
[非专利文献]
[非专利文献1] Hiroaki Okada, "Drug delivery
using functional DDS carriers" Chapter 1, General Statement: Kinousei DDS
carrier wo mochiita seizai sekkei ni yoru soyaku (Drug Discovery by Preparation
Design Using Functional DDS Carrier), CMC Publishing Co., Ltd., 2008, 1-23
[非专利文献2] Masayuki Yokoyama, "Polymeric
materials for drug carriers, Special Topic, DDS ni riyou sareru kobunshi kagaku
(Polymer Chemistry Utilized in DDS)", Drug Delivery System 23-6, 2008:
610-617
[非专利文献3] Maria Laura Immordino et al.,
International Journal of Nanomedicine 2006: 1(3) 297-315
[非专利文献4] J. Milton Harris and Robert B. Chess,
NATURE REVIEWS, DRUG DISCOVERY, VOLUME 2, MARCH 2003, 214-221
[非专利文献5] Nawaji et al., Carbohydr. Res. 2008,
343, 2692-2696。
发明内容
本发明要解决的问题
本发明的目的是解决上述问题。
可以安全使用的带负电荷的药效成分的理想改性材料被认为具有以下特征:
(1)该改性材料应该是能在生物体内降解的大分子材料;
(2)该改性材料应该具有稳定的质量使得其能用作药物。即结构可以确定,并且每次应该能制备具有相同质量的改性材料;
(3)该改性材料应该是可以具有任意数目的可与带负电荷的药效成分在分子中的特定位点结合或相互作用的氨基的大分子材料。
核酸的改性材料被认为优选具有以下特征:
(4)该改性材料应该具有核酸结合性,以及具有提高核酸表观分子量的功能。
本发明人认为作为药效成分改性材料最优秀的大分子物质是葡聚糖(在本说明书中,葡聚糖是指α-1,4-葡聚糖和具有α-1,6-键支链的α-1,4-葡聚糖)。由于作为储备多糖在动植物体内蓄积的糖原或淀粉是一种葡聚糖,它是在人体内始终存在的成分,并且具有优异的生物相容性。此外,葡聚糖在体内经历α-淀粉酶水解,并被转化为在体内始终存在的成分葡萄糖或麦芽低聚糖。因此,葡聚糖可以说是最安全的大分子材料。
葡聚糖具有其结构设计相对容易的另一个优点。控制葡聚糖分子量、支化度、环化等的方法是已知的。可以得到其中葡萄糖残基仅用α-1,4-键结合的完全直链葡聚糖、一些葡萄糖残基用α-1,6-键结合的高频率支化的葡聚糖等。在支链葡聚糖中,每当增加一个α-1,6-键,产生一个新的非还原端。α-1,6-键的数目可以根据需要在葡聚糖分子合成时适当调整。
另一方面,当葡聚糖用作药效成分的改性材料时,最大的问题是它不具有能与药效成分结合或相互作用的官能团。通过化学反应可以在葡聚糖中存在的大量羟基上引入阳离子或阴离子官能团。然而,当使用这样的步骤时,葡聚糖中官能团的引入位置是随机的,而且难以获得相同质量的改性材料。因此,该步骤对于在药物中应用不是优选的。
因此,试图提供一种适用于药物的药效成分,特别是带负电荷的药效成分的改性材料。
解决问题的方法
为了解决上述问题,本发明人认为向高分子量葡聚糖链的非还原端特定引入氨基糖(如葡糖胺)是改性葡聚糖的非常理想的方法。如果可以向高分子量葡聚糖的非还原端选择性地引入氨基糖(如葡糖胺),由于引入位置不是随机的,可重现性地制备相同质量的材料,并且所得产品适合用于药物。此外,给予氨基糖不用担心毒性。原因是葡糖胺是具有氨基的单糖,以单一成分或与软骨素(硫酸软骨素)的混合物作为补品或保健食品销售,并且具有低安全性忧虑。而且,氨基糖(如葡糖胺)的氨基可用于与药效成分结合。此外,氨基糖(葡糖胺)在水溶液中变为带正电荷的糖残基。因此,通过向葡聚糖链中引入氨基糖残基,可以赋予葡聚糖链与带负电荷的分子(如在水溶液中带负电荷的药效成分)相互作用的性质。带负电荷的分子的实例包括核酸。迄今为止,还不知道与在水溶液中带负电荷的分子结合并且不用担心在体内滞留的生物可降解载体。因此,本发明的葡聚糖可以说是在近年来收到关注的使用核酸的生物DDS技术中有用的载体。
本发明人发现α-葡聚糖磷酸化酶能利用不是其原始底物的氨基糖-1-磷酸(如葡糖胺-1-磷酸)作为底物,能将氨基糖残基转移到葡聚糖受体的非还原端,而且尽管如此,这种酶几乎不能催化其逆反应,并基于该发现完成了本发明。α-葡聚糖磷酸化酶是一种酶,当作用于原始底物葡萄糖-1-磷酸时,其催化其中将葡萄糖残基转移到葡聚糖受体的反应(葡聚糖合成反应)和其中将葡聚糖非还原端的葡萄糖磷酸解生成葡萄糖-1-磷酸的反应(葡聚糖降解反应)。然而,出人意料地,当这种酶使用氨基糖-1-磷酸(如葡糖胺-1-磷酸)作为底物时,这种酶催化其中将氨基糖残基转移到葡聚糖受体的反应(葡聚糖合成反应),但几乎不催化其中将葡聚糖非还原端的氨基糖残基磷酸解生成氨基糖-1-磷酸的反应(葡聚糖降解反应)。虽然葡聚糖降解反应再次释放结合的氨基糖残基,但是本发明人发现在本发明的方法中,α-葡聚糖磷酸化酶几乎不催化葡聚糖降解反应。即对合成反应的催化活性远高于对降解反应的催化活性。由于这个特征,如果葡聚糖具有多个非还原端,α-葡聚糖磷酸化酶可以将氨基糖残基(如葡糖胺残基)逐个与葡聚糖的多个非还原端结合。通过利用这种酶的这种特性,本发明的含氨基糖的葡聚糖首次成为可制备的。特别是,通过利用这种酶的这种特性,从具有大量(如5或更多个)非还原端的葡聚糖,首次可以得到非还原端改性的葡聚糖,其具有高频率(如50%或更高)的非还原端上氨基糖残基(如葡糖胺残基)的结合率。
在本说明书中,氨基糖是指具有氨基的糖。构成氨基糖的主链单糖的糖可以是单糖(如葡萄糖)或低聚糖。在本说明书中,低聚糖是指其中2或更多个且10或更少个单糖相连的化合物。结合到本发明的含氨基糖的葡聚糖的一个非还原端的氨基低聚糖的聚合度可以是,例如约2或更大、约3或更大、约4或更大、约5或更大等,并且可以是,例如约10或更小、约9或更小、约8或更小、约7或更小、约6或更小、约5或更小、约4或更小、约3或更小、约2或更小等。在一个实施方案中,结合到本发明的含氨基糖的葡聚糖的一个非还原端的氨基低聚糖具有2个糖(即二聚物)。在本说明书中,氨基单糖是指其中糖主链是单糖的氨基糖。在本说明书中,氨基低聚糖是指其中糖主链是低聚糖的氨基糖。
此外,由于通过静电相互作用的键不直接结合分子,因此认为如果将葡聚糖从结合物中降解而分离药效成分的话,该药效成分还保留原有的立体结构。因此,通过静电相互作用的键被认为是药效成分和载体间理想的结合模式。然而,通过静电相互作用的键易于受盐浓度的影响,并且预计在生物体内不稳定。因此,为了控制与核酸的键的强度和缔合物的形式,最好严格控制结合到葡聚糖分子的氨基糖(如葡糖胺)的位置和数目。
而且,本发明人发现含葡糖胺的葡聚糖具有与核酸非共价结合而提高核酸的表观分子量的功能,其中该含葡糖胺的葡聚糖中,至少一个葡糖胺残基与葡聚糖的一个或多个(优选2个或更多个)非还原端的每一个结合。
此外,本发明人发现可以通过控制结合到葡聚糖分子的诸如葡糖胺残基的氨基低聚糖残基的数目来控制与核酸的键的强度和缔合物的形式。
本发明人发现可以制备其中氨基糖残基仅结合到具有适当自由度的多个葡聚糖链的末端的葡聚糖,并且通过开发新型含氨基糖的葡聚糖,可以通过稳定的静电相互作用结合药效成分和载体。
在本发明的含氨基糖的葡聚糖,其改性产物和其结合物中,氨基糖残基仅结合到葡聚糖的非还原端上。在本发明优选的实施方案中,氨基糖残基是葡糖胺残基、半乳糖胺残基或甘露糖胺残基,或其单独或组合的低聚物(如二聚物)残基,并且最优选的是葡糖胺残基。在本发明的含葡糖胺的葡聚糖,其改性产物和其结合物中,葡糖胺残基仅结合到葡聚糖的非还原端上。在本发明中,使用α-葡聚糖磷酸化酶(EC 2.4.1.1)进行氨基糖(如葡糖胺)残基的转移。因此,氨基糖(如葡糖胺)残基与葡聚糖的结合是α-1,4-键。即在葡聚糖末端的葡糖基残基4位上的碳原子与在氨基糖(如葡糖胺)残基1位上的碳原子通过氧原子α结合。除了这种酶以外,还没发现能高产率地将氨基糖(如葡糖胺)直接转移到葡聚糖的酶。由于该含氨基糖的葡聚糖,其改性产物和其结合物在末端具有氨基糖,葡聚糖末端在水溶液中变为带正电荷的,并且改变了葡聚糖的理化性质。该含氨基糖的葡聚糖,其改性产物和其结合物有望被广泛用于食品、化妆品、药物等。
葡聚糖中氨基糖(如葡糖胺)残基的引入量可以通过所用葡聚糖的支化率和非还原端上氨基糖(如葡糖胺)残基的引入频率来控制。当想要提高葡聚糖中氨基糖(如葡糖胺)残基的引入量时,可以通过使用具有高支化率的葡聚糖和提高非还原端上氨基糖(如葡糖胺)的引入频率来提高引入量。当想要减少葡聚糖中氨基糖(如葡糖胺)残基的引入量时,可以通过使用具有低支化率的葡聚糖和降低非还原端上氨基糖(如葡糖胺)的引入频率来减少引入量。葡聚糖中氨基糖(葡糖胺)残基的引入量的下限是其中每个葡聚糖分子引入1个氨基糖(如葡糖胺)残基的情形,这可以通过向未支化的葡聚糖的非还原端引入1个氨基糖(如葡糖胺)残基来获得。而且,由于引入位置在末端,认为对利用α-淀粉酶的葡聚糖的降解性没有影响。在高度支化的葡聚糖的情况下,由于非还原端分布在葡聚糖分子的最外层,在引入氨基糖(如葡糖胺)残基后,所引入的氨基糖(葡糖胺)残基分布在葡聚糖分子的最外层,这对于与药效成分的相互作用或结合是理想的。如上所述,氨基糖(葡糖胺)残基选择性结合在非还原端上的葡聚糖可以是优异的药效成分改性材料。
例如,本发明提供下列项:
(项1)
含氨基糖的葡聚糖,其中至少一个氨基单糖残基与葡聚糖的至少一个非还原端的每一个通过α-1,4-键结合,但在除了葡聚糖的非还原端以外的位置没有氨基糖残基存在,其中葡聚糖是支链α-1,4-葡聚糖或直链α-1,4-葡聚糖,并且葡聚糖的聚合度为约10或更大且约1 x 105或更小,并且优选约15或更大且约4 x 105或更小。
(项2)
根据项1的含氨基糖的葡聚糖,其中葡聚糖是支链α-1,4-葡聚糖,该葡聚糖具有多个非还原端,并且至少一个氨基单糖残基与支链α-1,4-葡聚糖的至少一个(优选2个或更多个)非还原端的每一个通过α-1,4-键结合。即含氨基糖的葡聚糖是含氨基糖的支链葡聚糖,其中葡聚糖具有多个非还原端,并且至少一个氨基单糖残基与支链α-1,4-葡聚糖的至少一个(优选2个或更多个)非还原端的每一个通过α-1,4-键结合,但在除了支链α-1,4-葡聚糖的非还原端以外的位置没有氨基糖残基存在,其中支链α-1,4-葡聚糖的聚合度为约10或更大且约1 x 105或更小,并且优选约15或更大且约4 x 105或更小。
(项3)
根据项2的含氨基糖的葡聚糖,其中支链α-1,4-葡聚糖选自支链麦芽低聚糖、淀粉、支链淀粉、糖原、糊精、酶法合成的支链葡聚糖和高支化环葡聚糖。
(项4)
根据项1-3中任一项的含氨基糖的葡聚糖的羟基改性产物,其中羟基改性是对葡聚糖的一些或所有醇羟基改性,并且羟基改性独立地选自羟烷基化、烷基化、乙酰化、羧甲基化、硫酸化和磷酸化。
(项5)
根据项1-3中任一项的含氨基糖的葡聚糖或其羟基改性产物的还原端改性产物。
(项6)
根据项1-3中任一项的含有氨基糖的葡聚糖、其羟基改性产物或其还原端改性产物的氨基改性产物,其中氨基改性是对氨基单糖残基的一些或所有氨基改性,氨基改性通过氨基和氨基改性试剂的反应实现,并且氨基改性试剂具有至少一个羧基和至少一个其它官能团。
(项7)
根据项1-3中任一项的含氨基糖的葡聚糖、其羟基改性产物、其还原端改性产物或其氨基改性产物的非还原端改性产物,其中靶向分子和未与葡聚糖的葡糖胺残基结合的至少一个非还原端结合,或与葡糖胺残基的4位结合,其中靶向分子选自甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、N-乙酰基葡糖胺、木糖、岩藻糖、半乳糖胺、抗体、抗体片段、受体、受体片段和受体配体。
(项8)
制备含氨基糖的葡聚糖的方法,其特征在于使α-葡聚糖磷酸化酶作用于包含葡聚糖和氨基糖-1-磷酸的水溶液,其中所述葡聚糖是支链α-1,4-葡聚糖或直链α-1,4-葡聚糖,并且葡聚糖的聚合度是约10或更大且约1 x 105或更小,并且优选约15或更大且约4 x 105或更小。
(项9)
根据项8的方法,其中α-葡聚糖磷酸化酶与源自超嗜热菌(Aquifex aeolicus)VF5的α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列具有95%或更高的序列一致性,并且具有将氨基糖转移到支链葡聚糖的非还原端而形成α-1,4-键的活性。
(项10)
药物,包含根据项1-3中任一项的含氨基糖的葡聚糖、其羟基改性产物、其还原端改性产物、其氨基改性产物或其非还原端改性产物和药效成分。
(项11)
根据项10的药物,其中药效成分选自低分子量有机化合物、蛋白质、肽、抗体、抗体片段、受体、受体片段、DNA、RNA、siRNA、miRNA和RNA适体。
(项12)
临床诊断用组合物,包含根据项1-3中任一项的含氨基糖的葡聚糖、其羟基改性产物、其还原端改性产物、其氨基改性产物或其非还原端改性产物。
(项13)
DDS用纳米微粒载体,包含根据项1-3中任一项的含氨基糖的葡聚糖、其羟基改性产物、其还原端改性产物、其氨基改性产物或其非还原端改性产物。
(项14)
根据项13的载体,其中DDS用纳米微粒载体选自脂质体、病毒颗粒、大分子胶束和带疏水基团的大分子组成的纳米凝胶。
(项15)
由包含能在细胞内表达的基因的核酸分子和根据项1的含氨基糖的支链葡聚糖形成的复合物。
(项16)
根据项15的复合物,其中核酸分子选自DNA、RNA、siRNA、miRNA和RNA适体。
(项17)
由根据项15或16的复合物载体和阳离子聚合物或阳离子脂质形成的复合物。
(项18)
根据项17的复合物,其中阳离子聚合物包括至少一种选自聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚精氨酸、聚酰胺-胺树枝状聚合物、聚氨基苯乙烯、壳聚糖、阳离子葡聚糖和DEAE-右旋糖苷的阳离子聚合物。
(项19)
将核酸分子传递到离体细胞中的方法,其包括使根据项15-18中任一项的复合物与细胞接触。
在一个实施方案中,氨基糖是葡糖胺,并且在此情况下,本发明如下:
(项1A)
含葡糖胺的葡聚糖,其中至少一个葡糖胺残基与葡聚糖的至少一个非还原端的每一个通过α-1,4-键结合,但在除了葡聚糖的非还原端以外的位置没有葡糖胺残基存在,其中葡聚糖是支链α-1,4-葡聚糖或直链α-1,4-葡聚糖,并且葡聚糖的聚合度为约10或更大且约1 x 105或更小,并且优选约15或更大且约4 x 105或更小。即,含葡糖胺的葡聚糖是含葡糖胺的支链葡聚糖,其中葡聚糖具有多个非还原端,并且至少一个葡糖胺残基与支链α-1,4-葡聚糖的至少一个(优选2个或更多个)非还原端的每一个通过α-1,4-键结合,但在除了葡聚糖的非还原端以外的位置没有葡糖胺残基存在,其中支链α-1,4-葡聚糖的聚合度为约10或更大且约1 x 105或更小,并且优选约15或更大且约4 x 105或更小。
(项2A)
根据项1A的含有葡糖胺的葡聚糖,其中该葡聚糖是支链α-1,4-葡聚糖,该葡聚糖具有多个非还原端,并且至少一个葡糖胺残基与该支链α-1,4-葡聚糖的至少一个非还原端的每一个结合。
(项3A)
根据项2A的含葡糖胺的葡聚糖,其中支链α-1,4-葡聚糖选自支链麦芽低聚糖、淀粉、支链淀粉、糖原、糊精、酶法合成的支链葡聚糖和高支化环葡聚糖。
(项4A)
根据项1A-3A中任一项的含葡糖胺的葡聚糖的羟基改性产物,其中羟基改性是对葡聚糖的一些或所有醇羟基改性,并且羟基改性独立地选自羟烷基化、烷基化、乙酰化、羧甲基化、硫酸化和磷酸化。
(项5A)
根据项1A-3A中任一项的含葡糖胺的葡聚糖或其羟基改性产物的还原端改性产物。
(项6A)
根据项1A-3A中任一项的含葡糖胺的葡聚糖、其羟基改性产物或其还原端改性产物的氨基改性产物,其中氨基改性是对葡糖胺残基的一些或所有氨基改性,氨基改性通过氨基和氨基改性试剂的反应实现,并且氨基改性试剂具有至少一个羧基和至少一个其它官能团。
(项7A)
根据项1A-3A中任一项的含葡糖胺的葡聚糖、其羟基改性产物、其还原端改性产物或其氨基改性产物的非还原端改性产物,其中靶向分子和未与葡聚糖的葡糖胺残基结合的至少一个非还原端结合,其中靶向分子选自甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、N-乙酰基葡糖胺、木糖、岩藻糖、半乳糖胺、抗体、抗体片段、受体、受体片段和受体配体。
(项8A)
制备含葡糖胺的葡聚糖的方法,其特征在于使α-葡聚糖磷酸化酶作用于包含葡聚糖和葡糖胺-1-磷酸的水溶液,其中葡聚糖是支链α-1,4-葡聚糖或直链α-1,4-葡聚糖,并且葡聚糖的聚合度为约10或更大且约1 x 105或更小,并且优选约15或更大且约4 x 105或更小。
(项9A)
根据项8A的方法,其中α-葡聚糖磷酸化酶与源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列具有95%或更高的序列一致性,并且具有将葡糖胺转移到支链葡聚糖的非还原端而形成α-1,4-键的活性。
(项10A)
药物,包含根据项1A-3A中任一项的含葡糖胺的葡聚糖、其羟基改性产物、其还原端改性产物或其氨基改性产物和药效成分。
(项11A)
根据项10A的药物,其中药效成分选自低分子量有机化合物、蛋白质、肽、抗体、抗体片段、受体、受体片段、DNA、RNA、miRNA和RNA适体。
(项12A)
临床诊断用组合物,包含根据项1A-3A中任一项的含葡糖胺的葡聚糖、其羟基改性产物、其还原端改性产物或其氨基改性产物。
(项13A)
DDS用纳米微粒载体,包含根据项1A-3A中任一项的含葡糖胺的葡聚糖、其羟基改性产物、其还原端改性产物或其氨基改性产物。
(项14A)
根据项13A的载体,其中DDS用纳米微粒载体选自脂质体、病毒颗粒、大分子胶束和带疏水基团的大分子组成的纳米凝胶。
(项15A)
由包含能在细胞内表达的基因的核酸分子和根据项1A-3A中任一项的含葡糖胺的支链葡聚糖形成的复合物。
(项16A)
根据项15A的复合物,其中核酸分子选自DNA、RNA、siRNA、miRNA和RNA适体。
(项17A)
由根据项15A或16A的复合物载体和阳离子聚合物或阳离子脂质形成的复合物。
(项18A)
根据项17A的复合物,其中阳离子聚合物包括至少一种选自聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚精氨酸、聚酰胺-胺树枝状聚合物、聚氨基苯乙烯、壳聚糖、阳离子葡聚糖和DEAE-右旋糖苷的阳离子聚合物。
(项19A)
种将核酸分子传递到细胞中的方法,包括使根据项15A-18A中任一项的复合物与细胞接触。
发明效果
在本发明的含氨基糖的葡聚糖、其羟基改性产物、其还原端改性产物、其氨基改性产物和其结合物中,氨基糖残基仅结合到葡聚糖的非还原端上。由于该含氨基糖的葡聚糖、其羟基改性产物、其还原端改性产物、其氨基改性产物和其结合物在末端具有氨基糖,葡聚糖末端在水溶液中变为带正电荷的,并且改变了葡聚糖的理化性质。该含氨基糖的葡聚糖、其羟基改性产物、其还原端改性产物、其氨基改性产物和其结合物有望被广泛用于食品、化妆品、药物等。这些葡聚糖具有以下特征,当用作药效成分的载体时,由于通过静电相互作用的键,这些葡聚糖不会很大程度上改变药效成分的化学结构,并且每个载体分子可以将多个氨基糖结合到非还原端上。因此,这些葡聚糖可以稳定地保持药效成分。
由于本发明的含氨基糖的葡聚糖、其羟基改性产物、其还原端改性产物和其氨基改性产物相比于未改性的葡聚糖的血液半衰期,可以提高在血液中的半衰期,并且最终在生物体内被完全降解并从肾脏中排出,所以它们具有非常高的安全性。因此,它们可用作药效成分的改性材料、临床诊断试剂、造影剂和DDS用纳米微粒载体。在本发明的含氨基糖的葡聚糖、其羟基改性产物、其还原端改性产物和其氨基改性产物中,由于它们的结构可以通过酶反应控制,因此它们也具有优异的质量稳定性。
在本发明的含氨基糖的葡聚糖和其改性产物中,由于氨基糖残基仅结合到葡聚糖的非还原端上,可以在结构上分离与其它分子相互作用的位点和抑制降解的位点。而且,本发明的含氨基糖的葡聚糖及其改性产物与天然存在的葡聚糖相比降解被适当抑制,与其它分子间的相互作用不太强,并且随着葡聚糖部分被降解可以适当地释放其它分子,因此,它们通过与其它分子缔合可以赋予其它分子适当的降解性。此外,本发明的含氨基糖的葡聚糖及其改性产物和其结合物在体内被酶降解,因此不会引起由于在体内过度长期滞留的残留性问题。
当本发明的含氨基糖的葡聚糖和其改性产物与诸如核酸分子的带负电荷的物质缔合时,可以控制缔合物的分子量。由于考虑到安全性、结果稳定性和再现性,优选可以控制DDS中给药产物的分子量,因此本发明的含葡糖胺的葡聚糖和其改性产物可有效用作优异的DDS用载体。
附图简述
[图1] 图1是将葡糖胺残基转移到支链葡聚糖的非还原端的反应的示意图。用星号表示的部分的结构示于方框中。
[图2] 图2是制备例2中所得支链葡聚糖的酶处理产物、以及使制备例1中源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶作用于葡糖胺-1-磷酸和制备例2的支链葡聚糖所得产物(实施例1所得产物)的酶处理产物用DIONEX制HPAEC-PAD装置分析的结果。横轴表示溶出时间(elusion
time)(分钟)。A表示通过分析用足量(即过量)异淀粉酶降解支链葡聚糖的支化部分而断裂所有支链后的降解产物所得的结果。关于图2A中峰上的数字,6表示麦芽六糖,7表示麦芽七糖。其上方用黑色实心圆表示的峰从左到右表示葡萄糖聚合度为8-14的麦芽低聚糖。图2B表示通过分析用过量异淀粉酶降解支链葡聚糖、然后进一步用过量的源自微生物的α-葡萄糖苷酶降解后所得降解产物所得的结果。由于α-葡萄糖苷酶是从非还原端开始以葡萄糖单元降解葡聚糖的酶,支链葡聚糖被完全降解,并且检测到葡萄糖的峰(由图2B中“葡萄糖”表示)。图2C是分析用过量的异淀粉酶降解本实施例1所得含葡糖胺的支链葡聚糖所得降解产物所得的结果。虽然图2C中用黑色实心圆表示的峰对应于在与图2A中相应位置用黑色实心圆表示的峰相同的溶出时间检测到的峰,但是检测到具有与其不同间隔的用“x”表示峰。图2D表示分析用异淀粉酶降解本实施例1所得含葡糖胺的支链葡聚糖、并进一步用过量的源自微生物的α-葡萄糖苷酶降解后所得降解产物所得的结果。由于降解用黑色实心圆表示的这组峰消失,结果出现葡萄糖的峰(在图2D中由“葡萄糖”表示),然而,用“x”表示的峰没有消失。即“x”所示的峰表示的部分降解产物表现出对α-葡萄糖苷酶降解的抗性。图2E表示分析用过量异淀粉酶降解本实施例1所得含葡糖胺的支链葡聚糖、并进一步同时用过量的源自微生物的α-葡萄糖苷酶和过量的α-淀粉酶降解后所得降解产物所得的结果。结果,除了葡萄糖的峰,还检测到用星号表示的峰。星号所示的峰表示含葡糖胺的低聚糖(三糖),这是不能被α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶降解的最小单元,因此,可知获得了葡糖胺残基结合到非还原端的葡聚糖。
[图3] 图3是表示形成实施例1的含葡糖胺的葡聚糖和DNA的复合物的图。相对于0.5 μg λ DNA-Hind III片段,分别对于样品1加入离子交换水、对于样品2加入0.1 mg支链葡聚糖、对于样品3加入0.5 mg支链葡聚糖、对于样品4加入0.1 mg含葡糖胺的支链葡聚糖、对于样品5加入0.5 mg含葡糖胺的支链葡聚糖、对于样品6加入与样品4中所含葡糖胺单元相同摩尔浓度的葡糖胺、对于样品7加入与样品5中所含葡糖胺单元相同摩尔浓度的葡糖胺,并使它们(10 μl)在室温下静置5分钟,然后进行1%琼脂糖凝胶电泳。虽然对样品1-3检测到条带(a),但是当加入含葡糖胺的支链葡聚糖时,DNA没有通过琼脂糖凝胶迁移(b)。因此,可以知道阳离子化的含葡糖胺的支链葡聚糖能与DNA形成复合物。此外,在加入了葡糖胺的样品6和7中,与未添加葡糖胺的情况相比迁移率没有变化,可知葡糖胺对于提高DNA分子量没有效果。
[图4] 图4是表示低聚(dT)-纤维素和实施例3的含葡糖胺的支链葡聚糖(BN5和BN6)或实施例4的含葡糖胺的支链葡聚糖(PN6)之间结合力的图。将低聚(dT)-纤维素悬浮于各浓度的NaCl溶液中(0.1 M、0.2 M、0.3 M、0.5 M、1 M或2 M),加入实施例3或实施例4所得的含葡糖胺的支链葡聚糖并使其在室温下静置30分钟,然后离心分离,并测定在上清液部分中所含的未与低聚(dT)-纤维素结合的含葡糖胺的支链葡聚糖的量,由此计算结合的阳离子化的葡聚糖的量(总糖量)相对于加入的含葡糖胺的葡聚糖的量(总糖量)的百分比(%)。所得结果如图所示。可知在1 M或更高的NaCl中PN6与核酸分离。可知在0.5 M或更高的NaCl中BN6与核酸分离。可知在0.2或更高时BN5与核酸分离。存在一分子的含葡糖胺的支链葡聚糖中所含葡糖胺残基的数目越多,这些残基分离的NaCl浓度越高的趋势。因此,可以通过控制葡糖胺结合到支链葡聚糖的频率来控制与核酸的结合力。在使用聚赖氨酸的情况下,聚赖氨酸与核酸牢固结合,而甚至在2 M
NaCl中不与核酸分离。
[图5] 图5是在使用实施例4的含葡糖胺的支链葡聚糖(PN6)的情况下,表示巨噬细胞系转染率的图。将含葡糖胺的支链葡聚糖与含有编码源自萤火虫的荧光素酶的LUC基因的质粒培养24小时,然后测定荧光素酶活性。如图5所示,可知PN6表现出转染功能,特别是,当N/P比为200时表现出最高的转染率。虽然聚乙烯亚胺在N/P比为10和50时表现出高转染率,但当N/P比为200时转染率明显降低。聚赖氨酸在N/P比为2时表现出最高的转染率,但当N/P比大于10时转染率明显降低。
[图6] 图6是当使用实施例4的含葡糖胺的支链葡聚糖(PN6)时,评价巨噬细胞系转染中细胞毒性的图。测定实施例11中所得细胞裂解液的上清液中的蛋白质浓度,并作为毒性的量度。如图6所示,表明PN6对细胞的毒性低。当使用聚乙烯亚胺和聚赖氨酸时,在N/P比为50和200时观察到明显的毒性。
本发明的实施方式
下面将详细说明本发明。
在本说明书中,除非另有说明,应该理解单数形式的表达也包括其复数形式的概念。此外,除非另有说明,应该理解本说明书中所用术语使用本领域常用的含义。
(常规技术)
本说明书中所用分子生物学的方法、生物化学的方法和微生物学的方法是本领域公知的常规方法,并记载于例如Sambrook,
J. et al., (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
and its 3rd Ed. (2001); Ausubel, F.M. (1987). Current Protocols in Molecular
Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Ausubel, F.M. (1989).
Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current
Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience;
Innis, M.A. (1990). PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications,
Academic Press; Ausubel, F.M. (1992). Short Protocols in Molecular Biology: A
Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub.
Associates; Ausubel, F.M. (1995). Short Protocols in Molecular Biology: A
Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub.
Associates; Innis, M.A. et al., (1995). PCR Strategies, Academic Press;
Ausubel, F.M. (1999). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of
Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, and annual updates;
Sninsky, J.J. et al., (1999). PCR Applications: Protocols for Functional
Genomics, Academic Press, Bessatsu Jikken-igaku "Idenshidounyu & Hatsugen
kaiseki jikkenhou" (实验医学分卷"Experimental
methods for gene introduction and expression analysis"), Yodosha Co.,
Ltd., 1997等中,其相关部分(可以是全部)并入本文作为参考。
制备人工合成基因的DNA合成技术和核酸化学记载于例如Gait, M.J.
(1985). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Gait, M.J.
(1990). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein,
F. (1991). Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approac, IRL Press;
Adams, R.L. et al., (1992). The Biochemistry of the Nucleic Acids, Chapman
& Hall; Shabarova, Z. et al., (1994). Advanced Organic Chemistry of Nucleic
Acids, Weinheim; Blackburn, G.M. et al., (1996). Nucleic Acids in Chemistry and
Biology, Oxford University Press; Hermanson, G.T. (I996). Bioconjugate
Techniques, Academic Press等中,其相关部分通过引用结合到本文中。
当在本说明书中提及基因时,“载体”或“重组载体”是指能将目标多核苷酸序列转移到目标细胞的载体。这种载体的实例包括在宿主细胞,如原核细胞、酵母菌、动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、动物个体和植物个体中能自主复制,或能并入染色体中,并且在适合转录本发明的多核苷酸的位点具有启动子的载体。在这种载体中,适合于克隆的那些载体被称为“克隆载体”。这种克隆载体通常包括含有多个限制酶位点的多克隆位点。这种限制酶位点和多克隆位点是本领域公知的,并且本领域技术人员可以根据目的适当选择和使用它们。这种技术记载于本说明书所述文献中(如Sambrook,
et al., supra)。优选的载体包括但不限于质粒、噬菌体、粘性质粒、附加体、病毒颗粒或病毒、以及可整合的DNA片段(即可以通过同源重组整合到宿主基因组中的片段)。
一种类型的载体是“质粒”,是指能与附加DNA片段连接的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体,其中附加DNA片段可以连接到病毒基因组。特定的载体(如具有细菌复制起点的细菌载体和附加体哺乳动物载体)能在这些载体被导入的宿主细胞中自主复制。其它载体(例如非附加体哺乳动物载体)在引入宿主细胞后被整合到宿主细胞的基因组中,因此与宿主基因组一起被复制。此外,特定的载体能够指导与这些载体可操作地连接的基因的表达。这种载体在本说明书中被称为“表达载体”。
因此,在本说明书中,“表达载体”或“表达质粒”是指核酸序列,其中各种调控元件以及结构基因和调节其表达的启动子,在宿主细胞中以可操作的条件连接。表达载体优选是可操作地连接到目标结构基因以便转录和翻译目标结构基因的载体,而且必要时含有对宿主细胞内的复制和重组体的选择必要的因子。调控元件优选可含有终止子、诸如药物抗性基因的可选标记物和增强子。生物体(如哺乳动物)的表达载体的类型和所用调控元件的种类可以根据宿主细胞改变,这是本领域技术人员公知的。当目的是表达产物(α-葡聚糖磷酸化酶或药效成分)的分泌制备时,将编码分泌信号肽的多核苷酸,在正确的阅读框中连接到编码目标蛋白质的DNA的上流。
优选的表达载体包括在大肠杆菌中也能表达的pTRC99A(Pharmacia制)等。为了可操作地将α-葡聚糖磷酸化酶基因连接到上述表达载体中对转录和翻译必要的因子上,在某些情况下应该处理目标α-葡聚糖磷酸化酶基因。实例包括其中启动子和编码域之间的距离太长,而预料到转录效率降低的情况,或其中核糖体结合部位与翻译起始密码子之间的距离不合适的情况等。处理方法包括用限制酶消化、用诸如Bal31和ExoIII的核酸外切酶消化、或用诸如M13的单链DNA引入定点突变或PCR。
作为可用于本发明的原核细胞的“重组载体”,列举pcDNA3(+)、pBluescript-SK(+/-)、pGEM-T、pEF-BOS、pEGFP、pHAT、pUC18、pFT-DESTTM
42GATEWAY、pENTRTM/D-TOPO (Invitrogen)等。原核细胞可用于基因的扩增、修饰等。
可用于本发明的真核细胞的“重组载体”包括但不限于pECFP (Clontech)、pAcGFP (Clontech)、pEYFP
(Clontech)、pDsRED (Clontech)、pTRE (Clontech)、pCMV
(Clontech)、pcDNA (Invitrogen)、pTarget (Promega)等。
在本说明书中,“哺乳动物表达载体”是指核酸序列,其中调节本发明的基因表达的诸如启动子的各种调控元件在宿主细胞内可操作地连接。本申请的说明书中所用术语“调控序列”是指具有功能性启动子和任意相关的转录元件(如增强子、CCAAT盒、TATA盒、SPI位点等)的DNA序列。本申请的说明书中所用术语“可操作地连接”是指与基因相关的多核苷酸和调节基因表达的诸如启动子和增强子的各种调控元件在宿主细胞内以可操作的条件连接,使得该基因能够被表达。哺乳动物表达载体优选可包括哺乳动物基因、启动子、终止子、药物抗性基因和增强子。对本领域的技术人员来说,所用表达载体的类型和调控元件的种类可以根据宿主细胞改变是公知的。
上述哺乳动物表达载体可以使用本领域技术人员公知的基因重组技术制备。为了构建哺乳动物表达载体,优选使用例如pECFP型载体、pcDNA型载体等,但不局限于此。
在本说明书中,“终止子”是位于基因的蛋白质编码区域下游,并涉及在转录DNA到mRNA中转录的终止和聚A序列的加成的序列。已知终止子有助于mRNA的稳定性并影响基因的表达水平。
在本说明书中,“启动子”是指DNA上决定基因的转录起始点并直接调节转录频率的区域,并且是与RNA聚合酶结合从而引发转录的碱基序列。假定的启动子区域随着每个结构基因而改变,而没有限制的话通常是结构基因的上游,并且可以是结构基因的下游。
虽然启动子可以是诱导型的、组成型的、位点导向型的或阶段特异性的,但优选组成型启动子或诱导型启动子。只要其能在诸如哺乳动物细胞、大肠杆菌或酵母菌的宿主细胞中表达,可以是任何启动子。
在本说明书中,启动子是“组成型的”的表达意味着在生物体生长/繁殖的无论任何阶段,启动子在有机体的所有组织中以几乎固定的量被表达的特性。特别是,在本发明的定义中,当用印迹杂交(Northern
blot)分析时,如果在相同或相应位点的任一个,例如,在任何时间点(如在2个或更多个的点(如在第5天和第15天)),观察到几乎相同程度的表达量,该表达被称为组成型的。据信组成型启动子在维持处于正常生长环境中的生物体的体内平衡中起作用。本发明的启动子的“应答型”表达意味着当至少一个因子被给予生物体时,表达量发生改变的特性。特别是,表达量增加的特性被称为被因子“诱导的”,而表达量减少的特性被称为被因子“减少的”。由于“减少”表达具有该表达在正常条件下被观测的前提,它是与“组成型”表达重合的概念。这些特性可以通过从生物体的任何部分提取RNA,并通过印迹杂交分析分析表达量,或通过免疫印迹(western blot)定量表达的蛋白质而确定。使用整合了因子诱导型启动子和编码本发明的位点导向重组诱导因子的核酸的载体转化的哺乳动物细胞或哺乳动物(包括特定组织等)能通过使用具有对该启动子的诱导活性的刺激因子,在一定条件下进行位点导向重组序列的位点导向重组。
本发明的多核苷酸可以用本领域技术人员公知的方法完整地或经修饰地连接到适当的表达载体上,并通过已知的基因重组技术导入宿主细胞中。导入的基因与宿主细胞内的DNA存在整合。需要注意的是,宿主细胞中的DNA不仅包括包含在染色体中的DNA,还包括包含在宿主细胞内所含各种细胞器(如线粒体等)中的DNA。
当大肠杆菌被用作宿主细胞时,可以包含源自大肠杆菌、噬菌体等的启动子,如trp启动子(Ptrp)、lac启动子(Plac)、PL启动子、PR启动子和PSE启动子、SPO1启动子、SPO2启动子、penP启动子等。此外,也可以使用人工设计和调制的启动子等,如由2个连续排列的Ptrps组成的启动子(Ptrp x2)、tac启动子、lacT7启动子、let I启动子。
在本说明书中,“复制起点”是指染色体上DNA复制开始的特定区域。可以通过构建载体以便包含内源性起点,或通过宿主细胞的染色体复制机能提供复制起点。当载体被整合到宿主细胞染色体时,后者可以是充足的。另一方面,本领域技术人员能够通过与可选择的标记物和本发明的DNA共转化,而不是通过使用包含病毒复制起点的载体,来转化哺乳动物细胞。合适的可选择的标记物的实例是二氢叶酸还原酶(DHFR)或胸苷激酶(参见第4,399,216号美国专利)。
在本说明书中,“可操作地连接”是指所需序列的表达(操作)置于转录和翻译调控序列(如启动子、增强子等)或翻译调控序列的控制下。为了将启动子与基因可操作地连接,通常启动子被立即置于该基因的上游,但没有必要将该启动子与该基因相邻地设置。
在本说明书中,将核酸分子导入细胞的技术可以是任何技术。这种技术的实例包括,例如转化、转导和转染。这种导入核酸分子的技术在本领域是公知和常规的,而且被记载于,例如Ausubel
F.A. et al., ed. (1988), Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York,
NY; Sambrook J et al., (1987) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.
and 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY;
Bessatsu Jikken-igaku "Idenshidounyu & Hatsugen kaiseki
jikkenhou" (a separate volume of Experimental Medicine "Experimental
methods for gene introduction and expression analysis"), Yodosha Co.,
Ltd., 1997等。可以通过利用本说明书中描述的方法,如印迹杂交分析和免疫印迹分析或其它公知和常规的技术确认基因的导入。
此外,作为导入载体的方法,可以使用上述将DNA导入细胞的任何方法,该方法包括,例如转化、转导、转染等(如磷酸钙法、脂质体法、DEAE-右旋糖苷法、电穿孔法、使用粒子枪(基因枪)的方法等)。
在本说明书中,“转化体”是指通过转化制备的生物体的整体或一部分(如细胞)。转化体的实例包括原核细胞、酵母菌、动物细胞、植物细胞、昆虫细胞等。转化体根据主体也可以指转化的细胞、转化的组织或转化的宿主。本发明所用的细胞可以是转化体。
当原核细胞在本发明中被用于基因操作等时,原核细胞的实例包括属于大肠杆菌属、沙雷氏菌属、芽孢杆菌属、短杆菌属、棒状杆菌属、微杆菌属、假单胞菌属等,如大肠杆菌XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue和大肠杆菌DH1的原核细胞。
本说明书中所用的作为导入重组载体的方法,可以使用任何导入DNA的方法,该方法包括,例如氯化钙法、电穿孔法(Methods.
Enzymol., 194, 182 (1990))、脂质体转染法、原生质体法(Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 84, 1929 (1978))、醋酸锂法等。
在本说明书中,基因表达(如mRNA表达和多肽表达)的“检测”或“定量”可以利用适当的方法实现,该方法包括,例如mRNA测定和免疫学测定方法。分子生物学测定方法的实例包括,例如印迹杂交法、斑点杂交(dot blot)法、PCR法等。免疫学测定方法可列举,例如使用微量滴定板的ELISA法、RIA法、免疫荧光法、免疫印迹法、免疫组织化学染色法等作为方法。此外,定量方法的实例包括ELISA法、RIA法等。它可以通过使用阵列(如DNA阵列和蛋白质阵列)的基因分析方法完成。DNA阵列在Shujunsha
Ed., Saibo Kogaku Bessatsu, "DNA Microarray to Saishin PCR Hou"中被广泛地综述。在Nat Genet. 2002 Dec; 32 Suppl: 526-32中详述了蛋白质阵列。分析基因表达的方法除了上述还包括但不限于,RT-PCR、RACE 法、SSCP 法、免疫沉淀法、双杂交体系、体外转译等。这些额外的分析方法记载于例如Genomu kaiseki
jikkenhou, Nakamura Yusuke lab manual (Understand the Basics of Genomics
Experiments - Yusuke Nakamura Laboratory Manual), Editor Yusuke Namamura,
Yodosha Co., Ltd. (2002)等中,其整个说明书并入本文作为参考。
(1. 材料)
(1.1)葡聚糖和葡聚糖改性产物
当用于本说明书时,“葡聚糖”是含有以葡萄糖作为组成单元的多糖。在本说明书中,优选使用α-D-葡聚糖作为葡聚糖。在α-D-葡聚糖中连接葡萄糖残基的键主要由α-1,4-葡萄糖苷键构成,并可含有α-1,6-葡萄糖苷键。含有α-1,6-葡萄糖苷键的α-D-葡聚糖具有支链结构。在分子中具有至少1个α-1,6-葡萄糖苷键的葡聚糖被称为支链葡聚糖,并且在分子中没有α-1,6-葡萄糖苷键的葡聚糖被称为直链葡聚糖。在本说明书中,除非另有指明,优选该“葡聚糖”的重均分子量为约1 x 103或更大。优选的用于本发明的葡聚糖是直链葡聚糖和支链葡聚糖,更优选的是直链α-1,4-葡聚糖和α-1,6-键支化的α-1,4-葡聚糖(也被称为支链α-1,4-葡聚糖)。优选用于本发明的葡聚糖不含α-1,3-键。
直链α-D-1,4-葡聚糖是指其中2个或多个D-葡萄糖单元的糖单元仅通过α-1,4-葡萄糖苷键结合的多糖。在本说明书中,除非另有指明,直链α-D-1,4-葡聚糖是指直链葡聚糖或直链α-1,4-葡聚糖。该直链葡聚糖具有一个非还原端。适用于本发明的直链葡聚糖的实例包括直链淀粉。
在本说明书中,术语“直链淀粉”是指由葡萄糖单元通过α-1,4-键连接构成的直链分子。在天然淀粉中含有直链淀粉。直链淀粉可以是从天然淀粉中提取的天然直链淀粉,或者可以是通过酶反应合成的直链淀粉(在本说明书中也被称为“酶法合成的直链淀粉”)。天然直链淀粉在一些情况下可以含有支链部分,但酶法合成的直链淀粉不含有支链。此外,天然直链淀粉具有多分散性并且分子量各不相同,但是酶法合成的直链淀粉(特别是,通过国际公开WO
02/097107小册子中所述的SP-GP法合成的酶法合成的直链淀粉)具有低分散性和极其均匀的分子量。因此,在本发明中,优选使用酶法合成的直链淀粉。用于本发明的直链淀粉的聚合度优选为约10或更大,更优选约50或更大,还更优选约100或更大,且最优选约180或更大。用于本发明的直链淀粉的聚合度优选为约1 x
105或更小,更优选约1 x 104或更小,还更优选约1 x 103或更小,且最优选约500或更小。
在本说明书中,术语“支链α-D-葡聚糖”是指其中直链葡聚糖以除了α-1,4-葡萄糖苷键以外的键支化的葡聚糖,在该直链葡聚糖中,D-葡萄糖单元通过α-1,4-葡萄糖苷键连接。在本说明书中,除非另有指明,该支链α-D-葡聚糖被称为支链葡聚糖。支化键是α-1,6-葡萄糖苷键、α-1,3-葡萄糖苷键或α-1,2-葡萄糖苷键,且最优选的是α-1,6-葡萄糖苷键。优选用于本发明的支链α-D-葡聚糖不含α-1,3-葡萄糖苷键和α-1,2-葡萄糖苷键。支链葡聚糖通常具有与支化键数目相同数目的非还原端。当用只选择性地断开α-1,6-葡萄糖苷键的酶(如异淀粉酶、支链淀粉酶等)处理该支链葡聚糖时,该支链葡聚糖能被降解成直链α-1,4-葡聚糖的混合物。这些被称为该支链葡聚糖的单元链,并且其聚合度被称为单元链长度。
适用于本发明的支链葡聚糖的实例包括淀粉、支链淀粉、糖原、糊精、酶法合成的支链葡聚糖和高支化环葡聚糖。
在本说明书中,术语“淀粉”是直链淀粉和支链淀粉的混合物。作为淀粉,只要其是普通市售的,可以使用任何淀粉。淀粉中所含直链淀粉和支链淀粉的比例根据生成该淀粉的植物的种类而不同。几乎所有由糯米、糯玉米等具有的淀粉都是支链淀粉。另一方面,仅由直链淀粉组成而不含支链淀粉的淀粉不能从普通植物获得。淀粉分类为天然淀粉、降解淀粉和改性淀粉。
天然淀粉根据原料可分类为块茎淀粉和谷物淀粉。块茎淀粉的实例包括马铃薯淀粉、木薯淀粉、红薯淀粉、野葛淀粉、欧洲蕨菜淀粉等。谷物淀粉的实例包括玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉等。天然淀粉的实例是高直链淀粉(如高直链玉米淀粉)或蜡质淀粉。该淀粉可以是可溶性淀粉。可溶性淀粉是指通过使天然淀粉经过一系列处理得到的水溶性淀粉。该淀粉可以选自可溶性淀粉、蜡质淀粉和高直链淀粉。该淀粉可以是改性淀粉。
用于本发明的淀粉的聚合度优选为约1 x 103或更大,更优选约5 x 103或更大,还更优选约1 x
104或更大,且最优选约2 x 104或更大。用于本发明的淀粉的聚合度优选为约1 x 107或更小,更优选约3 x 106或更小,还更优选约1 x
106或更小,且最优选约3 x 105或更小。
支链淀粉是其中葡萄糖单元通过α-1,6-键结合到由α-1,4-键结合的葡萄糖单元上的支链分子。天然淀粉中含有支链淀粉。作为支链淀粉,可以使用例如由100%支链淀粉构成的蜡质玉米淀粉。用于本发明的支链淀粉的聚合度优选为约1 x 103或更大,更优选约5 x 103或更大,还更优选约1 x
104或更大,且最优选约2 x 104或更大。用于本发明的支链淀粉的聚合度优选为约1 x 107或更小,更优选约3 x 106或更小,还更优选约1 x
106或更小,且最优选约1 x 105或更小。
糖原是一种由葡萄糖构成的葡聚糖,并且是具有高支化率的葡聚糖。糖原以颗粒状态广泛分布于几乎所有的细胞中作为动物用储备多糖。在植物中,糖原存在于例如玉米的甜玉米品种的种子中。在糖原中,通常由经α-1,4-键结合的葡萄糖组成的、具有12-18平均聚合度的糖链以每大约3个葡萄糖单元大约1个链的比率通过α-1,6-键与由经α-1,4-键结合的葡萄糖组成的糖链结合。此外,类似地,由经α-1,4-键结合的葡萄糖组成的糖链,与经α-1,6-键结合的支链通过α-1,6-键结合。因此,糖原形成了网络结构。也可以酶法合成糖原。本发明中所用糖原的聚合度优选为约500或更大,更优选约1 x 103或更大,还更优选约2 x
103或更大,且最优选约3 x 103或更大。本发明所用糖原的聚合度优选为约1 x 107或更小,更优选约3 x 106或更小,还更优选约1 x
106或更小,且最优选约3 x 105或更小。
糊精是一种由葡萄糖构成的葡聚糖,并且是具有介于淀粉的复杂程度和麦芽糖的复杂程度之间的中等复杂程度的葡聚糖。糊精通过用酸、碱或酶部分降解淀粉而获得。本发明所用糊精的聚合度优选为约10或更大,更优选约20或更大,还更优选约30或更大,且最优选约50或更大。本发明所用糊精的聚合度优选为约1 x
104或更小,更优选约9 x 103或更小,还更优选约7 x 103或更小,且最优选约5 x
103或更小。
酶法合成的支链葡聚糖是指使用酶合成的支链葡聚糖。通过在用SP-GP法合成直链淀粉酶时向反应溶液中加入支化酶,可以支化产物。支化程度可以通过支化酶的添加量来调节。由于酶法合成的支链葡聚糖与天然支链葡聚糖相比具有均匀的结构,当用作药物原料时是非常有利的。例如,用于本发明的酶法合成的支链葡聚糖的聚合度优选为约10或更大,更优选约20或更大,还更优选约30或更大,且最优选约500或更大。用于本发明的酶法合成的支链葡聚糖的聚合度优选为约2 x
105或更小,更优选约1 x 105或更小,还更优选约5 x 104或更小,且最优选约3 x
104或更小。
在本说明书中,术语“高支化环葡聚糖”是指具有内部支化的环状结构部分和外部支化的结构部分、并具有50或更大的聚合度的葡聚糖。高支化环葡聚糖整个分子可以具有至少2个非还原端。可用于本发明的高支化环葡聚糖整个分子的聚合度优选为约50或更大,更优选约60或更大,且还更优选约100或更大。可用于本发明的高支化环葡聚糖整个分子的聚合度优选为约1 x 104或更小,更优选约7 x 103或更小,且还更优选约5 x
103或更小。
在高支化环葡聚糖中存在的内部支化的环状结构部分的聚合度优选为约10或更大,更优选约15或更大,且更优选约20或更大。在高支化环葡聚糖中存在的内部支化的环状结构部分的聚合度优选为约500或更小,更优选约300或更小,且更优选约100或更小。
在高支化环葡聚糖中存在的外部支化的结构部分的聚合度优选为约40或更大,更优选约100或更大,更优选约300或更大,且还更优选约500或更大。在高支化环葡聚糖中存在的外部支化的结构部分的聚合度优选为约3 x 103或更小,更优选约1 x 103或更小,更优选约500或更小,且还更优选约300或更小。
在高支化环葡聚糖中存在的内部支化的环状结构部分中的α-1,6-葡萄糖苷键的数目可以是至少1个,例如可以是1个或多个、5个或更多个、10个或更多个等;内部支化的环状结构部分中的α-1,6-葡萄糖苷键的数目可以是,例如约200个或更少、约50个或更少、约30个或更少、约15个或更少、约10个或更少等。
在高支化环葡聚糖中存在的外部支化的结构部分中的支链的数目(即α-1,6-葡萄糖苷键的数目)优选约2个或更多个,更优选约3个或更多个,更优选约5个或更多个,且特别优选约10个或更多个。在高支化环葡聚糖中存在的外部支化的结构部分中的支链的数目(即α-1,6-葡萄糖苷键的数目)优选约5 x 103个或更少,更优选约4 x
103个或更少,且更优选约3 x 103个或更少。
作为高支化环葡聚糖,可以单独使用具有一种聚合度的高支化环葡聚糖,或者可以使用具有各种聚合度的高支化环葡聚糖的混合物。优选地,高支化环葡聚糖的聚合度使得最大聚合度和最小聚合度的聚合度之比为约100或更小,更优选约50或更小,且还更优选约10或更小。
高支化环葡聚糖优选是具有内部支化的环状结构部分和外部支化的结构部分、并具有50-5 x 103聚合度的葡聚糖,其中内部支化的环状结构部分是以α-1,4-葡萄糖苷键和α-1,6-葡萄糖苷键形成的环状结构部分,并且外部支化的结构部分是与该内部支化的环状结构部分结合的非环状结构部分。该外部支化的结构部分的每个单元链的聚合度的平均值优选为约10或更大且优选约20或更小。在日本公开出版物 No. 8-134104(日本专利No. 3107358)中详细描述了高支化环葡聚糖和其制备方法,并且可以根据其说明书制备该葡聚糖。高支化环葡聚糖是市售可得的,如Ezaki
Glico Co., Ltd.的“Cluster Dextrin”。用于本发明的高支化环葡聚糖的聚合度优选为约50或更大,更优选约70或更大,更优选约100或更大,最优选约150或更大。用于本发明的高支化环葡聚糖的聚合度优选为约1 x 104或更小,更优选约7 x 103或更小,更优选约5 x
103或更小,且最优选约4 x 103或更小。
在具体实施方案中,支链葡聚糖可以是颗粒。已知直径约4 nm或更小的粒子从肾脏中排出,直径约4
nm-200 nm的粒子长时间在血液中循环,直径约200 nm-7 μm的粒子被网状内皮***捕获,而直径约7 μm或更大的例子阻碍毛细血管。网状内皮***分布在肝脏和脾脏中。因此,通过控制支链葡聚糖的粒径,可以控制本发明的含氨基糖的葡聚糖及其改性产物和其结合物在体内的药代动力学。当想要在血液中长时间循环粒子时,颗粒状支链葡聚糖的粒径作为直径优选为约4 nm或更大,更优选约10 nm或更大,优选约200 nm或更小,且更优选约100 nm或更小。具有该粒径的颗粒状直链葡聚糖的分子量优选为约5 x
105或更大,更优选约1 x 106或更大,优选约5 x 107或更小,且更优选约2 x
107或更小。例如,由于已知直径20-50 nm的粒子在癌细胞中蓄积,当目的是在癌细胞中蓄积该粒子时,颗粒状支链葡聚糖的粒径作为直径优选约10 nm或更大,更优选约15 nm或更大,优选约100 nm或更小,且更优选约50 nm或更小。具有该粒径的颗粒状支链葡聚糖的分子量优选为约5 x
105或更大,更优选约1 x 106或更大,优选约2 x 107或更小,且更优选约5 x
106或更小。
在α-葡聚糖中支链的数目(即α-1,6-葡萄糖苷键的数目)优选是约1个或多个,更优选约10个或更多,更优选约30个或更多。在α-葡聚糖中支链的数目(即α-1,6-葡萄糖苷键的数目)优选是约5 x
103或更少,更优选约3 x 103或更少,更优选约1 x 103或更少。
在本发明所用的支链α-葡聚糖中,α-1,6-葡萄糖苷键的数目与α-1,4-葡萄糖苷键的数目的比(“α-1,6-葡萄糖苷键数”:“α-1,4-葡萄糖苷键数”)优选为1:1-1:1
x 103,更优选1:1.1-1:500,更优选1:1.2-1:100,还更优选1:1.5-1:50,且最优选1:2-1:20。在某些情况下,该比例可以是1:10-1:5 x 103、1:50-1:1 x 103或1:100-1:500。
在本发明中,支链葡聚糖的支化率的下限优选是0.2%或更大,优选1%或更大,更优选2%或更大,且最优选5%或更大。而支化率没有特定的上限,它可以是,例如99%或更小、90%或更小、85%或更小、65%或更小、50%或更小等。支化率通过{(α-1,6-键的数目)/(葡聚糖中α-1,4-键和α-1,6-键的总和} x 100计算。
