CN103283785B - 一种有效防治油茶病害的复合微生物源农药及应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种有效防治油茶病害的复合微生物源农药及应用方法，具体是放线菌球孢链霉菌球孢亚种CSUFTAC0906002(保藏编号为CCTCC NO:M 2011012)和细菌短短芽孢杆菌Z26(保藏编号为CCTCC NO:M 2011013)及其他助剂复配的微生物农药，属森林保护技术领域。所述复合微生物源农药能有效抑制油茶主要病害病原菌的生长和繁殖。同时其主要成分对环境安全性好，具有良好的开发应用前景。

Description

一种有效防治油茶病害的复合微生物源农药及应用方法

技术领域

本发明属于森林保护领域，尤其涉及一种防治油茶林主要病害的复合微生物源农药及应用方法。

背景技术

油茶(Camellia oleifera)属山茶科山茶属常绿小乔木，主产我国，是世界四大木本油料树种之一。油茶在我国分布范围极广，从东南沿海丘陵到西部云贵高原均有分布。油茶的产量高、寿命长、适应性强，对土壤没有严苛的条件要求，在秦岭、淮河以南16个省区的丘陵、山地均有大面积栽培种植。油茶结果较早，一般从栽植到开花结果仅需3-5年时间，但结果期却可达50-60年，具有很大的增产潜力，一次种植可多年受益。油茶种子含大量优质不饱和脂肪酸及维生素E，其含油率可高达25.22%-33.50%，是一种在食用油中占有重要地位的优质、耐贮藏的高级食用油。除供食用外，茶油在医药、工业上也有多种用途，可作为凡士林、肥皂、防锈有、润滑油等的原料。茶枯不止可做农药使用，而且是优质的有机肥料，还可用其提取皂素、栲胶、碳酸钾、糖醛、活性炭以及浸出残油等。饼渣还可作为猪的精饲料而加以利用。可以说，油茶全身都是宝，它不止集经济效益、社会效益和生态效益于一身，而且对于促进农民就业增收、加快推进山区综合发展、维护国家粮油安全以及加快国土绿化进程都有非常重要的作用。

油茶作为纯天然绿色保健食品，具有很好的应用开发前景，但由于我国对油茶病害的研究起步较晚，故油茶病害目前已成为制约油茶产业化发展的瓶颈。油茶叶枯病为油茶主要病害之一，在全国各主要油茶产区，均有不同程度的发生。该病可引起油茶大量落叶落果，对油茶的产量和质量均造成极大影响。该病主要为害油茶叶、芽及果实，一旦发病，病株率即可达到15%-25%，严重的甚至可达到90%以上；果实的发病率也可达到25%，严重的可达到40%以上。油茶叶枯病多从叶尖或叶缘开始发病，染病2-3天后病叶就会脱落，而果实或叶芽染病后一个月左右会出现枯黄或裂果、落果现象，直至腐败软化。以往针对此病多是喷洒托布津等化学农药，效果不甚理想，，而且由于药物残留及污染环境等，化学防治已越来越受到限制。其他油茶主要病害还有油茶炭疽病、油茶根腐病、油茶软腐病等等，以往针对油茶病害多为单一防治，且目前市面基本没有可以同时防治两种以上油茶病害效果很好的菌剂产品，本发明所述水分散粒剂通过抗菌谱测定，可有效防治油茶叶枯病、油茶炭疽病、油茶根腐病等多种油茶病害，且抑菌效果显著，十分具有开发利用前景，并可填补市面上没有可同时防治多种油茶病害的菌剂产品这一空白。

目前国内针对油茶叶枯病的防治基本都是使用化学农药，在化学农药弊端日益凸显的情况下，一些微生物源农药逐渐受到了国内外学者的高度关注。微生物源农药的开发及应用已逐渐成为农药行业的新趋势，其主要优势在于：1)种类繁多，研发的选择余地大；2)专一性强，对非靶标生物安全，不易产生抗药性；3)活性高，生产成本低，发酵工艺简单；4)对环境安全，无公害，无残留。

从生物防治的角度来看，从微生物中研究开发安全、有效、低毒的复合微生物源农药，对推进林业无公害防治具有一定的现实意义。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的空白，提供一种有效防治油茶主要病害的复合微生物源农药及其应用方法，对油茶林的无公害防治具有重要意义。

