CN103290137A - 一种肿瘤易感基因的筛查方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种预测性好、准确度高的肿瘤易感基因的筛查方法，从个体中抽取3-5ml的血液，从血液中提取3-5ugDNA，并将其打断，扩增，从而构建病人的全基因组文库，然后利用本发明的TumorMutScanTM肿瘤高频突变基因扫描试剂盒对高频基因进行捕获，然后利用新一代测序仪进行高通量测序，分析找出这些基因相关的突变信息，从而得到个体的肿瘤高频突变基因的突变情况，已达到准确的基因诊断的目的。

Description

一种肿瘤易感基因的筛查方法

技术领域

本发明涉及一种基因筛查方法，尤其是一种肿瘤易感基因的筛查方法。

背景技术

近些年来，随着测序技术的飞跃式的发展，肿瘤的分子诊断和预测，已成为近年肿瘤研究的热点领域，甚至被列为21世纪“最有望改善全球健康状况的关键生物技术”的首位。随着分子生物学的发展，特别是人类基因组计划的顺利实施，人类基因组序列在不断的被解读和剖析，不断有新的相关基因功能被识别，肿瘤的发生发展及转归机制有了很深入的了解，使人类除了能更早期发现及诊断肿瘤外，还可以预测人群或个体发生肿瘤发风险，病因检测，肿瘤的早期发现等，对肿瘤进行诊断、分类、指导治疗、判断预后等。

目前，肿瘤分子诊断的方法有许多种，包括DNA测序、PCR技术、DNA芯片技术、毛细管电泳法等。然而，上述的方法在临床应用上均有其局限性。传统的PCR方法，需要设计特定引物，且对样本的质量要求比较高，无法处理石蜡包埋等样本，且通量低，无法适用于大范围的临床筛查上。DNA芯片技术是基于对肿瘤标志物进行筛查，较好的肿瘤血清标志物特异度、敏感度较强，可作为监测病程、评估疗效、预防复发的重要检测指标。然而，这些组织标志物在血清中不一定存在，更不用说起血清浓度伴随肿瘤的发展而变化。而毛细管电泳法等方法，只能检测特定的已知突变。传统的sanger测序，虽然可以得到个体的全部基因序列，但其检测成本非常高，即便是只检测一百多个基因，成本也要十几万以上。总的来说，临床上目前缺乏一种方法，能够同时快速而准确的对肿瘤相关突变基因进行一次性全面的筛查。

本发明的目的是提供一种快速准确且能够覆盖最新的高频突变肿瘤基因的所有外显子区域的基因诊断试剂盒及方法。本发明的基本方案是从个体中抽取3-5ml的血液，从血液中提取3-5ugDNA，并将其打断，扩增，从而构建病人的全基因组文库，然后利用本发明的TumorMutScan^TM肿瘤高频突变基因扫描试剂盒对高频基因进行捕获，然后利用新一代测序仪进行高通量测序，分析找出这些基因相关的突变信息，从而得到个体的肿瘤高频突变基因的突变情况，已达到准确的基因诊断的目的。