α-1,6-葡萄糖苷键可以随机分布在α-葡聚糖中或可以均匀分布在α-葡聚糖中。优选能在α-葡聚糖中形成5个或更多个糖单元的直链部分这种程度的分布。
在本发明中,葡聚糖的改性产物可以用于替代葡聚糖。葡聚糖改性产物的实例包括改性淀粉和上述葡聚糖的酯化产物。并且,葡聚糖的改性产物可以是羟基改性产物或还原端改性产物。此外,如后所述,在至少一个氨基单糖残基α-1,4-结合到葡聚糖的至少一个非还原端的每一个后,葡聚糖部分可以被改性。
改性淀粉是通过使天然淀粉经过诸如水解、酯化或凝胶化的处理制成具有更容易使用的特性的淀粉。各种具有凝胶化起始温度、淀粉浆粘度、淀粉浆透明度、抗回生稳定性的各种组合的改性淀粉可供选择。存在各种各样的改性淀粉。这种淀粉的实例是通过将淀粉颗粒在淀粉的凝胶化温度或更低的温度下浸泡在酸中,由此断开淀粉分子而不破坏淀粉颗粒所获得的淀粉。
除了改性淀粉之外,葡聚糖的改性产物的实例包括其中未改性的葡聚糖的至少一个醇羟基被改性的改性产物(以下在本说明中被称为“葡聚糖的羟基改性产物”),其中葡聚糖的一些非还原端被改性的改性产物(以下在本说明书中被称为“葡聚糖的非还原端改性产物”),和其中葡聚糖的还原端被改性的改性产物(以下在本说明书中被称为“葡聚糖的还原端改性产物”)。
在羟基上改性的实例包括羟烷基化、烷基化、酰化、羧甲基化、硫酸化和磷酸化。优选在羟基上的改性是在体内能够用酶去除的改性。葡聚糖的羟基改性产物优选是酰化葡聚糖,且更优选乙酰化葡聚糖。改性基团向醇羟基的引入频率可以在葡聚糖的改性反应时任意设定。改性基团向醇羟基的引入频率用DS表示,并且DS1意味着其中每个葡萄糖残基引入一个改性基团的情形。DS可以通过DS =(改性基团的数目)/(葡萄糖残基的数目)来计算。由于在未改性的葡萄糖残基的2位、3位和6位上具有羟基,理论上每个葡萄糖残基可以引入最多3个改性基团。因此,DS的上限通常是3。改性基团向醇羟基的引入频率是约DS 0.01或更大,更优选约DS
0.03或更大,更优选约DS 0.05或更大,尤其优选约DS
0.07或更大,且最优选约DS 0.1或更大。改性基团的引入频率优选约DS
1.5或更小,更优选约DS 1.3或更小,更优选约DS
1.1或更小,尤其优选约DS 1.0或更小,且最优选约DS
0.9或更小。通过改性葡聚糖,抑制了葡聚糖在血液中或在体内的降解。
在非还原端改性的实例包括与诸如甘露糖残基或半乳糖残基的靶向分子结合。在非还原端的改性将在以下第2.6节和第3节详细解释。非还原端改性产物优选与甘露糖残基的结合物或与半乳糖残基的结合物。
在还原端改性的实例包括与选自单糖、非还原性碳水化合物、生物相容性大分子、脂质体组成成分、糖苷和含胺基的低分子量物质的物质结合。在非还原端的改性将在以下第2.6节和第3节详细解释。
(1.2)氨基糖
氨基糖是其中至少一个羟基被氨基取代的糖的通用名称。优选氨基糖的糖部分是单糖,且优选是己糖。当糖部分是己糖时,氨基糖中氨基的数目可以是1-4中任意的整数,优选1或2,且最优选1。在本发明中,优选其中糖的2位的羟基被氨基取代的氨基糖。代表性的氨基糖的实例包括葡糖胺、半乳糖胺和甘露糖胺。葡糖胺是本发明中最优选的氨基糖。可以混合使用多种氨基糖,或者可以使用一种氨基糖。
(2. 制备含氨基糖的葡聚糖的方法)
(2.1)氨基糖-1-磷酸
在本发明的方法中,可以使用氨基糖-1-磷酸。优选使用葡糖胺-1-磷酸、半乳糖胺-1-磷酸或甘露糖胺-1-磷酸。氨基糖-1-磷酸可以是市售的氨基糖-1-磷酸,或通过化学方法、酶法或诸如发酵的生物方法合成的氨基糖-1-磷酸。制备氨基糖-1-磷酸的方法在本领域是已知的。例如,在例如Nawaji, et al., Carbohydr. Res. 2008,
343, 2692-2696中公开了合成葡糖胺-1-磷酸的方法。
作为氨基糖-1-磷酸,可以使用非盐形式的氨基糖-1-磷酸和盐形式的氨基糖-1-磷酸中的任一种。例如,作为葡糖胺-1-磷酸,可以使用非盐形式的葡糖胺-1-磷酸和盐形式的葡糖胺-1-磷酸中的任一种。例如,可以使用葡糖胺-1-磷酸的金属盐、葡糖胺-1-磷酸的碱金属盐(如葡糖胺-1-磷酸二钠和葡糖胺-1-磷酸二钾)。
(2.2)α-葡聚糖磷酸化酶
在本说明书中,术语“α-葡聚糖磷酸化酶”意味着具有α-葡聚糖磷酸化酶活性的酶。α-葡聚糖磷酸化酶归类于EC 2.4.1.1。α-葡聚糖磷酸化酶活性是指催化从无机磷酸和α-1,4-葡聚糖制备葡萄糖-1-磷酸和α-1,4-葡聚糖的部分降解产物的反应、或其逆反应的活性。α-葡聚糖磷酸化酶也能催化α-1,4-葡聚糖合成反应,这是磷酸解的逆反应。反应向哪个方向进行取决于底物的量。
在本发明中,可以使用任意的α-葡聚糖磷酸化酶,只要它具有将葡糖胺残基转移到葡聚糖的非还原端的功能。用于本发明的α-葡聚糖磷酸化酶可以源自细菌、酵母菌、动物或植物。本发明的α-葡聚糖磷酸化酶可以源自,例如马铃薯、红薯、蚕豆、拟南芥、菠菜、玉米、大米、小麦、柑橘杂交品种、超嗜热菌、海栖热袍菌、Thermococcus
zilligii、Thermoanaerobacter pseudethanolicus等。
优选用于本发明的α-葡聚糖磷酸化酶是源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶。在具体实施方案中,可以使用源自马铃薯的α-葡聚糖磷酸化酶或源自Thermococcus zilligii AN1的α-葡聚糖磷酸化酶。
源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列列于SEQ ID NO: 1,并且其氨基酸序列列于SEQ
ID NO: 2的位置1-692。源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶与植物α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列有约21%-约24%的序列一致性,与源自Thermus thermophilus的α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列有约34%的序列一致性,并且与源自Thermococcus
litoralis的α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列有约38%的序列一致性。它与源自Thermotoga maritima的α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列有约38%的序列一致性,与源自Thermococcus
zilligii的麦芽糊精磷酸化酶的氨基酸序列有约38%的序列一致性,并且与源自Thermoanaerobacter pseudethanolicus的那些有约33%的序列一致性。
源自马铃薯的L型α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列列于SEQ ID NO: 3,且其氨基酸序列列于SEQ
ID NO: 4的15-930位。源自Thermococcus
zilligii AN1的α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列列于SEQ
ID NO: 5,且其氨基酸序列列于SEQ ID NO: 6的1-717位。
在本说明书中,“源自”生物体的酶不仅意味着从生物体直接分离的酶,还指以任何方式利用生物体获得的酶。例如,当将从生物体获得的编码酶的基因导入大肠杆菌,并且从大肠杆菌分离该酶时,该酶被称为“源自”该生物体。
在本说明书中,序列(如氨基酸序列、碱基序列等)的“一致性”指在两个序列之间出现相同氨基酸(当比较碱基序列时是碱基)的程度。一致性通常可以通过比较两个氨基酸序列或碱基序列,并比较以最佳的形式匹配的这两个序列(可能含有添加或缺失)来测定。
在本说明书中,序列一致性用GENETYX-WIN Ver.4.0(Genetics
Co., Ltd.)的最大匹配来计算。该程序对齐要分析的序列数据和要比较的序列数据,以便当考虑取代和缺失时序列间匹配的氨基酸对变得最大,从而对每个匹配、不匹配和缺口打分,计算总和,在最小总和时输出对准,并根据(参考文献:
Takeishi, K., and Gotoh, O. 1984. Sequence Relationships among Various 4.5 S
RNA Species J. Biochem. 92:1173-1177)计算一致性。
例如,用于本发明的α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列可以与SEQ
ID NO: 2、4或6相同,即它可以有100%的一致性。在另一个实施方案中,只要具有将葡糖胺残基转移到葡聚糖的非还原端上的活性,与参考氨基酸序列相比可以在多达一定数目的氨基酸中改变该氨基酸序列。这种改变可以选自缺失、取代(包括保守性取代和非保守性取代)或***至少1个(例如1个或多个)氨基酸。这种改变可以发生在氨基酸序列SEQ
ID NO: 2、4或6的氨基末端或羧基末端的位置,或可以发生在除了这些末端以外的任意位置。氨基酸残基的改变可以***一个残基,或几个残基可以是相邻的。例如,用于本发明的α-葡聚糖磷酸化酶可以在氨基酸序列SEQ ID NO: 2、4或6的任一个末端添加氨基酸残基(优选约20个或更少的残基、更优选约10个或更少的残基、且更优选约5个或更少的残基),为了诸如易于酶的纯化、提高稳定性等的原因。
用于本发明的α-葡聚糖磷酸化酶具有与SEQ ID NO: 2、4或6的氨基酸序列具有优选约50%或更高、更优选约60%或更高、还更优选约70%或更高、还更优选约80%或更高、尤其更优选约90%或更高、且最优选约95%或更高的序列一致性的氨基酸序列,并且具有将葡糖胺残基转移到葡聚糖的非还原端的活性。用于本发明的α-葡聚糖磷酸化酶可以具有与SEQ ID NO: 2、4或6的氨基酸序列具有约96%或更高、约97%或更高、约98%或更高或约99%或更高的序列一致性的氨基酸序列。
在反应开始时溶液中所含α-葡聚糖磷酸化酶的量优选为约0.01 U/ml或更多,更优选约0.1 U/ml或更多,尤其优选约0.5 U/m或更多,且最优选约1 U/ml或更多。在反应开始时溶液中所含α-葡聚糖磷酸化酶的量优选为约1,000 U/ml或更少,更优选约100
U/ml或更少,尤其优选约50 U/ml或更少,且最优选约20
U/ml或更少。如果α-葡聚糖磷酸化酶的重量太大,可能使反应中变性的酶易于聚集。如果所用的量太少,反应自己发生,但葡聚糖的收率会降低。需要注意的是,α-葡聚糖磷酸化酶的单位量定义如下:
关于1单位的α-葡聚糖磷酸化酶,每分钟产生1 μmol无机磷酸(Pi)的α-葡聚糖磷酸化酶活性应该是1单位(U或单位)。这种α-葡聚糖磷酸化酶活性的测定定量了由G-1-P产生的游离无机磷酸(Pi)。在将200 μl反应溶液(含有12.5 mM G-1-P、1%糊精和100 mM醋酸盐缓冲液(pH 6.0)中的酶溶液)在50℃培养15分钟后,加入800 μl钼试剂(15 mM钼酸铵、100 mM醋酸锌),并搅拌终止反应。加入568 mM抗坏血酸(pH 5.8)200 μl,然后混合。在30℃培养15分钟后,在850 nm用分光光度计测定吸光度。用已知浓度的无机磷酸同样测定吸光度,并生成标准曲线。样品得到的吸光度值与该标准曲线拟合,并测定样品中无机磷酸的量。无机磷酸以磷酸离子定量。没有定量葡萄糖-1-磷酸的量。
(2.3 制备α-葡聚糖磷酸化酶)
本发明所用α-葡聚糖磷酸化酶可以从自然界中存在的产生α-葡聚糖磷酸化酶的生物体,如上述生物体中直接分离。或者,用于本发明的α-葡聚糖磷酸化酶可以从微生物(如细菌、真菌等)中分离,该微生物被从上述生物体中分离的编码α-葡聚糖磷酸化酶的基因基因修饰。
在优选的实施方案中,通过化学合成SEQ ID NO: 1的基因片段,构建含有此基因片段的表达载体,将该表达载体导入微生物中制备重组微生物,培养该重组微生物产生α-葡聚糖磷酸化酶,并收集生成的α-葡聚糖磷酸化酶,从而制备源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶。也可以同样制备源自其它生物体的α-葡聚糖磷酸化酶。通过基因重组的酶法制备方法对本领域技术人员来说是公知的。用于本发明的宿主微生物包括原核生物和真核生物,且优选嗜温微生物。尤其优选的微生物的实例包括但不限于大肠杆菌。
可以使用常规基因工程技术制备α-葡聚糖磷酸化酶以及编码用于本发明的α-葡聚糖磷酸化酶的多核苷酸,其中α-葡聚糖磷酸化酶具有SEQ
ID NO: 2的1-692位、SEQ
ID NO: 4的15-930位或SEQ
ID NO: 6的1-717位的氨基酸序列,或与其有同源性的氨基酸序列,并具有葡糖胺转移活性。
(2.4 制备含氨基糖的葡聚糖)
本发明的含氨基糖的葡聚糖可以通过包括下述步骤的方法制备,使含有葡糖胺-1-磷酸、葡聚糖和α-葡聚糖磷酸化酶(如源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶、源自马铃薯的α-葡聚糖磷酸化酶或源自Thermococcus zilligii AN1的α-葡聚糖磷酸化酶)的溶液进行反应,其中该α-葡聚糖磷酸化酶能催化将葡糖胺残基转移到葡聚糖的非还原端的反应。通过在该方法中使用葡聚糖改性产物代替葡聚糖,可以制备含氨基糖的葡聚糖的改性产物。作为一个实施例,采用葡聚糖的方法将在下面说明。
首先,制备反应溶液。该反应溶液可以通过,例如将氨基糖-1-磷酸(如葡糖胺-1-磷酸)、葡聚糖和α-葡聚糖磷酸化酶加入到适当的溶剂中来制备。必要时可以向该反应溶液中加入用于调节pH的任何缓冲剂和无机盐,只要不抑制酶反应。必要时可以向该反应溶液中加入α-葡聚糖磷酸化酶的原始底物葡萄糖-1-磷酸。在氨基糖-1-磷酸和葡萄糖-1-磷酸共存的反应的情况下,同时进行将葡萄糖残基结合到受体葡聚糖的非还原端的反应和结合氨基单糖残基的反应。甚至当氨基单糖残基结合到葡聚糖的非还原端时,α-葡聚糖磷酸化酶可进一步将一个分子转移到氨基单糖残基的非还原端,然而,该转移的效率远低于转移到葡萄糖残基的效率。当将葡萄糖残基结合到葡聚糖的非还原端时,α-葡聚糖磷酸化酶可进一步将葡萄糖残基或氨基单糖残基转移到所得分子的非还原端上。因此,当葡萄糖-1-磷酸共存时,葡聚糖的链长能被有效地延长。因此,最终得到的含氨基糖的葡聚糖的结构可以通过所加氨基糖-1-磷酸和所加葡萄糖-1-磷酸的比例来控制。必要时,可以向反应溶液中加入选自脱支酶、分支酶、4-α-葡聚糖转移酶和糖原脱支酶的酶。
通过改变反应溶液中氨基糖-1-磷酸的量和葡聚糖的非还原端总体数目的比例,可以控制氨基单糖残基的引入率。即随着增大(葡聚糖的分子数)x(相对于分子中非还原端数目的氨基糖-1-磷酸的量),可以提高氨基单糖残基的引入率。通过调节加入的酶的量或酶反应时间,也可以调节氨基单糖残基的引入率。
然后,使反应溶液反应,必要时通过本领域已知的方法加热。只要达到本发明的效果,反应温度可以是任意温度。反应温度代表性地可以是约30℃至约90℃的温度。优选在该反应步骤中溶液的温度是这样的温度,使得在预定的反应时间后,反应前溶液中所含α-葡聚糖磷酸化酶的活性保持约50%或更高,更优选约80%或更高的活性。源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶是一种耐热酶,而且其最优反应温度是约80℃-90℃。从反应速度的观点出发,优选反应温度高到一定程度。另一方面,从源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶的最优反应温度的观点出发,在大约80℃-90℃的反应是可行的。然而,从所得产物的稳定性、氨基糖-1-磷酸和葡萄糖-1-磷酸的稳定性等的观点出发,优选反应温度稍低于源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶的最优反应温度。反应温度优选约30℃或更高,更优选约35℃或更高,更优选约40℃或更高。在特定的实施方案中,反应温度可以是约45℃或更高或约50℃或更高。反应温度优选是约90℃或更低,更优选约80℃或更低,更优选约70℃或更低。在特定的实施方案中,反应温度可以是约65℃或更低或约60℃或更低。在使用最优反应温度较低的酶,如源自马铃薯的α-葡聚糖磷酸化酶的情况下,优选反应温度被设定为低于其中使用源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶的情况。
考虑到反应温度和酶的剩余活性,反应时间可以被设定为任意时间段。反应时间代表性地为约1小时至约100小时,更优选约1小时至约72小时,还更优选约2小时至约36小时,且最优选约2小时至约24小时。在特定的实施方案中,反应时间可以是,例如约1小时或更长、约2小时或更长、约5小时或更长、约10小时或更长、约12小时或更长、或约24小时或更长。在特定的实施方案中,反应时间可以是,例如约100小时或更短、约72小时或更短、约60小时或更短、约48小时或更短、约36小时或更短、或约24小时或更短。
可以用各种方式进行加热,但是优选在搅拌下进行加热,以便将热量均匀传递到整个溶液中。通过将溶液放入例如带热水套和搅拌装置的不锈钢制反应槽来搅拌该溶液。
此外,在本发明的方法中,在反应已经进行一定程度的阶段,可以将氨基糖-1-磷酸、葡聚糖和α-葡聚糖磷酸化酶中的至少一种加入到反应溶液中。
以这种方式,制备了含有含氨基糖葡聚糖的溶液。
在反应完成后,在反应溶液中,必要时可以通过例如在100℃加热10分钟来灭活反应溶液中的酶。或者,可以进行后续步骤而无需进行灭活酶的处理。反应溶液可以原样储存,或者为了分离制备的含氨基糖的葡聚糖而被处理。
在反应完成后,在纯化含氨基糖的葡聚糖后,或在纯化含氨基糖的葡聚糖前,可以通过修饰所得含氨基糖的葡聚糖的葡聚糖部分的至少一个醇羟基来制备含氨基糖的葡聚糖的羟基修饰物。优选在纯化含氨基糖的葡聚糖后进行改性。可以根据本领域已知的方法进行改性。改性的实例包括羟烷基化、烷基化、酰化、羧甲基化、硫酸化和磷酸化。优选酰化,且更优选乙酰化。通过在制备含氨基糖的葡聚糖或含氨基糖的葡聚糖的羟基改性产物后修饰葡聚糖的还原端,可以制备含氨基糖的葡聚糖或含氨基糖的葡聚糖的羟基改性产物的还原端改性产物。此外,没有结合氨基糖的这些葡聚糖部分的非还原端可以被修饰。氨基单糖残基与葡聚糖的结合、羟基改性、还原端改性和利用除了氨基单糖残基之外的改性基团对一些非还原端的改性可以以任意顺序进行。
(2.5 含氨基糖的葡聚糖的纯化)
<纯化方法>
必要时可以纯化所制备的含氨基糖的葡聚糖(或其改性产物)。通过纯化除去的杂质的实例包括无机磷酸、氨基糖-1-磷酸、无机盐等。纯化葡聚糖的方法的实例包括使用有机溶剂的方法(T. J. Schoch et al., J. American
Chemical Society, 64, 2957 (1942))和不使用有机溶剂的方法。
能用于使用有机溶剂的纯化中的有机溶剂的实例包括丙酮、正戊醇、五唑、正丙醇、正己醇、2-乙基-1-丁醇、2-乙基-1己醇、月桂醇、环己醇、正丁醇、3-戊醇、4-甲基-2-戊醇、d,l-冰片、α-松油醇、异丁醇、仲丁醇、2-甲基-1-丁醇、异戊醇、叔戊醇、薄荷醇、甲醇、乙醇和醚。
作为不使用有机溶剂的纯化方法的实例,存在在含氨基糖的葡聚糖的制备反应后,无需沉淀溶于水的含氨基糖的葡聚糖,使含氨基糖的葡聚糖经过利用超滤膜的膜分离或色谱法,除去无机磷酸、氨基糖-1-磷酸和无机盐的方法。
可用于纯化的超滤膜的实例包括截留分子量约1 x 103至约1 x 104、优选约5 x
103至约5 x 104、更优选约1 x 104至约3 x
104的超滤膜(DAICEL制UF膜部件)。
可用于色谱法的载体的实例包括凝胶过滤色谱用载体、配体交换色谱用载体、离子交换色谱用载体和疏水色谱用载体。
在制备本发明的含氨基糖的葡聚糖的方法中,由于使用高分子量葡聚糖,该方法具有制备后容易分离的优点。具体地,由于当反应副产物无机磷酸的浓度增大时,含氨基糖的葡聚糖的制备反应达到平衡,因此在反应完成后,反应溶液中残留大量氨基糖-1-磷酸。当使用低分子量葡聚糖时,所得含氨基糖的葡聚糖和氨基糖-1-磷酸都是阳离子型的。由于它们具有几乎相同的分子量和电荷,非常难于分离。因此,不能制备不含氨基糖-1-磷酸杂质的含氨基糖的葡聚糖。然而,当使用高分子量葡聚糖时,通过采用利用分子量不同的制备方法,可以制备不含氨基糖-1-磷酸杂质的含氨基糖的葡糖胺。利用电荷的差异,可以通过离子色谱等容易地分离葡聚糖和含氨基糖的葡聚糖。
(2.6)含氨基糖的葡聚糖及其改性产物和结合物
本发明的含氨基糖的葡聚糖是其中至少一个氨基单糖残基通过α-1,4-键与葡聚糖的至少一个非还原端的每一个结合的葡聚糖。必要时,糖等可进一步结合到与葡聚糖的非还原端结合的氨基单糖的末端。当2个或更多个的氨基单糖残基结合到本发明的含氨基糖的葡聚糖中葡聚糖的非还原端时,结构为其中这些氨基单糖互相结合并结合到一个末端。例如,结构为其中一个氨基单糖结合到葡聚糖的一个末端,而下一个氨基单糖进一步结合到该氨基单糖的末端。在一个实施方案中,仅一个氨基单糖结合到葡聚糖的每个末端。
在本发明的含氨基糖的葡聚糖中,氨基单糖(如葡糖胺)可以结合到葡聚糖的所有非还原端,或者氨基单糖可以只结合到非还原端的一部分。即一些非还原端可以保持未与氨基单糖结合。
基于非还原端的数目的转化率,即氨基糖和非还原端间的键的数目相对于结合氨基单糖前存在的非还原端的数目的比率,可以根据其中利用含氨基糖的葡聚糖的应用,从接近0%(例如约1%)到100%的比率适当选择。例如,当希望存在少量氨基时,可以选择低转化率,而当希望存在大量氨基时,可以选择高转化率。
通过适当调节制备含氨基糖的葡聚糖的酶反应的条件,例如,通过调节酶反应的反应时间、底物浓度等,可以容易地获得具有所选转化率的含氨基糖的葡聚糖。
此外,结合到非还原端的氨基单糖的总数相对于结合氨基单糖前葡聚糖中存在的非还原端的数目的比率,可以用作氨基数目的指标。在本说明书中,该比率被称为结合率。一般情况下,在分析含氨基糖的葡聚糖时,测定结合率比测定上述转化率更容易,因此,从实用的观点出发,基于结合率设计含氨基糖的葡聚糖是有利的。
需要注意的是,取决于合成含氨基糖的葡聚糖的酶反应的条件,在一些情况下氨基单糖可以进一步结合到与一个非还原端结合的氨基单糖的末端。即在一些情况下,结构可以是其中2个氨基单糖串联结合到一个非还原端(即其中二糖结合到非还原端的结构)。具有这种结构的化合物也可以用作本发明的含氨基糖的葡聚糖。上述结合率具有或更小优点,即使通过如上所述将多个氨基单糖结合到一个非还原端来增加氨基的数目,也可以估计氨基的数目。因此,相对于上述转化率,在一些情况下该结合率可能具有大于100%的值。可以根据其中利用含氨基糖的葡聚糖的应用来适当选择结合率。例如,当希望存在少量氨基时,可以选择低结合率(如约1%至约2%),而当希望存在大量氨基时,可以选择高结合率(如约150%至约200%)。
当含氨基糖的支链葡聚糖用作DDS用纳米微粒载体时,氨基单糖残基的结合率优选为约10%或更大、更优选约20%或更大、更优选约30%或更大、且最优选约40%或更大;氨基单糖残基的结合率优选为约500%或更小,更优选约400%或更小、更优选约300%或更小、且最优选约200%或更小。
当含氨基糖的支链葡聚糖用作复合载体时,氨基单糖残基的结合率优选为约1%或更大、更优选约5%或更大、更优选约10%或更大、且最优选约20%或更大;氨基单糖残基的结合率优选为约500%或更小、更优选约400%或更小、更优选约300%或更小、且最优选约200%或更小。
当含氨基糖的支链葡聚糖用作DDS纳米微粒载体时,每个葡聚糖分子氨基单糖残基结合的数目优选为约2个或更多、更优选约5个或更多、更优选约10个或更多、且最优选约20个或更多;每个葡聚糖分子氨基单糖残基结合的数目优选为约5000个或更少、更优选约4000个或更少、更优选约3000个或更少、且最优选约2000个或更少。
当含氨基糖的支链葡聚糖用作复合载体时,每个葡聚糖分子氨基单糖残基结合的数目优选为约10个或更多、更优选约50个或更多、更优选约100个或更多、且最优选约200个或更多;每个葡聚糖分子氨基单糖残基结合的数目优选为约5000个或更少、更优选约4000个或更少、更优选约3000个或更少、且最优选约2000个或更少。
当含氨基糖的支链葡聚糖与核酸形成复合物时,在37℃、0.1 M
NaCl水溶液中,本发明的含氨基糖的葡聚糖和核酸的复合物的结合率优选为约50%或更大,更优选约60%或更大,且更优选约70%或更大;在37℃、1 M NaCl水溶液中,结合率优选为约40%或更小,更优选约30%或更小,且最优选约20%或更小。可以通过实施例10中所述的方法测定结合率。
在本发明的含氨基糖的葡聚糖中,除了氨基糖之外的糖可以结合到未与氨基单糖结合的非还原端。即一些非还原端可以与氨基单糖结合,而剩余的非还原端可以与除氨基糖之外的糖结合。
或者,也可以制备其中一些非还原端与氨基单糖结合,一些与除氨基糖之外的糖结合,而其余的非还原端未结合的结构。在这方面,在多个非还原端中,与氨基单糖结合的末端的数目、与除氨基单糖以外的糖结合的末端的数目和未与糖结合的末端的数目可以自由选择。
本发明的含氨基糖的葡聚糖及其改性产物可进一步在其氨基糖残基的氨基上与药效成分结合,从而获得结合物。与药效成分结合的含氨基糖的葡聚糖被称为“含氨基糖的葡聚糖-药效成分结合物”,而与药效成分结合的含氨基糖的葡聚糖的改性产物被称为“含氨基糖的葡聚糖的改性产物-药效成分结合物”。类似地,在该氨基糖是葡糖胺的情况下,与药效成分结合的含葡糖胺的葡聚糖被称为“含葡糖胺的葡聚糖-药效成分物质结合物”,而与药效成分结合的含葡糖胺的葡聚糖的改性产物被称为“含葡糖胺的葡聚糖的改性产物-药效成分结合物”。
含氨基糖的葡聚糖的改性产物可以是羟基改性产物、非还原端改性产物或还原端改性产物。
羟基改性产物如上所述。
非还原端改性产物将被说明。当含氨基糖的葡聚糖或其改性产物的葡聚糖部分是支链α-1,4-葡聚糖,并且存在没有氨基糖残基与之结合的非还原端时,其它物质可以结合到没有氨基糖残基结合的非还原端。在优选的实施方案中,将靶向分子结合到没有氨基糖残基结合的非还原端。在本说明书中,术语“靶向分子”是指具有组织靶向功能的分子。靶向分子的实例包括甘露糖、半乳糖、木糖、岩藻糖、半乳糖胺、抗体、抗体片段、受体、受体片段和受体配体。特别是,由于半乳糖被肝实质细胞表面上存在的去唾液酸糖蛋白受体识别,因此它是有效的。此外,由于甘露糖被各种巨噬细胞(包括库普弗细胞(Kupffer
cell)和肝窦血管内皮细胞)上表达的甘露糖受体识别,因此它是有效的。例如通过使α-葡聚糖磷酸化酶作用于作为底物的甘露糖-1-磷酸或半乳糖-1-磷酸,甘露糖和半乳糖可以与含氨基糖的葡聚糖或其改性产物的非还原端结合。当通过酶反应结合时,甘露糖和半乳糖结合到未与氨基糖残基结合的非还原端葡萄糖残基的4位上。也可以将甘露糖和半乳糖以任意比例结合,并且结合到支链葡聚糖的多个非还原端上。在一个实施方案中,甘露糖或半乳糖可以结合到与非还原端结合的氨基糖残基上。
还原端改性产物将被说明。“含氨基糖的葡聚糖的还原端改性产物”是指其中其它物质结合到本发明的含氨基糖的葡聚糖中存在的还原端上的物质。在优选的实施方案中,作为在还原端与不同物质结合的方法有以下两种方法。第一种方法是通过已知的酶法或已知的化学方法将葡聚糖的还原端与其它物质结合,然后利用本发明的方法将氨基糖结合到该葡聚糖的非还原端的方法,该葡聚糖的聚合度为5 x
103或更大,优选聚合度1 x 104或更大、更优选聚合度1 x 105或更大。第二种方法是通过已知的酶法将本发明的含氨基糖的葡聚糖的还原端与其它物质结合的方法。
例如在日本公开出版物No. 5-276883、日本公开出版物No.