一种有效防治油茶病害的复合微生物源农药，是由放线菌球孢链霉菌球孢亚种CSUFTAC0906002，保藏编号为CCTCC NO:M 2011012和细菌短短芽孢杆菌Z26，保藏编号为CCTCC NO:M2011013种子培养液按体积比3:1混配后联合发酵培养后，再与载体和添加剂混合制备而成；活菌数>10¹⁰cfu/g。

所述的油茶植物病害包括：油茶叶枯病、油茶炭疽病、油茶根腐病、油茶软腐病、油茶煤污病、油茶叶斑病、杉木炭疽病中的一种或几种。

所述的种子培养液制备过程为：分别将已活化好的放线菌摇瓶液体培养110-120h和细菌菌饼摇瓶液体培养17-18h后，分别获得各自种子培养液。

所述的种子培养液制备过程具体为：将直径5-6mm的放线菌菌饼接种于高氏一号液体培养基，27.5-29℃、150-160r/min振荡培养110-120h后获得放线菌种子培养液；将直径2-4mm的细菌菌饼接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基，29-30℃、190-200r/min振荡培养17-18h后获得细菌种子培养液。

复合菌发酵培养的过程为：先将放线菌种子培养液加入发酵培养基中，110-120h后再加入细菌种子培养液，放线菌与细菌种子液的体积比为3:1，总接种量10%，摇瓶培养50-55h后获得复合菌发酵培养液。

所述的发酵培养基为葡萄糖黄豆粉酵母膏培养液，发酵培养条件为：27.5-29℃、150-160r/min，总的振荡培养160-175h，获得复合菌发酵培养液。

所述的发酵培养基为葡萄糖15g、大豆粉10g、NaCl5g、酵母膏1g、CaCO₃1g、蒸馏水1000mL，pH7.0，接种量10%，装液量100mL，间隔接种时间5天，发酵培养条件为：28℃、160r/min，总的振荡培养时间7d。

将制备的复合菌发酵培养液与载体高岭土按6.5-7.5：1的料液体积质量比，单位为mL/g，混合均匀烘干粉碎后制成菌剂原粉，再取添加剂，载体、水混合均匀捏合造粒，干燥即可；所述的添加剂包括：润湿剂十二烷基硫酸钠、分散剂木质素磺酸钠、崩解剂硫酸铵、粘结剂聚乙二醇。

具体是将制备的复合菌发酵培养液与高岭土按7:1的料液体积质量比，单位为mL/g，混合均匀烘干粉碎后制成菌剂原粉，再取菌剂原粉40wt%，润湿剂十二烷基硫酸钠4wt%，分散剂木质素磺酸钠5wt%，崩解剂硫酸铵4wt%，粘结剂聚乙二醇2wt%，加水量控制在16-20wt%之间，载体补足100wt%，混合均匀捏合造粒，干燥过30-60目筛即可。

所述的复合微生物源农药的应用方法，将所述的复合微生物源农药溶于水，形成水分散粒剂，活菌数>8×10¹⁰cfu/mL，用于防治油茶植物病害。

本发明球孢链霉菌球孢亚种球孢变种（Streptomyces globisporus supsp.globisporus）CSUFTAC0906002菌株已于2011年1月10日在中国典型培养物保藏中心进行了保藏，名称为：球孢链霉菌球孢亚种，保藏编号为：CCTCC M 2011012。

本发明短短芽孢杆菌Z26（Brevibacillus brevis Z26），已于2011年1月10日在中国典型微生物保藏中心进行了保藏，保藏号CCTCC M2011013。

本发明具有如下的有益效果

1)本发明的复合微生物源农药中所需微生物，活性高，生产成本低，发酵工艺简单。

2)本发明的复合微生物源农药，工艺制作简单，成本低廉，对环境污染小，有无公害和无残毒的特点，有效避免了化学农药的危害。

3)本发明的复合微生物源农药，一方面通过放线菌与细菌的复配，极大减少了病原菌对本发明的复合微生物源农药产生抗性的可能，另一方面，通过混配大大降低了林间防治的经济成本，且防治效果良好。

