CN103282492A - 修饰的瓦伦烯合酶多肽、编码核酸分子及其用途 - Google Patents
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Abstract
提供了修饰的瓦伦烯合酶多肽以及使用所述修饰的瓦伦烯合酶多肽的方法。还提供了产生修饰的萜烯合酶的方法。
Description
相关申请
要求2010年10月29日提交的美国临时申请系列号61/455,990(题为“修饰的瓦伦烯合酶多肽及其用途”,Park E.,Burlingame,R.P.,Amick,J.D.和Julien,B.)以及2011年9月9日提交的美国临时申请系列号61/573,745(题为“修饰的瓦伦烯合酶多肽、其编码核酸分子和用途”,Park E.,Burlingame,R.P.,Amick,J.D.和Julien,B.)的优先权权益。
本申请涉及同日提交的美国申请系列号13/317,839,题为“修饰的瓦伦烯合酶多肽、其编码核酸分子和用途”,其要求美国临时申请系列号61/455,990和61/573,745的优先权。
如果允许,上面引用的每一申请的主题以其整体并入本文。
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发明领域
提供了修饰的瓦伦烯合酶多肽,编码所述修饰的瓦伦烯合酶的核酸分子,以及使用所述修饰的瓦伦烯合酶多肽的方法。还提供了产生修饰的萜烯合酶的方法。
背景
瓦伦烯(Valencene)和诺卡酮(nootkatone)是在柑橘属(例如橙和葡萄柚)油和其它植物物质中天然发现的倍半萜类。瓦伦烯衍生自无环焦磷酸萜烯前体,法尼基二磷酸(FPP),而瓦伦烯的氧化导致诺卡酮的形成。尽管瓦伦烯和诺卡酮均用作香料和芳香剂,诺卡酮尤其广泛用于香水和香料工业。因此,本文的目的包括提供修饰的瓦伦烯合酶多肽以及使用所述修饰的瓦伦烯合酶多肽生产瓦伦烯和诺卡酮的方法。
概述
本文提供了编码修饰的瓦伦烯合酶多肽的核酸分子,和其中编码的修饰的瓦伦烯合酶。本文还提供了制备修饰的瓦伦烯合酶多肽的方法。本文还提供了产生瓦伦烯的方法,以及从瓦伦烯产生诺卡酮的方法。本文还提供了制备修饰的萜烯合酶的方法,以及所述修饰的萜烯合酶。
本文提供了编码修饰的瓦伦烯合酶多肽的核酸分子。在一些实例中,本文提供的所述核酸分子编码修饰的瓦伦烯合酶,其含有与SEQ ID NO:3所示的修饰的瓦伦烯合酶多肽具有小于100%相同性的氨基酸序列。在另一些实例中,本文提供的所述核酸分子编码修饰的瓦伦烯合酶,其含有与SEQ ID NO:3所示的修饰的瓦伦烯合酶多肽具有100%相同性的氨基酸序列。在一些方面,由所述核酸分子编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽与SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶多肽具有小于95%的相同性。在另一些方面,由所述核酸分子编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽与SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶多肽具有大于62%的序列相同性。
本文还提供编码修饰的瓦伦烯合酶多肽的核酸分子,所述修饰的瓦伦烯合酶多肽在具有与SEQ ID NO:3所示的修饰的瓦伦烯合酶多肽的序列相同性小于100%的氨基酸序列的瓦伦烯合酶中含有氨基酸修饰。在一些实例中,所述修饰的瓦伦烯合酶多肽含有与SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶多肽具有小于95%的相同性的氨基酸序列。在另外的实例中,所述修饰的瓦伦烯合酶多肽含有与SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶多肽具有大于62%的序列相同性的氨基酸序列。在一些方面,由所述核酸分子编码的修饰的瓦伦烯多肽含有与SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶多肽具有至少82%的序列相同性的氨基酸序列。
本文还提供的是编码修饰的瓦伦烯合酶多肽的核酸分子,所述修饰的瓦伦烯合酶多肽与不含修饰的瓦伦烯合酶或SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶多肽相比含有或至少含有29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136或137个氨基酸修饰。
本文提供了编码修饰的瓦伦烯合酶多肽的核酸分子,所述修饰的瓦伦烯合酶多肽含有氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2所述的瓦伦烯合酶的序列相同性选自小于95%且大于75%、小于94%且大于75%、小于93%且大于75%、小于92%且大于75%、小于95%且大于80%、小于94%且大于80%、小于93%且大于80%、小于92%且大于80%、小于95%且大于85%、小于94%且大于85%、小于93%且大于85%、以及小于92%且大于85%。在一些实例中,由本文提供的核酸分子编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽具有与SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶具有小于或约小于94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%或75%的相同性的氨基酸序列。在另一些实例中,所述修饰的瓦伦烯合酶多肽含有与SEQ ID NO:3所示的修饰的瓦伦烯合酶多肽具有至少80%的相同性的氨基酸序列。在仍另一些实例中,所述修饰的瓦伦烯合酶多肽具有与SEQ ID NO:3所示的瓦伦烯合酶多肽具有至少或至少约81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、76%或99%的相同性的氨基酸序列。
本文还提供编码修饰的瓦伦烯合酶多肽的核酸分子,所述修饰的瓦伦烯合酶多肽与SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶相比含有氨基酸修饰;由此所述修饰的瓦伦烯合酶多肽包含与SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶多肽具有小于100%相同性和大于62%相同性的氨基酸序列并且所述修饰的瓦伦烯合酶多肽不含有SEQ ID NO:289-291、346、347、752、882、883或886任一所示的氨基酸序列。在某些方面,所述修饰的瓦伦烯合酶多肽不含有SEQ ID NO:6-8、14-16和348任一所示的氨基酸序列。在另外的方面,所述修饰的瓦伦烯合酶多肽不含有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。在仍另外的方面,所述修饰的瓦伦烯合酶多肽不含有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
在一些实例中,本文提供的核酸分子编码修饰的瓦伦烯合酶多肽,其催化从无环焦磷酸萜烯前体形成瓦伦烯。例如,所述修饰的瓦伦烯合酶多肽催化从无环焦磷酸萜烯前体法尼基二磷酸(FPP)形成瓦伦烯。
本文还提供编码修饰的瓦伦烯合酶多肽的核酸分子,所述修饰的瓦伦烯合酶多肽在宿主细胞中从FPP产生瓦伦烯的量大于由SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶在相同宿主细胞中及在相同条件下从FPP产生瓦伦烯的量,其中所述宿主细胞是产生FPP的细胞。在一些方面,所述宿主细胞是酵母细胞.可以通过在相同条件下以及在相同的酵母株中单独地培养表达所述修饰的瓦伦烯合酶多肽和SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶的酵母细胞并比较所产生的瓦伦烯的量来评估所述修饰的瓦伦烯合酶多肽产生的瓦伦烯的量。在一些实例中,所述修饰的瓦伦烯合酶从FPP产生的瓦伦烯的量比SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶从FPP产生的瓦伦烯的量多至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、250%、300%、350%、400%、500%或更多。在另外的实例中,所述修饰的瓦伦烯合酶从FPP产生的瓦伦烯的量比SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶从FPP产生的瓦伦烯的量多10%至500%、10%至250%、50%至250%、100%至500%或100%至250%。本文提供的(例如下面描述的和实施例中的)示例性的修饰的瓦伦烯合酶多肽产生增加的瓦伦烯。
在一些方面,本文提供的核酸分子所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽在酵母细胞培养基中产生至少或约0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L1.0g/L、1.1g/L、1.2g/L、1.3g/L、1.4g/L、1.5g/L、2.0g/L、2.5g/L、3.0g/L、3.5g/L、4.0g/L、4.5g/L、5.0g/L或更多的瓦伦烯。在另一些方面,本文提供的核酸分子所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽在酵母细胞培养基中产生0.1g/L-5.0g/L、0.1g/L-3.0g/L、0.5g/L-5.0g/L、1.0g/L-5.0g/L或1.0-3.0g/L的瓦伦烯。在此类实例中,通过大规模发酵方法产生瓦伦烯。了解微量培养或摇瓶(如50mL)或其它较小规模的生产方法在产生增加的瓦伦烯时,通常产生10mg/L-1000mg/L或约10mg/L-1000mg/L,例如50-60mg/L或600-800mg/L的量的瓦伦烯。
本文提供编码修饰的瓦伦烯合酶多肽的核酸分子,其中所述修饰的瓦伦烯合酶多肽在瓦伦烯合酶多肽中选自相应于CVS编号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、50、53、54、55、56、57、58、60、62、69、77、78、82、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、111、113、114、116、117、118、120、121、122、124、125、127、129、130、132、135、136、138、139、141、142、144、146、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、162、163、165、166、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、186、187、188、189、190、191、193、194、195、196、197、198、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、227、228、229、238、252、257、263、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、305、306、307、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、329、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、375、377、378、380、381、382、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、422、423、424、428、429、434、435、436、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、451、452、454、457、465、468、473、474、484、492、495、496、499、500、501、506、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、536和539位的位置处包含至少一个氨基酸修饰,所述CVS编号参考SEQ ID NO:2所示氨基酸位置。
在一具体实施方案中,本文提供的核酸分子编码修饰的瓦伦烯合酶多肽,所述修饰的瓦伦烯合酶多肽具有至少一个修饰,所述修饰是选自相应于CVS编号M1T、S2R、S2K、S2E、S2Q、S2P、S2T、S2L、S2H、S2A、S2V、S3D、S3R、S3G、S3I、S3E、S3V、S3A、S3T、S3L、S3M、S3N、G4K、G4V、G4N、G4I、G4R、G4S、G4P、G4A、G4E、G4F、G4C、G4T、G4L、G4Q、E5A、E5G、E5S、E5T、E5D、E5H、E5I、E5P、E5L、E5N、E5V、T6R、T6V、T6D、T6L、T6A、T6E、T6K、T6S、T6G、T6C、T6M、T6Y、F7C、F7A、F7Q、F7K、F7S、F7G、F7T、F7L、F7R、F7P、F7N、T10V、A11T、D12N、S16N、L17I、R19K、R19P、R19G、N20D、H21Q、L23S、L23I、K24A、K24Q、K24Y、K24T、G25Y、A26T、S27P、D28G、D28E、F29D、D33T、H34R、T35A、A36C、T37K、Q38V、Q38A、Q38N、Q38E、R40Q、H41I、R50G、T53L、T53R、D54A、D54P、D54C、A55T、A55P、A55R、A55V、A55Q、E56G、E56P、E56F、E56A、E56T、E56Q、D57R、D57P、D57S、D57Q、D57A、K58Q、K58R、K58P、K58E、K58A、V60I、V60G、K62R、V69I、F78L、I82V、A85M、I86L、Q87D、K88Q、K88A、K88H、L89I、C90Y、P91N、I92Y、I92N、I92S、Y93H、Y93F、Y93F、I94E、I94H、D95A、S96H、S96C、N97D、N97E、R98K、R98Y、R98D、A99N、A99M、H102Y、L106A、L106S、L106K、L106F、L111S、Q113R、I166Y、K117T、V122I、E124N、K125A、K125Q、K127T、D129E、E130R、R132G、、S135E、S136A、N139S、Q142R、S146G、Y152H、M153N、M153G、H159Q、H159K、H159R、E163D、K173E、K173Q、K173A、Q178A、D179P、V181L、T182K、P183S、K184R、K184P、Q188R、I189A、I189V、I189P、T200Q、P202S、F209I、F209H、F209E、F209L、F209T、M210T、M212R、M212D、M212N、M212S、M212A、M212Y、M212K、M212F、M212H、M212Q、M212I、M212S、M212V、I213Y、I213M、I213A、I213R、I213S、I213L、I213F、I213S、I213P、I213Q、I213N、I213K、I213V、I213Y、N214D、N214E、N214S、N214L、N214Y、N214V、N214P、N214H、N214C、N214A、N214T、N214R、N214Y、N214Q、S215H、S215G、S215K、S215R、S215P、S215A、S215N、S215T、S215L、S215V、S215Q、S215D、T216Q、T216Y、T216E、T216P、T216R、T216C、T216V、T216K、T216D、T216A、T216S、T216K、S217R、S217K、S217F、S217I、S217T、S217G、S217Y、S217N、S217H、S217E、S217F、S217C、S217E、S217D、D218I、D218G、D218V、D218C、D218P、D218M、D218R、D218L、D218S、D218A、D218Y、D218K、D218E、H219D、H219A、H219L、H219C、H219W、H219R、H219S、H219F、H219E、H219G、H219Q、H219A、L220V、L220S、L220T、L220P、L220M、L220A、L220H、L220E、L220G、L220D、L220F、Y221C、Y221V、Y221Q、Y221F、Y221S、Y221N,Y221T、Y221P、Y221L、Y221K、Y221W、Y221E、Y221V、Y221H、N227S、E238D、K252A、K252Q、T257A、D274M、D274N、D274S、D274F、D274G、D274H、D274E、F279S、F279I、F279P、F279D、F279L、F279N、F279M、F279H、F279C、F279A、F279G、F279W、E280L、P281S、P281H、P281K、P281A、P281W、P281L、P281Y、Q282L、Q282S、Q282A、Q282I、Q282R、Q282Y、Q282G、Q282W、Q282P、Q282E、Y283F、Y283N、A284T、A284G、A284P、A284V、A284R、A284D、A284E、A284S、A284H、A284K、A284I、A284W、A284M、Q292K、I299Y、Y307H、L310H、E311P、E311T、L313C、S314A、S314T、L315M、F316L、T317S、E318K、A319T、V320D、V320G、V320S、Q321A、W323R、N324S、I325T、E326K、E333D、K336R、L337I、L343V、A345V、A345T、N347L、N347S、E348A、E348S、E350K、G357R、H360L、H360A、C361R、V362A、E367G、N369I、Q370D、Q370H、Q370G、K371G、A375D、S377Y、Y387C、I397V、L399S、T405R、T409G、N410S、F424L、N429S、N429G、A436S、V439L、Q448L、C465S、K468Q、S473Y、K474T、E484D、I492V、E495G、K499E、P500L、T501P、P506S、D536E和A539V的氨基酸置换,所述CVS编号参考SEQ ID NO:2所示位置。