07-241181和国际公开No. WO 01/073106中,公开了在第一种方法中将葡聚糖与不同物质酶法结合的方法。与这些方法类似地可以将高分子量葡聚糖与不同物质结合。
在第一种方法中将葡聚糖与不同物质化学结合的方法可用于具有氨基的物质。例如,作为将麦芽五糖与具有氨基的物质化学结合的方法,有以下三种方法:
(A)通过还原性胺化将麦芽五糖的还原端醛基与具有氨基的物质结合的方法;
(B)将麦芽五糖的还原端醛基氧化成麦芽四糖基葡萄糖酸,然后用缩合剂将其与具有氨基的物质脱水缩合的方法;和
(C)将麦芽五糖的还原端醛基氧化成麦芽四糖基葡萄糖酸,然后将其脱水制备麦芽四糖基葡萄糖酸内酯,并在无水溶剂条件下加热麦芽四糖基葡萄糖酸内酯和具有氨基的物质而使其结合。在日本专利申请No.
2008-121693中详细描述了这三种方法(A)、(B)和(C)。与这些方法类似地可以将高分子量葡聚糖与不同的物质结合。
可用于第二种方法的酶仅能适用于碳水化合物和糖苷,该第二种方法是通过酶法将本发明的含氨基糖的葡聚糖的还原端与不同的物质结合的方法。作为这种酶,使用诸如支化酶、环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)、D酶、麦芽糖转葡糖基酶等的所谓葡聚糖链转移酶。这些酶断开含氨基糖的葡聚糖中的α-1,4-键,并将其非还原端侧的片段(含氨基糖片段)转移到受体分子(本文中,碳水化合物或糖苷)上。
与还原端结合的物质的实例包括单糖、非还原性碳水化合物、生物相容性大分子、脂质体组成成分、糖苷和含氨基的低分子量物质。
单糖的实例包括具有一个官能团的单糖,如N-乙酰基葡糖胺、葡糖酸等。非还原性碳水化合物的实例包括山梨糖醇、蔗糖和海藻糖。生物相容性大分子的实例包括直链淀粉、糊精、淀粉、纤维素、甲壳素、壳聚糖、右旋糖酐、蛋白质和肽。脂质体组成成分的实例包括磷脂、脂肪酸和表面活性剂。糖苷的实例包括抗坏血酸葡糖苷、氢醌葡糖苷、橙皮苷葡糖苷、芸香苷葡糖苷、对硝基苯基麦芽五糖、十二烷基麦芽糖、黄酮糖苷、萜糖苷、酚糖苷、查尔酮糖苷和类固醇糖苷。含氨基的低分子量物质的实例包括各种氨基酸、十二胺等。
其中将不同的物质结合到含氨基糖的葡聚糖或其改性产物的氨基糖残基的氨基上的实施方案将在以下“3”中详细描述。
(3. 含氨基糖的葡聚糖及其改性产物的用途)
由于在本发明的含氨基糖的葡聚糖及其改性产物中,氨基糖残基结合到葡聚糖的非还原端上,所以它们在非还原端上具有氨基,并因此在水溶液中能使葡聚糖带正电荷。例如,其中将多个氨基糖与葡聚糖的非还原端结合的本发明的含氨基糖的葡聚糖或其改性产物,通过改变溶剂的pH值,能产生其中在非还原端上的氨基糖的氨基是NH3 +的状态和其中氨基仍为NH2的状态。这被认为是,在其中非还原端上的氨基糖残基的氨基被解离的状态下,含氨基糖的葡聚糖、其改性产物和其结合物根据静电斥力形成扩展的外部结构,并且在该氨基没有被解离的状态下,含氨基糖的葡聚糖及其改性产物成为缩小的状态。这种取决于pH的多糖微凝胶的构象的改变可用于药物传递。
本发明的含氨基糖的葡聚糖及其改性产物在非还原端上具有反应性基团氨基。因此,通过该氨基,葡聚糖链可以与不同的物质(如药效成分)直接或经合适的间隔物间接结合。因此,可以改变该物质的物理性质,并且可以将功能赋予该物质。本文中所指不同的物质可以是低分子量有机化合物、大分子有机化合物、DDS用纳米微粒载体(大分子胶束、病毒颗粒、脂质体等)和无机物质(如磁性微粒)中的任一种。该不同的物质优选是药效成分,且更优选在水溶液中带负电荷的药效成分。例如,通过在诸如碳二亚胺的适当的缩合剂存在下与具有羧基的物质反应,本发明的含氨基糖的葡聚糖及其改性产物能容易地与具有羧基的物质结合。当该具有羧基的物质是诸如肽或蛋白质的药效成分时,所得化合物是其中含氨基糖的葡聚糖及其改性产物与药效成分直接结合的结合物。或者,药效成分可以通过间隔物与含氨基糖的葡聚糖或其改性产物结合。在这种情况下,具有能用于结合氨基和药效成分的官能团的化合物,可以与含氨基糖的葡聚糖或其改性产物的氨基结合。将不同的化合物与用于与药效成分等结合的氨基结合被称为“氨基改性”。作为通过赋予葡聚糖链来改变物理性质的效果,可期望改进水溶性、赋予由于水合层形成的生物亲和性等。
为了修饰氨基,可以使用具有羧基和不同官能团的改性剂。在本说明书中,用于修饰含氨基糖的葡聚糖和含氨基糖的葡聚糖的改性产物的氨基的具有羧基的物质也被称为“氨基改性剂”。该氨基改性剂具有至少一个羧基和至少一个不同的官能团。该官能团的实例包括阳离子官能团、阴离子官能团、疏水性基团、马来酰亚胺基、硫醇基和醛基。阳离子官能团的实例包括氨基、二甲基氨基、二乙基氨基、三甲基氨基、铵基和吡啶鎓基。具有阳离子官能团的改性剂的实例包括3-氨基-2,5-二氯苯甲酸。阴离子官能团的实例包括磷酸基、磺酸基、羧基和硫酸基。具有阴离子官能团的改性剂的实例包括草酸、丙二酸、琥珀酸、谷氨酸、邻苯二甲酸和柠檬酸。疏水性基团的实例包括诸如硬脂基、十六烷基、甲基、丙基和丁基的烷基,和诸如苯基、苄基和甲苯基的芳基。具有疏水性基团的改性剂的实例包括硬脂酸、苯甲酸和肉桂酸。具有马来酰亚胺基的改性剂的实例包括N-(4-马来酰亚胺丁酰氧基)琥珀酰亚胺。硫醇基也被称为巯基。具有硫醇基的改性剂的实例包括巯基乙酸和巯基苯甲酸。醛基的实例包括饱和非环状醛基、不饱和非环状醛基、饱和脂环族醛基和芳香族醛基。具有醛基的改性剂的实例包括2-羧基苯甲醛。
例如,在具有羧基的物质是诸如海藻酸或透明质酸的含有糖醛酸的多糖的情况下,可以将大量本发明的含氨基糖的葡聚糖接枝(即结合)到主链上,由此可以极大改变该含糖醛酸的多糖的物理性质。在这种情况下,形成了含氨基糖的葡聚糖或其改性产物和含糖醛酸的多糖的结合物。在该结合物中,含氨基糖的葡聚糖或其改性产物和含糖醛酸的多糖直接结合。在特定的实施方案中,无糖醛酸残基与本发明的含氨基糖的葡聚糖结合。
此外,当具有羧基的物质是磷脂时,可以得到与本发明的含氨基糖的葡聚糖或其改性产物结合的磷脂。该磷脂也被称为含氨基糖的葡聚糖或其改性产物和磷脂的结合物。在该结合物中,含氨基糖的葡聚糖或其改性产物和磷脂直接结合。通过用这种结合葡聚糖的磷脂制备脂质体,能容易获得可用于药物传递的结合葡聚糖链的脂质体。
当具有羧基的物质是诸如蛋白质或肽的蛋白质类药效成分时,能获得与葡聚糖链结合的诸如蛋白质或肽的蛋白质类药效成分。该蛋白质或肽也被称为含氨基糖的葡聚糖或其改性产物和蛋白质或肽的结合物。在该结合物中,含氨基糖的葡聚糖或其改性产物和蛋白质或肽直接结合。该技术可用于改进蛋白质类药效成分(药物)的药代动力学。
当具有羧基的物质是磁性微粒时,可以获得与葡聚糖链结合的磁性微粒,并且其可被用作临床诊断的造影剂。在这种情况下,形成了含氨基糖的葡聚糖或其改性产物和磁性微粒的结合物。在该结合物中,含氨基糖的葡聚糖或其改性产物和磁性微粒直接结合。
当具有羧基的物质是金属配体(螯合剂)时,可以得到与葡聚糖链结合的金属配体,并且其通过与放射性金属元素配合可用作临床诊断的造影剂。在这种情况下,形成了含氨基糖的葡聚糖或其改性产物和金属配体的结合物。在该结合物中,含氨基糖的葡聚糖或其改性产物和金属配体直接结合。
本发明的含氨基糖的葡聚糖在非还原端具有反应性基团氨基。该氨基在水溶液中在中性条件下带正电荷。另一方面,通过化学修饰该氨基,可以将阴离子官能团或疏水性基团导入葡聚糖的末端。另一方面,具有各种结构和分子量的葡聚糖可用于本发明的葡聚糖部分。当组合这些技术时,例如,能够可控地将阳离子官能团、阴离子官能团、疏水性基团等导入具有可封装蛋白质的分子量的支链葡聚糖的末端。这种改性葡聚糖的末端可以被灵活转移,与蛋白质表面存在的带电部分发生静电相互作用,并与疏水区域发生疏水相互作用,因此,本发明的葡聚糖与蛋白质通过非共价键形成复合物。因此,通过将本发明的含氨基糖的葡聚糖或其改性产物与蛋白质、肽等在溶液中混合,可以形成本发明的含氨基糖的葡聚糖或其改性产物和蛋白质、肽等的复合物。类似地,也可以设计能与核酸、脂质体、病毒颗粒、大分子胶束或低分子量化合物有效地形成非共价结合复合物的葡聚糖的末端结构。如上所述,本发明的葡聚糖和其末端衍生物能与蛋白质、核酸、低分子量化合物或DDS用纳米微粒载体(如脂质体、大分子胶束或病毒颗粒)有效地形成复合物,并且能影响它们的稳定性、物理性质、吸收性、药代动力学(如器官蓄积性、组织靶向性或血液滞留性)等。如上所述,本发明的葡聚糖能有效用作药物的药效成的DDS载体或DDS用纳米微粒载体的改性剂。
当本发明的含氨基糖的葡聚糖用作药物的药效成分的改性材料时,必须控制改性材料在体内的降解。当该葡聚糖是直链α-1,4-葡聚糖时,它经受α-淀粉酶的快速降解,而在体内存在的时间可能会太短。在这种情况下,可能不能获得作为改性材料的物体。然后,通过修饰构成葡聚糖的葡萄糖的一些或全部羟基,能够控制降解的必要时间。本发明中优选该含氨基糖的葡聚糖的羟基改性产物。改性是醚化或酯化。醚化优选是用烷基卤或醇的醚化。用于醚化的烷基卤或醇的碳原子数优选1-10,更优选1-5,更优选1-3。卤素基团可优选氟、氯、溴或碘。酯化优选使用羧酸或酰卤的酯化。用于酯化的羧酸或酰卤的碳原子数优选1-10,更优选1-5。改性期望是酯化。酯化更优选是酰化,更优选是乙酰化。
如上所述,本发明的含氨基糖的葡聚糖及其改性产物和其结合物(优选含氨基糖的葡聚糖及其改性产物和其结合物)可以自由地设计它们的葡聚糖的结构和其非还原端的结构,并且通过利用这点,可以随意控制药物的药效成分的药代动力学。这是药物的药效成分的改性材料,它具有在体内能完全降解的结构,并且可以安全地利用而无需担心由于蓄积引起的毒性。
因此,根据本发明,提供了含有本发明的含氨基糖的葡聚糖或其改性产物(优选含氨基糖的葡聚糖和其改性产物)和药效成分的药物。在本发明的药物中,药效成分优选自低分子量有机化合物、蛋白质、肽、抗体、抗体片段、受体、受体片段、DNA、RNA、siRNA、miRNA和RNA适体,以及其改性产物。药效成分改性的实例包括,例如添加官能团(磷酸化、羧化、酰胺化等)。核酸改性的实例包括胺化、硫醇化、磷硫酰化、甘油化(glycerylation)和赋予阳离子性的化学改性(如引入诸如氨基的阳离子基团)。
根据本发明的特定的实施方案,提供了药效成分和本发明的含氨基糖的葡聚糖、其羟基改性产物、其还原端改性产物或其氨基改性产物的结合物,其中药效成分与氨基糖残基的至少一个氨基直接共价结合,或者与氨基糖残基的至少一个氨基通过间隔物结合。该药效成分优选自低分子量有机化合物、蛋白质、肽、抗体、抗体片段、受体、受体片段、DNA、RNA、siRNA、miRNA和RNA适体,以及其改性产物。
根据特定的实施方案,本发明提供了临床诊断用组合物,其含有本发明的含氨基糖的葡聚糖、其羟基改性产物、其还原端改性产物、其氨基改性产物或其非还原端改性产物(优选含葡糖胺的葡聚糖、其羟基改性产物、其还原端改性产物、其氨基改性产物或其非还原端改性产物)。
根据本发明的特定的实施方案,提供了DDS用纳米微粒载体,含有本发明的含氨基糖的葡聚糖、其羟基改性产物、其还原端改性产物或其氨基改性产物(优选含氨基糖的葡聚糖、其羟基改性产物、其还原端改性产物或其氨基改性产物)。该DDS用纳米微粒载体优选自脂质体、病毒颗粒、大分子胶束和由带有疏水性基团的大分子组成的纳米凝胶。
根据本发明,也可以设计能与核酸、脂质体、病毒颗粒、大分子胶束和低分子量化合物有效形成非共价结合复合物的葡聚糖的末端结构。如上所述,本发明的含氨基糖的葡聚糖、其羟基改性产物、其还原端改性产物或其氨基改性产物能与蛋白质、核酸、低分子量化合物或DDS用纳米微粒载体(如脂质体、大分子胶束和病毒颗粒)有效形成复合物,并能影响它们的稳定性、物理性质、吸收性、药代动力学(如器官蓄积性、组织靶向性或血液滞留性)等。如上所述,本发明的含氨基的葡聚糖和其改性产物可有效用作药物的药效成分的DDS载体或DDS用纳米微粒载体的改性剂。
因此,根据本发明,提供了含有本发明的含氨基糖的葡聚糖或其改性产物(优选含葡糖胺的葡聚糖和其改性产物)和药效成分的药物。在本发明的药物中,药效成分优选自低分子量有机化合物、蛋白质、肽、抗体、抗体片段、受体、受体片段、DNA、RNA、siRNA、miRNA和RNA适体,以及其改性产物。
(4. 本发明的含氨基糖的葡聚糖及其改性产物和其结合物)
在本说明书中,其中至少一个氨基单糖残基α-1,4-结合到葡聚糖的至少一个非还原端的每一个上,但是在除了葡聚糖的非还原端以外的位置不存在氨基糖残基的葡聚糖被称为“含氨基糖的葡聚糖”。需要注意的是,当2个或更多个的氨基单糖结合到葡聚糖的一个末端时,那么结构是其中一个氨基单糖结合到葡聚糖的一个末端,而下一个氨基单糖结合到该氨基单糖的末端。在本说明书中,其中至少一个葡糖胺残基α-1,4-结合到葡聚糖的至少一个非还原端的每一个上,但是在除了非还原端之外的位置不存在葡糖胺残基的葡聚糖被称为“含葡糖胺的葡聚糖”。
在本说明书中,即使当糖链(由各自经α-1,4-键结合的2个或更多个氨基单糖残基组成)结合到葡聚糖的特定的非还原端,而在除了葡聚糖的非还原端以外的位置不存在氨基糖残基时,也认为氨基糖残基仅结合到非还原端,而在除了非还原端以外的位置不存在氨基糖残基。
本发明的含氨基糖的葡聚糖是其中至少一个氨基单糖残基经α-1,4-键结合到葡聚糖的至少一个非还原端的每一个上,但在除了葡聚糖的非还原端之外的位置不存在氨基糖残基的含氨基糖的葡聚糖,其中该葡聚糖是支链α-1,4-葡聚糖或直链α-1,4-葡聚糖。
本发明的含氨基糖的葡聚糖优选是含葡糖胺的葡聚糖,且更优选含葡糖胺的直链葡聚糖或含葡糖胺的支链葡聚糖。当含氨基糖的葡聚糖的葡聚糖部分是直链葡聚糖时,由于非还原端的数目是1,至少一个氨基单糖残基通过α-1,4-键结合到该非还原端。当含氨基糖的葡聚糖的葡聚糖部分是支链葡聚糖时,由于有2个或更多个非还原端,至少一个氨基单糖残基通过α-1,4-键结合到它们中的一个或多个非还原端。在一个实施方案中,本发明的含葡糖胺的支链葡聚糖是这样的含葡糖胺的支链葡聚糖,其中葡聚糖具有多个非还原端,且至少一个葡糖胺残基通过α-1,4-键结合到一个或多个非还原端,但在除了非还原端以外的位置不存在葡糖胺残基。
例如通过用α-淀粉酶处理含氨基糖的葡聚糖,可以证实在本发明的含氨基糖的葡聚糖的非还原端之外的位置不存在葡糖胺残基。α-淀粉酶作用于α-1,4-葡聚糖而产生麦芽糖和葡萄糖,然而,它不能降解在氨基糖基化的α-1,4-葡聚糖链中氨基糖和葡萄糖之间的糖苷键。因此,含氨基糖的葡聚糖表现出α-淀粉酶处理抗性。在非还原末端上含有氨基糖残基的葡聚糖,可以通过其经α-淀粉酶处理产生麦芽糖和葡萄糖,且检测到含有氨基糖的麦芽三糖的事实来确认。
(4.1)其中结合氨基糖残基的支链葡聚糖,其改性产物和其结合物
当本发明的含氨基糖的葡聚糖中所含的葡聚糖部分是支链α-1,4-葡聚糖时,在含氨基糖的葡聚糖中,至少一个氨基单糖残基α-1,4-结合到该支链α-1,4-葡聚糖所有的多个非还原端的至少一个上。根据本发明,也提供了至少一个氨基单糖残基α-1,4-结合到至少一个非还原端的支链葡聚糖的改性产物。根据本发明,还提供了至少一个氨基单糖残基α-1,4-结合到至少一个非还原端的支链葡聚糖或其改性产物的结合物。改性产物的改性如上详述。结合物中结合的物质也如上详述。
本发明的含氨基糖的支链葡聚糖、其改性产物和其结合物中所含的支链葡聚糖部分优选自淀粉、支链淀粉、糖原、糊精、酶法合成的支链葡聚糖和高支化环葡聚糖。这些支链葡聚糖部分的优选范围如“(1.1)葡聚糖和葡聚糖的改性产物”中所释。
本发明的含氨基糖的支链葡聚糖的分子量优选为约5 x 103或更大、更优选约1 x 104或更大、且更优选约5 x
104或更大。本发明的含氨基糖的支链葡聚糖的分子量优选为约1 x 109或更小,更优选约3 x 108或更小,且更优选约1 x
108或更小。
本发明的含氨基糖的支链葡聚糖的改性产物的分子量优选为约5 x 103或更大、更优选约1 x 104或更大、且更优选约5 x
104或更大。本发明的含氨基糖的支链葡聚糖的改性产物的分子量优选为约1 x 109或更小,更优选约3 x 108或更小,且更优选约1 x
108或更小。
在本发明的结合物中,优选将其它的物质(如靶向分子、药效成分等)结合到上述具有适当分子量的含氨基糖的支链葡聚糖上。
在本发明中,优选含氨基糖的支链葡聚糖的改性产物。改性优选是酰化或醚化,且更优选乙酰化。酰化度优选是约0.1或更大,更优选约0.2或更大,且尤其优选约0.3或更大。酰化度通过定量在碱性条件下加热释放的乙酸来计算。醚化度优选是约0.1或更大,更优选约0.2或更大,且尤其优选约0.3或更大。醚化度通过NMR计算。
结合到本发明的含氨基糖的支链葡聚糖、其改性产物和其结合物的氨基单糖残基的数目优选为每个分子1个或多个,更优选2个或更多,且更优选3个或更多。结合到本发明的含氨基糖的支链葡聚糖或其改性产物的氨基单糖残基的数目不局限于此,例如可以是每个分子5个或更多、10个或更多、15个或更多、20个或更多、50个或更多或100个或更多等。可以根据目的适当调整该数目。结合到本发明的含氨基糖的支链葡聚糖或其改性产物的氨基单糖残基的数目的上限是该支链葡聚糖部分的非还原端的数目。结合到本发明的含氨基糖的支链葡聚糖或其改性产物的氨基单糖残基的数目可以是,例如每个分子约1000个或更少、约800个或更少、约700个或更少、约600个或更少、约500个或更少、约400个或更少、约300个或更少、约200个或更少、约100个或更少、约50个或更少等。
在特定的实施方案中,结合到本发明的含氨基糖的支链葡聚糖、其改性产物和其结合物的氨基单糖残基的数目优选为支链葡聚糖部分所有的非还原端数目的约10%或更多,更优选约20%或更多、尤其优选约30%或更多,且例如可以是约40%或更多、约50%或更多或约60%或更多。在特定的实施方案中,结合到本发明的含氨基糖的支链葡聚糖、其改性产物和其结合物的氨基单糖残基的数目优选为支链葡聚糖部分所有的非还原端数目的约100%或更少,更优选约90%或更少,尤其优选约80%或更少,且例如可以是约70%或更少、约60%或更少或约50%或更少。
(4.2)其中结合氨基糖残基的直链葡聚糖,其改性产物和其结合物
在本发明的含氨基糖的直链葡聚糖中,至少一个氨基单糖残基α-1,4-结合到直链葡聚糖部分的非还原端上。由于直链葡聚糖只有一个非还原端,如果在氨基单糖和葡聚糖反应中加入反应溶液的氨基单糖的量少,本发明的含氨基糖的直链葡聚糖只含有一个氨基单糖残基。如果在氨基单糖和葡聚糖反应中加入反应溶液的氨基单糖的量大,2个或更多个通过α-1,4-键结合的氨基单糖可以结合到直链葡聚糖的非还原端上。根据本发明,还提供了直链葡聚糖的改性产物,该直链葡聚糖带有至少一个与其α-1,4-结合的氨基单糖残基。根据本发明,还提供了直链葡聚糖或其改性产物的结合物,该直链葡聚糖带有至少一个与其α-1,4-结合的氨基单糖残基。改性产物的改性如上详述。结合物中结合到含氨基糖的葡聚糖或其改性产物的物质也如上详述。
本发明的含氨基糖的直链葡聚糖或其改性产物中所含的直链葡聚糖部分优选自直链淀粉(如天然直链淀粉或酶法合成的直链淀粉)和其衍生物。这些直链葡聚糖部分的优选范围如“(1.1)葡聚糖和葡聚糖的改性产物”中所释。
本发明的含氨基糖的直链葡聚糖的分子量为例如约1 x 103或更大、优选约1.5 x 103或更大、更优选约2 x
103或更大,且更优选约3 x 103或更大。本发明的含氨基糖的直链葡聚糖的分子量为例如约1 x 107或更小,优选约2 x 105或更小,更优选约1.5 x
105或更小,且更优选约1 x 105或更小。
本发明的含氨基糖的直链葡聚糖的改性产物的分子量为例如约1 x 103或更大、优选约1.5 x 103或更大、更优选约2 x
103或更大,且更优选约3 x 103或更大。本发明的含氨基糖的直链葡聚糖的分子量为例如约1 x 107或更小,优选约2 x 105或更小,更优选约1.5 x
105或更小,且更优选约1 x 105或更小。
在本发明的结合物中,优选将其它的物质(如靶向分子、药效成分等)结合到具有上述适当分子量的含氨基糖的直链葡聚糖或其改性产物上。
在本发明中,优选含氨基糖的直链葡聚糖的改性产物。改性优选是酰化或醚化,且更优选乙酰化。酰化度优选是约0.1或更大,更优选约0.2或更大,且尤其优选约0.3或更大。酰化度通过定量在碱性条件下加热释放的乙酸来计算。醚化度优选是约0.1或更大,更优选约0.2或更大,且尤其优选约0.3或更大。醚化度通过NMR计算。
本发明的含葡糖胺的直链葡聚糖的实例可由例如下式1的结构表示:
[化学式1]
其中n为1或更大的整数。n优选约8或更大,更优选约9或更大,且更优选约10或更大。n优选约1200或更小,更优选约900或更小,且更优选约600或更小。
本发明的含葡糖胺的直链葡聚糖和其还原端改性产物的实例可由例如下式2表示:
[化学式2]
其中n为1或更大的整数。n优选约8或更大,更优选约9或更大,且更优选约10或更大。n优选约1200或更小,更优选约900或更小,且更优选约600或更小。X选自氢、单糖、非还原性碳水化合物、生物相容性大分子、脂质体组成成分、糖苷和含氨基的低分子量物质。X优选自氢、葡糖胺、N-乙酰基葡糖胺、葡糖酸、山梨醇、蔗糖、海藻糖、糊精、直链淀粉、淀粉、纤维素、甲壳素、壳聚糖、右旋糖酐、蛋白质、肽、磷脂、脂肪酸、表面活性剂、抗坏血酸葡糖苷、氢醌葡糖苷、橙皮苷葡糖苷、芸香苷葡糖苷、对硝基苯基麦芽五糖、十二烷基麦芽糖、黄酮糖苷、萜糖苷、苯酚糖苷、查耳酮糖苷、类固醇糖苷、氨基酸和十二烷胺。当X是氢时,该分子是含葡糖胺的直链葡聚糖;当X是除了氢以外的物质时,该分子是含葡糖胺的直链葡聚糖的还原端改性产物。
本发明的含葡糖胺的直链葡聚糖、含葡糖胺的直链葡聚糖的羟基改性产物和其还原端改性产物可由例如下式3表示:
[化学式3]
其中n为1或更大的整数。n优选约8或更大,更优选约9或更大,且更优选约10或更大。n优选约1200或更小,更优选约900或更小,且更优选约600或更小。X选自氢、单糖、非还原性碳水化合物、生物相容性大分子、脂质体组成成分、糖苷和含氨基的低分子量物质。X优选自氢、葡糖胺、N-乙酰基葡糖胺、葡糖酸、山梨醇、蔗糖、海藻糖、糊精、直链淀粉、纤维素、甲壳素、壳聚糖、右旋糖酐、蛋白质、肽、磷脂、脂肪酸、表面活性剂、抗坏血酸葡糖苷、氢醌葡糖苷、橙皮苷葡糖苷、芸香苷葡糖苷、对硝基苯基麦芽五糖、十二烷基麦芽糖、黄酮糖苷、萜糖苷、苯酚糖苷、查耳酮糖苷、类固醇糖苷、氨基酸和十二烷胺。其中R独立地优选自氢、羟烷基、烷基、乙酰基、羧甲基、硫酸基和磷酸基。当X和全部的R为氢时,该分子是含葡糖胺的直链葡聚糖;当X为氢,且每个R独立地为氢或其它基团,前提是至少1个R为除氢以外的基团时,该分子是含葡糖胺的直链葡聚糖的羟基改性产物;当X为除氢以外的物质,且全部的R为氢时,该分子是含葡糖胺的直链葡聚糖的还原端改性产物;当X为除氢以外的物质,且每个R独立地为氢或其它基团,前提是至少1个R为除氢以外的基团时,该分子是含葡糖胺的直链葡聚糖的羟基改性产物的还原端改性产物。
本发明的含葡糖胺的直链葡聚糖、含葡糖胺的直链葡聚糖的羟基改性产物、其还原端改性产物和其氨基改性产物可由例如下式4表示:
[化学式4]
其中n为1或更大的整数。n优选约8或更大,更优选约9或更大,且更优选约10或更大。n优选约1200或更小,更优选约900或更小,且更优选约600或更小。X选自氢、单糖、非还原性碳水化合物、生物相容性大分子、脂质体组成成分、糖苷和含氨基的低分子量物质。X优选自氢、葡糖胺、N-乙酰基葡糖胺、葡糖酸、山梨醇、蔗糖、海藻糖、糊精、直链淀粉、淀粉、纤维素、甲壳素、壳聚糖、右旋糖酐、蛋白质、肽、磷脂、脂肪酸、表面活性剂、抗坏血酸葡糖苷、氢醌葡糖苷、橙皮苷葡糖苷、芸香苷葡糖苷、对硝基苯基麦芽五糖、十二烷基麦芽糖、黄酮糖苷、萜糖苷、苯酚糖苷、查耳酮糖苷、类固醇糖苷、氨基酸和十二烷胺。其中R独立地优选自氢、羟烷基、烷基、乙酰基、羧甲基、硫酸基和磷酸基。其中Y优选自氨基、阴离子取代基、疏水性取代基、含马来酰亚胺基的取代基和含琥珀酰亚胺基的取代基。当X和全部的R为氢且Y为氨基时,该分子是含葡糖胺的直链葡聚糖;当X和全部的R为氢,且Y为除氨基以外的基团(即阴离子取代基、疏水性取代基、含马来酰亚胺基的取代基或含琥珀酰亚胺基的取代基)时,该分子是含葡糖胺的直链葡聚糖的氨基改性产物;当X为氢,每个R独立地为氢或其它基团,前提是至少1个R为除氢以外的基团,且Y为氨基时,该分子是含葡糖胺的直链葡聚糖的羟基改性产物;当X为氢,每个R独立地为氢或其它基团,前提是至少1个R为除氢以外的基团,且Y为除氨基以外的基团(即阳离子取代基、疏水性取代基、含马来酰亚胺基的取代基或含琥珀酰亚胺基的取代基)时,该分子是含葡糖胺的直链葡聚糖的羟基改性产物的氨基改性产物;当X为除氢以外的物质,全部的R为氢,且Y为氨基时,该分子是含葡糖胺的直链葡聚糖的还原端改性产物;当X为除氢以外的物质,全部的R为氢,且Y为除氨基以外的基团(即阴离子取代基、疏水性取代基或含马来酰亚胺基的取代基)时,该分子是含葡糖胺的直链葡聚糖的氨基改性产物的还原端改性产物;当X为除氢以外的物质,每个R独立地为氢或其它基团,前提是至少1个R为除氢以外的基团,且Y为氨基时,该分子是含葡糖胺的直链葡聚糖的羟基改性产物的还原端改性产物;当X为除氢以外的物质,每个R独立地为氢或其它基团,前提是至少1个R为除氢以外的基团,且Y为除氨基以外的基团(即阴离子取代基、疏水性取代基或含马来酰亚胺基的取代基)时,该分子为含葡糖胺的直链葡聚糖的羟基改性产物的氨基改性产物。
本发明的含葡糖胺的葡聚糖的实例可由例如下式5表示:
[化学式5]
其中m为1或更大的整数。m优选8或更大,更优选9或更大,且更优选10或更大,且m优选约1×104或更小,更优选约1000或更小,且更优选约700或更小。R1独立地为氢、具有式A结构的葡聚糖链或具有式B结构的葡聚糖链。当全部的R1为氢时,式5所示葡聚糖为直链葡聚糖。当至少一个R1具有式A或式B的结构时,式5所示葡聚糖为支链葡聚糖。
[化学式6]
在式A中,k为1或更大的整数。k优选为8或更大,更优选9或更大,且更优选10或更大,且k优选为约1×104或更小,更优选约1000或更小,且更优选约700或更小。在式A中,每个R2独立地为氢、具有式A结构的葡聚糖链或具有式B结构的葡聚糖链。
[化学式7]
在式B中,s为1或更大的整数。s优选为8或更大,更优选9或更大,且更优选10或更大,且s优选为约1×104或更小,更优选约1000或更小,且更优选约700或更小。在式B中,R3独立地为氢、具有式A结构的葡聚糖链或具有式B结构的葡聚糖链。
如上所释,在式5中,R1可具有其中具有式A结构的基团的R2位置或具有式B结构的基团的R3位置多次被具有式A结构的基团或具有式B结构的基团取代的结构。用式A和式B取代的总次数等于式5所示支链葡聚糖分子的单元链的数目。支链葡聚糖分子的单元链的数目优选为1个或多个,更优选2个或更多,且还更优选3个或更多。支链葡聚糖分子的单元链的数目优选为约5×103或更少,更优选约2×103或更少,且还更优选约1×103或更少。
