CN103290080B - 制备分子量可控的药用右旋糖酐的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备分子量可控的药用右旋糖酐的方法,包括以下步骤:在含蔗糖的发酵培养基中加入肠膜状明串珠菌(Leuconstoc?mesenteroides)种子液进行发酵培养,从发酵液中分离高分子右旋糖酐,采用高酶活性的右旋糖酐酶催化降解高分子右旋糖酐为药用右旋糖酐,从反应液中分离右旋糖酐,然后经过逐级醇沉得到特定分子量的药用右旋糖酐。该方法解决现有制备工艺中引入氯离子、右旋糖酐分子量分布不集中等问题,且能够大幅度提高产品收率,获得高品质药用右旋糖酐。
Description
技术领域
本发明属于生物制药与酶工程领域,特别涉及一种发酵法结合酶法制备分子量可控的药用右旋糖酐的方法。
技术背景
右旋糖酐(dextran)又名葡聚糖,是蔗糖经肠膜状明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)产生的右旋糖酐蔗糖酶(dextransucraseEC2.4.1.5)催化合成的高分子葡萄糖聚合物,该聚合物含有95%的α-1,6糖苷键,同时含有少量其他糖苷键的分支结构。因其具有安全、无毒等多种优点,已被广泛应用于医药、食品和工业等多个领域。高分子右旋糖酐可以用作药物载体,以及常用的凝胶色谱填料。临床上常用的右旋糖酐有三种规格:右旋糖酐70、右旋糖酐40及右旋糖酐20,它们主要用作血浆代用品,用于出血性休克、创伤性休克及烧伤性休克等。重均分子量6-8kDa的右旋糖酐常被制成右旋糖酐铁,用于治疗严重的贫血症。重均分子量5kDa的右旋糖酐常被硫酸化,用于治疗血栓。低分子异麦芽糖近来被发现,可用作益生元。作为一种来源丰富的多糖,右旋糖酐是食品工业中的优良配料,主要用作保湿剂、稳定剂、增量及和增稠剂。在工业上,右旋糖酐被用作为油井钻泥的添加剂。
目前国内主要采用发酵法制备高分子右旋糖酐,再利用盐酸水解得到不同分子量的右旋糖酐。在药用右旋糖酐的生产过程中,由于酸水解工艺引入大量氯化物,严重影响右旋糖酐的品质,在临床使用中出现过敏反应,可引起皮肤过敏、呼吸和循环***衰竭,甚至导致死亡。在高温、强酸的水解条件,水解过程无序、难以操作,得到的右旋糖酐分子量不集中,影响产品质量和产率。另外,高温、强酸的水解条件,也不利于环保。采用发酵法结合酶法制备药用右旋糖酐,不仅能避免氯化物对产品质量的影响,同时由于右旋糖酐酶对底物的特异性水解,能得到分子量集中的高品质右旋糖酐,提高产率。此外,酶催化水解反应条件温和、能耗低,实现了中、小分子量多糖生产工艺的绿色、环保、低碳的目标。目前国内外已有学者直接采用分别产右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶的菌株发酵制备药用右旋糖酐,但是由于直接发酵,菌株产生的代谢物种类繁杂,不利于产品的分离纯化,同时由于产率低,不利于产业化生产。另外也有学者采用右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶双酶联合制备药用右旋糖酐,但是由于右旋糖酐蔗糖酶成本高,从而不利于产业化生产。
发明内容
本发明为了解决现有技术存在的不足之处,提供一种采用发酵法结合酶法制备分子量可控的药用右旋糖酐的方法,该方法不仅绿色、环保、低成本、简便易操作;而且可实现右旋糖酐的分子量可控性生产。
本发明解决技术问题采用如下方案:
发酵法结合酶法制备分子量可控的药用右旋糖酐,按如下步骤进行:
(1)肠膜状明串珠菌发酵合成高分子右旋糖酐
向发酵培养基中加入发酵培养基体积5%的肠膜状明串珠菌种子液,在25度,pH值为7.2~7.6,摇床转速为120r/min条件下,发酵22小时后,从发酵液中分离高分子右旋糖酐。