发明内容

本发明提供了一种预测性好、准确度高的肿瘤易感基因的筛查方法。

实现本发明目的的一种肿瘤易感基因的筛查方法，包括制作肿瘤高频突变基因扫描试剂盒的方法和遗传代谢疾病基因的筛查方法：

所述制作肿瘤高频突变基因扫描试剂盒的方法包括如下步骤：

(1)根据人类基因组HG19，调取如下基因的外显子序列，即肿瘤高频突变扫描基因列表：

ABL1

ATRX

CDKN2A

DNMT3A

FLT3

HRAS

KDR

MLH1

NCOA2

PAX5

PTCH1

RUNX1

STK11

ARID2

BAP1

CEBPA

EGFR

FOXL2

IDH1

KIT

MLL2

NF1

PDE4DIP

PTEN

SETD2

TET2

ARID1A

BRAF

CIC

EP300

GATA1

IDH2

KRAS

MLL3

NF2

PDGFRA

PTPN11

SF3B1

TGFBR2

AKT1

BRCA1

CREBBP

ERBB2

GATA3

IKZF1

MAP2K1

MPL

NOTCH1

PHOX2B

PTPRC

SMAD2

TNFAIP3

AKAP9

BRCA2

CSF1R

FAM123B

GNA11

ITK

MAP2K2

MSH2

NOTCH2

PIK3CA

RB1

SMAD4

top1

ALK

CRL

CTNNA1

FBXW7

GNAQ

JAK2

MAP2K4

MSH6

NPM1

PIK3R1

RET

SMARCA4

TP53

APC

CDC73

CTNNB1

FUBP1

GNAS

JAK3

MED12

MYD88

NRAS

POLR3A

RNF213

SMARCB1

TSHR

ASXL1

CDH1

CYLD

FGFR2

GRIN2A

KDM6A

MEN1

MYH11

NSD1

PPP2R1A

RMF43

SMO

UTX

ATM

CDK12

DAXX

FGFR3

HMF1A

KDM5C

MET

MYST4

NTRK1

PKKAR1A

ROS1

SOCS1

VHL

此区域包含了所有高频肿瘤突变基因的基因区域，以及已知各个transcript的启动子区域；

(2)对每个区域中非重复区域设计60bp的探针序列，每个序列沿着基因位置挪动设计，探针之间的挪动大小3bp；

(3)采用原位合成技术，在芯片上大量合成设计的探针，并利用多聚酶链式反应或转录的方法扩增出大量的带有生物术标记的探针，并制作肿瘤高频突变基因扫描试剂盒；

所述肿瘤突变基因的筛查方法包括如下步骤：

从病人血液中提取3-5ug DNA，并将其打断，扩增，从而构建病人的全基因组文库，然后利用所述肿瘤高频突变基因扫描试剂盒将目的基因捕获出来，再采用测序仪(IlluminaHiSeq 2000)进行高通量测序，进而分析，找出这些疾病相关基因的所有突变信息，从而得到找到个体肿瘤高频突变基因的变异情况，以达到准确基因诊断的目的。

采用测序仪(IlluminaHiSeq 2000)进行高通量测序，分析的过程包括SNP分析过程、InDel分析流程和大片段扩增确实分析流程；

所述单核苷酸多态性分析(SNP分析)过程包括如下步骤：

(1)测序仪(IlluminaHiSeq 2000)获取原始短序列；

(2)去除测序数据中的接头和低质量数据；

(3)把短序列(用SOAPaligner软件)定位到人类基因组数据相应的位置上(所用到参数：soap2.20 -a -b -t -v 3 -l 42 -s 63 -m 100 -x 400，其中序列错配数为3)；

(4)统计测序结果信息，短序列数量、目标区域覆盖大小、平均测序深度等；

(5)过滤低质量值(质量值＞＝20)和低覆盖度(深度＞＝10)的单核苷酸；

(6)利用CCDS、人类基因组数据库(NCBI36.3)、dbSNP(v130)信息对单核苷酸进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、氨基酸改变、单核苷酸功能(错义突变/无义突变/可变剪切位点)、SIFT预测单核苷酸影响蛋白功能预测；

(7)根据疾病样品和正常样品信息，选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的单核苷酸作为候选的单核苷酸，在候选的单核苷酸中去除掉在dbSNP、HAPMAP、1000人类基因组、其他外显子测序项目中出现的单核苷酸。同时，过滤掉SIFT预测对蛋白功能无影响的单核苷酸作为最后疾病相关的候选单核苷酸；

所述***缺失标记分析(InDel分析)流程包括如下步骤

(1)把去除接头序列和低质量的测序数据用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)比对到人类基因组上(所以到参数：bwaaln -L -l 31 -i 10 -k 2 -t 7-e 40)；

(2)(用GATK软件)找出序列中所含有的***/缺失(InDel)的信息；

(3)利用CCDS、人类基因组数据库(NCBI36.3)、dbSNP(v130)信息对InDel进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、编码区域序列的改变、对氨基酸的影响、InDel功能(氨基酸***/氨基酸缺失/移码突变)；