本发明的含葡糖胺的葡聚糖或含葡糖胺的葡聚糖的羟基改性产物的实例可由例如下式6表示:
[化学式8]
其中m为1或更大的整数。m优选8或更大,更优选9或更大,且更优选10或更大,且m优选约1×104或更小,更优选约1000或更小,且更优选约700或更小。R1独立地为H、羟烷基、烷基、乙酰基、羧甲基、硫酸基、磷酸基、具有式6A结构的葡聚糖链或具有式6B结构的葡聚糖链。
[化学式9]
在式6A中,k为1或更大的整数。k优选为8或更大,更优选9或更大,且更优选10或更大,且k优选为约1×104或更小,更优选约1000或更小,且更优选约700或更小。在式6A中,每个R2独立地为氢、羟烷基、烷基、乙酰基、羧甲基、硫酸基、磷酸基、具有式6A结构的葡聚糖链或具有式6B结构的葡聚糖链。
[化学式10]
在式6B中,s为1或更大的整数。s优选为8或更大,更优选9或更大,且更优选10或更大,且s优选为约1×104或更小,更优选约1000或更小,且更优选约700或更小。在式6B中,每个R3独立地为氢、羟烷基、烷基、乙酰基、羧甲基、硫酸基和磷酸基、具有式6A结构的葡聚糖链或具有式6B结构的葡聚糖链。
在式6、式6A和式6B中,每个R4独立地选自H、羟烷基、烷基、乙酰基、羧甲基、硫酸基和磷酸基。
本发明的含葡糖胺的葡聚糖、含葡糖胺的葡聚糖的羟基改性产物和其还原端改性产物可由例如下式7表示:
[化学式11]
式7
其中m为1或更大的整数。m优选为8或更大,更优选9或更大,且更优选10或更大,且m优选约1×104或更小,更优选约1000或更小,且更优选约700或更小。R1独立地为H、具有式6A结构的葡聚糖链或具有式6B结构的葡聚糖链。式6A和式6B与上述式6的定义相同。
在式7、式6A和式6B中,R4独立地选自氢、羟烷基、烷基、乙酰基、羧甲基、硫酸基和磷酸基。在式7中,X独立地优选自单糖、非还原性碳水化合物、生物相容性大分子、脂质体组成成分、糖苷和含氨基的低分子量物质。X更优选自氢、葡糖胺、N-乙酰基葡糖胺、葡糖酸、山梨醇、蔗糖、海藻糖、糊精、直链淀粉、淀粉、纤维素、甲壳素、壳聚糖、右旋糖酐、蛋白质、肽、磷脂、脂肪酸、表面活性剂、抗坏血酸葡糖苷、氢醌葡糖苷、橙皮苷葡糖苷、芸香苷葡糖苷、对硝基苯基麦芽五糖、十二烷基麦芽糖、黄酮糖苷、萜糖苷、苯酚糖苷、查尔酮糖苷、类固醇糖苷、氨基酸和十二烷胺。
本发明的含葡糖胺的葡聚糖、含葡糖胺的葡聚糖的羟基改性产物、其还原端改性产物或其氨基改性产物可由例如下式8表示:
[化学式12]
其中m为1或更大的整数。m优选为8或更大,更优选9或更大,且更优选10或更大,且m优选约1×104或更小,更优选约1000或更小,且更优选约700或更小。R1独立地为氢、羟烷基、烷基、乙酰基、羧甲基、硫酸基、磷酸基、具有式6A结构的葡聚糖链、具有式8A结构的葡聚糖链或具有式6B结构的葡聚糖链。
[化学式13]
在式6A中,k为1或更大的整数。k优选为8或更大,更优选9或更大,且更优选10或更大,且k优选为约1×104或更小,更优选约1000或更小,且更优选约700或更小。在式6A中,每个R2独立地为氢、羟烷基、烷基、乙酰基、羧甲基、硫酸基、磷酸基、具有式6A结构的葡聚糖链、具有式8A结构的葡聚糖链或具有式6B结构的葡聚糖链。
[化学式14]
式8A
在式8A中,p为1或更大的整数。p优选为8或更大,更优选9或更大,且更优选10或更大,且p优选为约1×104或更小,更优选约1000或更小,且更优选约700或更小。在式8A中,R5独立地为氢、羟烷基、烷基、乙酰基、羧甲基、硫酸基、磷酸基、具有式6A结构的葡聚糖链、具有式8A结构的葡聚糖链或具有式6B结构的葡聚糖链。
[化学式15]
在式6B中,s为1或更大的整数。s优选为8或更大,更优选9或更大,且更优选10或更大,且s优选为约1×104或更小,更优选约1000或更小,且更优选约700或更小。在式6B中,每个R3独立地为氢、羟烷基、烷基、乙酰基、羧甲基、硫酸基、磷酸基、具有式6A结构的葡聚糖链、具有式8A结构的葡聚糖链或具有式6B结构的葡聚糖链。
在式8、式6A、式8A和式6B中,R4独立地选自氢、羟烷基、烷基、乙酰基、羧甲基、硫酸基和磷酸基。
在式8中,X独立地选自单糖、非还原性碳水化合物、生物相容性大分子、脂质体组成成分、糖苷和含氨基的低分子量物质。
在式8中,Y是被引入用于与氨基或药效成分结合的取代基,优选自氨基、阴离子取代基、疏水性取代基、含马来酰亚胺基的取代基和含琥珀酰亚胺基的取代基,并且在式8A中,Y是被引入用于与药效成分结合的取代基,优选自阴离子取代基、疏水性取代基、含马来酰亚胺基的取代基和含琥珀酰亚胺基的取代基,Y通过与氨基改性剂的反应得到,且该氨基改性剂具有至少一个羧基和至少一个其它官能团。
如上所释,在式8中,R1可以具有以下结构,其中具有式6A结构的基团的R2或具有式6B结构的基团的R3或具有式8A结构的基团的R5位置被具有式6A结构的基团或具有式6B结构的基团或具有式8A结构的基团多次取代。用式6A的基团、式6B的基团或式8A的基团取代的总次数等于式8表示的支链葡聚糖分子的单元链的数目。支链葡聚糖分子的单元链的数目优选约2个或更多、更优选约5个或更多、且还更优选约10个或更多。支链葡聚糖分子的单元链的数目优选约5000或更少、更优选约3000或更少、且还更优选约2000或更少。
在具体实施方案中,本发明的含葡糖胺的葡聚糖、含葡糖胺的葡聚糖的羟基改性产物、其还原端改性产物或其氨基改性产物可具有例如下式9的结构:
[化学式16]
其中q为0或1或更大的整数。在一个实施方案中,q可以为例如0、1、2、3、4或5。q优选为0、1或2,且更优选0或1。r为1或更大的整数。r优选为8或更大,更优选9或更大,且更优选10或更大,并且r优选约1×104或更小,更优选约1000或更小,且更优选约700或更小。R1独立地为氢、羟烷基、烷基、乙酰基、羧甲基、硫酸基、磷酸基、具有式9A结构的葡聚糖链、具有式8A结构的葡聚糖链或具有式6B结构的葡聚糖链。
[化学式17]
在式9A中,t为0或1或更大的整数。在一个实施方案中,t可以为例如0、1、2、3、4或5。t优选为0、1或2,且更优选0或1。u为1或更大的整数。u优选为8或更大,更优选9或更大,且更优选10或更大,并且u优选约1×104或更小,更优选约1000或更小,且更优选约700或更小。在式9A中,R6各自独立地为氢、羟烷基、烷基、乙酰基、羧甲基、硫酸基、磷酸基或具有式9A结构的葡聚糖链。
在式9中,X独立地选自单糖、非还原性碳水化合物、生物相容性大分子、脂质体组成成分、糖苷和含氨基的低分子量物质。
在式9和式9A中,R4独立地选自氢、羟烷基、烷基、乙酰基、羧甲基、硫酸基和磷酸基。
在式9和式9A中,Y是被引入用于与OH、NH2或药效成分结合的取代基,前提是至少一个Y是被引入用于与NH2或药效成分结合的取代基。Y优选自氨基、阴离子取代基、疏水性取代基、含马来酰亚胺基的取代基和含琥珀酰亚胺基的基团。Y通过与氨基改性剂的反应得到,且该氨基改性剂具有至少一个羧基和至少一个其它的官能团。
如上所释,在式9中,R1可以具有以下结构,其中具有式9A结构的基团的R6的位置被具有式9A结构的基团多次取代。用式9A的基团取代的总次数等于由式9表示的支链葡聚糖分子的单元链的数目。支链葡聚糖分子的单元链的数目优选为约2个或更多、更优选约5个或更多、且还更优选约10个或更多。支链葡聚糖分子的单元链的数目优选约5000或更少、更优选约3000或更少、且还更优选约2000或更少。
在以下表1中总结了本发明的含葡糖胺的葡聚糖的改性的实例和改性的目的。表中的结构仅仅是实例。
[表1] 表1:含葡糖胺的葡聚糖的改性实例和应用
在表1中,列举了其中将1个葡糖胺残基结合到非还原端的情况。如在本说明书其它部分中说明的,其中2个或更多个葡糖胺残基经1,4-结合的低聚葡糖胺可以结合到非还原端。此外,葡萄糖残基、甘露糖残基、半乳糖残基或由它们构成的低聚糖残基等可以结合到葡糖胺残基的4位上。
在一个实施方案中,提供用于与药物结合的组合物,其包含本发明的含葡糖胺的葡聚糖、含葡糖胺的葡聚糖的羟基改性产物、其还原端改性产物、其氨基改性产物或其非还原端改性产物。在本发明的用于与药物结合的组合物中,这些物质的纯度非常高,而且几乎不含用于合成这些物质的物质。例如,本发明的用于与药物结合的组合物中葡糖胺-1-磷酸的含量为约10wt%或更少,更优选约1wt%或更少,更优选约0.1wt%或更少。对其它合成材料类似地,优选每个的含量优选为约10wt%或更少,更优选约1wt%或更少,且最优选约0.1wt%或更少。
(药物制备)
当本发明的含葡糖胺的支链葡聚糖、羟基改性产物、还原端改性产物、氨基改性产物或非还原端改性产物不包含药物时,它们优选可用作DDS载体。例如,通过在水溶液中混合本发明的含葡糖胺的支链葡聚糖、羟基改性产物、还原端改性产物和氨基改性产物(它们统一被称为本发明的载体)和带负电荷的药物,本发明的载体和带负电荷的药物静电结合形成复合物。该复合物可用作药物,该药物的分子量可适当调节。由于该复合物由两种组分(载体和带负电荷的药物)构成,该复合物也可被称为“双组分复合物”。本说明书中所用术语“双组分复合物”广义上是指第一种物质或试剂和与第一种物质或试剂特定相互作用的第二种物质或试剂的复合物。
当在本发明的结合物中结合的物质为药物时,本发明的结合物优选可用作药物。
(含氨基糖的葡聚糖、其改性产物或其结合物和核酸分子的复合物)
本发明的含氨基糖的葡聚糖在溶液中与核酸分子(多核苷酸)形成复合物。复合物中含氨基糖的葡聚糖和核酸分子间的结合强度适当,并且结合的强度可以通过控制氨基糖引入的比率来调节,因此,该复合物可适用于将核酸分子导入细胞。优选地,本发明的复合物是核酸分子和本发明的含氨基糖的支链葡聚糖形成的复合物,该核酸分子包含能在目标细胞中表达的基因。更优选地,本发明的复合物是核酸分子和本发明的含葡糖胺的支链葡聚糖形成的复合物,该核酸分子包含能在目标细胞中表达的基因。该基因可以是打算在目标细胞中合适的地方(如细胞核中、线粒体中、细胞质中等)导入和表达的基因。优选地,核酸分子可选自DNA、RNA、siRNA、miRNA和RNA适体。
阳离子性聚合物或阳离子性脂质可进一步非共价结合到本发明的含氨基糖的葡聚糖和核酸分子的复合物上以形成进一步的复合物。
因此,在具体的实施方案中,本发明的复合物是由本发明的含氨基糖的葡聚糖和核酸分子的复合载体和阳离子性聚合物或阳离子性脂质形成的复合物。阳离子性聚合物可包含至少一种选自聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚精氨酸、聚酰胺-胺树枝状聚合物、聚氨基苯乙烯、壳聚糖、阳离子葡聚糖和DEAE-右旋糖酐中的阳离子性聚合物。由于该复合物由三种组分(载体、核酸分子和阳离子性聚合物或阳离子型脂质)构成,该复合物也可以被称为“三组分复合物”。
本说明书中所用术语“三组分复合物”广义上是指第一种物质或试剂、第二种物质或试剂和第三种物质或试剂的复合物,其中该第二种物质或试剂特定地与第一种物质或试剂相互作用,该第三种物质或试剂特定地与第一种物质或试剂或第二种物质或试剂相互作用。这样的三组分复合物包括但不限于本发明的载体、带负电荷的药物(如核酸分子)和带正电荷的物质(如聚阳离子聚合物)的复合物。
(传递基因的方法)
本发明的复合物可有效地用于传递基因。本发明的传递核酸分子的方法是将核酸分子传递到细胞中的方法,其包括将上述本发明的含氨基糖的葡聚糖和核酸分子的复合物、或由含氨基糖的葡聚糖和核酸分子的复合载体和阳离子型聚合物或阳离子型脂质形成的复合物与细胞接触。该复合物和细胞在体外或体内接触,且优选在体外接触。
用于本说明书的“接触”是指直接地或间接地使细胞与本发明的复合物物理临近。该复合物可以在缓冲剂、盐、溶液等中存在。体外接触可以通过将细胞放入例如含有复合物的烧杯、微量滴定板、细胞培养瓶或微阵列(如基因芯片)中进行。
本说明书中的“复合物”是指通过非共价结合诸如糖、多肽、多核苷酸、脂质或小分子的多种分子而形成的分子。这样的复合物的实例包括但不限于,例如含氨基糖的葡聚糖和多核苷酸的复合物、含氨基糖的葡聚糖和蛋白质的复合物、含氨基糖的葡聚糖、核酸分子和阳离子型聚合物或阳离子型脂质的复合物等。
多核苷酸向细胞内部的体外和体内传递(转染)可通过将三组分复合物与待转染的细胞接触来进行。优选地,该细胞是哺乳动物细胞。体外三组分复合物和细胞的接触可以用本领域技术人员已知的各种方法进行,例如,如下述非限制性实施例中说明的。体内三组分复合物和细胞的接触可以通过,优选通过诸如全身给药或局部给药将该复合物导入动物(优选哺乳动物)的体内来进行。优选地,给药通过向哺乳动物(例如人)给予三组分复合物来进行,所述哺乳动物具有需要转染特定多核苷酸的细胞,所述三组分复合物包含有效量的该多核苷酸以便将所需量的多核苷酸传递到细胞中。有效传递该所需多核苷酸的三组分复合物的量可根据常规的体外实验和/或诸如临床试验的本领域技术人员已知的方法来确定。
(治疗方法)
本发明的复合物可有效用于基因治疗、药物治疗等。在基因治疗的具体实施方案中,本发明的治疗方法是包括向受试者给予本发明的含氨基糖的葡聚糖和核酸分子的复合物、或由含氨基糖的葡聚糖和核酸分子的复合载体和阳离子型聚合物或阳离子型脂质形成的复合物的方法,其中该核酸分子包含用于治疗的基因。在药物治疗的具体实施方案中,本发明的治疗方法包括向受试者给予本发明的含氨基糖的葡聚糖和药效成分的复合物。
包含基因的核酸分子也可用常规基因工程技术制备,该基因编码适合治疗目标疾病的治疗用蛋白质。核酸分子可以是表达载体或质粒。对于表达载体、质粒和其中所含元素参考通用解释。
实施例
以下将根据实施例说明本发明,但本发明不限于所述实施例。用于实施例的源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶是通过以下制备例1制备的源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶。
(制备例1:制备源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶)
源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶通过以下方法重组制备。
(A) 制备源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶基因
通过本领域技术人员公知的方法化学合成具有编码源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶基因的氨基酸序列(序列表的SEQ
ID NO:2中描述的氨基酸序列;通过翻译美国国家生物技术信息中心(NCBI)的GenBank碱基序列数据库的ACCESSION
No.AE000657的第491380号到第493458号的碱基序列得到的氨基酸序列)的碱基序列(GenBank碱基序列数据库的ACCESSION
No.AE000657的第491380号到第493458号的碱基序列)的核酸(也称为“α-葡聚糖磷酸化酶基因”)。在该α-葡聚糖磷酸化酶的翻译起始密码子的上游创建Ndel位点。此外,在翻译终止密码子的下游创建BamHI位点,并且以Ndel和BamHI切割该合成的基因,并***到预先以Ndel和BamHI切割的质粒pET11c(Novagen生产)中制备具有源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶基因的质粒pET-AqGP。
(B) 源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶基因在大肠杆菌中的表达
根据常规方法用该质粒pET-AqGP转化大肠杆菌BL21(DE3)得到转化体。稀释含有该转化体的液体,并置于含氨苄西林的LB琼脂培养基(100μg/ml氨苄西林、1% Difco生产的胰蛋白胨、0.5% Difco生产的酵母提取物、0.5%NaCl、1.5%琼脂,pH 7.3)中以便获得独立的菌落,并将其在37℃培养过夜。在该含氨苄西林的LB琼脂培养基中生长的大肠杆菌是含有引入的质粒的转化体,并且能表达引入的质粒。以这种方式,成功制备了表达α-葡聚糖磷酸化酶基因的大肠杆菌。
(C) 制备源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶酶
将上述(B)中制备的表达源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶基因的大肠杆菌接种到LB培养基(50 μg/ml氨苄西林、1% Difco生产的胰蛋白胨、0.5% Difco生产的酵母提取物、0.5%NaCl、pH 7.3)中,并在37℃培养5小时。然后,将IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)和盐酸吡哆醇加入到该培养物中使得最终浓度为0.1
mM IPTG和 1 mM盐酸吡哆醇,并再在37℃培养24小时。然后,通过离心培养物收集细菌细胞,并用20 mM柠檬酸盐缓冲液(pH 6.7)洗涤除去培养基成分。将洗涤后的细菌细胞悬浮于20 mM柠檬酸盐缓冲液(pH 6.7)中,用超声仪破碎并离心分离,并将上清液用作细菌细胞提取物。所得细菌细胞提取物在60℃加热30分钟。然后,将该细菌细胞提取物装入预平衡的Q-Sepharose
FF柱,并以20 mM柠檬酸盐缓冲液(pH
6.7)中0.1 M-0.3 M NaCl的浓度梯度洗脱,收集GP纯化的含酶活性部分。
使用约1 μg所得纯化的含酶活性部分进行非变性PAGE(非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)。结果,在由表达α-葡聚糖磷酸化酶的大肠杆菌所得的部分中,在分子量约150 kDa的位置识别到单一条带,而在其它地方没有发现条带。由于根据其氨基酸序列计算预测源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶的分子量为约75 kDa,根据该非变性PAGE的结果,认为该α-葡聚糖磷酸化酶采取二聚体结构。以这种方式,表明源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶被均匀纯化。
(制备例2:制备支链葡聚糖(B))
将50 g蜡质玉米淀粉(SANWA
CORNSTARCH Co., LTD生产)悬浮于1000 ml 10 mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)中,并将混悬液加热至约100℃使蜡质玉米淀粉凝胶化。将200,000单位根据日本公开出版物No.
2000-216581的实施例1中所述方法制备的高热稳定支化酶加入到冷却至70℃的淀粉浆中制备反应溶液,然后使其在70℃反应16小时。将反应溶液在100℃加热20分钟后,以6500 rpm离心分离10分钟后,将上清液用孔径0.8 μm的膜过滤。然后,将滤液用凝胶过滤色谱(AKTA纯化器)***(色谱柱:GE
Healthcare生产的HiPrepTM 26/10 Desalting)脱盐除去低分子量多糖。将1000 ml滤液分成7.5
ml等分试样,并用于凝胶过滤色谱***,并且分别分离10 ml/min流速下2.7分钟到3.7分钟的洗脱部分。合并从1000 ml滤液中所得的洗脱部分,将合并的洗脱部分用孔径0.2 μm的膜过滤,然后冷冻干燥得到约35 g支链葡聚糖(B)的粉末。用配有多角度激光光散射检测仪(DAWN
DSP,Wyatt Technology Corporation 生产)和差分折射仪(Shodex RI-71,SHOWA
DENKO K.K.生产)的高效液相色谱(HPLC)***(色谱柱:OHPAK
SB-806MHQ,SHOWA DENKO K.K.生产)研究支链葡聚糖的重均分子量。将20 mg支链葡聚糖粉末溶解于10 ml
100 mM硝酸钠水溶液,并将溶液用孔径0.45 μm的膜过滤得到滤液。将100 μl所得滤液注射到上述HPLC***中。表明该支链葡聚糖(B)的重均分子量为约140 K。
当使异淀粉酶作用于上述支链葡聚糖时,通过改进的Park-Johnson方法(Hizukuri et al., Starch, Vol., 35, pp. 348-350,
(1983))考察还原力,表明支化的单元链长度平均约为15,而支化数平均约为60。
(制备例3:制备支链葡聚糖(P))
通过将150 g蔗糖溶于1000
ml蒸馏水中制备蔗糖水溶液,并将溶液用孔径0.2 μm的膜过滤。混合蔗糖水溶液(800 ml)、20 ml 5%支链葡聚糖(B)水溶液(通过将上述支链葡聚糖的制备例2制备的支链葡聚糖(B)的5%水溶液用孔径0.2 μm的膜过滤制备)、4 ml 1 M磷酸钠缓冲液(pH7.0)、1800单位通过国际公开WO 02/097107的实施例2.5中所述方法制备的重组Streptococcus mutans蔗糖磷酸化酶、1200 U本申请的制备例1中制备的α-葡聚糖磷酸化酶、和6000 U用于制备例2的根据日本公开出版物No. 2000-316581的实施例1中所述方法制备的高热稳定支化酶,并用蒸馏水调节液体体积至1000
ml,然后使在55℃反应24小时。在将反应溶液在100℃加热20分钟并以6500 rpm离心分离20分钟后,所得上清液用孔径0.8 μm的膜过滤得到滤液。然后,所得滤液用凝胶过滤色谱(AKTA 纯化器)***(色谱柱:GE
Healthcare生产的HiPrepTM 26/10 Desalting)脱盐除去低分子量多糖。将1000 ml滤液分成7.5
ml等分试样,并用于凝胶过滤色谱***,并且分别分离10 ml/min流速下2.7分钟到3.7分钟的洗脱部分。合并从1000 ml滤液中所得的洗脱部分,并用孔径0.2 μm的膜过滤,然后冷冻干燥得到约40 g支链葡聚糖(P)。当与制备例2中支链葡聚糖类似地考察葡聚糖的重均分子量时,表明支链葡聚糖(P)的重均分子量为约4000
K(对于聚合度约25000)。此外,与制备例2类似地测定还原力的结果表明,所得支链葡聚糖(P)的支化的单元链长度平均约为15,而支化数平均约为1600。此外,用集成***粒径分析仪(Otsuka
Electronics Co., Ltd.生产的FPAR-1000)测定支链葡聚糖(P)的平均粒径时,平均粒径约为37 nm。
(制备例4:制备低分子量支链淀粉)
将100 ml蜡质玉米淀粉在水中的1%混悬液用超声仪(超声匀浆器、UH-600S)处理10分钟,然后以10000 rpm离心分离,并收集上清液可溶部分。用脱盐柱(HiPrep Desalting Column, GE Company)部分纯化所得可溶部分得到淀粉部分,并冷冻干燥淀粉部分得到粉末。当用带有角度光散射检测仪的尺寸排阻色谱分析所得粉末时,证实得到了重均分子量约6100
kDa的低分子量支链淀粉。此外,与制备例2类似地测定还原力的结果表明,所得低分子量支链淀粉的支化的单元链长度平均约为22,而支化数平均约为1600。
(制备例5:制备乙酰化支链葡聚糖)
将制备例2所得支链葡聚糖(B)溶于二甲亚砜至1.8%(w/v),加入0.2%碳酸钠和0.055 M醋酸乙烯酯,并在25℃进行搅拌1小时。所得溶液用超纯水稀释2倍,并在凝胶过滤柱(PD-10)上收集葡聚糖部分得到乙酰化支链葡聚糖。为了确认乙酰化程度,将5 N氢氧化钠水溶液200 μl加入到300 μl收集到的部分中,在55℃加热30分钟进行脱乙酰化反应。将1 N Tris缓冲液(pH7.0)300 μl加入到该反应溶液中,并进一步加入5 N盐酸200 μl进行中和。使用中和后的溶液,通过苯酚硫酸法定量葡萄糖。此外,用游离乙酸定量试剂盒定量中和后溶液中的游离乙酸。其结果证实得到了乙酰化程度为0.43的乙酰化支链葡聚糖。
(制备例6:重组马铃薯α-葡聚糖磷酸化酶的重组制备)
L型马铃薯α-葡聚糖磷酸化酶通过以下日本国家阶段PCT公开出版物No. 2004-526463中所示方法重组制备。
在马铃薯α-葡聚糖磷酸化酶基因(Nakano et al.,
Journal of Biochemistry 106: 691-695 (1989),SEQ
ID NO: 3,它是编码SEQ ID NO: 4氨基酸序列的核酸序列)的上游和下游创建BamHI位点,用BamHI切割该基因,并入预先被BamHI切割的pET3d(STRATAGENE生产)得到质粒pET-PGP113。在该质粒中,α-葡聚糖磷酸化酶基因在异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导型启动子的控制下被可操作地连接。通过感受态细胞方法将该质粒导入大肠杆菌TG-1(STRATAGENE生产)中。将该大肠杆菌涂到含有含抗生素氨苄西林的LB培养基(1%胰蛋白胨(Difco生产)、0.5%酵母提取物(Difco生产)、1%氯化钠和1.5%琼脂)的平板上,并将其37℃培养过夜。选择在该板上生长的大肠杆菌,得到其中引入源自马铃薯的α-葡聚糖磷酸化酶基因的大肠杆菌。通过分析引入的基因的序列证实所得大肠杆菌含有α-葡聚糖磷酸化酶基因。此外,通过活性测定证实了所得大肠杆菌表达α-葡聚糖磷酸化酶。
将该大肠杆菌接种到1升含抗生素氨苄西林的LB培养基(1%胰蛋白胨(Difco生产)、0.5%酵母提取物(Difco生产)和1%氯化钠)中,并将其在120 rpm振荡下在37℃培养3小时。然后,将IPTG加入到该培养基中至0.1 mM,并将吡哆醇加入到该培养基中至1 mM,并将其在振荡下在22℃再培养20小时。然后,将该培养物在5000 rpm离心5分钟收集大肠杆菌细胞。将所得细胞悬浮于50 ml含有0.05%Triton X-100的20 mM
Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)中,然后,通过超声破碎得到50 ml细胞破碎液。该破碎液含有4.7 U/mg α-葡聚糖磷酸化酶。
将该细胞破碎液在55℃加热30分钟。加热后,在8500 rpm离心20分钟除去不溶性蛋白质等得到上清液。将所得上清液用于预平衡的阴离子交换树脂Q-Sepharose,使α-葡聚糖磷酸化酶被吸附到树脂上。用含有200
mM氯化钠的缓冲液洗涤树脂除去杂质。然后,用含有300 mM氯化钠的缓冲液洗脱蛋白质,得到重组马铃薯α-葡聚糖磷酸化酶酶溶液。
(制备例7:制备源自Thermococcus zilligii
AN1的α-葡聚糖磷酸化酶)
使用具有编码源自Thermococcus zilligii AN1的α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO: 6)的碱基序列(GenBank 碱基序列数据库的ACCESSION No.