其中,所述的肠膜状明串珠菌种子液是工业上常用的肠膜状明串珠菌(L.M-1226号菌)种子液,优选处于菌体生长指数期的肠膜状明串珠菌种子液。该肠膜状明串株菌的培养基是本领域工业上用于培养肠膜状明串珠菌的培养基,种子液培养基是:蔗糖15%,蛋白胨0.25%,磷酸氢二钠0.18%。发酵培养基:蔗糖10%,蛋白胨0.25%,磷酸氢二钠0.18%,所述的百分比为质量百分比,pH值优选7.2~7.6,更优选7.4;;
其中,从所述的发酵液中分离高分子右旋糖酐的方法包括向发酵液中加入85%乙醇使发酵液中乙醇的体积浓度为35%~38%,右旋糖酐沉淀后,再经85%乙醇捏洗至“老化”;
(2)高分子右旋糖酐的糊化
高分子右旋糖酐用蒸馏水按照湿糖酐与缓冲溶液按照1∶1.8(w/V)配制成高分子右旋糖酐溶液,在90度条件下保温12小时。
(3)右旋糖酐酶催化水解高分子右旋糖酐
向步骤3)加入右旋糖酐酶使其终浓度为0.5IU/mL,置于35℃条件下搅拌反应130~150min,然后终止酶催化反应。
其中,所述的右旋糖酐酶的一个酶活U是指,以蒸馏水配制的终体积浓度为3.0%的重均分子量为70kDa的右旋糖酐溶液为底物,在35度条件下,每分钟产生1μmol还原糖所需要的右旋糖酐酶量;
(4)去除杂质
将上述步骤3)经右旋糖酐酶催化水解的反应液置于80℃保温30min,随后采用中速定性滤纸过滤上清,然后再将上述过滤后的上清液采用活性炭搅拌吸附10min后,静置10min,再利用中速定性滤纸去除杂质,清澈无色的滤液用于右旋糖酐分离醇沉;
(5)乙醇分级醇沉及真空干燥
其中,从所述的反应液中分离右旋糖酐的方法包括采用4级划分,一级划分乙醇体积浓度为39%,在搅拌装置下,向权利要求11中澄清无色的滤液中加入体积浓度95%乙醇,使滤液中乙醇的体积浓度达到39%时停止醇沉,将滤液置于40度保温22h,然后倒出上清液,再向沉淀中加入适量乙醇,取出一级沉淀大分子杂质;二级划分乙醇体积浓度为43%,向一级划分后的上清液加入体积浓度95%乙醇,使一级上清液中乙醇的体积浓度达到43%时停止醇沉,将醇沉好的溶液置于34度保温22h,然后倒出上清液,再向沉淀中加入乙醇获得右旋糖酐70产品;三级划分乙醇浓度为48%,向二级划分后的上清液中加入体积浓度95%的乙醇,使二级上清液中乙醇体积浓度达到48%时停止醇沉,将醇沉好的溶液置于40度保温12h,然后倒出上清液,再向沉淀中加入乙醇获得右旋糖酐40产品;四级划分乙醇浓度为58%,向三级划分后的上清液中加入体积浓度95%的乙醇,使三级上清液中乙醇体积浓度达到58%时停止醇沉,将醇沉好的溶液置于室温静置2h,然后倒出上清液,再向沉淀中加入乙醇获得右旋糖酐20产品。
将上述的右旋糖酐产品分别置于80℃真空干燥箱中干燥4h,去除产品中残留的乙醇及水分,即得到相应的右旋糖酐产品。
其中,所述的右旋糖酐酶优选使用从土壤中筛选出的棘孢青霉菌株发酵产生的右旋糖酐酶,该菌株GenBank登录号为HQ647326,保藏号为CGMCCNo.4725,该酶催化水解高分子右旋糖酐具有较强的底物特异性,该酶在催化降解右旋糖酐时,优先降解分子量较大的糖酐,从而实现中小分子量右旋糖酐的累积,有利于定向制备药用右旋糖酐,同时获得较高的产品收率。
本发明采用发酵法结合酶法制备分子量可控的药用右旋糖酐,该方法具有以下优点:
(1)本发明先用肠膜状明串珠菌发酵法合成高分子右旋糖酐,转化率高达97%,之后再利用右旋糖酐酶催化降解130~150min,得到系列右旋糖酐产品,该方法不仅绿色、环保、低成本、简便;而且能够大幅度提高产品收率,获得高品质药用右旋糖酐。