在一个实施方案中,本文提供的酸分子编码修饰的瓦伦烯合酶多肽,所述修饰的瓦伦烯合酶多肽具有至少一个修饰,所述修饰是氨基酸置换,并且至少一个氨基酸置换位于相应于CVS编号选自1、2、3、4、5、6、7、11、19、20、23、24、28、38、50、53、54、55、56、57、58、60、62、69、78、82、88、93、97、98、102、106、111、113、125、132、152、153、159、163、173、184、188、189、200、202、209、210、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、227、238、252、257、274、279、280、281、282、283、284、292、297、299、307、310、311、313、314、315、316、317、318、319、320、321、323、324、325、326、333、336、337、343、345、347、348、350、357、360、361、362、367、369、370、371、375、377、387、397、399、405、409、410、424、429、436、439、448、465、468、473、474、484、492、495、499、500、501、506、536和539位的位置,所述CVS编号参考SEQ ID NO:2所示位置。例如,所述修饰的瓦伦烯合酶多肽中的至少一个氨基酸置换可以选自相应于CVS编号M1T、S2R、S2K、S2E、S2Q、S2P、S2T、S2L、S2H、S2A、S2V、S3D、S3R、S3G、S3I、S3E、S3V、S3A、S3T、S3L、S3M、S3N、G4K、G4V、G4N、G4I、G4R、G4S、G4P、G4A、G4E、G4F、G4C、G4T、G4L、E5A、E5G、E5S、E5T、E5D、E5H、E5I、E5P、E5L、E5N、T6R、T6V、T6D、T6L、T6A、T6E、T6K、T6S、T6G、T6C、T6M、T6Y、F7C、F7A、F7Q、F7K、F7S、F7G、F7T、F7L、F7R、F7P、A11T、R19K、R19P、N20D、L23S、K24A、K24Q、K24Y、D28G、Q38V、Q38A、Q38N、R50G、T53L、T53R、D54A、D54P、D54C、A55T、A55P、A55R、A55V、A55Q、E56G、E56P、E56F、E56A、E56T、E56Q、D57R、D57P、D57S、D57Q、D57A、K58Q、K58R、K58P、K58E、K58A、V60I、V60G、K62R、V69I、F78L、I82V、K88Q、K88A、Y93H、N97D、R98K、H102Y、L106A、L106S、L106K、L106F、L111S、Q113R、K125A、K125Q、R132G、Y152H、M153N、M153G、H159Q、H159K、H159R、E163D、K173E、K173Q、K173A、K184R、Q188R、I189A、I189V、I189P、T200Q、P202S、F209I、F209H、F209E、F209L、F209T、M210T、M212R、M212D、M212N、M212S、M212A、M212Y、M212K、M212F、M212H、M212Q、I213Y、I213M、I213A、I213R、I213S、I213L、I213F、I213S、I213P、I213Q、I213N、I213K、I213V、N214D、N214E、N214S、N214L、N214Y、N214V、N214P、N214H、N214C、N214A、N214T、N214R、S215H、S215G、S215K、S215R、S215P、S215A、S215N、S215T、S215L、S215V、S215Q、T216Q、T216Y、T216E、T216P、T216R、T216C、T216V、T216K、T216D、T216A、T216S、S217R、S217K、S217F、S217I、S217T、S217G、S217Y、S217N、S217H、S217E、S217F、S217C、D218I、D218G、D218V、D218C、D218P、D218M、D218R、D218L、D218S、D218A、D218Y、D218K、H219D、H219A、H219L、H219C、H219W、H219R、H219S、H219F、H219E、L220V、L220S、L220T、L220P、L220M、L220A、L220H、L220E、L220G、L220D、Y221C、Y221V、Y221Q、Y221F、Y221S、Y221N,Y221T、Y221P、Y221L、Y221K、Y221W、Y221E、Y221V、N227S、E238D、K252A、K252Q、T257A、D274M、D274N、D274S、D274F、D274G、D274H、D274E、F279S、F279I、F279P、F279D、F279L、F279N、F279M、F279H、F279C、F279A、F279G、F279W、E280L、P281S、P281H、P281K、P281A、P281W、P281L、P281Y、Q282L、Q282S、Q282A、Q282I、Q282R、Q282Y、Q282G、Q282W、Q282P、Q282E、Y283F、Y283N、A284T、A284G、A284P、A284V、A284R、A284D、A284E、A284S、A284H、A284K、A284I、A284W、A284M、Q292K、I299Y、Y307H、L310H、E311P、E311T、L313C、S314A、S314T、L315M、F316L、T317S、E318K、A319T、V320D、V320G、V320S、Q321A、W323R、N324S、I325T、E326K、E333D、K336R、L337I、L343V、A345V、A345T、N347L、N347S、E348A、E348S、E350K、G357R、H360L、H360A、C361R、V362A、E367G、N369I、Q370D、Q370H、Q370G、K371G、A375D、S377Y、Y387C、I397V、L399S、T405R、T409G、N410S、F424L、N429S、N429G、A436S、V439L、Q448L、C465S、K468Q、S473Y、K474T、E484D、I492V、E495G、K499E、P500L、T501P、P506S、D536E和A539V的氨基酸置换,所述CVS编号参考SEQID NO:2所示位置。
在另一实施方案中,由本文提供的核酸分子编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽在相应于选自60、97、209、212、214、221、238、292、333、345、369、405、429、473和/或536位的位置处包含氨基酸置换,所述编号为相对于SEQ ID NO:2所示瓦伦烯合酶多肽的编号;例如,所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽包含选自的CVS编号V60I、V60G、N97D、F209I、F209H、F209E、F209L、F209T、M212R、M212D、M212N、M212S、M212A、M212Y、M212K、M212F、M212H、M212Q、N214D、N214E、N214S、N214L、N214Y、N214V、N214P、N214H、N214C、N214A、N214T、N214R、Y221C、Y221V、Y221Q、Y221F、Y221S、Y221N、Y221T、Y221P、Y221L、Y221K、Y221W、Y221E、Y221V、E238D、Q292K、E333D、A345V、A345T、N369I、T405R、N429S、N429G、S473Y、和/或D536E的氨基酸置换,所述的CVS编号参考SEQ ID NO:2所示位置。
本文提供的核酸分子包括那些编码修饰的瓦伦烯合酶多肽的核酸分子,所述修饰的瓦伦烯合酶多肽含有选自相应于CVS编号N214D/S473Y;T405R;A345V/D536E;Y221C;E238D;F209I;N97D;E333D/N369I;N214D/T405R;N214D/A345V/T405R/D536E;V60I/N214D/A345T/T405R;N214D/T405R/N429S;N214D/Q292K/T405R;V60G/N214D/T405R;V60I/N214D/A345T/T405R/N429S;V60I/M212R/N214D/Y221V/A345T/T405R/N429G的氨基酸置换,所述CVS编号具有相对于SEQ ID NO:2所示位置的编号。
在一些实例中,本文提供的核酸分子编码修饰的瓦伦烯合酶,所述修饰的瓦伦烯合酶在相应于CVS编号60、209、238和292位的位置处具有氨基酸置换,所述CVS编号具有相对于SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶的位置。例如,所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽含有在位置V60的置换V60I或V60G;在位置F209的置换F209I、F209H、F209E、F209L或F209T;在位置E238的置换E238D;以及在位置Q292的置换Q292K,各自为具有相对于SEQ ID NO:2的编号的CVS编号。
在一些实例中,本文提供的核酸分子编码修饰的瓦伦烯合酶,所述修饰的瓦伦烯合酶在相应于60、125、173、209、238、252和292位的位置处具有氨基酸置换,所述编号是具有相对于SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶的位置的编号的CVS编号。例如,所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽含有在位置V60的置换V60I或V60G;在位置K125的置换K125A或K125Q;在位置K173的置换K173E、K173Q或K173A;在位置F209的置换F209I、F209H、F209E、F209L或F209T;在位置E238的置换E238D;在位置K252的置换K252Q;和在位置Q292的置换Q292K,各自为具有相对于SEQ ID NO:2位置的编号的CVS编号。
本文提供的核酸分子包括那些编码修饰的瓦伦烯合酶多肽的核酸分子,所述修饰的瓦伦烯合酶多肽含有氨基酸置换,所述氨基酸置换选自相应于:
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/Q292K/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/V320S/Q321A/E326K/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24A/Q38A/R50G/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/V320G/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/L315M/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/V320G/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/Q321A/E333D/A345T/G357R/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/Q321A/E333D/A345T/N369I/E367G/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/Q321A/E333D/A345T/N369I/Q370D/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/I299Y/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/Q321A/E333D/A345T/H360L/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/T317S/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/V320D/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24A/Q38V/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/T409G/N429G/A436S/E495G/T501P/D536E;
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/P281S/Q292K/Q321A/E333D/L337I/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/Q321A/E333D/A345T/N369I/A375D/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/Q321A/E333D/K336R/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/E311P/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/Q321A/E333D/A345T/N369I/Q370H/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/Q321A/E333D/L343V/A345T/H360A/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q282S/Q292K/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/Q321A/E333D/A345T/N369I/K371G/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/Q321A/E333D/A345T/N347L/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/E311T/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q282L/Q292K/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/S314T/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/Q321A/E333D/A345T/N369I/Q370G/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/L310H/Q321A/E333D/A345T/V362A/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24A/Q38A/K58A/V60I/F78L/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/L313C/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/P281S/Q292K/I299Y/L310H/E311P/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/P281S/Q282L/Q292K/L310H/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/P281S/Q282L/Q292K/I299Y/E311P/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/P281S/Q292K/L313C/S314T/L315M/T317S/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/P281S/Q292K/Q321A/E333D/K336R/A345T/N347L/G357R/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/Q292K/L310H/E311T/L313C/S314T/L315M/T317S/V320G/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
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S2R/S3V/G4I/E5D/T6G/F7G/K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/Q292K/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/L106A/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/Q292K/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/L106S/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/Q292K/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/L106K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/Q292K/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24Q/Q38N/T53L/D54A/A55P/E56P/D57P/K58R/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/Q292K/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
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K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/H219A/Y221V/E238D/K252Q/Q292K/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
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K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/M153N/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/Q292K/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/K474T/T501P/D536E;