AJ318499 中所述第1号至第2151号碱基序列,SEQ ID NO: 5)的核酸代替源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶基因,以与制备例1同样的方式得到α-葡聚糖磷酸化酶液体。
(实施例1:制备含葡糖胺的支链葡聚糖)
将含有50 mM葡糖胺-1-磷酸、100 mM柠檬酸盐缓冲液、制备例1中得到的源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶(18单位/ml)和制备例2得到的支链葡聚糖(B)的反应溶液在55℃培养6小时,并使其进行酶反应,由此得到酶反应产物。为了测定酶反应产物的结构,用DIONEX生产的HPAEC-PAD装置分析制备例2所得支链葡聚糖的酶处理产物和本实施例1所得酶反应产物的酶处理产物的结果示于图2。图2A是用HPAEC-PAD装置分析降解产物所得的结果,并表示支链葡聚糖的葡聚糖直链部分的长度分布,其中所述降解产物通过用足量(即过量)异淀粉酶降解支链葡聚糖的支链部分而断开全部支链后得到。关于图2A中峰上的数字,6表示麦芽六糖,7表示麦芽七糖。其上用黑色实心圆表示的峰从左到右分别表示葡萄糖聚合度8-14的麦芽低聚糖。图2B是分析降解产物所得结果,所述降解产物通过用足量(即过量)异淀粉酶降解支链葡聚糖的支链部分而断开全部支链,然后进一步用过量的源自微生物的α-葡萄糖苷酶(2000单位/ml)降解其得到。由于α-葡萄糖苷酶是从非还原端开始以葡萄糖单元降解葡聚糖的酶,因此支链葡聚糖被完全降解,并检测到葡萄糖的峰(图2B中由“葡萄糖”表示)。图2C是分析降解产物所得结果,所述降解产物通过用过量异淀粉酶降解本实施例1所得含葡糖胺的葡聚糖后得到。虽然图2C中黑色实心圆所示峰对应于与图2A中相应位置的黑色实心圆所示峰相同的洗脱时间检出的峰,但检测到具有不同间隔的由“x”表示的峰。图2D表示分析降解产物所得结果,所述降解产物通过用过量异淀粉酶降解本实施例1所得含葡糖胺的支链葡聚糖后,进一步用过量的源自微生物的α-葡萄糖苷酶降解得到。由黑色实心圆表示的峰组由于降解而消失,结果出现葡萄糖的峰(图2D中由“葡萄糖”表示),然而,由“x”表示的峰没有消失。即,由“x”表示的峰代表的部分降解产物表现出对α-葡萄糖苷酶降解的抗性。因此,证实在实施例1中获得了其中葡糖胺残基结合到非还原端的支链葡聚糖。图2E表示分析降解产物所得的结果,所述降解产物通过用过量异淀粉酶降解本实施例1所得含葡糖胺的葡聚糖,并进一步用过量的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶同时降解后得到。结果,除了葡萄糖的峰,检测到由星号表示的峰。当用α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶降解支链葡聚糖时,α-淀粉酶随机水解α-1,4-键而使支链葡聚糖降解为葡萄糖和麦芽糖,而α-葡萄糖苷酶将麦芽糖降解为葡萄糖。因此,当使α-葡萄糖苷酶和α-葡萄糖苷酶同时与支链葡聚糖反应时,支链葡聚糖被完全降解为葡萄糖,然而,在含葡糖胺的葡聚糖的情况下,由于α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶不能破坏葡糖胺和葡萄糖之间的键,因此检测到星号所示的峰。以这种方式,证实了可以制备本发明的含葡糖胺的葡聚糖,其具有其中至少一个葡糖胺残基连接到多个非还原端的每一个的结构(其中结合到非还原端的葡糖胺残基的数目为1的示例结构示于图1)。
通过定量反应溶液中游离无机磷酸的量,并使用下列公式计算支链葡聚糖与葡糖胺的结合率:
葡糖胺结合率 =(反应溶液中生成的无机磷酸的量/非还原端的数目)× 100(%)
(注:非还原端的数目 = 1 + 支链葡聚糖中支链的数目)
无机磷酸的量如下测定。首先,将钼试剂(15 mM钼酸铵和100 mM醋酸锌)(800 μl)与样品(含有无机磷酸的水溶液)(200 μl)混合,然后,加入568 mM抗坏血酸水溶液(pH 5.0)200 μl,并搅拌该混合物得到反应体系。将该反应体系在30℃保持20分钟后,用分光光度计测定850 nm处的吸光度。用具有已知浓度的无机磷酸,类似地测定吸光度,并制作标准曲线。将样品所得吸光度与该标准曲线拟合,得到样品中的无机磷酸。结果,证实用源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶能将每个非还原端58%的葡糖胺结合到支链葡聚糖(B)上。
(实施例2:用支链葡聚糖为原料制备含葡糖胺的葡聚糖)
使用制备例6得到的源自马铃薯的α-葡聚糖磷酸化酶(18单位/ml)或制备例7得到的源自Thermococcus
zilligii AN1的α-葡聚糖磷酸化酶(18单位/ml)代替制备例1得到的源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶(18单位/ml),通过与实施例1类似的酶反应可以制备含葡糖胺的葡聚糖。通过与实施例1类似地定量反应溶液中的游离无机磷酸,得到结合到含葡糖胺的葡聚糖的非还原端的葡糖胺的量。结果,证实使用源自马铃薯的α-葡聚糖磷酸化酶,每个非还原端37%的葡糖胺残基可结合到支链葡聚糖(B)上。
(实施例3:制备具有不同葡糖胺结合率的各种含葡糖胺的支链葡聚糖(BNs))
使源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶(18单位/ml)在55℃作用于含有制备例2所得支链葡聚糖、葡糖胺-1-磷酸和50 mM醋酸钠缓冲液(pH 5.5)的反应溶液4小时或18小时,制备具有不同葡糖胺结合率的7种含葡糖胺的支链葡聚糖(BN1至BN7)。各种含葡糖胺的支链葡聚糖的反应条件(支链葡聚糖浓度、葡糖胺-1-磷酸浓度和反应时间)和所得含葡糖胺的支链葡聚糖的葡糖胺结合率示于表2。通过与实施例1类似地定量反应溶液中的游离无机磷酸的量,得到结合到含葡糖胺的葡聚糖的非还原端的葡糖胺的量。
如表2所示,通过增大加入的葡糖胺-1-磷酸的浓度,提高了葡糖胺结合率。此外,通过延长反应时间,提高了葡糖胺结合率。以这种方式,通过改变相对于支链葡聚糖加入的葡糖胺-1-磷酸的比例和改变反应时间,可以调节葡聚糖向支链的非还原端的引入量。对于BN6和BN7,结合率超过100%。这表明2个或更多个葡糖胺残基结合到非还原端上,因此,聚合度为2或更大的低聚葡糖胺残基结合到一个非还原端上。即,假设葡糖胺残基平均结合到非还原端上,表明在BN7含葡糖胺的支链葡聚糖中,聚合度为2的低聚葡糖胺残基结合到71%的非还原端,而葡糖胺残基结合到剩余29%的非还原端。以这种方式,证实可以用α-1,4-键将一个葡糖胺残基结合到非还原端上,然后,另一个葡糖胺残基可进一步通过α-1,4-键结合。
[表2] 表2:制备各种含葡糖胺的葡聚糖(BNs)的反应条件和葡糖胺结合率
BN1 | BN2 | BN3 | BN4 | BN5 | BN6 | BN7 | |
支链葡聚糖浓度 (mM) | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 4 |
葡糖胺-1-磷酸浓度 (mM) | 0.04 | 0.2 | 1 | 4 | 15 | 15 | 10 |
反应时间 (hrs) | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 18 | 18 |
支链葡聚糖的非还原端上的葡糖胺结合率 (%) | 1.6 | 5.0 | 20 | 42 | 58 | 131 | 171 |
(实施例4:制备具有不同葡糖胺结合率的各种含葡糖胺的支链葡聚糖)
向制备例2制备的支链葡聚糖(B)、制备例3制备的支链葡聚糖(P)、制备例4中制备的低分子量支链淀粉或制备例5中制备的乙酰化支链葡聚糖中,以表3中所示浓度加入葡糖胺-1-磷酸,然后加入100 mM醋酸钠缓冲液(pH 5.5)和源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶(18单位/ml),并在55℃反应。反应时间如表3中所示。结果,可以制备含葡糖胺的支链葡聚糖(BN1-BN7、PN1-PN6、AN和AcBN8)。通过与实施例3类似地定量反应溶液中游离无机磷酸的量,得到结合到支链葡聚糖的非还原端的葡糖胺的量。
如表3所示,通过改变相对于支链葡聚糖加入的葡糖胺-1-磷酸的比例和改变反应时间,可以调节支链葡聚糖的非还原端上的葡糖胺的引入量。
[表3] 表3:制备各种含葡糖胺的支链葡聚糖的反应条件和葡糖胺结合率
结合率1(%):支链葡聚糖的非还原端上的葡糖胺结合率(%)
缩写2:含葡糖胺的葡聚糖的缩写。
(实施例5:制备与葡糖胺和甘露糖结合的各种支链葡聚糖)
向实施例4中制备的三种含葡糖胺的支链葡聚糖BN7、PN5和AN1的每一个(5 mM)中,加入5 mM甘露糖-1-磷酸、100 mM醋酸钠缓冲液(pH 5.5)和源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶(18单位/ml),并在55℃反应42小时。结果,可以制备甘露糖结合到含葡糖胺的支链葡聚糖上的含葡糖胺/甘露糖的支链葡聚糖。通过与实施例3类似地定量反应溶液中的游离无机磷酸的量,得到结合到含葡糖胺的支链葡聚糖的非还原端上的甘露糖的量。相对于非还原端的数目,分别可以将13%、9%和18%的甘露糖引入BN7、PN5和AN1中。结果,可以制备葡糖胺残基和甘露糖残基结合到非还原端的支链葡聚糖。
(实施例1-5汇总)
实施例1-5中用作原料的葡聚糖和各实施例得到的含葡糖胺的支链葡聚糖如下所示。
[表3A]实施例中用作原料的葡聚糖
缩写 | 产物的重均分子量 (Da) | 产物的单元链长 | 产物支化数 | ||
制备例2 | 支链葡聚糖 | B | 约140K | 约15 | 约60 |
制备例3 | 支链葡聚糖 | P | 约4000K | 约15 | 约1600 |
制备例4 | 低分子量支链淀粉 | A | 约6100K | 约22 | 约1500 |
制备例5 | 乙酰化支链葡聚糖 | AcB | 约140K | 约15 | 约60 |
[表3B] 含葡糖胺的支链葡聚糖
Mw1 = 产物的重均分子量
平均单元链长2 = 产物的平均单元链长
支化数3 = 产物的平均支化数
GlcN结合率4 = 产物非还原端上的葡糖胺的平均结合率(重均)
GlcN结合数5 = 结合到产物一个分子上的葡糖胺残基的平均数(重均)
Man结合率6 = 产物非还原端上的甘露糖的平均结合率(重均)
Man结合数7= 结合到产物一个分子上的甘露糖残基的平均数(重均)。
(实施例6:使蛋白质成为大分子)
将0.2 mg白蛋白(源自牛血清)和2 mg实施例1中制备的含葡糖胺的支链葡聚糖溶于700 μl 0.1 M 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液(pH 5.0)中。加入1 mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)并在室温下反应2小时后,用水稀释反应溶液至1/4,并用PD-10柱(GE生产)脱盐。用Superose 6 10/300 GL柱(尺寸分离柱,GE生产)通过FPLC分析分析所得溶液。用洗脱剂(50 mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)、150 mM氯化钠)以0.5 ml/min进行洗脱,并用UV(280 nm)检测产物。通过含葡糖胺的葡聚糖和白蛋白的缩合反应得到的样品的产物具有早的洗脱时间,这表明分子尺寸大。因此,这表明含葡糖胺的葡聚糖和蛋白质可脱水缩合制备大分子。
(实施例7和比较例1:含葡糖胺的支链葡聚糖和核酸的复合物形成)
每个样品分别加入0.5 μg λ DNA-Hind III片段,并使其以10μl在室温下静置5分钟,并进行1%琼脂糖凝胶电泳。所用的每个样品如下:样品1是离子交换水(比较例1-1);样品2是0.1 mg制备例2得到的支链葡聚糖(比较例1-2);样品3是0.5 mg制备例2得到的支链葡聚糖(比较例1-3);样品4是0.1 mg实施例1得到的含葡糖胺的支链葡聚糖(实施例7-1);样品5是0.5 mg实施例1得到的含葡糖胺的支链葡聚糖(实施例7-2);样品6是与样品4中所含葡糖胺单元的摩尔浓度相同的摩尔浓度的葡糖胺(比较例1-4);且样品7是与样品5中所含葡糖胺单元的摩尔浓度相同的摩尔浓度的葡糖胺(比较例1-5)。琼脂糖凝胶电泳的结果示于图3。在图3中,泳道1是样品1的结果,泳道2是样品2的结果,泳道3是样品3的结果,泳道4是样品4的结果,泳道5是样品5的结果,泳道6是样品6的结果,且泳道7是样品7的结果。虽然在样品1、2和3中检测到条带(a),在添加含葡糖胺的支链葡聚糖的样品4和5中DNA不在琼脂糖凝胶中迁移(b)。因此,发现阳离子化的含葡糖胺的葡聚糖能与DNA形成复合物。由图3的泳道4和5,该结果显而易见。另一方面,当使用葡糖胺时,没有观察到琼脂糖凝胶电泳中DNA迁移率的变化,证实葡糖胺不能改变DNA的电荷和分子量。由图3的泳道6和7,该结果显而易见。
(参考例8:使用直链葡聚糖为原料制备含葡糖胺的葡聚糖)
使用直链葡聚糖(重均分子量约5000)代替制备例2中得到的支链葡聚糖,通过与实施例1类似的酶反应制备含葡糖胺的葡聚糖。通过与实施例1类似的分析,证实一个葡糖胺残基结合到所得含葡糖胺的葡聚糖的非还原端上。
(参考例9:核酸的稳定化和由含葡糖胺的直链葡聚糖形成复合物)
除了使用参考例8中得到的含葡糖胺的直链葡聚糖(重均分子量约5000)代替实施例1中得到的含葡糖胺的支链葡聚糖以外,进行与实施例7中所述方法同样的处理,并进行琼脂糖凝胶电泳。观察到DNA迁移率的改变,并能证实增大分子量的效果。然而,该增大分子量的效果与实施例1得到的含葡糖胺的支链葡聚糖的效果相比是轻微的。
(实施例10、比较例2和比较例3:评价含葡糖胺的葡聚糖和核酸间的结合力)
用2 M NaCl溶液预先洗涤50 mg低聚(dT)-纤维素(Wako Pure
Chemical Industries, Ltd.),然后,用超纯水平衡。将平衡的低聚(dT)-纤维素悬浮于1 ml 0.1 M、0.2 M、0.3 M、0.5 M、1 M和2 M NaCl溶液中,向其中加入0.2 mg/20 μL实施例3或实施例4得到的含葡糖胺的支链葡聚糖(BN5、BN6或PN6)、制备例2得到的支链葡聚糖(B)、参考例8得到的含葡糖胺的直链葡聚糖或聚赖氨酸,混合并将混合物在室温下静置30分钟,然后以3000
rpm离心5分钟。通过苯酚硫酸法得到上清液部分中所含未与低聚(dT)-纤维素结合的含葡糖胺的支链葡聚糖(或支链葡聚糖或直链葡聚糖)的量,和相对于加入的含葡糖胺的葡聚糖(或支链葡聚糖或直链葡聚糖)的量(总糖量),结合的阳离子化的葡聚糖的量(总糖量)的比例(%)。结果示于表4。发现BN6在较高NaCl浓度下维持结合,BN6相比于BN5具有较高的阳离子化的葡聚糖的结合葡糖胺的量。此外,发现相比于BN6,具有较高分子量和较多支链的PN6在甚至更高的NaCl浓度下稳定地维持该结合。根据这些结果,发现可以通过葡糖胺残基的结合量控制与核酸的结合力。
如上所述,使用制备例2中得到的支链葡聚糖评价与低聚(dT)-纤维素的结合率。如图4所示,发现支链葡聚糖与核酸的结合力小。
如上所述,使用聚赖氨酸评价与低聚(dT)-纤维素的结合率。但是,使用蛋白质定量盒(Dojindo制)并根据制造说明测定聚赖氨酸的量。如图4所示,聚赖氨酸和低聚(dT)-纤维素间的结合力非常强,且甚至增大NaCl浓度至2 M,也不能分开它们的结合。
由于聚赖氨酸是阳离子型氨基酸的聚合产物,电荷非常强,并当与核酸复合时,它们结合太牢固而不能分开。因此,当聚赖氨酸和核酸的复合物被用作药物的药效成分时,预料该药效成分的毒性非常高,这是一个问题。
在含葡糖胺的支链葡聚糖的情况下,它与核酸在生理盐水水平的0.15 M NaCl中稳定结合,并在1 M NaCl中它可以与核酸分离。
另一方面,虽然本文所用含葡糖胺的直链葡聚糖是BN5的异淀粉酶降解产物,该直链葡聚糖在低浓度NaCl的条件下与核酸分离。特别是,该直链葡聚糖在生理盐水水平与核酸分离。即,直链葡聚糖和核酸间的结合力太弱而不能用于体内。同时,直链葡聚糖的结果表明,当含葡糖胺的支链葡聚糖给予生物体时,该支链葡聚糖在生物体内被葡聚糖降解酶降解,因此产物和核酸间的结合力变得更弱,结果可逐步释放核酸。
核酸和含葡糖胺的葡聚糖稳定结合的NaCl浓度优选为约0.1 M或更高且约2 M或更低,更优选约0.15 M或更高且约1 M或更低。
(实施例11:使用含葡糖胺的支链葡聚糖的巨噬细胞系的转染实验)
将含有编码源自萤火虫的荧光素酶的LUC基因的pGL4.51
[luc2P/CMV/NEO]载体(Promega制)与实施例4中得到的含葡糖胺的支链葡聚糖(PN6)、聚乙烯亚胺或聚赖氨酸在水溶液中混合,并在室温下静置15分钟,由此形成该载体和含葡糖胺的葡聚糖的复合物。混合的比例基于N/P比(DNA的磷酸酯基和含葡糖胺的支链葡聚糖的摩尔比),对于PN6使用2、10、50或200的N/P比,对于聚乙烯亚胺和聚赖氨酸使用200的N/P比。将含有该复合物的溶液无需纯化加入到巨噬细胞系RAW264.7(购自DS Pharma Biomedical Co., Ltd.)培养液(以4×104/0.1
mL/孔的每孔细胞数接种,并在Dulbecco改性培养基(D-MEM)中培养24小时)中。在37℃和5% CO2气氛下培养该培养液24小时,然后除去培养基,并加入Reporter裂解缓冲液(Promega生产)裂解细胞。全部根据制造商的说明,在96孔板上进行发光反应,并用照度计(Berthold生产、Centro
LB 960)测定细胞裂解液的上清液中的荧光素酶活性。
如图5所示,发现PN6表现出转染功能,且特别是,当N/P比为200时表现出最高的转染效率。聚乙烯亚胺在N/P比为200时具有明显低的效率。聚赖氨酸在N/P比为200时具有明显低的效率。
(实施例12:评价使用含葡糖胺的支链葡聚糖转染巨噬细胞系的细胞毒性)
使用蛋白质定量盒(Dojindo生产)根据制造商的说明测定实施例11中得到的细胞裂解液的上清液中蛋白质的浓度,由此研究转染对细胞数目的改变。较低的蛋白质浓度表明细胞毒性较强。如图6所示,虽然聚乙烯亚胺和聚赖氨酸在N/P比为200时产生高细胞毒性,但是PN6甚至在N/P比为50或更大时不显示明显的细胞毒性。如上所述,表明虽然由于在N/P比为200时转染效率低和毒性高,聚乙烯亚胺和聚赖氨酸不能被使用,但是由于甚至在高N/P比时毒性低且转染效率高,本发明的含葡糖胺的支链葡聚糖非常适用于作为转染载体。
(实施例13:当联合使用含葡糖胺的支链葡聚糖和聚乙烯亚胺时对转染巨噬细胞系的协同效应)
将含有编码源自萤火虫的荧光素酶的LUC基因的pGL4.51
[luc2P/CMV/NEO]载体(Promega制)与实施例3中得到的含葡糖胺的支链葡聚糖(BN7)在水溶液中混合,并在室温下静置15分钟,由此形成载体和含葡糖胺的葡聚糖的复合物。混合的比例基于N/P比(DNA的磷酸酯基和含葡糖胺的支链葡聚糖的摩尔比),并且使用2、10、50或200的N/P比。然后,将聚乙烯亚胺加入到混合物中使N/P比为10,然后在室温下静置15分钟,由此进一步将聚乙烯亚胺与载体和含葡糖胺的葡聚糖的复合物复合。将所得复合物加入到巨噬细胞系RAW264.7(购自DS Pharma Biomedical Co., Ltd.)培养液(以4×104/0.1
mL/孔的每孔细胞数接种,并在Dulbecco改性培养基(D-MEM)中培养24小时)中。将培养物在37℃和5% CO2气氛下培养24小时,然后除去培养基,并加入Reporter裂解缓冲液(Promega生产)裂解细胞。全部根据制造商的说明,在96孔板上进行发光反应,并用照度计(Berthold生产、Centro
LB 960)测定细胞裂解液的上清液中的荧光素酶活性。结果示于表4。发现与单独的聚乙烯亚胺或单独的含葡糖胺的支链葡聚糖相比,当加入聚乙烯亚胺和含葡糖胺的支链葡聚糖两者时,转染效率非常高。
[表4] 表4:含葡糖胺的支链葡聚糖、聚乙烯亚胺及其混合物的转染效率(以发光量(相对光单位、RLU)表示)
*粗线框中的数字表示转染效率。
(实施例14:α-淀粉酶消化率)
在含有0.2 M醋酸盐缓冲液(pH
5.5)、1 mM氯化钙和来源于猪胰的α-淀粉酶(26单位/mL)的反应溶液中制备例4中所得各含葡糖胺的支链葡聚糖的1%溶液,并在37℃反应4小时。4小时后,取一部分反应溶液,并用Glucose CII Test
Wako根据制造商的说明定量葡萄糖。通过苯酚硫酸法获得总糖量,并计算消化率(%)= {葡萄糖含量(g)/总糖量(g)}×100。含葡糖胺的支链葡聚糖的α-淀粉酶消化率为31.6%,而含葡糖胺的乙酰化支链葡聚糖的α-淀粉酶消化率为9.3%。因此,通过乙酰化葡聚糖可以抑制α-淀粉酶消化率。
(实施例15:含葡糖胺的支链葡聚糖和阴离子葡聚糖的颗粒形成)
将实施例4所得含葡糖胺的葡聚糖(BN5)和阴离子葡聚糖混合,并分析粒径。对于阴离子葡聚糖,相对于10 mM制备例2制备的支链葡聚糖加入15 mM葡萄糖醛酸-1-磷酸,加入100 mM醋酸钠缓冲液(pH 5.5)和源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶(18单位/ml),并在55℃反应18小时,由此制备含葡萄糖醛酸的葡聚糖(阴离子葡聚糖)。通过与实施例3类似地定量反应溶液中游离无机磷酸的量获得葡萄糖醛酸与支链葡聚糖的结合率,结果其结合率为50%。制备BN5和阴离子葡聚糖的各自的1%溶液,并以各种比例混合,在室温下静置20分钟,然后用粒径测量装置(Malvern
Instrument生产的zeta sizer nano)测量。
BN5的粒径为20 nm,而阴离子葡聚糖的粒径为23 nm。BN5和阴离子葡聚糖的混合物形成复合物颗粒。BN5和阴离子葡聚糖的1:1混合物的粒径为200 μm,10:1混合物的粒径为53 μm,而100:1混合物的粒径为774 nm。
(实施例16:含葡糖胺的支链葡聚糖的荧光标记)
将实施例4中所得含葡糖胺的支链葡聚糖BN5或AcBN8各自制成50 mg/ml二甲亚砜溶液。将2 ml的各葡聚糖/二甲亚砜溶液置于试管中,并在90℃搅拌该溶液。向它们中分别加入56 μl或112 μl的50 mg/ml异硫氰酸荧光素(FITC)的二甲亚砜溶液,加入1滴吡啶和1滴二月桂酸二正丁基锡得到反应溶液。在90℃搅拌这些反应溶液2小时。反应完成后,向这些反应溶液中加入20 ml乙醇,以3,500 rpm离心5分钟,并收集沉淀物。向沉淀物中进一步加入乙醇,进行洗涤,将洗涤后的沉淀物溶于1 ml超纯水,将1 ml溶液置于凝胶过滤柱(PD-10)上,其上通过1.5 ml超纯水,然后用超纯水收集2 ml进行纯化。将所得样品冻干。对于一部分所得样品,测定490 nm处的UV吸收。当使用荧光素钠作为标准物质获得BN5和AcBN8各自的FITC引入量时,证实各自的FITC的引入率为0.86%和0.82%。(FITC引入率(W/W %)=(FITC标记的支链葡聚糖的荧光素浓度)/(FITC标记的支链葡聚糖的总糖量)×100)。
(实施例17:制备含葡糖胺的葡聚糖的还原端改性产物)
向其中将6 g葡萄糖-1-磷酸和0.5 mg麦芽糖基海藻糖溶于100 ml 0.2 M马来酸盐缓冲液(pH 6.0)的溶液中,加入150 U本发明制备例1中制备的源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶和2,000 U根据日本公开出版物No. 2000-316581的实施例1中所述的方法制备的高耐热分支酶来制备反应溶液,然后在50℃搅拌下进行反应16小时。通过加热反应溶液使酶灭活,并通过玻璃过滤器过滤除去灭活的酶。向滤液中加入两倍量的乙醇以沉淀葡聚糖反应产物,然后离心分离。用300毫升1:1的水:乙醇溶液洗涤沉淀物两次以除去共存的葡萄糖-1-磷酸,并用乙醇再洗涤沉淀物两次,然后冻干。得到分子量为100 kDa的还原端改性的支链葡聚糖,收率为1.8 g。
使本发明的制备例1中制备的源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶(18单位/mL)在55℃作用于含有1.6 mg/mL上述还原端改性的支链葡聚糖、10 mM葡糖胺-1-磷酸和50 mM醋酸钠缓冲液(pH 5.5)的反应溶液18小时,由此制备含葡糖胺的葡聚糖。以与实施例3类似的方法得到葡糖胺的结合率,其为74%。以这种方式,得到具有改性的还原端的含葡糖胺的支链葡聚糖。
(实施例18:制备葡糖酸残基进一步结合到还原端的含葡糖胺的葡聚糖)
将10 ml 0.2 M I2/MeOH溶液加入到10 ml 5%麦芽五糖(G5)中,并在30℃在搅拌下缓慢滴加4 ml 4% KOH/MeOH溶液进行碘酸盐氧化反应。直至碘的颜色消失,进一步滴加4% KOH/MeOH溶液,并在搅拌下反应1小时。加入所得反应溶液体积的3倍量的甲醇以沉淀G5氧化物,并通过离心收集沉淀物(约0.4 g)。该沉淀物是麦芽六糖基葡萄糖酸,其中麦芽五糖的还原端葡萄糖残基被转化为葡萄糖酸残基。向其中将6 g葡萄糖-1-磷酸和0.6 mg麦芽六糖基葡萄糖酸溶于100 ml 0.2 M马来酸盐缓冲液(pH
6.0)的溶液中,加入150 U本发明制备例1中制备的源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶和2,000 U根据日本公开出版物No. 2000-316581的实施例1中所述的方法制备的高耐热分支酶来制备反应溶液,然后在50℃搅拌下进行反应16小时。通过加热溶液使酶灭活,并通过玻璃过滤器过滤除去灭活的酶。向滤液中加入两倍量的乙醇沉淀葡聚糖反应产物,并离心分离。用300毫升1:1的水:乙醇溶液洗涤沉淀物两次以除去共存的葡萄糖-1-磷酸,并用乙醇再洗涤两次,然后冻干。得到分子量为120 kDa的葡萄糖酸结合到还原端改性的支链葡聚糖,收率为1.7 g。
向含有1.6 mg/mL上述还原端改性的支链葡聚糖、10 mM葡糖胺-1-磷酸和50 mM醋酸钠缓冲液(pH 5.5)的反应溶液中,加入源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶(18单位/ml),并在55℃反应18小时,由此将葡糖胺残基结合到支链葡聚糖的非还原端,其中葡萄糖酸残基结合到该支链葡聚糖的还原端。以与实施例3类似的方法得到葡糖胺的结合率,其为70%。以这种方式,得到具有改性的还原端的含葡糖胺的支链葡聚糖。
如上所述,用优选的本发明的实施方案举例说明了本发明,但本发明不应被理解为局限于这些实施方案。应该理解,本发明的范围应该只由权利要求解释。应该理解,本领域技术人员可以基于本发明的说明书和技术常识,从本发明的具体优选的实施方案的说明出发,实施等效范围。应该理解,本说明书中引用的专利、专利申请和参考文献的内容应该并入本文作为参考,就像内容本身被具体记载于本说明书中。
工业适用性
本发明的新型含氨基糖的葡聚糖具有仅结合到非还原端的氨基糖残基。由于该含氨基糖的葡聚糖在末端具有氨基糖,葡聚糖末端变为带正电荷的,并且改变了葡聚糖的理化性质。电荷的强度可以根据氨基糖的引入频率改变。该含氨基糖的葡聚糖与核酸非共价结合以提高核酸的表观分子量。该含氨基糖的葡聚糖可广泛用于食品、化妆品、药物等。
序列表的自由文本
SEQ ID NO: 1: 源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列
SEQ ID NO: 2: 源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列
SEQ ID NO: 3: 源自马铃薯的α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列
SEQ ID NO: 4: 源自马铃薯的α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列
SEQ ID NO: 5: 源自Thermococcus
zilligii AN1的α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列
SEQ ID NO: 6: 源自Thermococcus
zilligii AN1的α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列。
序列表
<110> EZAKI GLICO CO., LTD.