(4)根据疾病样品和正常样品信息，选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的InDel作为候选的InDels，在候选的InDels中去除掉在dbSNP、其他外显子测序项目中出现的InDel，最后筛选出疾病相关的候选InDels；

所述大片段扩增确实分析流程包括如下步骤：

(1)测序仪(IlluminaHiSeq 2000)获取原始短序列；

(2)去除测序数据中的接头和低质量数据；

(3)把短序列(用SOAPaligner软件)定位到人类基因组数据相应的位置上(所用到参数：soap2.20 -a -b -t -v 3 -l 42 -s 63 -m 100 -x 400，其中序列错配数为3)；

(4)统计目标区域覆盖大小，然后根据每个目标区域位点的位置信息为横坐标，每个位置相应的覆盖度为纵坐标作图，得出扩增和缺失的分析图。

本发明的一种肿瘤易感基因的筛查方法的有益效果如下：

本发明的一种肿瘤易感基因的筛查方法，是以DNA文库的方式进行捕获测序，因此，样品DNA的部分降解对最后的结果几乎不会产生影响，而过量的探针，保证了对目标片段的完全捕获。所以，即使可能出现的某些丰度较低的变异DNA也能被捕获并检测出来，其灵敏度相对于传统的sanger测序要高出许多。本方法对样本的质量要求不高，即使是石蜡包埋的样本也能满足测序的需要。相比于临床上传统的病理学诊断而言，本方法有以下优势：

1、对个体伤害小；本方法只需抽取个体少量的血液(3-5ml)既可完成整个的诊断流程，而不需要取个体患处的组织或细胞。

2、预测性强；临床诊断通常只能在患者身体已经出现病理改变(出现肿块，蛋白改变)时做出诊断，因此，临床上肿瘤患者的发现，特别是恶性肿瘤，往往发现时病人已经处于中晚期。而基因诊断不仅可以对已患病的个体进行准确的诊断，还可以根据高频突变基因的情况对个体未来可能的患病情况进行预测。

3、准确度高；本方法的提供的肿瘤高频突变基因捕获试剂盒覆盖了目前最新的肿瘤高频突变基因的所有外显子区域，能检测每个位点0.5％以上的及基因突变。

具体实施方式

本发明的一种肿瘤易感基因的筛查方法，包括如下步骤：

1.样本文库制备：

1.1)超声片段化：起始量为3μg，用1×low TE Buffer稀释到30ng/μL。采用Covaris S2超声仪进行超声片段化，按标准设定Covaris***的值，6次循环×60s，水浴温度：5℃，占空比：20％，强度：5，模式：Frequencysweeping。

1.2)末端补平：分别取100μL片段化的DNA、8μL dNTPs、2μL EndPolishing酶I(10U/μL，Agilent)、16μL End Polishing酶II(5U/μL，Agilent)，加水到总体积200μL。25℃孵育30min。用PureLink PCR纯化试剂盒(Invitrogen)纯化DNA。

1.3)连接P1和P2接头：SOLiD接头1(PleA)50μmol/L和接头2(P2eA)50μmol/L各26μL(Applied Biosystems)，末端补平的DNA48μL，T4DNA连接酶10μL(50U)，加水到总体积200μL，室温孵育15min。产物纯化。采用预制的2％SizeSelect Gel(Applied Biosys-tems)，放到E-GeliBase上。连接纯化后的DNA片段分3份各20μL加入上样孔，分子量对照用0.2μg的50bp ladder，无样品孔及回收孔分别用20μL、25μL水填满，电泳约12min，吸出进入样品回收孔的150～200bp之间的DNA片段。

1.4)DNA片段回收：采用预制的2％SizeSelect Gel(AppliedBiosys-tems)，放到E-Gel iBase上。连接纯化后的DNA片段分3份各20μL加入上样孔，分子量对照用0.2μg的50bp ladder，无样品孔及回收孔分别用20μL、25μL水填满，电泳约12min，吸出进入样品回收孔的150～200bp之间的DNA片段。