K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/H159R/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/Q292K/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/H159K/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/Q292K/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/I189P/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/Q292K/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24Q/Q38N/T53L/D54P/A55R/E56F/D57S/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252QQ292K/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24Q/Q38N/D54A/A55V/E56A/D57Q/K58P/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/L106F/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/Q292K/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24Q/Q38N/T53R/D54A/A55Q/E56T/D57A/K58R/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/Q292K/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24Q/Q38N/T53R/D54C/A55V/E56Q/D57P/K58E/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/Q292K/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/R132G/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/Q292K/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/H159Q/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/Q292K/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/M153G/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/Q292K/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/Q292K/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/I397V/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/I189A/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/Q292K/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/Q292K/L310H/E311P/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212N/I213Y/N214L/S215R/T216R/S217I/D218P/H219A/L220D/Y221S/E238D/K252Q/P281S/Q292K/L313C/S314T/L315M/T317S/Q321A/E333D/K336R/L337I/A345T/G357R/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/Q113R/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212D/I213Y/N214E/S215H/T216Q/D218I/H219L/L220V/Y221Q/E238D/K252Q/P281S/Q292K/L313C/S314T/L315M/T317S/Q321A/E333D/K336R/L337I/A345T/G357R/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212S/I213L/N214E/S215P/T216P/S217F/D218M/L220P/Y221C/E238D/K252Q/Q292K/L313C/S314T/L315M/T317S/Q321A/E333D/K336R/L337I/A345T/G357R/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212A/N214Y/S215A/T216R/S217T/D218G/H219R/L220M/Y221N/E238D/K252Q/Q292K/L313C/S314T/L315M/T317S/Q321A/E333D/K336R/L337I/A345T/G357R/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212N/I213M/N214S/T216Y/S217R/D218G/H219C/L220S/Y221V/E238D/K252Q/P281S/Q292K/L313C/S314T/L315M/T317S/A319T/Q321A/E333D/K336R/L337I/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212D/I213A/S215G/T216E/S217K/D218V/H219L/L220S/Y221F/E238D/K252Q/P281S/Q292K/L313C/S314T/L315M/T317S/Q321A/E333D/K336R/L337I/A345T/G357R/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212S/I213R/N214S/S215K/T216P/S217F/D218C/H219W/L220T/Y221S/E238D/K252Q/Q292K/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;和
K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209H/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/P281S/Q292K/L313C/S314T/L315M/T317S/Q321A/E333D/K336R/L337I/A345T/G357R/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E的置换,各自具有相对于SEQ ID NO:2所示位置的编号。
本文提供了具有SEQ ID NO:128-202、204-288、693-701、704-712、716-722、754-775和800任一所示核酸序列的核酸分子。本文还提供了具有与SEQ ID NO:128-202、204-288、693-701、704-712、716-722、754-775和800任一所示核酸序列具有至少95%相同性的核酸序列的核酸分子。本文还提供了具有与SEQ ID NO:128-202、204-288、693-701、704-712、716-722、754-775和800任一所示核酸序列简并的核酸序列的核酸分子。例如,所述核酸分子具有SEQ ID NO:128-202、204-288、693-701、704-712、716-722、754-775和800任一所示的核酸序列。
本文提供了编码修饰的瓦伦烯合酶的核酸分子,所述修饰的瓦伦烯合酶具有SEQID NO:3-66、68-127、723-731、734-742、746-751、810-832和857任一所示的氨基酸序列。本文还提供了编码修饰的瓦伦烯合酶的核酸分子,所述修饰的瓦伦烯合酶具有与SEQ ID NO:3-66、68-127、723-731、734-742、746-751、810-832和857任一所示氨基酸序列具有至少95%序列相同性的氨基酸序列。例如,所述核酸分子编码修饰的瓦伦烯合酶,所述修饰的瓦伦烯合酶具有SEQ ID NO:3-66、68-127、723-731、734-742、746-751、810-832和857任一所示的氨基酸序列。
本文还提供编码修饰的瓦伦烯合酶多肽的核酸分子,所述修饰的瓦伦烯合酶多肽包含一或多个来自一或多种萜烯合酶的异源结构域或其部分,其中所述结构域是无结构环1;α螺旋1;无结构环2;α螺旋2;无结构环3;α螺旋3;无结构环4;α螺旋4;无结构环5;α螺旋5;无结构环6;α螺旋6;无结构环7;α螺旋7;无结构环8;α螺旋8;无结构环9;α螺旋A;A-C环;α螺旋C;无结构环11;α螺旋D;无结构环12;α螺旋D1;无结构环13;α螺旋D2;无结构环14;α螺旋E;无结构环15;α螺旋F;无结构环16;α螺旋G1;无结构环17;α螺旋G2;无结构环18;α螺旋H1;无结构环19;α螺旋H2;无结构环20;α螺旋H3;无结构环21;α螺旋a-1;无结构环22;α螺旋I;无结构环23;α螺旋J;J-K环;α螺旋K;和/或无结构环25。
本文还提供编码修饰的瓦伦烯合酶多肽的核酸分子,所述修饰的瓦伦烯合酶多肽含有一或多个来自一或多种萜烯合酶的异源结构域或其部分。例如,所述一或多个异源结构域可以选自无结构环1;α螺旋1;无结构环2;α螺旋2;无结构环3;α螺旋3;无结构环4;α螺旋4;无结构环5;α螺旋5;无结构环6;α螺旋6;无结构环7;α螺旋7;无结构环8;α螺旋8;无结构环9;α螺旋A;A-C环;α螺旋C;无结构环11;α螺旋D;无结构环12;α螺旋D1;无结构环13;α螺旋D2;无结构环14;α螺旋E;无结构环15;α螺旋F;无结构环16;α螺旋G1;无结构环17;α螺旋G2;无结构环18;α螺旋H1;无结构环19;α螺旋H2;无结构环20;α螺旋H3;无结构环21;α螺旋a-1;无结构环22;α螺旋I;无结构环23;α螺旋J;J-K环;α螺旋K;和/或无结构环25。在一些实例中,所述异源结构域或其连续部分置换不含所述异源结构域的瓦伦烯合酶的相应天然结构域的全部或连续部分。在另一些实例中,所编码的修饰的瓦伦烯合酶不同的萜烯合酶的异源结构域的全部。本文还提供了编码修饰的瓦伦烯合酶多肽的核酸分子,所述修饰的瓦伦烯合酶多肽含有来自一或多种萜烯合酶的异源结构域的至少50%、60%、70%、80%、90%、或95%的连续氨基酸。
在一个实施方案中,由所述核酸分子编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽含有异源结构域,其是无结构环2结构域的全部或连续的部分。例如,所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽含有异源无结构环2结构域或其连续的部分,其中相应于SEQ ID NO:2所示瓦伦烯合酶53-58位氨基酸残基的天然无结构环2结构域被来自不同的萜烯合酶的相应区域的全部或部分置换。在另一个实施方案中,由所述核酸分子编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽含有异源结构院,其是α螺旋3结构域的全部或连续的部分。例如,所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽含有异源α螺旋3结构域或其连续的部分,其中相应于SEQ IDNO:2所示瓦伦烯合酶79-93位氨基酸残基的天然无结构环3结构域被来自不同的萜烯合酶的相应区域的全部或部分置换。在另一个实施方案中,由所述核酸分子编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽含有异源结构院,其是无结构环5结构域的全部或连续的部分。例如,所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽含有无结构环5结构域或其连续的部分,其中相应于SEQ ID NO:2所示瓦伦烯合酶115-141位氨基酸残基的天然无结构环5结构域被来自不同的萜烯合酶的相应区域的全部或部分置换。
在仍另一个实施方案中,由所述核酸分子编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽含有异源结构院,其是无结构环6结构域的全部或连续的部分。例如,所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽含有异源无结构环6结构域或其连续的部分,其中相应于SEQ ID NO:6所示瓦伦烯合酶153-162位氨基酸残基的天然无结构环2结构域被来自不同的萜烯合酶的相应区域的全部或部分置换。在一个实施方案中,由所述核酸分子编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽含有异源结构院,其是无结构环7结构域的全部或连续的部分。例如,所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽含有异源无结构环7结构域或其连续的部分,其中相应于SEQ ID NO:2所示瓦伦烯合酶174-184位氨基酸残基的天然无结构环7结构域被来自不同的萜烯合酶的相应区域的全部或部分置换。
在另一个实施方案中,由所述核酸分子编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽含有异源结构院,其是无结构环9结构域的全部或连续的部分。例如,所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽含有异源无结构环9结构域或其连续的部分,其中相应于SEQ ID NO:2所示瓦伦烯合酶213-222位氨基酸残基的天然无结构环9结构域被来自不同的萜烯合酶的相应区域的全部或部分置换。在另一个实施方案中,由所述核酸分子编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽含有异源结构院,其是α螺旋D1结构域的全部或连续的部分。例如,所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽含有异源α螺旋D1结构域或其连续的部分,其中相应于SEQID NO:2所示瓦伦烯合酶310-322位氨基酸残基的天然α螺旋D1结构域被来自不同的萜烯合酶的相应区域的全部或部分置换。
在仍另一个实施方案中,由所述核酸分子编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽含有异源结构院,其是J-K环结构域的全部或连续的部分。例如,所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽含有异源J-K环结构域或其连续的部分,其中相应于SEQ ID NO:2所示瓦伦烯合酶522-534位氨基酸残基的天然无结构环7结构域被来自不同的萜烯合酶的相应区域的全部或部分置换。在另一个实施方案中,由所述核酸分子编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽含有异源结构院,其是无结构环1结构域的全部或连续的部分。例如,所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽含有异源无结构环1结构域或其连续的部分,其中相应于SEQ IDNO:2所示瓦伦烯合酶1-29位氨基酸残基的天然无结构环1结构域被来自不同的萜烯合酶的相应区域的全部或部分置换。
在另一个实施方案中,由所述核酸分子编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽含有异源结构院,其是α螺旋1结构域的全部或连续的部分。例如,所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽含有异源α螺旋1结构域或其连续的部分,其中相应于SEQ ID NO:2所示瓦伦烯合酶30-39位和44-52位氨基酸残基的天然α螺旋1结构域被来自不同的萜烯合酶的相应区域的全部或部分置换。在另一个实施方案中,由所述核酸分子编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽含有异源结构院,其是无结构环4结构域的全部或连续的部分。例如,所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽含有异源无结构环4结构域或其连续的部分,其中相应于SEQ ID NO:2所示瓦伦烯合酶94-100位氨基酸残基的天然无结构环4结构域被来自不同的萜烯合酶的相应区域的全部或部分置换。
本文提供的是编码修饰的瓦伦烯合酶多肽的核酸分子,所述修饰的瓦伦烯合酶多肽含有一或多个来自一或多种萜烯合酶的异源结构域或其部分,其中所述不同的萜烯合酶是表5B所示的萜烯合酶。在一实例中,所述不同的萜烯合酶选自葡萄(Vitisvinifera)瓦伦烯合酶、烟草epi-aristolochene合酶(TEAS)和埃及莨菪(Hyoscyamusmuticus)premnaspirodiene合酶(HPS)。
在一个实施方案中,所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽具有异源无结构环2结构域或其连续部分,其中相应于SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶多肽的53-58位的氨基酸残基被SEQ ID NO:295或941所示的TEAS多肽的58-63位氨基酸残基置换。在另一个实施方案中,所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽具有异源α螺旋3结构域或其连续部分和异源无结构环4结构域或其连续部分,其中相应于SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶多肽的85-89位的氨基酸残基被SEQ ID NO:942所示的HPS多肽的93-97位氨基酸残基置换。在另一个实施方案中,所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽具有异源α螺旋3结构域或其连续部分和异源无结构环4结构域或其连续部分,其中相应于SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶多肽的85-99位的氨基酸残基被SEQ ID NO:346所示的葡萄瓦伦烯合酶的96-112位氨基酸残基置换。在另一个实施方案中,所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽具有异源无结构环5结构域或其连续部分,其中相应于所述瓦伦烯合酶多肽的115-146位的氨基酸残基被SEQ ID NO:346所示的葡萄瓦伦烯合酶的128-129位氨基酸残基置换。