(2)本发明能够实现药用右旋糖酐的分子量可控性生产,通过孔子反应条件,调节催化反应时间可以定向制备以右旋糖酐40为主的产品。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明技术方案进一步解释说明。
实施例1
(1)肠膜状明串珠菌发酵合成高分子右旋糖酐,包含以下A、B两步:
A:培养基配制
种子培养基(g/L):蔗糖100,蛋白胨2.5,Na2HPO4·12H2O1.8;发酵培养基(g/L):右旋糖酐70(1)15.0,蛋白胨5.0,K2HPO4·3H2O1.0,FeSO4·7H2O0.01,KCl0.5,MgSO4·7H2O0.5,用NaOH调pH至7.4;在0.1MPa压力下,灭菌20min。
B:肠膜状明串珠菌发酵合成高分子右旋糖酐
在无菌环境下,将肠膜状明串珠菌以5.0%的接种量转接到分别装有100mL种子培养基的3个摇瓶中,于25℃,120r/min条件下培养22h。然后以5.0%的接种量转接到装有5.0L发酵培养基的发酵罐中,于25℃,120r/min条件下发酵22h。出料时,向发酵液中加入85%的乙醇使发酵液中乙醇的体积浓度为35%~38%,右旋糖酐沉淀后,再经85%乙醇捏洗至“老化”。蔗糖转化率高达95%,该步骤糖酐收率在85%~90%。
(2)高分子右旋糖酐的糊化
将上述步骤1)获得的750.48g湿糖酐用蒸馏水按照湿糖酐与缓冲溶液按照1∶1.8(w/V)配制成高分子右旋糖酐溶液,在90度条件下保温12小时,标定高分子右旋糖酐的浓度为11%时添加55.41mL蒸馏水。
(3)右旋糖酐酶催化水解高分子右旋糖酐
右旋糖酐酶的活力测定:将4mL用蒸馏水配制的3.0%右旋糖酐70kDa溶液置于35度保温10min,再加入适当稀释的右旋糖酐酶液1mL保温1小时后,采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定生成的还原糖。以上述条件下酶分钟产生1μmol还原糖(葡萄糖当量)所需要的酶量定义为一个酶活力单位(U)。检测结果所示右旋糖酐酶液活力为300U/mL。
向步骤2)经浓度标定后为11%的高分子右旋糖酐溶液中加入右旋糖酐酶使其终浓度为0.5IU/mL,加入的右旋糖酐酶总活力单位为971.5U,置于35℃条件下搅拌反应130~150min,然后采用100度水浴保温10min或通入水蒸气5min的方法,是右旋糖酐酶变性失活,从而终止酶催化反应。
(4)去除杂质
将上述步骤3)经右旋糖酐酶催化水解的反应液置于80℃保温30min,冷却后采用中速定性滤纸过滤,然后将上述滤液采用活性炭搅拌吸附10min后,静置10min,再利用中速定性滤纸去除活性炭等,清澈透明的滤液用于右旋糖酐分离醇沉。
(5)乙醇分级醇沉及真空干燥
采用4级划分,一级划分乙醇体的积浓度为38%,在搅拌装置下,向步骤4)所得滤液中加入缓慢体积浓度95%的乙醇,根据滤液温度和酒精度值查表的滤液中酒精的体积浓度,当乙醇的体积浓度达到39%时停止醇沉,将醇沉好的溶液置于40度保温22h后,倒出上清液,再向沉淀中加入适量乙醇,取出一级沉淀大分子杂质;二级划分乙醇的体积浓度为43%,向一级划分后的上清液缓慢加入95%的乙醇,具体操作同上,使溶液中乙醇的体积浓度达到42%时,停止醇沉,将醇沉好的溶液置于34度保温22h后,倒出上清液,再向沉淀中加入适量乙醇获得右旋糖酐70产品;三级划分乙醇的体积浓度为47%,向二级划分后的上清液中缓慢加入95%的乙醇,具体操作同上,使溶液中乙醇体积浓度达到48%时停止醇沉,将醇沉好的溶液置于40度保温12h后,倒出上清液,再向沉淀中加入适量乙醇获得右旋糖酐40产品;四级划分乙醇浓度为58%,向三级划分后的上清液中缓慢加入95%的乙醇,使溶液中乙醇体积浓度达到58%时停止醇沉,将醇沉好的溶液置于室温静置2h后,倒出上清液,再向沉淀中加入适量乙醇获得右旋糖酐20产品。