1.5)缺口平移：回收的纯化片段需要采用切口平移法进行文库模板量的平衡的线性扩增。每100μL回收样品加400μL的master mix(Agilent)，按程序进行反应：72℃ 20min，95℃ 5min；然后95℃ 15s，54℃ 15s，70℃1min进行10到12个循环；70℃再延伸5min；4℃保存。纯化产物并定量，取1μL样本产物进行Flash Gel(2.2％，Lonza公司)电泳，约10min。

2.样本富集液相杂交，以上得到的DNA通过Illumina HiSeq2000测序，得到测序的数据。

3.SNP分析流程

lluminaHiSeq 2000获取原始短序列；

去除测序数据中的接头和低质量数据等：

(3)把短序列用SOAPaligner软件定位到人类基因组数据相应的位置上，所用到参数：soap2.20 -a -b -t -v 3 -l 42 -s 63 -m 100 -x 400，其中序列错配数为3；

(4)统计测序结果信息，短序列数量、目标区域覆盖大小、平均测序深度等；

(5)SOAPsnp用于在目标区域找出位点的基因型，所用到参数：soapsnp -i-d -o -r 0.00005 -e 0.0001 -M -t -u -L -s -2 -T，具体参数含义请参考：http://soap.genomics.org.cn/soapsnp.html；

(6)过滤低质量值(质量值＞＝20)和低覆盖度(深度＞＝10)的SNP；

利用CCDS、人类基因组数据库(NCBI36.3)、dbSNP(v130)信息对SNP进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、氨基酸改变、SNP功能(错义突变/无义突变/可变剪切位点)、SIFT预测SNP影响蛋白功能预测等；

(7)根据疾病样品和正常样品信息，选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的SNP作为候选的SNPs，在候选的SNPs中去除掉在dbSNP、HAPMAP、1000人类基因组、其他外显子测序项目中出现的SNP。同时，过滤掉SIFT预测对蛋白功能无影响的SNPs作为最后疾病相关的候选SNPs；

4.InDel分析流程

(1)把去除接头序列和低质量的测序数据用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)比对到人类基因组上，所以到参数：bwaaln -L -l 31 -i 10 -k 2 -t 7-e 40；

(2)用GATK软件找出序列中所含有的***/缺失(InDel)的信息；

利用CCDS、人类基因组数据库(NCBI36.3)、dbSNP(v130)信息对InDel进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、编码区域序列的改变、对氨基酸的影响、InDel功能(氨基酸***/氨基酸缺失/移码突变)；

(3)根据疾病样品和正常样品信息，选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在InDel作为候选的InDels，在候选的InDels中去除掉在dbSNP、其他外显子测序项目中出现的InDel，最后筛选出疾病相关的候选InDels.

5.大片段扩增确实分析流程

(1)lluminaHiSeq2000获取原始短序列；

(2)去除测序数据中的接头和低质量数据等；

(3)把短序列用SOAPaligner软件定位到人类基因组数据相应的位置上，所用到参数：soap2.20 -a -b -t -v 3 -l 42 -s 63 -m 100 -x 400，其中序列错配数为3；

(4)统计目标区域覆盖大小，然后根据每个目标区域位点的位置信息为横坐标，每个位置相应的覆盖度为纵坐标作图，得出扩增和缺失的分析图。

上面所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神前提下，本领域普通工程技术人员对本发明技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (2)