在另一个实施方案中,所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽具有异源无结构环7结构域或其连续部分,其中相应于SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶多肽的174-184位的氨基酸残基被SEQ ID NO:942所示的HPS多肽的185-193位氨基酸残基置换。在另一个实施方案中,所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽具有异源无结构环9结构域或其连续部分,其中相应于SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶多肽的212-221位的氨基酸残基被SEQ ID NO:942所示的HPS多肽的221-228位氨基酸残基置换。在仍另一个实施方案中,所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽具有异源无结构环9结构域或其连续部分,其中相应于SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶多肽的212-221位的氨基酸残基被SEQ IDNO:295所示的TEAS多肽的213-221位氨基酸残基置换。
在一个实施方案中,所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽具有异源无结构环9结构域或其连续部分,其中相应于SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶多肽的212-221位的氨基酸残基被SEQ ID NO:346所示的葡萄瓦伦烯合酶的223-230位氨基酸残基置换。在另一个实施方案中,所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽具有异源无结构环1结构域或其连续部分和异源α螺旋1结构域或其连续部分,其中相应于SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶多肽的3-41位的氨基酸残基被SEQ ID NO:346所示的葡萄瓦伦烯合酶的3-51位氨基酸残基置换。在仍另一个实施方案中,所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽具有异源无结构环6结构域或其连续部分,其中相应于SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶多肽的152-163位的氨基酸残基被SEQ ID NO:942所示的HPS多肽的163-174位氨基酸残基置换。
在仍另一个实施方案中,所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽具有异源α螺旋D1结构域或其连续部分,其中相应于SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶多肽的310-322位的氨基酸残基被SEQ ID NO:942所示的HPS多肽的317-329位氨基酸残基置换。在另一个实施方案中,所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽具有异源J-K环结构域或其连续部分,其中相应于SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶多肽的522-534位的氨基酸残基被SEQ IDNO:942所示的HPS多肽的527-541位氨基酸残基置换。
本文提供的核酸分子包括那些编码修饰的瓦伦烯合酶多肽的核酸分子,所述修饰的瓦伦烯合酶多肽含有选自相应于以下修饰的置换:
K24Q/Q38N/T53L/D54A/A55T/E56G/D57R/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/Q292K/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24Q/Q38N/T53L/D54A/A55T/E56G/D57R/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/P281S/Q292K/L313C/S314T/L315M/T317S/Q321A/E333D/K336R/L337I/A345T/N347L/G357R/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24Q/Q38N/T53L/D54A/A55T/E56G/D57R/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/P281S/Q292K/L313C/S314T/L315M/T317S/Q321A/E333D/K336R/L337I/A345T/G357R/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/
L175→---/V176→---/Q178→A176/D179→P177/V181→L179/T182→K180/P183→S181/K184→P182/F209→I207/M212→R210/N214→D212/H219→D217/Y221→V219/E238→D236/K252→Q250/P281→S279/Q292→K290/L313→C311/S314→T312/L315→M313/T317→S315/Q321→A319/E333→D331/K336→R334/L337→I335/A345→T343/G357→R355/N369→I367/S377→Y375/T405→R403/N429→G427/A436→S434/T501→P499/D536→E534;
S2R/S3D/G4K/E5G/F7C/K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/L175→---/V176→---/Q178→A176/D179→P177/V181→L179/T182→K180/P183→S181/K184→P182/F209→I207/M212→R210/N214→D212/H219→D217/Y221→V219/E238→D236/K252→Q250/P281→S279/Q292→K290/L313→C311/S314→T312/L315→M313/T317→S315/Q321→A319/E333→D331/K336→R334/L337→I335/A345→T343/G357→R355/N369→I367/S377→Y375/T405→R403/N429→G427/A436→S434/E484→D482/T501→P499/D536→E534;
K24Q/Q38N/T53L/D54A/A55T/E56G/D57R/V60I/A85M/I86L/Q87D/K88H/L89I/C90Y/---→R91/---→A92/---→D93/I92→Y95/Y93→F96/I94→E97/D95→A98/S96→H99/N97→E100/R98→Y101/A99→N102/L111→S114/K125→Q128/K173→Q176/L175→---/V176→---/Q178→A179/D179→P180/V181→L182/T182→K183/P183→S184/K184→P185/F209→I210/M212→R213/N214→D215/H219→D220/Y221→V222/E238→D239/K252→Q253/P281→S282/Q292→K293/L313→C314/S314→T315/L315→M316/T317→S318/Q321→A322/E333→D334/K336→R337/L337→I338/A345→T346/G357→R358/N369→I370/S377→Y378/T405→R406/N429→G430/A436→S437/E484→D485/T501→P502/D536→E537;
R19K/K24Q/Q38N/T53L/D54A/A55T/E56G/D57R/V60I/A85M/I86L/Q87D/K88H/L89I/C90Y/---→R91/---→A92/---→D93/I92→Y95/Y93→F96/I94→E97/D95→A98/S96→H99/N97→E100/R98→Y101/A99→N102/K125→Q128/K173→Q176/L175→---/V176→---/Q178→A179/D179→P180/V181→L182/T182→K183/P183→S184/K184→P185/F209→I210/M212→R213/N214→D215/H219→D220/Y221→V222/E238→D239/K252→Q253/P281→S282/Q292→K293/L313→C314/S314→T315/L315→M316/T317→S318/Q321→A322/E333→D334/K336→R337/L337→I338/A345→T346/G357→R358/N369→I370/S377→Y378/T405→R406/N429→G430/A436→S437/E484→D485/T501→P502/D536→E537;
K24Q/Q38N/T53L/D54A/A55T/E56G/D57R/V60I/A85M/I86L/Q87D/K88H/L89I/C90Y/---→R91/---→A92/---→D93/I92→Y95/Y93→F96/I94→E97/D95→A98/S96→H99/N97→E100/R98→Y101/A99→N102/K125→Q128/K173→Q176/L175→---/V176→---/Q178→A179/D179→P180/V181→L182/T182→K183/P183→S184/K184→P185/F209→I210/M212→R213/N214→D215/H219→D220/Y221→V222/E238→D239/K252→Q253/P281→S282/Q292→K293/L313→C314/S314→T315/L315→M316/T317→S318/Q321→A322/E333→D334/K336→R337/L337→I338/A345→T346/G357→R358/N369→I370/S377→Y378/T405→R406/N429→G430/A436→S437/E484→D485/T501→P502/D536→E537;
K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212I/I213Y/N214E/S215→---/T216→---/S217→E215/D218→E216/H219→G217/L220→F218/Y221→K219/E238→D236/K252→Q250/P281→S279/Q292→K290/L313→C311/S314→T312/L315→M313/T317→S315/Q321→A319/E333→D331/K336→R334/L337→I335/A345→T343/G357→R355/N369→I367/S377→Y375/T405→R403/N429→G427/A436→S434/T501→P499/D536→E534;
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S3T/G4Q/E5V/---→S6/---→A7/---→S8/---→S9/---→L10/---→A11/---→Q12/---→I13/---→P14/---→Q15/---→P16/T6→K17/F7→N18/T10→V21/D12→N23/S16→N27/L17→I28/R19→G30/N20→D31/H21→Q32/L23→I34/K24→T35/G25→Y36/A26→T37/S27→P38/D28→E39/F29→D40/T31→---/D33→T43/H34→R44/T35→A45/A36→C46/T37→K47/Q38→E48/R40→Q50/H41→I51/T53→L63/D54→A64/A55→T65/E56→G66/D57→R67/V60→I70/I86→L96/K88→H98/L89→I99/P91→N101/I92→S102/Y93→F103/I94→H104/S96→C106/R98→D108/A99→M109/---→G111/---→D112/K125→Q137/K173→Q185/L175→---/V176→---/Q178→A188/D179→P189/V181→L191/T182→K192/P183→S193/K184→P194/F209→I219/M212→V222/I213→Y223/N214→---/S215→---/T216→Q224/S217→D225/D218→E226/H219→A227/L220→F228/Y221→H229/E238→D246/K252→Q260/P281→S289/Q292→K300/L313→C321/S314→T322/L315→M323/T317→S325/Q321→A329/E333→D341/K336→R344/L337→I345/A345→T353/G357→R365/N369→I377/S377→Y385/T405→R413/N429→G437/A436→S444/E484→D492/T501→P509/D536→E544;和
S3T/G4Q/E5V/---→S6/---→A7/---→S8/---→S9/---→L10/---→A11/---→Q12/---→I13/---→P14/---→Q15/---→P16/T6→K17/F7→N18/T10→V21/D12→N23/S16→N27/L17→I28/R19→G30/N20→D31/H21→Q32/L23→I34/K24→T35/G25→Y36/A26→T37/S27→P38/D28→E39/F29→D40/T31→---/D33→T43/H34→R44/T35→A45/A36→C46/T37→K47/Q38→E48/R40→Q50/H41→I51/T53→L63/D54→A64/A55→T65/E56→G66/D57→R67/V60→I70/A85→M95/I86→L96/Q87→D97/K88→H98/L89→I99/C90→Y100/---→R101/---→A102/---→D103/I92→Y105/Y93→F106/I94→E107/D95→A108/S96→H109/N97→E110/R98→Y111/A99→N112/K125→Q138/K173→Q186/L175→---/V176→---/Q178→A189/D179→P190/V181→L192/T182→K193/P183→S194/K184→P195/F209→I220/M212→V223/I213→Y224/N214→---/S215→---/T216→Q225/S217→D226/D218→E227/H219→A228/L220→F229/Y221→H230/E238→D247/K252→Q261/P281→S290/Q292→K301/L313→C322/S314→T323/L315→M324/T317→S326/Q321→A330/E333→D342/K336→R345/L337→I346/A345→T354/G357→R366/N369→I378/S377→Y386/T405→R414/N429→G438/A436→S445/E484→D493/T501→P510/D536→E545。
本文提供了核酸分子,其具有SEQ ID NO:203、352-353、702、703、713-715、776-799、801-809、891-894、896、945、947、949、951、953、955、957、959、961、963、965、967、969、971、973、975、977、979、981、983、985、987、989、991、993、995、997和999任一所示的核酸序列。本文提供了核酸分子,其具有与SEQ ID NO:203、352-353、702、703、713-715、776-799、801-809、891-894、896、945、947、949、951、953、955、957、959、961、963、965、967、969、971、973、975、977、979、981、983、985、987、989、991、993、995、997和999任一具有至少95%序列相同性的核酸序列。本文提供了核酸分子,其具有与SEQ ID NO:203、352-353、702、703、713-715、776-799、801-809、891-894、896、945、947、949、951、953、955、957、959、961、963、965、967、969、971、973、975、977、979、981、983、985、987、989、991、993、995、997和999任一简并的核酸序列。例如,本文提供了核酸分子,其具有SEQ ID NO:203、352-353、702、703、713-715、776-799、801-809、891-894、896、945、947、949、951、953、955、957、959、961、963、965、967、969、971、973、975、977、979、981、983、985、987、989、991、993、995、997和999任一所示的核酸序列。
本文提供了编码修饰的瓦伦烯合酶的核酸分子,所述修饰的瓦伦烯合酶具有SEQID NO:67、350、351、732-733、743-745、833-856、858-866、887-890和895任一所示的氨基酸序列。本文还提供了编码修饰的瓦伦烯合酶的核酸分子,所述修饰的瓦伦烯合酶具有与SEQ ID NO:67、350、351、732-733、743-745、833-856、858-866、887-890和895任一所示氨基酸序列具有至少95%序列相同性的氨基酸序列。例如,本文提供了编码修饰的瓦伦烯合酶的核酸分子,所述修饰的瓦伦烯合酶具有SEQ ID NO:67、350、351、732-733、743-745、833-856、858-866、887-890和895任一所示的氨基酸序列。
在一实例中,本文所提供的核酸分子能够编码修饰的瓦伦烯合酶,所述修饰的瓦伦烯合酶具有氨基酸置换,所述氨基酸置换选自K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/V320S/Q321A/E326K/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;和K24A/Q38A/R50G/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/V320G/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;和一或多个另外的氨基酸置换。
本文提供了编码修饰的瓦伦烯合酶多肽的核酸分子,其中未修饰的瓦伦烯合酶多肽具有SEQ ID NO:2-4、289-291、346、347、752、882和883任一所示的氨基酸序列。
本文提供了编码修饰的柑橘属瓦伦烯合酶的核酸分子,其中所述修饰的瓦伦烯合酶含有与柑橘属来源瓦伦烯合酶不同的氨基酸。在一些实例中,所述核酸编码修饰的葡萄柚或橙瓦伦烯合酶,其中所述修饰的瓦伦烯合酶含有与葡萄柚来源或橙来源瓦伦烯合酶不同的氨基酸。在一方面,所述柑橘属来源瓦伦烯合酶具有SEQ ID NO:2、289-291、752和886任一所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽是融合蛋白或嵌合蛋白。
在一些实施方案中,本文提供的核酸分子编码修饰的瓦伦烯合酶多肽,与SEQ IDNO:2所示的瓦伦烯合酶相比,所述修饰的瓦伦烯合酶多肽显示增加的催化活性。在另一些实施方案中,与SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶相比,所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽显示改变的底物特异性。在另一些实施方案中,与SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶相比,所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽显示改变的产物分布。