4)本发明的复合微生物源农药区别于其他市面上的农药仅针对某一种油茶病害有很好的防治效果，该复合微生物源农药可对油茶叶枯病、油茶炭疽病、油茶根腐病、油茶软腐病等多种油茶病害均有很好的拮抗效果，抗菌谱较为广泛，可有效降低防治成本。

说明书附图

图1为培养时间对复合菌菌体生长及抑菌活性的影响；

图2为接种比例对复合菌菌体生长及抑菌活性的影响；

图3为间隔接种时间对复合菌菌体生长及抑菌活性的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，而非限制本发明。

本发明实施例中所述的复合菌发酵液的制备过程为：先在300mL三角瓶中装入100mL葡萄糖黄豆粉酵母膏培养液（葡萄糖15g、大豆粉10g、NaCl5g、酵母膏1g、CaCO₃1g、蒸馏水1000mL，pH7.0），接入放线菌球孢链霉菌球孢亚种CSUFTAC0906002种子培养液，5d后接种细菌短短芽孢杆菌Z26种子培养液，放线菌与细菌种子液的接种体积比为3:1，总接种量10%，28℃、160r/min振荡培养7d。复合菌发酵液中放线菌种子培养液制备方法为：将拮抗放线菌活化，用直径6mm的灭菌打孔器打成菌饼若干，在300mL三角瓶中接入100mL高氏一号液体培养基，每瓶接种1个菌饼，在28℃、160r/min培养5d，获得放线菌发酵种子液。细菌Z26种子培养液制备方法为：将拮抗细菌Z26活化，用直径3mm的灭菌打孔器打成菌饼若干，在250mL三角瓶中接入50mL种子液，每瓶接种1个菌饼，30℃、200r/min振荡培养18h，获得细菌Z26发酵种子液。

实施例1复合菌发酵工艺优化

以油茶叶枯病原菌为指示菌株，抑菌率和菌体干重为主要筛选指标，筛选出最佳发酵培养基为：葡萄糖15g、大豆粉10g、NaCl5g、酵母膏1g、CaCO₃1g、蒸馏水1000mL，pH7.0。最佳发酵条件为：接种量10%，装液量100mL，放线菌与细菌种子液的接种体积比为3:1，先接种放线菌种子液，间隔接种时间5天，之后接种细菌种子液，培养条件均为28℃、160r/min，总的振荡培养时间7d。在此条件下，菌体干重为1.6354g，抑菌率为97.19%。采用此种经优化的发酵工艺后，复合菌发酵液抑菌率及菌体干重均比其他条件下有显著提高。

结果见图1，菌株在第3天和第6天分别达到峰值，这是因为前期细菌生长迅速，后期放线菌逐渐繁殖，故出现两个峰值。

图2，因放线菌较细菌生长缓慢，故选取的细菌：放线菌的接种比例为2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5。当接种比例为2:1、1:1、1:2时，菌体干重及抑菌率均不显著，当接种比例高于1:3时，菌体干重呈上升趋势，但抑菌率逐渐下降，综合考虑，选取最佳接种比例为1:3。

由图3可知，菌体干重及抑菌率均呈阶梯式上升趋势，综合考虑菌体干重及抑菌率，最终选定最佳间隔接种时间为5天，即接种放线菌振荡培养5天后再次接种细菌Z26。

由于细菌生长繁殖迅速，放线菌相对缓慢，综合考虑间隔接种时间、接种比例及培养时间，最终确定复合菌的培养条件为：接种比例(细菌：放线菌)1:3；间隔接种时间5d；总的振荡培养时间7d。

实施例2复合微生物源农药研制

经生物相容性测定，选定载体为高岭土，润湿剂为十二烷基硫酸钠，分散剂为木质素磺酸钠，粘结剂为聚乙二醇，崩解剂为硫酸铵。将复合菌发酵液与高岭土按7:1的料液比混合制成原粉备用。配方优化结果表明，原粉40%，润湿剂十二烷基硫酸钠4%，分散剂木质素磺酸钠5%，崩解剂硫酸铵4%，粘结剂聚乙二醇2%，加水量控制在16-20%之间，载体高岭土补足100%为菌剂最优配方。此配方下复合微生物源农药的润湿性、分散性、悬浮性、崩解时间、成粒率都可达最佳水平。经测定，复合微生物源农药的货架保存期常温下可存放3个月，抑菌率可保持在70%以上。使用时溶于水，使得活菌数>8×10¹⁰cfu/mL，抑菌率达91.2%。