1.一种肿瘤易感基因的筛查方法，包括制作肿瘤高频突变基因扫描试剂盒的方法和遗传代谢疾病基因的筛查方法：

所述制作肿瘤高频突变基因扫描试剂盒的方法包括如下步骤：

(1)根据人类基因组HG19，调取如下基因的外显子序列，即肿瘤高频突变扫描基因列表：

ABL1 ATRX CDKN2A DNMT3A FLT3 HRAS KDR MLH1 NCOA2 PAX5 PTCH1 RUNX1 STK11 ARID2 BAP1 CEBPA EGFR FOXL2 IDH1 KIT MLL2 NF1 PDE4DIP PTEN SETD2 TET2 ARID1A BRAF CIC EP300 GATA1 IDH2 KRAS MLL3 NF2 PDGFRA PTPN11 SF3B1 TGFBR2 AKT1 BRCA1 CREBBP ERBB2 GATA3 IKZF1 MAP2K1 MPL NOTCH1 PHOX2B PTPRC SMAD2 TNFAIP3 AKAP9 BRCA2 CSF1R FAM123B GNA11 ITK MAP2K2 MSH2 NOTCH2 PIK3CA RB1 SMAD4 top1 ALK CBL CTNNA1 FBXW7 GNAQ JAK2 MAP2K4 MSH6 NPM1 PIK3R1 RET SMARCA4 TP53 APC CDC73 CTNNB1 FUBP1 GNAS JAK3 MED12 MYD88 NRAS POLR3A RNF213 SMARCB1 TSHR ASXL1 CDH1 CYLD FGFR2 GRIN2A KDM6A MEN1 MYH11 NSD1 PPP2R1A RNF43 SMO UTX ATM CDK12 DAXX FGFR3 HMF1A KDM5C MET MYST4 NTRK1 PRKAR1A ROS1 SOCS1 VHL

(2)对每个区域中非重复区域设计60bp的探针序列，每个序列沿着基因位置挪动设计，探针之问的挪动大小3bp；

(3)采用原位合成技术，在芯片上大量合成设计的探针，并利用多聚酶链式反应或转录的方法扩增出大量的带有生物术标记的探针，并制作肿瘤高频突变基因扫描试剂盒；

所述肿瘤突变基因的筛查方法包括如下步骤：

从病人血液中提取3-5ug DNA，并将其打断，扩增，从而构建病人的全基因组文库，然后利用所述肿瘤高频突变基因扫描试剂盒将目的基因捕获出来，再采用测序仪进行高通量测序，进而分析，找出这些疾病相关基因的所有突变信息，从而得到找到个体肿瘤高频突变基因的变异情况，以达到准确基因诊断的目的。

2.根据权利要求1所述的一种肿瘤易感基因的筛查方法，其特征在于：采用测序仪进行高通量测序，分析的过程包括SNP分析过程、InDel分析流程和大片段扩增确实分析流程；

所述单核苷酸多态性分析过程包括如下步骤：

(1)测序仪获取原始短序列；

(2)去除测序数据中的接头和低质量数据；

(3)把短序列定位到人类基因组数据相应的位置上；

(4)统计测序结果信息，短序列数量、目标区域覆盖大小、平均测序深度等；

(5)过滤低质量值和低覆盖度的单核苷酸；

(6)利用CCDS、人类基因组数据库、dbSNP信息对单核苷酸进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、氨基酸改变、单核苷酸功能、SIFT预测单核苷酸影响蛋白功能预测；

(7)根据疾病样品和正常样品信息，选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的单核苷酸作为候选的单核苷酸，在候选的单核苷酸中去除掉在dbSNP、HAPMAP、1000人类基因组、其他外显子测序项目中出现的单核苷酸。同时，过滤掉SIFT预测对蛋白功能无影响的单核苷酸作为最后疾病相关的候选单核苷酸；

所述***缺失标记分析流程包括如下步骤

(1)把去除接头序列和低质量的测序数据比对到人类基因组上；

(2)找出序列中所含有的***/缺失的信息；

(3)利用CCDS、人类基因组数据库、dbSNP信息对InDel进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、编码区域序列的改变、对氨基酸的影响、InDel功能；

(4)根据疾病样品和正常样品信息，选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的InDel作为候选的InDels，在候选的InDels中去除掉在dbSNP、其他外显子测序项目中出现的InDel，最后筛选出疾病相关的候选InDels；

所述大片段扩增确实分析流程包括如下步骤：

(1)测序仪获取原始短序列；

(2)去除测序数据中的接头和低质量数据；

(3)把短序列定位到人类基因组数据相应的位置上；

(4)统计目标区域覆盖大小，然后根据每个目标区域位点的位置信息为横坐标，每个位置相应的覆盖度为纵坐标作图，得出扩增和缺失的分析图。