例如,如上所述,与表达SEQ ID NO:2所示的野生型瓦伦烯合酶的细胞相比,表达本文提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽的细胞产生增加的瓦伦烯。在一些实例中,与SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶在相同的宿主细胞产生的除瓦伦烯外的萜烯产物(如,萜烯副产物或由其衍生的产物)比例相比,本文提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽还产生降低比例的除瓦伦烯外的萜烯产物(如,萜烯副产物或由其衍生的产物),其中所述萜烯产物在产生FPP的宿主细胞中由所述合酶产生。例如,能够产生的除瓦伦烯外的萜烯产物包括但不限于β-芹子烯、τ-芹子烯、艾里莫芬酮、7-表-α-芹子烯、大根香叶烯A或β-榄香烯。例如,大根香叶烯A一起自发降解产物β-榄香烯检测,β-榄香烯是大根香叶烯A副产物经过热诱导重排形成β-榄香烯的产物。在具体的实例中,所述萜烯产物是β-榄香烯。例如,与由SEQ ID NO:2所示野生型瓦伦烯合酶产生的β-榄香烯相比,本文提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽产生95%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%或更低水平的β-榄香烯。所提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽产生的除瓦伦烯外的萜烯产物占总萜烯产物的百分比被降低0.01%至90%,如1%至80%,5%至80%,10%至60%或0.01%至20%。例如,除瓦伦烯外的萜烯产物占总萜烯产物的百分比被降低至少或至少约0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。示例性的此类核酸分子是编码修饰的瓦伦烯合酶多肽的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽在相应于281、313、314、315、317、336、337、347或357位的位置处包含氨基酸置换,所述编号为相对于SEQ ID NO:2所示瓦伦烯合酶多肽的CVS编号。例如所述氨基酸置换是P281S、P281H、P281K、P281A、P281W、P281L、P281Y、L313C、S314T、L315M、T317S、K336R、L337I、N347L、和/或G357R。在一些实例中,所述核酸分子编码修饰的瓦伦烯合酶多肽,所述修饰的瓦伦烯合酶多肽在相应于281、313、314、315、317、336、337和357位的位置处具有氨基酸置换,所述编号是相对于SEQ IDNO:2所示的瓦伦烯合酶的位置的编号。在另外的实例中,所述核酸分子还可以在347位含有氨基酸置换。例如,所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽包含置换P281S、L313C、S314T、L315M、T317S、K336R、L337I和G357。在另一实例中,所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽包含置换P281S、L313C、S314T、L315M、T317S、K336R、L337I、N347L和G357R。所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽还可以含有其他氨基酸置换,只要萜烯产物如β-榄香烯的产量被降低。
本文还提供了由本文提供的任意核酸分子编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽。
还提供了含有本文提供的所述核酸分子的载体。所述载体包括原核载体、病毒载体和真核载体,例如,酵母载体,包括酵母表达载体。提供了含有所述载体的细胞,包括原核细胞如细菌细胞,以及真核细胞,如酵母、昆虫、植物或哺乳动物细胞。在一实例中,所述细胞是酵母细胞例如酵母菌(Saccharomyces)属细胞或毕赤酵母(Pichia)属细胞。在一示例性实施方案中,所述酵母细胞是酿酒酵母细胞。在另一实例中,所述细胞是细菌细胞,例如,大肠杆菌细胞。本文提供的细胞产生FPP。在一具体实施方案中,所述细胞被修饰以比未修饰的细胞产生更多的FPP。例如,所述细胞在编码鲨烯合酶的基因中含有修饰,由此与未修饰的细胞相比,所述细胞中表达的鲨烯合酶的量或所述细胞中表达的鲨烯合酶的活性降低。本文还提供了表达修饰的瓦伦烯合酶多肽的细胞。本文还提供由本文提供的细胞产生的修饰的瓦伦烯合酶。
本文还提供含有本文提供的载体的转基因植物。在一些实例中,所述转基因植物是柑橘属植物。在另一些实例中,所述转基因植物是烟草。
本文提供用于产生修饰的瓦伦烯合酶多肽的方法,其中将本文提供的核酸分子或载体导入细胞中并在适于由所述核酸或载体编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽表达的条件下培养所述细胞。本文还提供用于产生修饰的瓦伦烯合酶多肽的方法,其中将本文提供的核酸分子或载体导入细胞中并在适于由所述核酸或载体编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽表达的条件下培养所述细胞,其中所述修饰的瓦伦烯合酶多肽被修饰。在一些实例中,所述修饰的瓦伦烯合酶多肽是分离的。
本文提供产生瓦伦烯的方法,其中使无环焦磷酸萜烯前体在适于瓦伦烯从所述无环焦磷酸萜烯前体形成的条件下,与任意本文提供的修饰的瓦伦烯合酶或由任意本文提供的核酸分子编码的任意修饰的瓦伦烯合酶接触。本文还提供产生瓦伦烯的方法,其中使无环焦磷酸萜烯前体在适于瓦伦烯从所述无环焦磷酸萜烯前体形成的条件下,与任意本文提供的修饰的瓦伦烯合酶或由任意本文提供的核酸分子编码的任意修饰的瓦伦烯合酶接触,
由此分离瓦伦烯。在一个实施方案中,使所述无环焦磷酸萜烯前体和所述修饰的瓦伦烯合酶多肽接触的步骤在体外或体内实现。本文提供的方法中使用的无环焦磷酸萜烯前体选自法尼基二磷酸(FPP)、香叶基二磷酸(GPP)和香叶基-香叶基二磷酸(GGPP)。在一具体实施方案中,所述无环焦磷酸萜烯前体是FPP。
本文提供了通过培养用本文提供的核酸分子或载体转化的细胞来产生瓦伦烯的方法,其中所述细胞产生无环焦磷酸萜烯前体,由所述核酸分子或载体编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽被表达,并且所述修饰的瓦伦烯合酶多肽催化从所述无环焦磷酸萜烯前体形成瓦伦烯。本文提供的方法中使用的无环焦磷酸萜烯前体选自法尼基二磷酸(FPP)、香叶基二磷酸(GPP)和香叶基-香叶基二磷酸(GGPP)。在一具体实施方案中,所述无环焦磷酸萜烯前体可以是FPP。在本文提供的方法中,所述细胞可选自细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。在一具体实施方案中,所述细胞是酵母细胞,其是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞。本文提供的细胞产生FPP。在一具体实施方案中,所述细胞被修饰以比未修饰的细胞产生更多的FPP。例如,所述细胞在编码鲨烯合酶的基因中含有修饰,由此与未修饰的细胞相比,所述细胞中表达的鲨烯合酶的量或所述细胞中表达的鲨烯合酶的活性降低。
在通过培养用本文提供的核酸分子或载体转化的细胞来产生瓦伦烯的方法的一个实施方案中,所产生的瓦伦烯的量大于用编码SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶的核酸转化的相同的宿主细胞类型在相同条件下产生的瓦伦烯的量。例如,所产生的瓦伦烯的量比SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶在相同条件下产生的瓦伦烯的量多至少或多约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、250%、300%、350%、400%、500%或更多。在另外的实例中,所产生的瓦伦烯的量比SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶产生的瓦伦烯的量多10%至500%、10%至250%、50%至250%、100%至500%或100%至250%。在另一实施方案中,在细胞培养上清液中的所产生的瓦伦烯的量是至少或约0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L1.0g/L、1.1g/L、1.2g/L、1.3g/L、1.4g/L、1.5g/L、2.0g/L、2.5g/L、3.0g/L、3.5g/L、4.0g/L、4.5g/L或5.0g/L;或在酵母细胞培养基中是0.1g/L至5.0g/L、0.1g/L至3.0g/L、0.5g/L至5.0g/L、1.0g/L至5.0g/L或1.0至3.0g/L。
在本文提供的方法的一个具体实施方案中,分离瓦伦烯。在另一实施方案中,瓦伦烯被氧化以产生诺卡酮。所述氧化可以通过生物合成或化学进行。在另一实施方案中,所述诺卡酮被分离。
本文提供了产生包含异源结构域的修饰的萜烯合酶的方法,其中第一萜烯合酶的结构域的全部或连续的部分用第二萜烯合酶相应结构域的全部或连续的部分置换,所述第一萜烯合酶和第二萜烯合酶的结构域或结构域连续部分的氨基酸序列至少有一个氨基酸残基不同,并且所述结构域选自无结构环1;α螺旋1;无结构环2;α螺旋2;无结构环3;α螺旋3;无结构环4;α螺旋4;无结构环5;α螺旋5;无结构环6;α螺旋6;无结构环7;α螺旋7;无结构环8;α螺旋8;无结构环9;α螺旋A;A-C环;α螺旋C;无结构环11;α螺旋D;无结构环12;α螺旋D1;无结构环13;α螺旋D2;无结构环14;α螺旋E;无结构环15;α螺旋F;无结构环16;α螺旋G1;无结构环17;α螺旋G2;无结构环18;α螺旋H1;无结构环19;α螺旋H2;无结构环20;α螺旋H3;无结构环21;α螺旋a-1;无结构环22;α螺旋I;无结构环23;α螺旋J;J-K环;α螺旋K;和/或无结构环25,且所述连续部分含有至少三个氨基酸残基,由此与所述第一萜烯合酶相比,所述修饰的萜烯合酶的特性被改变。例如,与所述第一萜烯合酶相比,所述修饰的萜烯合酶的特性被改善。
在所述方法的一个实施方案中,来自所述第一萜烯合酶的结构域的至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多个氨基酸残基被来自所述第二萜烯合酶相应结构域的3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多个残基置换。在一方面,来自所述第一萜烯合酶的结构域的全部氨基酸残基被来自所述第二萜烯合酶相应结构域的全部残基置换。
在本文提供的方法的一个实施方案中,无结构环1含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸1-29的氨基酸残基;α螺旋1含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸30-39和44-52的氨基酸残基;无结构环2含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸53-58的氨基酸残基;α螺旋2含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸59-71的氨基酸残基;无结构环3含有相应于SEQ IDNO:2氨基酸72-78的氨基酸残基;α螺旋3含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸79-93的氨基酸残基;无结构环4含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸94-100的氨基酸残基;α螺旋4含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸101-114的氨基酸残基;无结构环5含有相应于SEQID NO:2氨基酸115-141的氨基酸残基;α螺旋5含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸142-152的氨基酸残基;无结构环6含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸153-162的氨基酸残基;α螺旋6含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸163-173的氨基酸残基;无结构环7含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸174-184的氨基酸残基;α螺旋7含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸185-194的氨基酸残基;无结构环8含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸195-201的氨基酸残基;α螺旋8含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸202-212的氨基酸残基;无结构环9含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸213-222的氨基酸残基;α螺旋A含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸223-253的氨基酸残基;A-C环含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸254-266的氨基酸残基;α螺旋C含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸267-276的氨基酸残基;无结构环11含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸277-283的氨基酸残基;α螺旋D含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸284-305的氨基酸残基;无结构环12含有相应于SEQ IDNO:2氨基酸306-309的氨基酸残基;α螺旋D1含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸310-322的氨基酸残基;无结构环13含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸323-328的氨基酸残基;α螺旋D2含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸329的氨基酸残基;无结构环14含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸330-332的氨基酸残基;α螺旋E含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸333-351的氨基酸残基;无结构环15含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸352-362的氨基酸残基;α螺旋F含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸363-385的氨基酸残基;无结构环16含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸386-390的氨基酸残基;α螺旋G1含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸391-395的氨基酸残基;无结构环17含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸396-404的氨基酸残基;α螺旋G2含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸405-413的氨基酸残基;无结构环18含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸414-421的氨基酸残基;α螺旋H1含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸422-428的氨基酸残基;无结构环19含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸429-431的氨基酸残基;α螺旋H2含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸432-447的氨基酸残基;无结构环20含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸448-450的氨基酸残基;α螺旋H3含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸451-455的氨基酸残基;无结构环21含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸456-461的氨基酸残基;α螺旋a-1含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸462-470的氨基酸残基;无结构环22含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸471-473的氨基酸残基;α螺旋I含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸474-495的氨基酸残基;无结构环23含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸496-508的氨基酸残基;α螺旋J含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸509-521的氨基酸残基;J-K环含有相应于SEQ IDNO:2氨基酸522-534的氨基酸残基;α螺旋K含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸535-541的氨基酸残基;和无结构环25含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸542-548的氨基酸残基。
在所提供的方法的一个实施方案中,第一萜烯合酶的两个或更多个结构域的全部或连续的部分被第二萜烯合酶相应结构域的全部或连续的部分置换。在本文提供的方法中,所述第一萜烯合酶的所述结构域邻近的一或多个额外的残基被置换。例如,所述第一萜烯合酶的所述结构域邻近的至少或约1、2、3、4、5或更多个额外的残基被置换。