<120> 含氨基糖的葡聚糖,其制备方法及其用途
<130> EG037PCT
<150> JP 2010-249082
<151> 2010-11-05
<160> 6
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 2079
<212> DNA
<213> 超嗜热菌
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2079)
<400> 1
atg gaa gaa gaa aaa gta aaa gag gga ttg tgg gag tta gct tac
aac 48
Met Glu Glu Glu Lys Val Lys Glu Gly Leu Trp Glu Leu Ala Tyr
Asn
1
5
10
15
ctg tgg tgg acg tgg aat ccg ccg gct aag gaa tta ttc aga agc
att 96
Leu Trp Trp Thr Trp Asn Pro Pro Ala Lys Glu Leu Phe Arg Ser
Ile
20
25
30
gac ccg ctt ttg tgg aag gaa act aag gaa aac ccc att gag tta
ttg 144
Asp Pro Leu Leu Trp Lys Glu Thr Lys Glu Asn Pro Ile Glu Leu
Leu
35
40
45
agg aaa acc aaa ctc ctt gaa aac aag ctc aaa gac gaa gat ttt
ata 192
Arg Lys Thr Lys Leu Leu Glu Asn Lys Leu Lys Asp Glu Asp Phe
Ile
50
55
60
tct cac ttc aag tac gtt tat tcc ctt tac aaa acc tac atg aac agg
240
Ser His Phe Lys Tyr Val Tyr Ser Leu Tyr Lys Thr Tyr Met Asn
Arg
65
70
75
80
cat tcg aaa tac gag gat acg tat aag aag cct ata gtt ttc ctg
tct 288
His Ser Lys Tyr Glu Asp Thr Tyr Lys Lys Pro Ile Val Phe Leu
Ser
85
90
95
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ctg 336
Pro Glu Tyr Gly Leu His His Thr Leu Leu Ile Tyr Ala Gly Gly Leu
100
105
110
ggc ttt tta gca gga gat ata ctc aag gag agc agt gac ttg gga
ttt 384
Gly Phe Leu Ala Gly Asp Ile Leu Lys Glu Ser Ser Asp Leu Gly
Phe
115
120
125
ccg ctt ata ggt gtc ggg ttt atg tac cct cag ggc tac gta aag
cag 432
Pro Leu Ile Gly Val Gly Phe Met Tyr Pro Gln Gly Tyr Val Lys
Gln
130
135
140
agg ata agg gtt gac gga tgg cag gaa gac ctt gac gca caa aat
caa 480
Arg Ile Arg Val Asp Gly Trp Gln Glu Asp Leu Asp Ala Gln Asn
Gln
145
150
155
160
aag gaa tta atg ccc gtt aaa aaa gtt ctg gac aaa gaa gga aaa
tgg 528
Lys Glu Leu Met Pro Val Lys Lys Val Leu Asp Lys Glu Gly Lys
Trp
165
170
175
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gtc 576
Leu Lys Cys Tyr Val Tyr Val Arg Asp Glu Lys Val Tyr Phe Gly
Val
180
185
190
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aac 624
Trp Glu Val Asn Val Gly Lys Thr Lys Leu Tyr Leu Leu Asp Thr
Asn
195
200
205
gta gag gaa aat act ccc tgg aac agg gaa ata tcc tca aga ctc
tac 672
Val Glu Glu Asn Thr Pro Trp Asn Arg Glu Ile Ser Ser Arg Leu
Tyr
210
215
220
gtt ccg gac aaa gac ctg agg tta aga caa cag ata gtt ctt ggt
ttt 720
Val Pro Asp Lys Asp Leu Arg Leu Arg Gln Gln Ile Val Leu Gly
Phe
225
230
235
240
ggc acc gta ata ctc ctt gaa aag ctg ggc att gat gca gga ggt
ttt 768
Gly Thr Val Ile Leu Leu Glu Lys Leu Gly Ile Asp Ala Gly Gly
Phe
245
250
255
cac ata aac gaa gat tat ccc tcg ttc gtg ttc ctt gca gaa ata
ttt 816
His Ile Asn Glu Asp Tyr Pro Ser Phe Val Phe Leu Ala Glu Ile
Phe
260
265
270
aaa ctt cta aaa aaa ggt ctg acc tgg gat aag gcg ata gaa gaa
gta 864
Lys Leu Leu Lys Lys Gly Leu Thr Trp Asp Lys Ala Ile Glu Glu
Val
275
280
285
aga aag att tct ctc ttt acc acg cac aca cca cta cgg gtt gcc
gta 912
Arg Lys Ile Ser Leu Phe Thr Thr His Thr Pro Leu Arg Val Ala
Val
290
295
300
aat act tat ccc ttc cac atg ata gag gaa cag ttt cta ttc gtt
aag 960
Asn Thr Tyr Pro Phe His Met Ile Glu Glu Gln Phe Leu Phe Val
Lys
305
310
315
320
gat gtt tac gga ata gac gta aag aaa gtt ctg gaa ctc gga acg
aat 1008
Asp Val Tyr Gly Ile Asp Val Lys Lys Val Leu Glu Leu Gly Thr
Asn
325
330
335
cct gaa gac cct tcg gag ggt ttt aac agt acg att atg tcc ctc
aga 1056
Pro Glu Asp Pro Ser Glu Gly Phe Asn Ser Thr Ile Met Ser Leu
Arg
340
345
350
ctc gca aag tac gta aac gca gtg agt aaa aga cat caa gaa gtt
tca 1104
Leu Ala Lys Tyr Val Asn Ala Val Ser Lys Arg His Gln Glu Val
Ser
355
360
365
agc aag atg tgg agt ttt tta ttt aaa gaa aag gag aat cca ata
gat 1152
Ser Lys Met Trp Ser Phe Leu Phe Lys Glu Lys Glu Asn Pro Ile
Asp
370
375
380
tac gta acg aac ggt gtt cac ttt ccc aca tgg att tgt tca gat
ttg 1200
Tyr Val Thr Asn Gly Val His Phe Pro Thr Trp Ile Cys Ser Asp
Leu
385
390
395
400
aga aga ctg tac gag gag tat ttg gga gag aac ttt gtg gaa ctt
cac 1248
Arg Arg Leu Tyr Glu Glu Tyr Leu Gly Glu Asn Phe Val Glu Leu
His
405
410
415
gac cac aag tct ctg tgg gaa tta ata aga gac ata ccc gac gaa
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Asp His Lys Ser Leu Trp Glu Leu Ile Arg Asp Ile Pro Asp Glu
Glu
420
425
430
ctg tgg gaa tat cac ata aga aat aaa gaa aga ctt att gag cac
ata 1344
Leu Trp Glu Tyr His Ile Arg Asn Lys Glu Arg Leu Ile Glu His
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435
440
445
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450
455
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atc ctt atg gcc gaa ggt ctg ttc ctt gat tct gac gtt ctt acg
gtc 1440
Ile Leu Met Ala Glu Gly Leu Phe Leu Asp Ser Asp Val Leu Thr
Val
465
470
475
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Phe
485
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495
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Pro
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Gly
515
520
525
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Phe
530
535
540
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Gly Gly Arg Ile Ala Phe Val Glu Asp Tyr Asp Glu Leu Leu Ala
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545
550
555
560
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Tyr Met Val Arg Gly Val Asp Val Trp Leu Asn Asn Pro Leu Pro
Pro
565
570
575
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Leu Glu Ala Cys Gly Thr Ser Gly Met Lys Ala Ser Met Asn Gly
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gga 1824
Leu His Leu Ser Ile Leu Asp Gly Trp Trp Ile Glu Gly Tyr Asn
Gly
595
600
605
aag aac ggt tgg gct ttc gga gat tac gaa gtt gaa gga gac agg
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Lys Asn Gly Trp Ala Phe Gly Asp Tyr Glu Val Glu Gly Asp Arg
Asn
610
615
620
aga gcg gat gcg gag gcc att tac aac atc ctt gag aat gaa gta
atc 1920
Arg Ala Asp Ala Glu Ala Ile Tyr Asn Ile Leu Glu Asn Glu Val
Ile
625
630
635
640
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Pro Leu Tyr Tyr Glu Arg Asp Glu Arg Gly Val Pro Val Lys Trp
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655
agt atg atg aag gaa gct ata aaa agc att acc cct aac ttt tgc
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Ser Met Met Lys Glu Ala Ile Lys Ser Ile Thr Pro Asn Phe Cys
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660
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670
aga agg atg tta aaa gat tac ata aat aag ttc tat tca aaa att
tta 2064
Arg Arg Met Leu Lys Asp Tyr Ile Asn Lys Phe Tyr Ser Lys Ile
Leu
675
680
685
aag gag gag gga
tga
2079
Lys Glu Glu
Gly
690
<210> 2
<211> 692
<212> PRT
<213> 超嗜热菌
<400> 2
Met Glu Glu Glu Lys Val Lys Glu Gly Leu Trp Glu Leu Ala Tyr Asn
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5
10
15
Leu Trp Trp Thr Trp Asn Pro Pro Ala Lys Glu Leu Phe Arg Ser Ile
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25
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Asp Pro Leu Leu Trp Lys Glu Thr Lys Glu Asn Pro Ile Glu Leu Leu
35
40
45
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65
70
75
80
His Ser Lys Tyr Glu Asp Thr Tyr Lys Lys Pro Ile Val Phe Leu Ser
85
90
95
Pro Glu Tyr Gly Leu His His Thr Leu Leu Ile Tyr Ala Gly Gly Leu
100
105
110
Gly Phe Leu Ala Gly Asp Ile Leu Lys Glu Ser Ser Asp Leu Gly Phe
115
120
125
Pro Leu Ile Gly Val Gly Phe Met Tyr Pro Gln Gly Tyr Val Lys Gln
130
135
140
Arg Ile Arg Val Asp Gly Trp Gln Glu Asp Leu Asp Ala Gln Asn Gln
145
150
155
160
Lys Glu Leu Met Pro Val Lys Lys Val Leu Asp Lys Glu Gly Lys Trp
165
170
175
Leu Lys Cys Tyr Val Tyr Val Arg Asp Glu Lys Val Tyr Phe Gly Val
180
185
190
Trp Glu Val Asn Val Gly Lys Thr Lys Leu Tyr Leu Leu Asp Thr Asn
195
200
205
Val Glu Glu Asn Thr Pro Trp Asn Arg Glu Ile Ser Ser Arg Leu Tyr
210
215
220
Val Pro Asp Lys Asp Leu Arg Leu Arg Gln Gln Ile Val Leu Gly Phe
225
230
235
240
Gly Thr Val Ile Leu Leu Glu Lys Leu Gly Ile Asp Ala Gly Gly Phe
245
250
255
His Ile Asn Glu Asp Tyr Pro Ser Phe Val Phe Leu Ala Glu Ile Phe
260
265
270
Lys Leu Leu Lys Lys Gly Leu Thr Trp Asp Lys Ala Ile Glu Glu Val
275
280
285
Arg Lys Ile Ser Leu Phe Thr Thr His Thr Pro Leu Arg Val Ala Val
290
295
300
Asn Thr Tyr Pro Phe His Met Ile Glu Glu Gln Phe Leu Phe Val Lys
305
310
315
320
Asp Val Tyr Gly Ile Asp Val Lys Lys Val Leu Glu Leu Gly Thr Asn
325
330
335
Pro Glu Asp Pro Ser Glu Gly Phe Asn Ser Thr Ile Met Ser Leu Arg
340
345
350
Leu Ala Lys Tyr Val Asn Ala Val Ser Lys Arg His Gln Glu Val Ser
355
360
365
Ser Lys Met Trp Ser Phe Leu Phe Lys Glu Lys Glu Asn Pro Ile Asp
370
375
380
Tyr Val Thr Asn Gly Val His Phe Pro Thr Trp Ile Cys Ser Asp Leu
385
390
395
400
Arg Arg Leu Tyr Glu Glu Tyr Leu Gly Glu Asn Phe Val Glu Leu His
405
410
415
Asp His Lys Ser Leu Trp Glu Leu Ile Arg Asp Ile Pro Asp Glu Glu
420
425
430
Leu Trp Glu Tyr His Ile Arg Asn Lys Glu Arg Leu Ile Glu His Ile
435
440
445
Lys Asp Arg Ala Arg Glu Arg Trp Val Lys Glu Lys Ala Asp Pro Ser
450
455
460
Ile Leu Met Ala Glu Gly Leu Phe Leu Asp Ser Asp Val Leu Thr Val
465
470
475
480
Gly Phe Ala Arg Arg Met Thr Gly Tyr Lys Arg Pro Asp Leu Ile Phe
485
490
495
Thr Asp Val Glu Arg Leu Lys Lys Ile Val Asn Asp Ser Glu Arg Pro
500
505
510
Val Gln Ile Ile Phe Ala Gly Lys Ala His Pro Ala Asp Ile Glu Gly
515
520
525
Lys Lys Ile Ile Gln Arg Ile Phe Asn Phe Ala Lys Asp Pro Glu Phe
530
535
540
Gly Gly Arg Ile Ala Phe Val Glu Asp Tyr Asp Glu Leu Leu Ala His
545
550
555
560
Tyr Met Val Arg Gly Val Asp Val Trp Leu Asn Asn Pro Leu Pro Pro
565
570
575
Leu Glu Ala Cys Gly Thr Ser Gly Met Lys Ala Ser Met Asn Gly Val
580
585
590
Leu His Leu Ser Ile Leu Asp Gly Trp Trp Ile Glu Gly Tyr Asn Gly
595
600
605
Lys Asn Gly Trp Ala Phe Gly Asp Tyr Glu Val Glu Gly Asp Arg Asn
610
615
620
Arg Ala Asp Ala Glu Ala Ile Tyr Asn Ile Leu Glu Asn Glu Val Ile
625
630
635
640
Pro Leu Tyr Tyr Glu Arg Asp Glu Arg Gly Val Pro Val Lys Trp Ile
645
650
655
Ser Met Met Lys Glu Ala Ile Lys Ser Ile Thr Pro Asn Phe Cys Ser
660
665
670
Arg Arg Met Leu Lys Asp Tyr Ile Asn Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Leu
675
680
685
Lys Glu Glu Gly
690
<210> 3
<211> 2793
<212> DNA
<213> 马铃薯
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2790)
<220>
<221> 成熟肽
<222> (43)..(2790)
<400> 3
atg gct agc atg act ggt gga cag caa atg ggt cgg atc ctc acc
ttg 48
Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Ile Leu Thr
Leu
-10
-5
-1 1
agt gag aaa att cac cat ccc att act gaa caa ggt ggt gag agc
gac 96
Ser Glu Lys Ile His His Pro Ile Thr Glu Gln Gly Gly Glu Ser
Asp
5
10
15
ctg agt tct ttt gct cct gat gcc gca tct att acc tca agt atc
aaa 144
Leu Ser Ser Phe Ala Pro Asp Ala Ala Ser Ile Thr Ser Ser Ile
Lys
20
25
30
tac cat gca gaa ttc aca cct gta ttc tct cct gaa agg ttt gag
ctc 192
Tyr His Ala Glu Phe Thr Pro Val Phe Ser Pro Glu Arg Phe Glu
Leu
35
40
45
50
cct aag gca ttc ttt gca aca gct caa agt gtt cgt gat tcg ctc
ctt 240
Pro Lys Ala Phe Phe Ala Thr Ala Gln Ser Val Arg Asp Ser Leu
Leu
55
60
65
att aat tgg aat gct acg tat gat att tat gaa aag ctg aac atg
aag 288
Ile Asn Trp Asn Ala Thr Tyr Asp Ile Tyr Glu Lys Leu Asn Met
Lys
70
75
80
caa gcg tac tat cta tcc atg gaa ttt ctg cag ggt aga gca ttg
tta 336
Gln Ala Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu Gln Gly Arg Ala Leu
Leu
85
90
95
aat gca att ggt aat ctg gag ctt act ggt gca ttt gcg gaa gct
ttg 384
Asn Ala Ile Gly Asn Leu Glu Leu Thr Gly Ala Phe Ala Glu Ala
Leu
100
105
110
aaa aac ctt ggc cac aat cta gaa aat gtg gct tct cag gaa cca
gat 432
Lys Asn Leu Gly His Asn Leu Glu Asn Val Ala Ser Gln Glu Pro
Asp
115
120
125
130
gct gct ctt gga aat ggg ggt ttg gga cgg ctt gct tcc tgt ttt
ctg 480
Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser Cys Phe
Leu
135
140
145
gac tct ttg gca aca cta aac tac cca gca tgg ggc tat gga ctt
agg 528
Asp Ser Leu Ala Thr Leu Asn Tyr Pro Ala Trp Gly Tyr Gly Leu
Arg
150
155
160
tac aag tat ggt tta ttt aag caa cgg att aca aaa gat ggt cag
gag 576
Tyr Lys Tyr Gly Leu Phe Lys Gln Arg Ile Thr Lys Asp Gly Gln
Glu
165
170
175
gag gtg gct gaa gat tgg ctt gaa att ggc agt cca tgg gaa gtt
gtg 624
Glu Val Ala Glu Asp Trp Leu Glu Ile Gly Ser Pro Trp Glu Val
Val
180
185
190
agg aat gat gtt tca tat cct atc aaa ttc tat gga aaa gtc tct
aca 672
Arg Asn Asp Val Ser Tyr Pro Ile Lys Phe Tyr Gly Lys Val Ser
Thr
195
200
205
210
gga tca gat gga aag agg tat tgg att ggt gga gag gat ata aag
gca 720
Gly Ser Asp Gly Lys Arg Tyr Trp Ile Gly Gly Glu Asp Ile Lys
Ala
215
220
225
gtt gcg tat gat gtt ccc ata cca ggg tat aag acc aga acc aca
atc 768
Val Ala Tyr Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr Lys Thr Arg Thr Thr
Ile
230
235
240
agc ctt cga ctg tgg tct aca cag gtt cca tca gcg gat ttt gat
tta 816
Ser Leu Arg Leu Trp Ser Thr Gln Val Pro Ser Ala Asp Phe Asp
Leu
245
250
255
tct gct ttc aat gct gga gag cac acc aaa gca tgt gaa gcc caa
gca 864
Ser Ala Phe Asn Ala Gly Glu His Thr Lys Ala Cys Glu Ala Gln
Ala
260
265
270
aac gct gag aag ata tgt tac ata ctc tac cct ggg gat gaa tca
gag 912
Asn Ala Glu Lys Ile Cys Tyr Ile Leu Tyr Pro Gly Asp Glu Ser
Glu
275
280
285
290
gag gga aag atc ctt cgg ttg aag caa caa tat acc tta tgc tcg
gct 960
Glu Gly Lys Ile Leu Arg Leu Lys Gln Gln Tyr Thr Leu Cys Ser
Ala
295
300
305
tct ctc caa gat att att tct cga ttt gag agg aga tca ggt gat
cgt 1008
Ser Leu Gln Asp Ile Ile Ser Arg Phe Glu Arg Arg Ser Gly Asp
Arg
310
315
320
att aag tgg gaa gag ttt cct gaa aaa gtt gct gtg cag atg aat
gac 1056
Ile Lys Trp Glu Glu Phe Pro Glu Lys Val Ala Val Gln Met Asn
Asp
325
330
335
act cac cct aca ctt tgt atc cct gag ctg atg aga ata ttg ata
gat 1104
Thr His Pro Thr Leu Cys Ile Pro Glu Leu Met Arg Ile Leu Ile
Asp
340
345
350
ctg aag ggc ttg aat tgg aat gaa gct tgg aat att act caa aga
act 1152
Leu Lys Gly Leu Asn Trp Asn Glu Ala Trp Asn Ile Thr Gln Arg
Thr
355
360
365
370
gtg gcc tac aca aac cat act gtt ttg cct gag gca ctg gag aaa
tgg 1200
Val Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu Ala Leu Glu Lys
Trp
375
380
385
agt tat gaa ttg atg cag aaa ctc ctt ccc aga cat gtc gaa atc
att 1248
Ser Tyr Glu Leu Met Gln Lys Leu Leu Pro Arg His Val Glu Ile
Ile
390
395
400
gag gcg att gac gag gag ctg gta cat gaa att gta tta aaa tat
ggt 1296
Glu Ala Ile Asp Glu Glu Leu Val His Glu Ile Val Leu Lys Tyr
Gly
405
410
415
tca atg gat ctg aac aaa ttg gag gaa aag ttg act aca atg aga
atc 1344
Ser Met Asp Leu Asn Lys Leu Glu Glu Lys Leu Thr Thr Met Arg
Ile
420
425
430
tta gaa aat ttt gat ctt ccc agt tct gtt gct gaa tta ttt att
aag 1392
Leu Glu Asn Phe Asp Leu Pro Ser Ser Val Ala Glu Leu Phe Ile
Lys
435
440
445
450
cct gaa atc tca gtt gat gat gat act gaa aca gta gaa gtc cat
gac 1440
Pro Glu Ile Ser Val Asp Asp Asp Thr Glu Thr Val Glu Val His
Asp
455
460
465
aaa gtt gaa gct tcc gat aaa gtt gtg act aat gat gaa gat gac
act 1488
Lys Val Glu Ala Ser Asp Lys Val Val Thr Asn Asp Glu Asp Asp
Thr
470
475
480
ggt aag aaa act agt gtg aag ata gaa gca gct gca gaa aaa gac
att 1536
Gly Lys Lys Thr Ser Val Lys Ile Glu Ala Ala Ala Glu Lys Asp
Ile
485
490
495
gac aag aaa act ccc gtg agt ccg gaa cca gct gtt ata cca cct
aag 1584
Asp Lys Lys Thr Pro Val Ser Pro Glu Pro Ala Val Ile Pro Pro
Lys
500
505
510
aag gta cgc atg gcc aac ttg tgt gtt gtg ggc ggc cat gct gtt
aat 1632
Lys Val Arg Met Ala Asn Leu Cys Val Val Gly Gly His Ala Val
Asn
515
520
525
530
gga gtt gct gag atc cat agt gaa att gtg aag gag gag gtt ttc
aat 1680
Gly Val Ala Glu Ile His Ser Glu Ile Val Lys Glu Glu Val Phe
Asn
535
540
545
gac ttc tat gag ctc tgg ccg gaa aag ttc caa aac aaa aca aat
gga 1728
Asp Phe Tyr Glu Leu Trp Pro Glu Lys Phe Gln Asn Lys Thr Asn
Gly
550
555
560
gtg act cca aga aga tgg att cgt ttc tgc aat cct cct ctt agt
gcc 1776
Val Thr Pro Arg Arg Trp Ile Arg Phe Cys Asn Pro Pro Leu Ser
Ala
565
570
575
atc ata act aag tgg act ggt aca gag gat tgg gtc ctg aaa act
gaa 1824
Ile Ile Thr Lys Trp Thr Gly Thr Glu Asp Trp Val Leu Lys Thr
Glu
580
585
590
aag ttg gca gaa ttg cag aag ttt gct gat aat gaa gat ctt caa
aat 1872
Lys Leu Ala Glu Leu Gln Lys Phe Ala Asp Asn Glu Asp Leu Gln
Asn
595
600
605
610
gag tgg agg gaa gca aaa agg agc aac aag att aaa gtt gtc tcc
ttt 1920
Glu Trp Arg Glu Ala Lys Arg Ser Asn Lys Ile Lys Val Val Ser
Phe
615
620
625
ctc aaa gaa aag aca ggg tat tct gtt gtc cca gat gca atg ttt
gat 1968
Leu Lys Glu Lys Thr Gly Tyr Ser Val Val Pro Asp Ala Met Phe
Asp
630
635
640
att cag gta aaa cgc att cat gag tac aag cga caa ctg tta aat atc
2016
Ile Gln Val Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg Gln Leu Leu Asn
Ile
645
650
655
ttc ggc atc gtt tat cgg tat aag aag atg aaa gaa atg aca gct
gca 2064
Phe Gly Ile Val Tyr Arg Tyr Lys Lys Met Lys Glu Met Thr Ala
Ala
660
665
670
gaa aga aag act aac ttc gtt cct cga gta tgc ata ttt ggg gga
aaa 2112
Glu Arg Lys Thr Asn Phe Val Pro Arg Val Cys Ile Phe Gly Gly
Lys
675
680
685
690
gct ttt gcc aca tat gtg caa gcc aag agg att gta aaa ttt atc
aca 2160
Ala Phe Ala Thr Tyr Val Gln Ala Lys Arg Ile Val Lys Phe Ile
Thr
695
700
705
gat gtt ggt gct act ata aat cat gat cca gaa atc ggt gat ctg
ttg 2208
Asp Val Gly Ala Thr Ile Asn His Asp Pro Glu Ile Gly Asp Leu
Leu
710
715
720
aag gta gtc ttt gtg cca gat tac aat gtc agt gtt gct gaa ttg
cta 2256
Lys Val Val Phe Val Pro Asp Tyr Asn Val Ser Val Ala Glu Leu
Leu
725
730
735
att cct gct agc gat cta tca gaa cat atc agt acg gct gga atg
gag 2304
Ile Pro Ala Ser Asp Leu Ser Glu His Ile Ser Thr Ala Gly Met
Glu
740
745
750
gcc agt gga acc agt aat atg aag ttt gca atg aat ggt tgt atc
caa 2352
Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ala Met Asn Gly Cys Ile
Gln
755
760
765
770
att ggt aca ttg gat ggc gct aat gtt gaa ata agg gaa gag gtt
gga 2400
Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile Arg Glu Glu Val Gly
775
780
785
gaa gaa aac ttc ttt ctc ttt ggt gct caa gct cat gaa att gca
ggg 2448
Glu Glu Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Gln Ala His Glu Ile Ala
Gly
790
795
800