复合微生物源农药的林间施用方法及效果

一、盆栽实验

方法：对两年生油茶苗进行盆栽实验。取上述复合微生物源农药（已配成水分散粒剂），分别用无菌水稀释100倍、500倍和1000倍后，采用灌根接种的方法进行防治实验。

(1)预防效果的测定：灌撒复合微生物源农药，每株灌根100mL。保湿培养24h后，喷洒接种浓度为10⁵cfu/mL的油茶叶枯病病菌孢子悬浮液。

(2)治疗效果的测定：先用与上相同浓度的油茶叶枯病病菌孢子悬浮液对油茶幼苗叶片进行喷雾接种，保湿培养24h后，再用灌根接种的方法对油茶幼苗施用复合微生物源农药，每株灌根100mL，保湿培养24h。

以无菌水和75%多菌灵500倍稀释液作为对照，25℃保湿条件下培养，统计病情指数。每处理5株，重复3次。共需幼苗：4×5×3×2=120株。

病情分级标准：0级，未发病；Ⅰ级，病斑面积占叶片总面积1/4一下；Ⅱ级，病斑面积占叶片总面积1/4-1/2；Ⅲ级，病斑面积占叶片面积1/2-3/4；Ⅳ级，病斑面积占叶片面积3/4以上。

二、苗圃实验

(一)实验处理设计

Ⅰ(空白对照)：用清水进行喷洒、灌根处理；

Ⅱ(复合微生物源农药防效测定)：将用清水稀释100倍后的复合微生物源农药样品（复合微生物源农药样品为配成的水分散粒剂，下同）进行喷洒、灌根处理；

Ⅲ(复合微生物源农药防效测定)：将用清水稀释500倍后的复合微生物源农药样品进行喷洒、灌根处理；

Ⅳ(复合微生物源农药防效测定)：将用清水稀释1000倍后的复合微生物源农药进行喷洒、灌根处理；

Ⅴ(化学农药防效测定)：将用清水稀释500倍后的75%多菌灵溶液进行喷洒、灌根处理；

每处理重复3次。实验采用随机区组设计，每小区10株，小区间设保护行。共需幼苗：10×3×5=150株。随机选择2个苗圃做平行的实验处理。

(二)实验实施

至每年7月初第一次喷洒、灌根处理，每株幼苗灌根50-100mL。15d后进行第二次喷洒、灌根处理。以此类推，以每15d为一个周期对油茶幼苗施用复合微生物源农药，共计施用5次。

(三)防效调查

调查方法：第一次处理前进行一次病情指数调查，第二次处理前进行第二次调查，并在最后一次处理后10d再进行一次调查。共计调查6次。

每小区随机调查5株，合计每组处理共调查15株，每株调查所有叶片，调查病叶的严重度，记载病情指数，最后计算防治效果。

盆栽实验结果表明，复合微生物源农药对油茶叶枯病有较好的防治效果，且其对油茶叶枯病发病前的预防效果和发病后的治疗效果均较好。与化学农药多菌灵相比，复合微生物源农药的100倍稀释液和500倍稀释液的防治效果均优于前者，具有比较明显的优势。

表1复合微生物源农药对油茶叶枯病的盆栽防治效果

田间苗圃实验表明，复合微生物源农药水分散粒剂对油茶主要病害有较好的防治效果，使用了复合微生物源农药的实验组，其防治效果可达75%以上，大大降低了油茶叶枯病的发病率，并且复合微生物源农药100倍稀释液和500倍稀释液的防治效果均优于化学农药多菌灵。

表2复合微生物源农药对油茶叶枯病的林间防治效果

处理方式	发病率（%）	病情指数	防治效果（%）
				100倍稀释液	6.43	1.03	77.51
500倍稀释液	8.27	1.13	75.33
				1000倍稀释液	8.96	1.67	63.54
CK1（清水）	13.51	4.58	—
				CK2（500倍多菌灵）	8.85	1.25	72.71

实施例4不同组别间显著性水平分析

对单一拮抗放线菌球孢链霉菌球孢亚种CSUFTACO906002发酵液、拮抗细菌Z26发酵液、复合菌发酵液以及单独发酵后的混合液的抑菌活性及菌体干重进行显著性水平分析，分析结果如表3所示。