在本文提供的方法的一个实施方案中,第一萜烯合酶中相应于SEQ ID NO:2的氨基酸53-58的氨基酸被来自第二萜烯合酶的相应区域置换;在另一实施方案中,第一萜烯合酶中相应于SEQ ID NO:2的氨基酸85-99的氨基酸被来自第二萜烯合酶的相应区域置换;在另一实施方案中,第一萜烯合酶中相应于SEQ ID NO:2的氨基酸115-146的氨基酸被来自第二萜烯合酶的相应区域置换;在另一实施方案中,第一萜烯合酶中相应于SEQ ID NO:2的氨基酸153-162或152-163的氨基酸被来自第二萜烯合酶的相应区域置换;在另一实施方案中,第一萜烯合酶中相应于SEQ ID NO:2的氨基酸174-184的氨基酸被来自第二萜烯合酶的相应区域置换;在另一实施方案中,第一萜烯合酶中相应于SEQ ID NO:2的氨基酸212-222或221-222或213-222的氨基酸被来自第二萜烯合酶的相应区域置换;在一实施方案中,第一萜烯合酶中相应于SEQ ID NO:2的氨基酸310-322的氨基酸被来自第二萜烯合酶的相应区域置换;在另一实施方案中,第一萜烯合酶中相应于SEQ ID NO:2的氨基酸522-534的氨基酸被来自第二萜烯合酶的相应区域置换;在仍另一实施方案中,第一萜烯合酶中相应于SEQ ID NO:2的氨基酸53-58的氨基酸被SEQ ID NO:295或941所示的TEAS多肽的氨基酸58-63置换;
在所述方法的一个实施方案中,第一萜烯合酶中相应于SEQ ID NO:2的氨基酸85-89的氨基酸被SEQ ID NO:942所示的HPS多肽的氨基酸93-97置换;在另一实施方案中,第一萜烯合酶中相应于SEQ ID NO:2的氨基酸85-89的氨基酸被SEQ ID NO:346所示的葡萄瓦伦烯合酶的氨基酸96-113置换;在另一实施方案中,第一萜烯合酶中相应于SEQ ID NO:2的氨基酸115-146的氨基酸被SEQ ID NO:346所示的葡萄瓦伦烯合酶的氨基酸128-159置换;在仍另一实施方案中,第一萜烯合酶中相应于SEQ IDNO:2的氨基酸152-163的氨基酸被SEQ ID NO:942所示的HPS多肽的氨基酸163-174置换;在另一实施方案中,第一萜烯合酶中相应于SEQ ID NO:2的氨基酸174-184的氨基酸被SEQ ID NO:942所示的HPS多肽的氨基酸185-193置换;在仍另一实施方案中,第一萜烯合酶中相应于SEQ ID NO:2的氨基酸212-222或212-221的氨基酸被SEQ ID NO:942所示的HPS多肽的氨基酸221-228或221-229置换;
在所述方法的一个实施方案中,第一萜烯合酶中相应于SEQ ID NO:2的氨基酸310-322的氨基酸被SEQ ID NO:942所示的HPS多肽的氨基酸317-329置换;在另一实施方案中,第一萜烯合酶中相应于SEQ ID NO:2的氨基酸522-534的氨基酸被SEQ IDNO:942所示的HPS多肽的氨基酸527-541置换;在所述方法的仍另一实施方案中,第一萜烯合酶中相应于SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶多肽的氨基酸212-221或212-222的氨基酸被SEQ ID NO:295所示的TEAS多肽的氨基酸213-221置换;在所述方法的一个实施方案中,第一萜烯合酶中相应于SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶多肽的氨基酸212-221或212-222的氨基酸被SEQ ID NO:346所示的葡萄瓦伦烯合酶的氨基酸223-230置换;在所述方法的另一实施方案中,第一萜烯合酶中相应于SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶多肽的氨基酸3-41的氨基酸被SEQ ID NO:346所示的葡萄瓦伦烯合酶的氨基酸3-51置换。
在本文提供的方法的一个实施方案中,所述第一萜烯是倍半萜。在另一实施方案中,所述第二萜烯是倍半萜。例如,所述倍半萜可以选自瓦伦烯合酶、檀香烯合酶、TEAS和HPS。在一实例中,所述檀香烯合酶具有选自SEQ ID NO:481-485的氨基酸序列。在本文提供的方法的另一实施方案中,萜烯合酶的多个结构域被来自两种或更多种其它萜烯的相应结构域置换。
在本文提供的方法中,与所述第一萜烯合酶相比,所述修饰的萜烯合酶的特性被改善。例如,所述修饰的萜烯合酶与第一萜烯合酶相比改变的或改善的特性选自总萜烯产量、比萜烯产量、催化活性、产物分布和底物特异性。
本文还提供由本文提供的任意方法产生的修饰的瓦伦烯合酶。
附图简述
图1:图1是不同柑橘属瓦伦烯合酶(CVS)的比对,包括物种辩题和修饰的瓦伦烯合酶,包括来自甜橙(Citrus sinensis)(SEQ ID NO:2、289、886)和葡萄柚(Citrus xparadise)(SEQ ID NO:290、291、752)的柑橘属瓦伦烯合酶。还包括的是本文提供的含有氨基酸置换的修饰的瓦伦烯合酶(SEQ ID NO:3所示的V18,和SEQ ID NO:4所示的V19)。“*”表示该列的残基或核苷酸在比对中的全部序列式相同的,“:”表示观察到保守的取代,以及“.”表示观察到半保守取代。如本文描述以及在图4中,相应于SEQ IDNO:2中的位置的残基可以基于CVS编号表示为在相关或变体合酶间的对齐位置出现的残基。
图2:图2是鉴定示例性合酶间相对于SEQ ID NO:2所示的柑橘属瓦伦烯合酶的相应的区域的比对(例如来自葡萄的SEQ ID NO:346所示的瓦伦烯合酶;5-epi-aristolochene合酶(TEAS),来自烟草(Nicotiana tabacum),示于SEQ ID NO:941;和premnaspirodiene合酶(HPS),来自埃及莨菪(Hyoscyamus muticus),示于SEQ IDNO:942)。该比对显示结构性结构域,包括无结构环1(UL1;相应于SEQ ID NO:2的氨基酸1-29);α螺旋1(AH1;相应于SEQ ID NO:2的氨基酸30-39和44-52);无结构环2(UL2;相应于SEQ ID NO:2的氨基酸53-58);α螺旋2(AH2;相应于SEQ IDNO:2的氨基酸59-71);无结构环3(UL3;相应于SEQ ID NO:2的氨基酸72-78);α螺旋3(AH3;相应于SEQ ID NO:2的氨基酸79-93);无结构环4(UL4;相应于SEQ IDNO:2的氨基酸94-100);α螺旋4(AH4;相应于SEQ ID NO:2的氨基酸101-114);无结构环5(UL5;相应于SEQ ID NO:2的氨基酸115-141);α螺旋5(AH5;相应于SEQ ID NO:2的氨基酸142-152);无结构环6(UL6;相应于SEQ ID NO:2的氨基酸153-162);α螺旋6(AH6;相应于SEQ ID NO:2的氨基酸163-173);无结构环7(UL7;相应于SEQ ID NO:2的氨基酸174-184);α螺旋7(AH7;相应于SEQ ID NO:2的氨基酸185-194);无结构环8(UL8;相应于SEQ ID NO:2的氨基酸195-201);α螺旋8(AH8;相应于SEQ ID NO:2的氨基酸202-212);无结构环9(UL9;相应于SEQ IDNO:2的氨基酸213-222);α螺旋A(AH A;相应于SEQ ID NO:2的氨基酸223-253);A-C环(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸254-266);α螺旋C(AH C;相应于SEQ ID NO:2的氨基酸267-276);无结构环11(UL11;相应于SEQ ID NO:2的氨基酸277-283);α螺旋D(AH D;相应于SEQ ID NO:2的氨基酸284-305);无结构环12(UL12;相应于SEQ ID NO:2的氨基酸306-309);α螺旋D1(AH D1;相应于SEQ ID NO:2的氨基酸310-322);无结构环13(UL13;相应于SEQ ID NO:2的氨基酸323-328);α螺旋D2(AH D2;相应于SEQ ID NO:2的氨基酸329);无结构环14(UL14;相应于SEQ IDNO:2的氨基酸330-332);α螺旋E(AH E;相应于SEQ ID NO:2的氨基酸333-351);无结构环15(UL15;相应于SEQ ID NO:2的氨基酸352-362);α螺旋F(AH F;相应于SEQ ID NO:2的氨基酸363-385);无结构环16(UL16;相应于SEQ ID NO:2的氨基酸386-390);α螺旋G1(AH G1;相应于SEQ ID NO:2的氨基酸391-395);无结构环17(UL17;相应于SEQ ID NO:2的氨基酸396-404);α螺旋G2(AH G2;相应于SEQID NO:2的氨基酸405-413);无结构环18(UL18;相应于SEQ ID NO:2的氨基酸414-421);α螺旋H1(AH H1;相应于SEQ ID NO:2的氨基酸422-428);无结构环19(UL19;相应于SEQ ID NO:2的氨基酸429-431);α螺旋H2(AH H2;相应于SEQ ID NO:2的氨基酸432-447);无结构环20(UL20;相应于SEQ ID NO:2的氨基酸448-450);α螺旋H3(AH H3;相应于SEQ ID NO:2的氨基酸451-455);无结构环21(UL21;相应于SEQ ID NO:2的氨基酸456-461);α螺旋a-1(AH a-1;相应于SEQ ID NO:2的氨基酸462-470);无结构环22(UL22;相应于SEQ ID NO:2的氨基酸471-473);α螺旋I(AH I;相应于SEQ ID NO:2的氨基酸474-495);无结构环23(UL23;相应于SEQ IDNO:2的氨基酸496-508);α螺旋J(AH J;相应于SEQ ID NO:2的氨基酸509-521);J-K环(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸522-534);α螺旋K(AH K;相应于SEQ ID NO:2的氨基酸535-541)和无结构环25(UL25;相应于SEQ ID NO:2的氨基酸542-548)。灰色框表示不是任意二级结构域的氨基酸残基。“*”表示该列的残基或核苷酸在比对中的全部序列式相同的,“:”表示观察到保守的取代,以及“.”表示观察到半保守取代。如本文描述,相应于SEQ ID NO:2中的位置的残基可以基于CVS编号表示为在相关或变体合酶间的对齐位置出现的残基。例如,瓦伦烯合酶的无结构环2(SEQ ID NO:2的氨基酸53-58)相应于SEQ ID NO:941所示的烟草epi-aristolochene合酶(TEAS)多肽的氨基酸58-63。
图3:图3是产生瓦伦烯和诺卡酮的反应线路。瓦伦烯合酶是类型1植物萜烯环化酶或合酶,其将法尼基二磷酸(FPP)转变为倍半萜瓦伦烯。瓦伦烯然后可以通过氧化转变成为诺卡酮。
图4:图4示出表示不同萜烯合酶的CVS编号的比对。图4A来自烟草(Nicotianatabacum)的SEQ ID NO:295和941所示的5-epi-aristolochene合酶(TEAS);和SEQ IDNO:2所示的柑橘属瓦伦烯合酶的比对。图4B来自埃及莨菪Hyoscyamus muticus的SEQ ID NO:296和942所示的premnaspirodiene合酶(HPS);和SEQ ID NO:2所示的柑橘属瓦伦烯合酶的比对。图4C来自葡萄Vitis vinifera的SEQ ID NO:346和347所示的瓦伦烯合酶;和SEQ ID NO:2所示的柑橘属瓦伦烯合酶的比对。图4DSEQ ID NO:887所示的V277;和SEQ ID NO:2所示的柑橘属瓦伦烯合酶的比对。“*”表示该列的残基或核苷酸在比对中的全部序列式相同的,“:”表示观察到保守的取代,以及“.”表示观察到半保守取代。
发明详述
A.定义
B.瓦伦烯合酶
1.结构
2.功能
3.柑橘属瓦伦烯合酶
C.修饰的瓦伦烯合酶多肽和编码核酸分子
1.修饰的瓦伦烯合酶多肽-示例性氨基酸置换
2.结构域交换
3.产物分布突变体
D.产生修饰的萜烯合酶和编码核酸分子的方法
E.修饰的瓦伦烯合酶多肽和编码核酸分子的产生
1.编码萜烯合酶的核酸的分离
2.突变体或修饰的核酸的生成
3.载体和细胞
4.表达***
a.原核细胞
b.酵母细胞
c.植物和植物细胞
d.昆虫和昆虫细胞
e.哺乳动物细胞
5.纯化
6.融合蛋白
F.使用和评价瓦伦烯合酶的方法
1.瓦伦烯的产生
a.用于产生瓦伦烯的示例性细胞
b.培养用于产生瓦伦烯的细胞
c.分离和评价瓦伦烯
2.诺卡酮的产生
G.实施例
A.定义
除非另有定义,本文所用的全部技术和科学术语具有本发明所述技术领域的技术人员所通常理解的相同含义。本公开通篇提及的全部专利、专利申请、公开的申请和出版物、GENBANK序列、网站和其它出版材料,除非另外标明,以其整体援引加入本文。如果本文对处于存在多种定义,以本部分的定义为准。如果引用URL或其它这样标识符或地址,应理解这样的标识符会改变而在互联网上的具体信息会变化不定,但是等价的信息是已知的并且可以容易地访问,例如通过搜索互联网和/或合适的数据库。对其指向证明此类信息的可获得性和公开传播。
如本文所用,无环焦磷酸萜烯前体是任意无环焦磷酸化合物,其是产生至少一种萜烯的前体,包括但不限于法尼基-焦磷酸(FPP)、香叶基-焦磷酸(GPP)和香叶基香叶基-焦磷酸(GGPP)。无环焦磷酸萜烯前体因此是萜烯合酶的底物。
如本文所用,萜烯是基于异戊二烯单元(C5H8)的不饱和烃,并具有通式C5xH8x,例如C10H16。提及萜烯包括无环萜烯、单环萜烯和多环萜烯。萜烯包括但不限于单贴,其含有10个碳原子;倍半萜,其含有15个碳原子;二萜,其含有20个碳原子;和三萜,其含有30个碳原子。提及萜烯还包括所述萜烯的立体异构体。
如本文所用,萜烯合酶是能够催化从无环焦磷酸萜烯前体如FPP、GPP或GGPP形成一或多种萜烯的多肽。
如本文所用,瓦伦烯合酶是具有以下结构的倍半萜:
提及瓦伦烯包括提及其任何异构体,包括但不限于(+)-瓦伦烯。
如本文所用,“瓦伦烯合酶”或“瓦伦烯合酶多肽”是能够催化从无环焦磷酸萜烯前体,一般是法尼基二磷酸(FPP),形成瓦伦烯的多肽。一般而言,瓦伦烯合酶与SEQ IDNO:2所示的瓦伦烯合酶具有大于或大于约63%、65%、70%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的序列相同性。瓦伦烯可以是无环焦磷酸萜烯前体和瓦伦烯合酶的反应形成的产物混合物中的唯一产物或产物之一。从所述无环焦磷酸萜烯前体和瓦伦烯合酶的反应产生的瓦伦烯的量一般是所述反应产生的萜烯总量的至少或至少约1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。在一些实例中,瓦伦烯是所产生的主要的萜烯(即比任何其它从无环焦磷酸萜烯前体和瓦伦烯合酶的反应产生的萜烯以更高的量存在)。
提及瓦伦烯合酶包括任意瓦伦烯合酶多肽,包括但不限于,重组产生的多肽、合成产生的多肽和从细胞或植物物质(包括但不限于柑橘属果皮)或分离的瓦伦烯合酶。示例性的瓦伦烯合酶多肽包括分离自柑橘属果实、葡萄花(如Vitis vinifera L.cv.Gewürztraminer和Vitis vinifera L.cv.Cabernet Sauvignon(见,Lucker et al.,(2004)Phytochemistry65(19):2649-59和Martin et al.,(2009)Proc.Natl.Acad.Sci,USA106:7245-7250)SEQ ID NO:346和347)和紫苏(green shiso)的瓦伦烯合酶多肽。示例性的瓦伦烯合酶是柑橘属瓦伦烯合酶(CVS),包括但不限于来自Citrus sinensis(甜橙)(SEQ ID NO:2,289和752)以及Citrus x paradisi(葡萄柚)(SEQ ID NO:2,290和291)的瓦伦烯合酶其它示例性瓦伦烯合酶多肽包括分离自葡萄花的瓦伦烯合酶,包括Vitisvinifera L.cv.Gewürztraminer和Vitis vinifera L.cv.Cabernet Sauvignon(SEQ ID NO:346和347)和分离自红桧(Chamaecyparis nootkatensis pendula)(SEQ ID NO:882和883)的瓦伦烯合酶。提及瓦伦烯合酶包括来自任何属和物种的瓦伦烯合酶,并包括等位基因或物种变体、由剪接变体编码的变体、以及其其它变体,包括与SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶具有至少或至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列相同性的多肽。瓦伦烯合酶号包括其保留瓦伦烯合酶活性的片段。
如本文所用,“瓦伦烯合酶活性”(本文也称为催化活性)指的是催化从无环焦磷酸萜烯前体如法尼基二磷酸(FPP)形成瓦伦烯的能力。评估从合酶与无环焦磷酸萜烯前体如FPP的反应形成瓦伦烯的方法是本领域公知的且在本文描述。例如,所述合酶可以在宿主细胞例如酵母细胞中表达,所述宿主细胞也产生FPP。然后可以使用例如气相色谱-质谱(GC-MS)(见下文实施例)评估和定量瓦伦烯的产生。如果从所述反应产生的瓦伦烯的量是所述反应中产生的萜烯总量的至少或至少约1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多,则该合酶被认为是表现瓦伦烯合酶活性或催化从无环焦磷酸萜烯前体如FPP形成瓦伦烯的能力。
如本文所用,关于瓦伦烯合酶的活性的“增加的催化活性”指的是催化从无环焦磷酸萜烯前体如法尼基二磷酸(FPP)形成瓦伦烯的能力被增加,从而导致增加的瓦伦烯形成。处于本文的目的,如果由其修饰的瓦伦烯合酶从FPP产生瓦伦烯的量比由SEQ IDNO:2所示的瓦伦烯合酶从FPP产生瓦伦烯的量多10%-500%、10%-250%、50%-250%、100%-500%或100%-250%,例如比由SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶从FPP产生瓦伦烯的量多10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、250%、300%、350%、400%、500%或更多,则所述瓦伦烯合酶表现增加的催化活性。例如,如果其修饰的瓦伦烯合酶从FPP产生瓦伦烯的量是SEQ ID NO:2所示瓦伦烯合酶在相同条件下从FPP产生瓦伦烯的量的至少或至少约110%、115%、120%、125%、130%、135%、140%、145%、150%、160%、170%、180%、200%、250%、300%、350%、400%、500%、1500%、2000%、3000%、4000%、5000%,则所述瓦伦烯合酶表现增加的催化活性。
如本文所用,“野生型”或“天然的”的瓦伦烯合酶指的是由天然的或天然存在的瓦伦烯合酶基因编码的瓦伦烯合酶,包括等位基因变体,其存在于在自然界中的生物体(包括植物)中。提及野生型瓦伦烯合酶而不提及物种是旨在涵盖任何物种的野生型瓦伦烯合酶。示例性的瓦伦烯合酶的氨基酸序列示于SEQ ID NO:2(分离自Citrus sinensis cv.Valencia,Citrus sinensis cv.Cara Cara和Citrus x paradisi)、SEQ ID NO:289(分离自Citrus sinensis cv.Valencia)和SEQ ID NO:290(分离自Citrus paradisi)和SEQ ID NO:291(分离自Citrus x paradisi).