ctt aga aaa gaa aga gct gac gga aag ttt gta cct gat gaa cgt
ttt 2496
Leu Arg Lys Glu Arg Ala Asp Gly Lys Phe Val Pro Asp Glu Arg
Phe
805
810
815
gaa gag gtg aag gaa ttt gtt aga agc ggt gct ttt ggc tct tat
aac 2544
Glu Glu Val Lys Glu Phe Val Arg Ser Gly Ala Phe Gly Ser Tyr
Asn
820
825
830
tat gat gac cta att gga tcg ttg gaa gga aat gaa ggt ttt ggc
cgt 2592
Tyr Asp Asp Leu Ile Gly Ser Leu Glu Gly Asn Glu Gly Phe Gly
Arg
835
840
845
850
gct gac tat ttc ctt gtg ggc aag gac ttc ccc agt tac ata gaa
tgc 2640
Ala Asp Tyr Phe Leu Val Gly Lys Asp Phe Pro Ser Tyr Ile Glu
Cys
855
860
865
caa gag aaa gtt gat gag gca tat cgc gac cag aaa agg tgg aca
acg 2688
Gln Glu Lys Val Asp Glu Ala Tyr Arg Asp Gln Lys Arg Trp Thr
Thr
870
875
880
atg tca atc ttg aat aca gcg gga tcg tac aag ttc agc agt gac
aga 2736
Met Ser Ile Leu Asn Thr Ala Gly Ser Tyr Lys Phe Ser Ser Asp
Arg
885
890
895
aca atc cat gaa tat gcc aaa gac att tgg aac att gaa gct gtg
gaa 2784
Thr Ile His Glu Tyr Ala Lys Asp Ile Trp Asn Ile Glu Ala Val
Glu
900
905
910
ata gca
taa
2793
Ile
Ala
915
<210> 4
<211> 930
<212> PRT
<213> 马铃薯
<400> 4
Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Ile Leu Thr Leu
-10
-5
-1 1
Ser Glu Lys Ile His His Pro Ile Thr Glu Gln Gly Gly Glu Ser Asp
5
10
15
Leu Ser Ser Phe Ala Pro Asp Ala Ala Ser Ile Thr Ser Ser Ile Lys
20
25
30
Tyr His Ala Glu Phe Thr Pro Val Phe Ser Pro Glu Arg Phe Glu Leu
35
40
45
50
Pro Lys Ala Phe Phe Ala Thr Ala Gln Ser Val Arg Asp Ser Leu Leu
55
60
65
Ile Asn Trp Asn Ala Thr Tyr Asp Ile Tyr Glu Lys Leu Asn Met Lys
70
75
80
Gln Ala Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu Gln Gly Arg Ala Leu Leu
85
90
95
Asn Ala Ile Gly Asn Leu Glu Leu Thr Gly Ala Phe Ala Glu Ala Leu
100
105
110
Lys Asn Leu Gly His Asn Leu Glu Asn Val Ala Ser Gln Glu Pro Asp
115
120
125
130
Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser Cys Phe Leu
135
140
145
Asp Ser Leu Ala Thr Leu Asn Tyr Pro Ala Trp Gly Tyr Gly Leu Arg
150
155
160
Tyr Lys Tyr Gly Leu Phe Lys Gln Arg Ile Thr Lys Asp Gly Gln Glu
165
170
175
Glu Val Ala Glu Asp Trp Leu Glu Ile Gly Ser Pro Trp Glu Val Val
180
185
190
Arg Asn Asp Val Ser Tyr Pro Ile Lys Phe Tyr Gly Lys Val Ser Thr
195
200
205
210
Gly Ser Asp Gly Lys Arg Tyr Trp Ile Gly Gly Glu Asp Ile Lys Ala
215
220
225
Val Ala Tyr Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr Lys Thr Arg Thr Thr Ile
230
235
240
Ser Leu Arg Leu Trp Ser Thr Gln Val Pro Ser Ala Asp Phe Asp Leu
245
250
255
Ser Ala Phe Asn Ala Gly Glu His Thr Lys Ala Cys Glu Ala Gln Ala
260
265
270
Asn Ala Glu Lys Ile Cys Tyr Ile Leu Tyr Pro Gly Asp Glu Ser Glu
275
280
285 290
Glu Gly Lys Ile Leu Arg Leu Lys Gln Gln Tyr Thr Leu Cys Ser Ala
295
300
305
Ser Leu Gln Asp Ile Ile Ser Arg Phe Glu Arg Arg Ser Gly Asp Arg
310
315
320
Ile Lys Trp Glu Glu Phe Pro Glu Lys Val Ala Val Gln Met Asn Asp
325
330
335
Thr His Pro Thr Leu Cys Ile Pro Glu Leu Met Arg Ile Leu Ile Asp
340
345
350
Leu Lys Gly Leu Asn Trp Asn Glu Ala Trp Asn Ile Thr Gln Arg Thr
355
360
365
370
Val Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu Ala Leu Glu Lys Trp
375
380
385
Ser Tyr Glu Leu Met Gln Lys Leu Leu Pro Arg His Val Glu Ile Ile
390
395
400
Glu Ala Ile Asp Glu Glu Leu Val His Glu Ile Val Leu Lys Tyr Gly
405
410
415
Ser Met Asp Leu Asn Lys Leu Glu Glu Lys Leu Thr Thr Met Arg Ile
420
425
430
Leu Glu Asn Phe Asp Leu Pro Ser Ser Val Ala Glu Leu Phe Ile Lys
435
440
445
450
Pro Glu Ile Ser Val Asp Asp Asp Thr Glu Thr Val Glu Val His Asp
455
460
465
Lys Val Glu Ala Ser Asp Lys Val Val Thr Asn Asp Glu Asp Asp Thr
470
475
480
Gly Lys Lys Thr Ser Val Lys Ile Glu Ala Ala Ala Glu Lys Asp Ile
485
490
495
Asp Lys Lys Thr Pro Val Ser Pro Glu Pro Ala Val Ile Pro Pro Lys
500
505
510
Lys Val Arg Met Ala Asn Leu Cys Val Val Gly Gly His Ala Val Asn
515
520
525
530
Gly Val Ala Glu Ile His Ser Glu Ile Val Lys Glu Glu Val Phe Asn
535
540
545
Asp Phe Tyr Glu Leu Trp Pro Glu Lys Phe Gln Asn Lys Thr Asn Gly
550
555
560
Val Thr Pro Arg Arg Trp Ile Arg Phe Cys Asn Pro Pro Leu Ser Ala
565
570
575
Ile Ile Thr Lys Trp Thr Gly Thr Glu Asp Trp Val Leu Lys Thr Glu
580
585
590
Lys Leu Ala Glu Leu Gln Lys Phe Ala Asp Asn Glu Asp Leu Gln Asn
595
600
605
610
Glu Trp Arg Glu Ala Lys Arg Ser Asn Lys Ile Lys Val Val Ser Phe
615
620
625
Leu Lys Glu Lys Thr Gly Tyr Ser Val Val Pro Asp Ala Met Phe Asp
630
635
640
Ile Gln Val Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg Gln Leu Leu Asn Ile
645
650
655
Phe Gly Ile Val Tyr Arg Tyr Lys Lys Met Lys Glu Met Thr Ala Ala
660
665
670
Glu Arg Lys Thr Asn Phe Val Pro Arg Val Cys Ile Phe Gly Gly Lys
675
680
685
690
Ala Phe Ala Thr Tyr Val Gln Ala Lys Arg Ile Val Lys Phe Ile Thr
695
700
705
Asp Val Gly Ala Thr Ile Asn His Asp Pro Glu Ile Gly Asp Leu Leu
710
715
720
Lys Val Val Phe Val Pro Asp Tyr Asn Val Ser Val Ala Glu Leu Leu
725
730
735
Ile Pro Ala Ser Asp Leu Ser Glu His Ile Ser Thr Ala Gly Met Glu
740
745
750
Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ala Met Asn Gly Cys Ile Gln
755
760
765
770
Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile Arg Glu Glu Val Gly
775
780
785
Glu Glu Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Gln Ala His Glu Ile Ala Gly
790
795
800
Leu Arg Lys Glu Arg Ala Asp Gly Lys Phe Val Pro Asp Glu Arg Phe
805
810
815
Glu Glu Val Lys Glu Phe Val Arg Ser Gly Ala Phe Gly Ser Tyr Asn
820
825
830
Tyr Asp Asp Leu Ile Gly Ser Leu Glu Gly Asn Glu Gly Phe Gly Arg
835
840
845
850
Ala Asp Tyr Phe Leu Val Gly Lys Asp Phe Pro Ser Tyr Ile Glu Cys
855
860
865
Gln Glu Lys Val Asp Glu Ala Tyr Arg Asp Gln Lys Arg Trp Thr Thr
870
875
880
Met Ser Ile Leu Asn Thr Ala Gly Ser Tyr Lys Phe Ser Ser Asp Arg
885
890
895
Thr Ile His Glu Tyr Ala Lys Asp Ile Trp Asn Ile Glu Ala Val Glu
900
905
910
Ile Ala
915
<210> 5
<211> 2151
<212> DNA
<213> Thermococcus zilligii
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2151)
<400> 5
atg gcg gac gtt tcc cac aca gtt gag aat tta ata agg gcg aag
ctc 48
Met Ala Asp Val Ser His Thr Val Glu Asn Leu Ile Arg Ala Lys
Leu
1
5
10
15
ccc tac ccg ctg gag aat ctc gca gaa ctg gcc tat aac tac tgg
tgg 96
Pro Tyr Pro Leu Glu Asn Leu Ala Glu Leu Ala Tyr Asn Tyr Trp
Trp
20
25
30
agc tgg aac aga cgt gcc acc cgg ctc tgg gag tac ata gac tcc
gaa 144
Ser Trp Asn Arg Arg Ala Thr Arg Leu Trp Glu Tyr Ile Asp Ser
Glu
35
40
45
cac tgg cgt gag tac aag aac ccg gtc aag ctc ctt ctt gac acg
ccc 192
His Trp Arg Glu Tyr Lys Asn Pro Val Lys Leu Leu Leu Asp Thr
Pro
50
55
60
gaa gag agg ttc tgg gag ctc ctc aag gat gac gac ttc atg aac
ctc 240
Glu Glu Arg Phe Trp Glu Leu Leu Lys Asp Asp Asp Phe Met Asn
Leu
65
70
75
80
tac gag ctc gtt atg gac cag ttt acc gca tac atg aac ccg aaa
tca 288
Tyr Glu Leu Val Met Asp Gln Phe Thr Ala Tyr Met Asn Pro Lys
Ser
85
90
95
acg tgg ttc tcg acc aac tac ccc aaa tgg gac aaa ccg ata gtc
tat 336
Thr Trp Phe Ser Thr Asn Tyr Pro Lys Trp Asp Lys Pro Ile Val
Tyr
100
105
110
ctc tgc atg gag tac ggc ata agc aag agc ctc ccg att tac tcc
ggt 384
Leu Cys Met Glu Tyr Gly Ile Ser Lys Ser Leu Pro Ile Tyr Ser
Gly
115
120
125
ggc ctc gga atc ctc gcc ggg gat cac ctc aaa acc gcg agt gac
ctc 432
Gly Leu Gly Ile Leu Ala Gly Asp His Leu Lys Thr Ala Ser Asp
Leu
130
135
140
ggc ctt ccc ttc ata gct ata ggc ctc ctc tac aag cac ggc tac
ttc 480
Gly Leu Pro Phe Ile Ala Ile Gly Leu Leu Tyr Lys His Gly Tyr
Phe
145
150
155
160
agg cag gag ata gac agg gac gga agg cag agg gag ata ttc ccg
gaa 528
Arg Gln Glu Ile Asp Arg Asp Gly Arg Gln Arg Glu Ile Phe Pro
Glu
165
170 175
tac agg ccc gag gaa atg ccg ata aag cct gtt cta agc aaa gac
gga 576
Tyr Arg Pro Glu Glu Met Pro Ile Lys Pro Val Leu Ser Lys Asp
Gly
180
185
190
aaa ccc cta ctc gtt gag gtc ccc att gaa aac agg atc gtc tac gcg
624
Lys Pro Leu Leu Val Glu Val Pro Ile Glu Asn Arg Ile Val Tyr
Ala
195
200
205
agg gcc ttt gag gtc agc gtc ggc atg gcc aag ctc tac ctc ctt
gac 672
Arg Ala Phe Glu Val Ser Val Gly Met Ala Lys Leu Tyr Leu Leu
Asp
210
215
220
aca gat gtg ccc gag aac agc ccg gag gat agg gcg atc tgc gac
tac 720
Thr Asp Val Pro Glu Asn Ser Pro Glu Asp Arg Ala Ile Cys Asp
Tyr
225
230
235
240
ctc tac aac gcc gag atg gac aag aga ata aaa cag gag atc ctc
ctc 768
Leu Tyr Asn Ala Glu Met Asp Lys Arg Ile Lys Gln Glu Ile Leu
Leu
245
250
255
gga ata ggc gga atg aga ctg ctc cag gcc ctc ggc atc gag ccc
ggt 816
Gly Ile Gly Gly Met Arg Leu Leu Gln Ala Leu Gly Ile Glu Pro
Gly
260
265
270
gtg gtt cac ctc aac gag ggg cat ccc gcc ttt gcc aac ctc cag
aga 864
Val Val His Leu Asn Glu Gly His Pro Ala Phe Ala Asn Leu Gln
Arg
275
280
285
ata gcc tgg tac atg gaa aaa ggc ctc aca ttc acg gaa gct ttg
agc 912
Ile Ala Trp Tyr Met Glu Lys Gly Leu Thr Phe Thr Glu Ala Leu
Ser
290
295
300
atc gtc agg gga acc acg gtt ttc acc acc cac acg ccg gtt cct
gca 960
Ile Val Arg Gly Thr Thr Val Phe Thr Thr His Thr Pro Val Pro
Ala
305
310
315
320
ggc cac gac agg ttc ccg atc gcg gaa gtt agg aag agg ctt tca
aaa 1008
Gly His Asp Arg Phe Pro Ile Ala Glu Val Arg Lys Arg Leu Ser
Lys
325
330
335
ttc ctc gag gga agg gag gag cta ctc gaa ctc ggc cgc gag ggc
gac 1056
Phe Leu Glu Gly Arg Glu Glu Leu Leu Glu Leu Gly Arg Glu Gly
Asp
340
345
350
cag atc aac atg acc ctg ctt gca ata aga act tcg agc tac gtc
aac 1104
Gln Ile Asn Met Thr Leu Leu Ala Ile Arg Thr Ser Ser Tyr Val
Asn
355
360
365
ggc gta agc cag ctc cac gcg gag gta agc aag cgc atg tgg aaa
gac 1152
Gly Val Ser Gln Leu His Ala Glu Val Ser Lys Arg Met Trp Lys
Asp
370
375
380
ctc tgg ccc gga gtt ccc ctc aac gag atc cct ata gag ggc atc
aca 1200
Leu Trp Pro Gly Val Pro Leu Asn Glu Ile Pro Ile Glu Gly Ile
Thr
385
390
395
400
aac ggc gtc cac aca atg acg tgg gtc cac gac gag atg agg aag
ctc 1248
Asn Gly Val His Thr Met Thr Trp Val His Asp Glu Met Arg Lys
Leu
405
410
415
ttc gac cgc tac atc ggc aag gtc tgg agg gag cac acc aac ata
gag 1296
Phe Asp Arg Tyr Ile Gly Lys Val Trp Arg Glu His Thr Asn Ile
Glu
420
425
430
ggc atc tgg tac gcc gtg gaa agg atc ccg gat gaa gag ctc tgg
gga 1344
Gly Ile Trp Tyr Ala Val Glu Arg Ile Pro Asp Glu Glu Leu Trp
Gly
435
440
445
gcc cac ctc gag gcc aag aga cag ctc ata gag ttc ctc agg gag
aag 1392
Ala His Leu Glu Ala Lys Arg Gln Leu Ile Glu Phe Leu Arg Glu
Lys
450
455
460
aca atg gag agg aac agg agg ctc gga acc gat gac ccg ata ccg
gag 1440
Thr Met Glu Arg Asn Arg Arg Leu Gly Thr Asp Asp Pro Ile Pro
Glu
465
470
475
480
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acc 1488
Ile Asp Glu Asn Ala Leu Ile Ile Gly Phe Ala Arg Arg Phe Ala
Thr
485
490
495
tat aag agg gca act ctc atc ctg agc gac ctt gag agg ctg aag
aaa 1536
Tyr Lys Arg Ala Thr Leu Ile Leu Ser Asp Leu Glu Arg Leu Lys
Lys
500
505
510
atc ctc aac aac cca gaa agg ccg gtt tac ata gtc ttc ggc ggg
aag 1584
Ile Leu Asn Asn Pro Glu Arg Pro Val Tyr Ile Val Phe Gly Gly
Lys
515
520
525
gcc cat ccg cgc gac gag gct ggg aag gag ttc ctg agg agg gtt
tac 1632
Ala His Pro Arg Asp Glu Ala Gly Lys Glu Phe Leu Arg Arg Val
Tyr
530
535
540
gag gtc agc cag atg ccg gag ttc agg ggc aag ata ttc gtc ctc gag
1680
Glu Val Ser Gln Met Pro Glu Phe Arg Gly Lys Ile Phe Val Leu
Glu
545
550
555
560
aac tac gac atg ggg agc gcg agg ctc atg gtc gct gga gtc gac
gtc 1728
Asn Tyr Asp Met Gly Ser Ala Arg Leu Met Val Ala Gly Val Asp
Val
565
570
575
tgg ctc aac aac ccg cgc aga ccg ctt gaa gca agc ggg acg agc
ggc 1776
Trp Leu Asn Asn Pro Arg Arg Pro Leu Glu Ala Ser Gly Thr Ser
Gly
580
585
590
atg aag gcc ggc ctc aac ggt gtc ctc aac gcg agc atc ttc gac
gga 1824
Met Lys Ala Gly Leu Asn Gly Val Leu Asn Ala Ser Ile Phe Asp
Gly
595
600
605
tgg tgg gtt gaa ggc tac aat ggg aaa aac ggc tgg gtc att ggg
gag 1872
Trp Trp Val Glu Gly Tyr Asn Gly Lys Asn Gly Trp Val Ile Gly
Glu
610
615
620
gag acc acc gag ccg gag agc gaa gag gac gac gcg aag gac gct
gag 1920
Glu Thr Thr Glu Pro Glu Ser Glu Glu Asp Asp Ala Lys Asp Ala
Glu
625
630
635
640
agc ctc tac acc ctg ctc gag aag gag ata atc ccc acc tac tac
ggg 1968
Ser Leu Tyr Thr Leu Leu Glu Lys Glu Ile Ile Pro Thr Tyr Tyr
Gly
645
650
655
aac agg agc cgc tgg ata tac atg atg aag gag agc ata aag agc
ata 2016
Asn Arg Ser Arg Trp Ile Tyr Met Met Lys Glu Ser Ile Lys Ser
Ile
660
665
670
gcc ccg cgc ttc agc acg cac agg atg gtc aag gag tac atg gac
agg 2064
Ala Pro Arg Phe Ser Thr His Arg Met Val Lys Glu Tyr Met Asp
Arg
675
680
685
ttc tac tcc aag gcc atg agc aac tac atc tgg ctc acg agg gag
aac 2112
Phe Tyr Ser Lys Ala Met Ser Asn Tyr Ile Trp Leu Thr Arg Glu
Asn
690
695
700
tac aag ggg gcc agg gaa ata gcg gcc tgg aag gag
agg
2151
Tyr Lys Gly Ala Arg Glu Ile Ala Ala Trp Lys Glu
Arg
705
710
715
<210> 6
<211> 717
<212> PRT
<213> Thermococcus zilligii
<400> 6
Met Ala Asp Val Ser His Thr Val Glu Asn Leu Ile Arg Ala Lys Leu
1
5
10
15
Pro Tyr Pro Leu Glu Asn Leu Ala Glu Leu Ala Tyr Asn Tyr Trp Trp
20
25
30
Ser Trp Asn Arg Arg Ala Thr Arg Leu Trp Glu Tyr Ile Asp Ser Glu
35
40
45
His Trp Arg Glu Tyr Lys Asn Pro Val Lys Leu Leu Leu Asp Thr Pro
50
55
60
Glu Glu Arg Phe Trp Glu Leu Leu Lys Asp Asp Asp Phe Met Asn Leu
65
70
75
80
Tyr Glu Leu Val Met Asp Gln Phe Thr Ala Tyr Met Asn Pro Lys Ser
85
90
95
Thr Trp Phe Ser Thr Asn Tyr Pro Lys Trp Asp Lys Pro Ile Val Tyr
100
105
110
Leu Cys Met Glu Tyr Gly Ile Ser Lys Ser Leu Pro Ile Tyr Ser Gly
115
120
125
Gly Leu Gly Ile Leu Ala Gly Asp His Leu Lys Thr Ala Ser Asp Leu
130
135
140
Gly Leu Pro Phe Ile Ala Ile Gly Leu Leu Tyr Lys His Gly Tyr Phe
145
150
155
160
Arg Gln Glu Ile Asp Arg Asp Gly Arg Gln Arg Glu Ile Phe Pro Glu
165
170
175
Tyr Arg Pro Glu Glu Met Pro Ile Lys Pro Val Leu Ser Lys Asp Gly
180
185
190
Lys Pro Leu Leu Val Glu Val Pro Ile Glu Asn Arg Ile Val Tyr Ala
195
200
205
Arg Ala Phe Glu Val Ser Val Gly Met Ala Lys Leu Tyr Leu Leu Asp
210
215
220
Thr Asp Val Pro Glu Asn Ser Pro Glu Asp Arg Ala Ile Cys Asp Tyr
225
230
235
240
Leu Tyr Asn Ala Glu Met Asp Lys Arg Ile Lys Gln Glu Ile Leu Leu
245
250
255
Gly Ile Gly Gly Met Arg Leu Leu Gln Ala Leu Gly Ile Glu Pro Gly
260
265
270
Val Val His Leu Asn Glu Gly His Pro Ala Phe Ala Asn Leu Gln Arg
275
280
285
Ile Ala Trp Tyr Met Glu Lys Gly Leu Thr Phe Thr Glu Ala Leu Ser
290
295
300
Ile Val Arg Gly Thr Thr Val Phe Thr Thr His Thr Pro Val Pro Ala
305
310
315
320
Gly His Asp Arg Phe Pro Ile Ala Glu Val Arg Lys Arg Leu Ser Lys
325
330
335
Phe Leu Glu Gly Arg Glu Glu Leu Leu Glu Leu Gly Arg Glu Gly Asp
340
345
350
Gln Ile Asn Met Thr Leu Leu Ala Ile Arg Thr Ser Ser Tyr Val Asn
355
360
365
Gly Val Ser Gln Leu His Ala Glu Val Ser Lys Arg Met Trp Lys Asp
370
375
380
Leu Trp Pro Gly Val Pro Leu Asn Glu Ile Pro Ile Glu Gly Ile Thr
385
390
395
400
Asn Gly Val His Thr Met Thr Trp Val His Asp Glu Met Arg Lys Leu
405
410
415
Phe Asp Arg Tyr Ile Gly Lys Val Trp Arg Glu His Thr Asn Ile Glu
420
425
430
Gly Ile Trp Tyr Ala Val Glu Arg Ile Pro Asp Glu Glu Leu Trp Gly
435
440
445
Ala His Leu Glu Ala Lys Arg Gln Leu Ile Glu Phe Leu Arg Glu Lys
450
455
460
Thr Met Glu Arg Asn Arg Arg Leu Gly Thr Asp Asp Pro Ile Pro Glu
465
470
475
480
Ile Asp Glu Asn Ala Leu Ile Ile Gly Phe Ala Arg Arg Phe Ala Thr
485
490
495
Tyr Lys Arg Ala Thr Leu Ile Leu Ser Asp Leu Glu Arg Leu Lys Lys
500
505
510
Ile Leu Asn Asn Pro Glu Arg Pro Val Tyr Ile Val Phe Gly Gly Lys
515
520
525
Ala His Pro Arg Asp Glu Ala Gly Lys Glu Phe Leu Arg Arg Val Tyr
530
535
540
Glu Val Ser Gln Met Pro Glu Phe Arg Gly Lys Ile Phe Val Leu Glu
545
550
555
560
Asn Tyr Asp Met Gly Ser Ala Arg Leu Met Val Ala Gly Val Asp Val
565
570
575
Trp Leu Asn Asn Pro Arg Arg Pro Leu Glu Ala Ser Gly Thr Ser Gly
580
585
590
Met Lys Ala Gly Leu Asn Gly Val Leu Asn Ala Ser Ile Phe Asp Gly
595
600
605
Trp Trp Val Glu Gly Tyr Asn Gly Lys Asn Gly Trp Val Ile Gly Glu
610
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620
Glu Thr Thr Glu Pro Glu Ser Glu Glu Asp Asp Ala Lys Asp Ala Glu
625
630
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Ser Leu Tyr Thr Leu Leu Glu Lys Glu Ile Ile Pro Thr Tyr Tyr Gly
645
650
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Asn Arg Ser Arg Trp Ile Tyr Met Met Lys Glu Ser Ile Lys Ser Ile
660
665
670
Ala Pro Arg Phe Ser Thr His Arg Met Val Lys Glu Tyr Met Asp Arg
675
680
685
Phe Tyr Ser Lys Ala Met Ser Asn Tyr Ile Trp Leu Thr Arg Glu Asn
690
695
700
Tyr Lys Gly Ala Arg Glu Ile Ala Ala Trp Lys Glu Arg
705
710
715
Claims (18)
1.含葡糖胺的支链葡聚糖,其中所述葡聚糖具有多个非还原端,并且至少一个葡糖胺残基与所述支链α-1,4-葡聚糖的2个或更多个非还原端的每一个通过α-1,4-键结合,但在除了所述支链α-1,4-葡聚糖的非还原端以外的位置没有葡糖胺残基存在,并且所述支链α-1,4-葡聚糖的聚合度为15或更大且4 x 105或更小。
2.根据权利要求1的含葡糖胺的支链葡聚糖,其中所述支链α-1,4-葡聚糖选自支链麦芽低聚糖、淀粉、支链淀粉、糖原、糊精、酶法合成的支链葡聚糖和高支化环葡聚糖。
3.根据权利要求1的含葡糖胺的支链葡聚糖的羟基改性产物,其中羟基上的改性是在所述葡聚糖的一些或所有的醇羟基上的改性,并且所述羟基上的改性独立地选自羟烷基化、烷基化、乙酰化、羧甲基化、硫酸化和磷酸化。
4.根据权利要求1的含葡糖胺的支链葡聚糖或其羟基改性产物的还原端改性产物。
5.根据权利要求1的含葡糖胺的支链葡聚糖、其羟基改性产物或其还原端改性产物的氨基改性产物,其中氨基上的改性是在所述葡糖胺残基的一些或所有的氨基上的改性,所述氨基上的改性通过所述氨基和氨基改性试剂的反应实现,并且所述氨基改性试剂具有至少一个羧基和至少一个其它的官能团。
6.根据权利要求1的含葡糖胺的支链葡聚糖、其羟基改性产物、其还原端改性产物或其氨基改性产物的非还原端改性产物,其中靶向分子和未与所述支链葡聚糖的葡糖胺残基结合的至少一个非还原端结合,其中所述靶向分子选自甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、N-乙酰基葡糖胺、木糖、岩藻糖、半乳糖胺、抗体、抗体片段、受体、受体片段和受体配体。
7.含葡糖胺的支链葡聚糖的制备方法,其特征在于使α-葡聚糖磷酸化酶作用于包含支链α-1,4-葡聚糖和葡糖胺-1-磷酸的水溶液,其中所述支链α-1,4-葡聚糖的聚合度为15或更大且4 x 105或更小。
8.根据权利要求7的方法,其中所述α-葡聚糖磷酸化酶与源自超耐热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列具有95%或更高的序列一致性,并且具有将葡糖胺转移到支链葡聚糖的非还原端而形成α-1,4-键的活性。
9.药物,包含根据权利要求1的含葡糖胺的支链葡聚糖、其羟基改性产物、其还原端改性产物、其氨基改性产物或其非还原端改性产物和药效成分。
10.根据权利要求9的药物,其中所述药效成分选自低分子量有机化合物、蛋白质、肽、抗体、抗体片段、受体、受体片段、DNA、RNA、siRNA、miRNA和RNA适体。
11.临床诊断用组合物,包含根据权利要求1的含葡糖胺的支链葡聚糖、其羟基改性产物、其还原端改性产物、其氨基改性产物或其非还原端改性产物。
12.DDS用纳米微粒载体,包含根据权利要求1的含葡糖胺的支链葡聚糖、其羟基改性产物、其还原端改性产物、其氨基改性产物或其非还原端改性产物。
13.根据权利要求12的载体,其中所述DDS用纳米微粒载体选自脂质体、病毒颗粒、大分子胶束和带有疏水基团的大分子组成的纳米凝胶。
14.由核酸分子和根据权利要求1的含葡糖胺的支链葡聚糖形成的复合物。
15.根据权利要求14的复合物,其中所述核酸分子选自DNA、RNA、siRNA、miRNA和RNA适体。
16.由根据权利要求14的复合物载体和阳离子聚合物或阳离子脂质形成的复合物。
17.根据权利要求16的复合物,其中所述阳离子聚合物包括至少一种选自聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚精氨酸、聚酰胺-胺树枝状聚合物、聚氨基苯乙烯、壳聚糖、阳离子葡聚糖和DEAE-右旋糖苷的阳离子聚合物。
18.将核酸分子传递到分离的细胞中的方法,其包括使根据权利要求14的复合物与所述细胞接触。
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