表3不同组别间显著性水平分析

	（1）	（2）	（3）	（4）
					抑菌率(%)	91.3±2.05b	78.84±1.3d	97.19±2.04a	87.46±1.33c
菌体干重(g)	0.9835±0.0012c	1.131±0.002b	1.6354±0.0102a	0.2161±0.0002d

注:采用Duncan’s检验，同列数值后字母相同表示差异不显著(P>0.05)，字母全不相同表示差异显著(P<0.05)。

表3中：

（1）为球孢链霉菌球孢亚种CSUFTAC0906002发酵液；

（2）为球孢链霉菌球孢亚种CSUFTAC0906002、短短芽孢杆菌Z26分别单独发酵后混合；

（3）为本发明的发酵液；

（4）为短短芽孢杆菌Z26发酵液。

应用SPSS软件Duncan’s检验后表明，各组别间差异显著，复合菌发酵液的抑菌率及菌体干重均明显优于其他组别，因此，复合菌发酵液可用于后续复合微生物源农药的研制。

实施例5复合菌的抗菌谱测定

取1mL复合菌发酵液与已灭菌并冷却至40℃左右的PDA培养基混匀，制成带药培养基平板。在平板中央接入已预先活化好的直径6mm的指示菌菌饼，以不加发酵液的PDA培养基为对照，在28℃下培养5d后，用十字交叉法测量菌落直径并计算抑菌率，每处理重复3次。

表4复合菌及单一菌株发酵液抗菌谱的测定

Claims (5)

1.一种有效防治油茶病害的复合微生物源农药，其特征在于，是由保藏编号为CCTCC NO:M2011012的放线菌球孢链霉菌球孢亚种CSUFTAC0906002和保藏编号为CCTCC NO:M2011013的细菌短短芽孢杆菌Z26的种子培养液按体积比3:1混配后联合发酵培养后，再与载体和添加剂混合制备而成；活菌数>10¹⁰cfu/g；所述的种子培养液制备过程具体为：将直径5-6mm的放线菌菌饼接种于高氏一号液体培养基，27.5-29℃、150-160r/min振荡培养110-120h后获得放线菌种子培养液；将直径2-4mm的细菌菌饼接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基，29-30℃、190-200r/min振荡培养17-18h后获得细菌种子培养液；

联合发酵培养的过程为：先将放线菌种子培养液加入发酵培养基中，5天后再加入细菌种子培养液，总接种量10％，装液量100mL，发酵培养条件为：28℃、160r/min，总的振荡培养时间7d；所述的发酵培养基为葡萄糖15g、大豆粉10g、NaCl5g、酵母膏1g、CaCO₃1g、蒸馏水1000mL，pH7.0。

2.根据权利要求1所述的复合微生物源农药，其特征在于，所述的油茶植物病害包括：油茶叶枯病、油茶炭疽病、油茶根腐病、油茶软腐病、油茶煤污病、油茶叶斑病、杉木炭疽病中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的复合微生物源农药，其特征在于，将制备的复合菌发酵培养液与载体高岭土按6.5-7.5：1的料液体积质量比，单位为mL/g，混合均匀烘干粉碎后制成菌剂原粉，再取添加剂，载体、水混合均匀捏合造粒，干燥即可；所述的添加剂包括：润湿剂十二烷基硫酸钠、分散剂木质素磺酸钠、崩解剂硫酸铵、粘结剂聚乙二醇。

4.根据权利要求3所述的复合微生物源农药，其特征在于，将制备的复合菌发酵培养液与高岭土按7:1的料液体积质量比，单位为mL/g，混合均匀烘干粉碎后制成菌剂原粉，再取菌剂原粉40wt％，润湿剂十二烷基硫酸钠4wt％，分散剂木质素磺酸钠5wt％，崩解剂硫酸铵4wt％，粘结剂聚乙二醇2wt％，加水量控制在16-20wt％之间，载体补足100wt％，混合均匀捏合造粒，干燥过30-60目筛即可。

5.权利要求1-4任一项所述的复合微生物源农药的应用方法，其特征在于，将所述的复合微生物源农药溶于水，形成水分散粒剂，活菌数>8×10¹⁰cfu/mL，用于防治油茶植物病害。