如本文所用,物种变体指的是不同物种中的多肽的变体,包括不同柑橘属物种,如甜橙和葡萄柚。
如本文所用,等位基因变体涉及相同物种的成员中编码蛋白的差异。
如本文所用,剪接变体指的是由于基因组DNA初级转录物的不同加工而产生的变体,所述不同加工导致产生多于一种mRNA。
如本文所用,“修饰的瓦伦烯合酶多肽”指的是与未修饰的或野生型瓦伦烯合酶多肽相比具有一或多个氨基酸差异的瓦伦烯合酶多肽。所述一或多个氨基酸差异可以是氨基酸突变,例如一或多个氨基酸置换(取代)、***或缺失,或可以是整个结构域的***或缺失,以及它们的任意组合。一般而言,与未修饰的的或野生型瓦伦烯合酶多肽相比,修饰的瓦伦烯合酶多肽在一级序列具有一或多个修饰。例如,与未修饰的瓦伦烯合酶多肽相比,本文所提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽可以具有至少1、5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135或更多个氨基酸差异。考虑任何的修饰,只要所获得的多肽表现至少一种与野生型瓦伦烯合酶多肽相关的瓦伦烯合酶活性,例如,催化活性,结合FPP的活性,和/或催化从FPP形成瓦伦烯的活性。
如本文所用,提及修饰的瓦伦烯合酶多肽,其以多于由参考瓦伦烯合酶如野生型瓦伦烯合酶从FPP产生的瓦伦烯的量从FPP产生瓦伦烯,指的是所述修饰的瓦伦烯合酶比所述参考瓦伦烯合酶从FPP多产生至少或约10%的瓦伦烯。例如,与参考瓦伦烯合酶从FPP产生的瓦伦烯的量相比,这样的修饰的瓦伦烯合酶多肽可以从FPP多产生至少或至少约10%、11%、12%、13%、14%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、250%、300%、350%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%、2000%、5000%或更多的瓦伦烯。瓦伦烯合酶从FPP产生瓦伦烯的量可以通过本领域已知的任何方法进行评估。当比较两种瓦伦烯合酶从FPP产生瓦伦烯的量时,如修饰的瓦伦烯合酶和参考瓦伦烯合酶,理解对每种酶的测定是在相同条件下进行。在一个实例中,两种瓦伦烯合酶,如修饰的瓦伦烯合酶和参考瓦伦烯合酶,从FPP产生瓦伦烯的量的评估是通过在相同株的产FPP的酵母细胞表达所述修饰的瓦伦烯合酶和所述参考瓦伦烯合酶(其中表达来自相同的表达载体),并在相同条件下培养所述细胞,使得产生瓦伦烯。使用本领域公知的定量方法如GC-MS,比较表达所述修饰的瓦伦烯合酶的细胞培养物中产生的瓦伦烯的量和在表达所述参考瓦伦烯合酶的细胞培养物中产生的瓦伦烯的量。
如本文所用,“CVS编号”指的是如SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶的氨基酸编号。在除SEQ ID NO:2所示之外的合酶中的氨基酸残基可以通过其它萜烯合酶与SEQID NO:2所示的瓦伦烯合酶的比对来用CVS编号标示。在这种情况下与SEQ ID NO:2所示瓦伦烯合酶的氨基酸对其或对应的萜烯合酶的氨基酸(即相应的残基)通过SEQ IDNO:2所示的瓦伦烯合酶氨基酸的编号来标示图1示出了用于瓦伦烯合酶多肽的CVS编号。图4示出了用于示例其它萜烯合酶的CVS编号。例如,在图1中,该图示出通过基于SEQ ID NO:2的CVS编号,氨基酸残基24在SEQ ID NO:290,291,752,289和886所示的瓦伦烯合酶多肽中是K(Lys),在SEQ ID NO:3所示的瓦伦烯合酶中是A(Ala),在SEQ ID NO:4所示的瓦伦烯合酶多肽中是Q。根据图4,该图示出通过基于SEQ ID NO:2的CVS编号,氨基酸残基24在SEQ ID NO:295或941所示的TEAS中是S,在SEQ ID NO:942所示的HPS中是S,在SEQ ID NO:346或347所示的来自葡萄属的瓦伦烯合酶中是T,而在SEQ ID NO:887所示的瓦伦烯合酶V277变体中是T。
如本文所用,相应的残基指的是在对齐的位置上出现的残基。相关的或变体多肽通过本领域技术人员已知的任何方法进行比对。这样的方法一般使匹配最大化,并包括方法例如使用人工比对和使用可获得的数字比对程序(例如BLASTP)和其它本领域技术人员已知的方法。通过比对多肽的序列,本领域技术人员可以鉴定相应的残基,使用保守的和相同的氨基酸残基作为指导。相应的位置还可以基于结构比对,例如使用蛋白质结构的计算机模拟比对。例如,SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶的氨基酸残基R264,W273,T403,Y404,C441和D445相应于SEQ ID NO:295所示的烟草epi-aristolochene合酶的氨基酸残基R264,W273,T403,Y404,C440和D444。在另一实例中,在SEQ ID NO:2的氨基酸位置221(Y221)的酪氨酸相应于在SEQ ID NO:289的氨基酸位置221(C221)的半胱氨酸。在其它实例中,可以鉴定相应的区域。例如,瓦伦烯合酶的无结构环2(SEQ ID NO:2的氨基酸53-58)相应于SEQ ID NO:295所示的烟草epi-aristolochene合酶(TEAS)多肽的氨基酸58-63(见图2)。
处于本文的目的,提及修饰如“相应于CVS编号……位置,所述CVS编号基于SEQ ID NO:2”或类似短语指的是所标示的被修饰的氨基酸残基是SEQ ID NO:2中的氨基酸编号所示的氨基酸残基以及与其它合酶中这样的残基对齐的氨基酸残基。因此,提及修饰,例如相应于例如SEQ ID NO:2中的Y221V的氨基酸置换,包括在SEQ IDNO:2的221位的酪氨酸置换为缬氨酸的氨基酸置换;并且也包括在任何其它类似或相关多肽相应于SEQ ID NO:2的221位的位置上的内源氨基酸残基置换为缬氨酸的置换。例如,还将包括SEQ ID NO:289的221位的半胱氨酸置换为酪氨酸(C221V)的置换。
如本文所用,结构域或区域(一般是3个或更多,通常5或7或更多个氨基酸的序列)指的是分子(如蛋白质或编码核酸)的一部分,其结构性或功能性区别于所述分子的其它部分并且是可鉴定的。蛋白质可以具有一个或多于一个的不同结构域。例如,通过其中序列与相关家族成员例如其它萜烯合酶的同源性,可以鉴定、定义或区分结构域。结构域可以是氨基酸的线性序列或氨基酸的非线性序列。许多多肽含有多个结构域。本领域技术人员已知并可以鉴定这样的结构域。为了在本文示例,提供了定义,然而应理解本领域技术人员可以通过名字识别特定的结构域。如果需要,可以采用合适的软件来鉴定结构域。例如,如上所讨论,不同萜烯合酶中相应的结构域可以通过序列比对鉴定,例如使用本领域公知的工具和算法(如BLASTP)。
如本文所用,功能性结构域指的是通过功能性活性例如催化活性识别的那些多肽部分。功能性结构域可以通过其功能区分,例如通过催化活性,或与生物分子相互作用的能力,例如底物结合或金属结合。在一些实例中,结构域可独立地表现生物学功能或特性,使得所述结构域独立地或与其它分子融合可以执行活性,例如催化活性或底物结合。
如本文所用,结构性结构域指的是可以形成蛋白质内的独立折叠结构的那些多肽链部分,其由一或多个结构基序构成。
如本文所用,对于氨基酸序列或核酸序列,“异源”指的是序列的部分不存在于天然多肽或不是由天然多核苷酸编码。例如,瓦伦烯合酶多肽氨基酸的一部分,例如其结构域或区域或部分是异源的,如果这样的氨基酸不存在于天然的或野生型瓦伦烯合酶(如SEQ ID NO:2所示),或不是由所述天然的或野生型瓦伦烯合酶编码多核苷酸编码。含有这样的异源氨基酸的多肽或其编码多核苷酸分别指的是“嵌合多肽”或“嵌合多核苷酸”。
如本文所用,短语“与第一萜烯合酶相比,所述修饰的萜烯合酶的特性被改善”指的是与不含有修饰的萜烯合酶相比,修饰的萜烯合酶的特性的期望的改变。一般地,改善特性使得相比于从底物和没有修饰的萜烯合酶的反应产生的期望的萜烯的量相比,从底物和修饰的萜烯合酶的反应产生的期望的萜烯的量增加。修饰的萜烯合酶可以被改善的示例性的特性包括,例如,萜烯产量、催化活性、产物分布、底物特异性、区域选择性和立体选择性。一或多种所述特性可以使用本领域公知的方法进行评估以决定所述特性是否已经被改善(即,已经被改变为对于期望的萜烯或萜烯类的产生而言更加符合需要)。
如本文所用,萜烯产量(也称萜烯产率)指的是无环焦磷酸萜烯前体和萜烯合酶的反应中产生的萜烯的量(以重量计或以重量/体积计)。提及总萜烯产量指的是从所述反应产生的全部萜烯的总量,而提及特定萜烯产量指的是从所述反应产生的特定的萜烯的量(如瓦伦烯)。
如本文所用,改善的萜烯产量指的是,从无环焦磷酸萜烯前体和修饰的萜烯合酶的反应产生的萜烯总量的增加(即改善的总萜烯产量)或萜烯特定量的增加(即改善的特定萜烯产量),所述增加是和从相同无环焦磷酸萜烯前体和未经如此修饰的萜烯合酶的反应产生的量相比。从无环焦磷酸萜烯前体和修饰的萜烯合酶的反应中产生的萜烯的量(总量或特定量),与从相同无环焦磷酸萜烯前体和未经如此修饰的萜烯合酶的反应中产生的萜烯的量相比,可以增加至少或至少约5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或更多。
如本文所用,底物特异性指的是瓦伦烯合酶对一种靶底物的偏好性高于另一种,例如对一种无环焦磷酸萜烯前体(如法尼基-焦磷酸(FPP)、香叶基-焦磷酸(GPP)或香叶基香叶基-焦磷酸(GGPP))的偏好性高于另一种。底物特异性可以使用本领域公知的方法评估,例如那些计算kcat/Km的方法。例如,底物特异性可以通过比较相对Kcat/Km进行评估,其是酶对不同底物(例如GPP、FPP、GGPP)的催化效率的测量。
如本文所用,改变的特异性指的是修饰的萜烯合酶多肽(例如修饰的瓦伦烯合酶多肽)与未如此修饰的萜烯合酶(例如野生型瓦伦烯合酶)相比的底物特异性的改变。修饰的萜烯合酶多肽对底物如FPP、GPP或GGPP的特异性(如kcat/Km)相比于起始瓦伦烯合酶对相同底物的特异性可以被改变至少或至少约10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或更多。
如本文所用,改善的底物特异性指的是底物特异性改变或转变为更加需要的特异性。例如,改善的底物特异性可以包括修饰的萜烯合酶多肽对期望的底物例如FPP、GPP或GGPP的底物特异性的增加。修饰的萜烯合酶多肽对底物如FPP、GPP或GGPP的特异性(如kcat/Km)相比于未如此修饰的萜烯合酶的特异性可以增加至少或至少约10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或更多。.