将上述的右旋糖酐产品分别置于80℃真空干燥箱中干燥4h,去除产品中残留的乙醇及水分,最后得到三种不同分子量的药用级右旋糖酐,经搞笑液相色谱检测,三种产品的分子量分别是68574,39821和21053Da,保留时间分别为13.926min,14.327min和15.054min,分子量分布系数分别为1.86、1.40和1.23,酶解划分收率为85.35%,对应的产率为15.20%、60.49%和9.67%。当反应时间为130~150min,可以定向制备右旋糖酐40为主要的产品。
本实施例中的肠膜状明串珠菌(Leuconstocmesenteroides)为商购;右旋糖酐酶为申请号为CN201110117071.6的专利公开文本中的右旋糖酐酶。
以上所述是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明所述原理的前提下,还可以作出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种制备分子量可控的药用右旋糖酐的方法,其特征在于,包括以下步骤:
在含蔗糖的发酵培养基中加入肠膜状明串珠菌(Leuconstocmesenteroides)种子液进行发酵培养,从发酵液中分离高分子右旋糖酐,采用高酶活性的右旋糖酐酶催化降解高分子右旋糖酐为药用右旋糖酐,从反应液中分离右旋糖酐,然后经过逐级醇沉得到特定分子量的药用右旋糖酐;所述的肠膜状明串珠菌(Leuconstocmesenteroides)选自L.M-1226号菌;所述的右旋糖酐酶使用从土壤中筛选出的棘孢青霉菌株发酵产生的右旋糖酐酶,该菌株的保藏号为CGMCCNo.4725;
所述肠膜状明串珠菌的发酵培养在24-26℃、pH值7.2~7.6下进行,发酵时间为20~24小时,所得高分子右旋糖酐经醇沉分离,分离后的高分子右旋糖酐经80-100℃糊化成均一溶液后加入右旋糖酐酶进行催化降解;
从所述的发酵液中分离高分子右旋糖酐的方法包括向发酵液中加入80-90%乙醇,使发酵液中乙醇的体积浓度为35%~38%,右旋糖酐沉淀后,再经80-90%乙醇捏洗至老化;
所述从反应液中分离右旋糖酐的方法为,将右旋糖酐酶水解反应液置于75-85℃保温20-40min,随后采用中速定性滤纸过滤上清;然后再将上述过滤后的上清液采用活性炭搅拌吸附,静置,再利用中速定性滤纸去除杂质,清澈透明的滤液用于右旋糖酐逐级醇沉;
所述逐级醇沉得到特定分子量的药用右旋糖酐的方法采用4级划分:向澄清无色的滤液中加入乙醇使乙醇体积浓度为38-40%时醇沉,将滤液置于38-42℃保温20-24h,然后倒出上清液,取出一级沉淀右旋糖酐;向一级划分后的上清液加入乙醇,使一级上清液中乙醇的体积浓度达到43%时醇沉,将醇沉好的溶液置于32-36℃保温20-24h,然后倒出上清液,取出二级沉淀右旋糖酐;向二级划分后的上清液中加入乙醇,使二级上清液中乙醇体积浓度达到47-49%时醇沉,将醇沉好的溶液置于38-42℃保温10-14h,然后倒出上清液,取出三级沉淀右旋糖酐;向三级划分后的上清液中加入乙醇,使三级上清液中乙醇体积浓度达到56-60%时醇沉,将醇沉好的溶液置于室温静置1-3h,然后倒出上清液,取出沉淀右旋糖酐。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的发酵培养基和/或种子液包括蔗糖,蛋白胨以及磷酸氢二钠。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,将分离得到的特定分子量的右旋糖酐产品分别置于真空干燥箱中干燥,去除产品中残留的乙醇及水分,即得到相应的右旋糖酐产品。
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