如本文所用,“产物分布”指的是由无环焦磷酸萜烯前体(如FPP)和萜烯合酶(包括本文提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽)之间的反应产生的不同萜烯的相对量。所产生的萜烯的量可以被表示为由所述萜烯合酶产生的总产物的百分比。例如,从FPP和瓦伦烯合酶的反应产生的产物分布可以是90%(重量/体积)瓦伦烯和10%(重量/体积)大根香叶烯A。评估溶液中的萜烯的类型和量的方法是本领域公知的并在本文描述,并且包括例如,气相色谱-质谱(GC-MS)(见下文实施例)。
如本文所用,改变的产物分布指的是由无环焦磷酸萜烯前体(如FPP)和萜烯合酶(例如瓦伦烯合酶)之间的反应产生的单独萜烯的相对量的改变。一般而言,通过测定使用第一合酶(如野生型合酶)从所述无环焦磷酸萜烯前体产生的单独的萜烯的相对量并将其与使用第二合酶(如修饰的合酶)产生的单独的萜烯的相对量进行比较而评估所述改变。如果任意一或多种萜烯的相对量被增加或降低至少或至少约0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、60%、70%、80或更多,则认为存在改变的产物分布。
如本文所用,改善的产物分布指的是产物分布变换为更为期望的分布,即含有更期望的萜烯相对量。例如,改善的产物分布可以含有期望的萜烯的增加的量以及不如此期望的萜烯的降低的量。改善的产物分布中期望的萜烯的量可以被增加至少或至少约0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、60%、70%、80%或更多。改善的产物分布中不期望的萜烯的量可以被降低至少或至少约0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、60%、70%、80%或更多。
如本文所用,核酸或核酸分子包括DNA、RNA及其类似物,包括肽核酸(PNA)及其混合物。核酸可以是单链的或是双链的。当提及探针或引物时(任选地是标记的,如具有可检测标记,如荧光或放射性标记),考虑单链分子。这样的分子一般的长度一般使其靶为统计学独特或具有低拷贝数(一般少于5,通常少于3),用于探针或引发(priming)文库。通常,探针或引物含有与目标基因互补或相同的序列的至少14、16或30个连续的核苷酸。探针和引物可以长10、20、30、50、100或更多个核酸。
如本文所用,术语多核苷酸指的是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物,从5'端读至3'端。多核苷酸包括RNA和DNA,并可以从天然来源分离,体外合成,或从天然和合成分子的组合制备。多核苷酸分子的长度在本文以核苷酸(缩写“nt”)或碱基对(缩写“bp”)给出。如果上下文允许,术语核苷酸用于单链和双链分子。当该术语用于双链分子时期用于指代总体长度并将被理解为等价于术语碱基对。本领域技术人员将承认双链多核苷酸的两条链长度可以稍微不同并且其末端可以错开;因此双链多核苷酸分子内的核苷酸可以不全部是配对的。这样的不配对末端一般而言将不超过20个核苷酸的长度。
如本文所用,异源核酸是这样的核酸,其不是由表达其的细胞体内正常产生,或其是由所述细胞产生但是位于不同的基因座或表达不同,或者其介导或编码介导物改变内源核酸(如DNA)的表达,通过影响转录、翻译或其它可调节的生化过程。异源核酸一般对于其被导入的细胞而言不是内源的,而是从另外的细胞获得或合成制备。异源核酸可以是内源的,但是从不同的基因座表达或其表达被改变的核酸。一般而言,尽管不必须,这样的核酸编码在表达其的细胞中不是正常产生或不以相同方式产生的RNA和蛋白质。异源核酸(如DNA),也可以指外来核酸(例如DNA)。因此,异源核酸或外来核酸包括在对应核酸分子(如DNA)在基因组被发现的确切方向或位置不存在的核酸分子。其还指的是来自另外的生物体或物种的核酸分子(即,外源的)。
任何核酸(如DNA),其中本领域技术人员会承认或认为其对表达所述核酸的细胞是异源的或外来,将通过异源核酸而涵盖在本文;异源核酸包括外源地添加的核酸,其也内源地表达。异源核酸的实例包括但不限于,编码可追踪的标记蛋白(例如赋予药物抗性的蛋白)的核酸、编码治疗上有效的物质(如抗癌剂、酶和激素)的核酸和编码其它类型蛋白(如抗体)的核酸(例如DNA)。异源核酸编码的抗体可以被分泌或表达于细胞(所述异源核酸已被导入其中)表面上。
如本文所用,肽指的是长度为2-40个氨基酸的多肽。
如本文所用,本文提供的不同氨基酸序列中出现的氨基酸根据其已知的三字母或单字母缩写(表1)标示。不同核酸片段中出现的核苷酸以本领域通常使用的标准单字母指代来标示。
如本文所用,“氨基酸”是含有氨基基团和羧酸基团的有机化合物。多肽含有两个或更多个氨基酸。出于本文的目的,氨基酸包括天然存在的二十种氨基酸,非天然氨基酸和氨基酸类似物(即其中α-碳具有侧链的氨基酸)。
与J.Biol.Chem.,243:3557-3559(1968)中描述以及37C.F.R.§§1.821-1.822采用的标准多肽命名法一致,氨基酸的缩写示于表1:
表1–对应表
应当注意本文通过式子呈现的全部氨基酸序列具有从左到右的方向,其是氨基酸至羧基端的传统方向。另外,短语“氨基酸残基”广泛地定义为包括列于对应表(表1)的氨基酸和修饰的和罕见的氨基酸,例如在37C.F.R.§§1.821-1.822提及的那些,其通过引用并入本文。此外,应当注意氨基酸残基序列开始或结尾的横线表示与另外的一或更多个氨基酸残基的序列,与氨基-末端基团如NH2或与羧基-末端基团如COOH的肽键。
如本文所用,“天然存在的氨基酸”指的是在多肽中存在的20种L-氨基酸。
如本文所用,“非天然氨基酸”指的是含有氨基集团和羧酸基团的有机化合物,其不是表1中所列的天然存在的氨基酸之一。非天然存在的氨基酸因此包括,例如,除20种天然存在的氨基酸之外的氨基酸或氨基酸类似物,并包括但不限于,氨基酸的D-立体异构体。示例性的非天然氨基酸是本领域技术人员已知的并且可以包括在本文提供的瓦伦烯合酶多肽中。
如本文所用,修饰是指多肽的氨基酸序列的修饰或核酸分子的核苷酸序列的修饰,并包括分别包括氨基酸和核苷酸的缺失、***和置换。出于本文的目的,可以在任意本文提供的瓦伦烯合酶中进行氨基酸置换(或取代)、缺失和/或***。可以通过保守氨基酸置换以及非保守氨基酸取代来进行修饰。例如,可以进行期望地或有利地改变瓦伦徐合酶的特性的氨基酸置换。例如,可以对所述瓦伦烯合酶进行氨基酸置换使得获得的修饰的瓦伦烯合酶与未修饰的瓦伦烯合酶相比能够从FPP产生更多的瓦伦烯。
考虑的氨基酸置换或取代包括保守取代,包括但不限于表2所示的那些。合适的氨基酸保守取代是本领域技术人员已知的并且通常可以进行所述取代而不改变多肽的构象或活性。本领域技术人员承认,一般地,在多肽的非必需区域的单一氨基酸取代基本上不改变生物学活性(见,例如,Watson et al.Molecular Biology of the Gene,4thEdition,1987,The Benjamin/Cummings Pub.co.,p.224)。保守氨基酸取代例如根据下面表2所示的那些进行:
表2
原残基 | 保守取代 |
Ala(A) | Gly;Ser;Abu |
Arg(R) | Lys;orn |
Asn(N) | Gln;His |
Cys(C) | Ser |
Gln(Q) | Asn |
Glu(E) | Asp |
Gly(G) | Ala;Pro |
His(H) | Asn;Gln |
Ile(I) | Leu;Val |
Leu(L) | Ile;Val |
Lys(K) | Arg;Gln;Glu |
Met(M) | Leu;Tyr;Ile |
鸟氨酸 | Lys;Arg |
Phe(F) | Met;Leu;Tyr |
Ser(S) | Thr |
Thr(T) | Ser |
Trp(W) | Tyr |
Tyr(Y) | Trp;Phe |
Val(V) | Ile;Leu;Met |
其它的保守取代也是允许的并且可以凭经验确定或根据已知的保守取代确定。这样的取代的效果可以使用取代打分矩阵计算,例如在Altschul(J.Mol.Biol.219:55565(1991))中讨论的PAM120、PAM-200和PAM-250。
如本文所用,“一级序列”指的是多肽中的氨基酸残基的序列。
如本文所用,两种蛋白质或核酸之间的“相似性”指的是所述蛋白质的氨基酸序列或所述核酸的核苷酸序列之间的相关性(relatedness)。相似性可以基于残基序列和其中含有的残基的相同性程度和/或同源性。评估蛋白质或核酸间的相似性程度的方法是本领域技术人员已知的。例如,在一种评估序列相似性的方法中,两种氨基酸序列或核苷酸序列以产生序列间最大水平相同性的方式对齐。“相同性”指的是氨基酸序列或核苷酸序列无差别的程度。氨基酸序列的比对,以及某些程度上核苷酸序列的比对,也可以考虑氨基酸(或核苷酸)保守差异和/或常见取代。保守差异是保持涉及的残基的物理化学特性的差异。比对可以是全局的(在序列的完整长度上对比较的序列进行比对并包括全部残基)或局部的(仅包括最相似的区域或多个区域的序列一部分的比对)。
如本文所用,术语“同源性”和“相同性”用于描述两种和多种多肽(或编码核酸分子)之间的相关性。相同性指的是相同的序列;同源性可以包括保守氨基酸变化。一般而言,为鉴定相应的位置,对氨基酸序列比对以获得最高等级的匹配(见,如:Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988;Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993;Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994;Sequence Analysis in Molecular Biology,vonHeinje,G.,Academic Press,1987;和Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York,1991;Carillo et al.(1988)SIAM J Applied Math48:1073)。
如本文所用,“序列相同性”指的是在测试和参考多肽或多核苷酸之间的比较中相同氨基酸(或核苷酸)的数目。同源性多肽指的是两种或更多种肽,其具有预定数目的相同或保守氨基酸残基。同源性还包括不改变所编码的氨基酸的取代(即“沉默取代”)。序列相同性可以通过标准比对算法程序用各供应商建立的默认空位罚分确定。同源性核酸分子指的是两种或更多种核苷酸,其具有预定数目的相同或同源的核苷酸。基本上同源的核酸分子一般以中等严格性或高严格性与核酸全长杂交或与目标核酸分子全长的至少约70%、80%或90%杂交。还考虑含有简并密码子的核酸分子,所述简并密码子代替杂交的核酸分子中的密码子。(对于蛋白质同源性的确定,保守氨基酸可以如相同氨基酸一样好地对齐;在这种情况中,相同性百分比和同源性百分比不同)。任意两个核酸分子(或任意两个多肽)是否具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核苷酸序列(或氨基酸序列)可以使用已知的计算机算法确定,例如“FAST A”程序作为例子,默认参数如Pearson et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444(1988)(其它程序包括GCG程序包(Devereux,J.,et al.,Nucleic Acids Research12(I):387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul,S.F.,et al.,J.Molec.Biol.215:403(1990);Guide to Huge Computers,Martin J.Bishop,ed.,Academic Press,San Diego(1994),and Carillo et al.SIAM J Applied Math48:1073(1988))。例如,国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)数据库的BLAST功能可以用于确定相同性。其它商业或公众可得的程序包括DNAStar“MegAlign”程序(Madison,WI)和威斯康星大学遗传学计算机组(University of Wisconsin Genetics Computer Group,UWG)“Gap”程序(Madison WI)。蛋白质和/或核酸分子的同源性或相同性百分比可以例如通过使用GAP计算机程序比较序列信息来确定(如,Needleman et al.J.Mol.Biol.48:443(1970),由Smith and Waterman修改(Adv.Appl.Math.2:482(1981))。简言之,GAP程序将相似性定义为相似的比对符号(即核苷酸或氨基酸)的数目除以两个序列中较短者的符号总数目。GAP程序的默认参数可包括:(1)一元比较矩阵(相同值为1,不相同为0)和Gribskovet al.Nucl.Acids Res.14:6745(1986)的加权比较矩阵,描述于Schwartz and Dayhoff,eds.,Atlas of Protein Sequence and Structure,National Biomedical Research Foundation,pp.353-358(1979);(2)对每个缺口3.0的罚分和对每个缺口中的每个符号的额外的0.10罚分;和(3)对末端缺口不罚分。Clustal分析也可以用于比对核苷酸序列或蛋白质序列以及获得其相同性和相似性的水平(可以在ebi.ac.uk/Tools/msa/clusalw2/orebi.ac.uk/ebisearch/search.ebi?db=medline&t=clustal*获得)。
因此,如本文所用,术语“相同性”代表测试和参考多肽或多核苷酸之间的比较。在一个非限制性实例中,“具有至少90%相同性”指的是相对于参考多肽从90%至100%的百分比相同性。90%或更高水平的相同性代表以下事实,出于示例性目的,假设比较长度为100个氨基酸的测试和参考多肽,测试多肽中的氨基酸不超过10%(即,100个中的10个)与参考序列的氨基酸不同。类似的比较可以在测试和参考多核苷酸间进行。这样的差异可以表现为随机分布于氨基酸序列全长的点突变或者点突变可以被聚类在不同长度的一或多个位置,所述长度为最大可允许长度,例如,10/100个氨基酸差异(大约90%相同性)。差异可以定义为核酸或氨基酸取代、***或缺失。在高于约85%-90%的同源性或相同性水平,结果应当不依赖与程序和缺口参数设定;这样高水平的相同性可以容易地评估,经常无需依赖于软件。
如本文所用,也理解术语“基本上相同”或“相似”根据上下文本领域技术人员会有不同理解,但技术人员可以评估这样的差异。
如本文所用,对齐的序列指的是使用同源性(相似性和/或相同性)来对齐核苷酸或氨基酸序列中的相应的位置。一般地,两个或更多个以50%或更高相同性相关的序列是对齐的。对齐的序列组指的是两个或更多个在相应位置被对齐的序列以及可以包括比对来自RNA的序列,例如EST和其它cDNA,与基因组DNA序列比对。
如本文所用,分离的或纯化的多肽或蛋白质或其生物学活性部分基本上不含细胞物质或来自所述蛋白质所分离自的组织细胞的其它污染蛋白质,或当被化学合成时基本上不含化学前体或其它化学品。可以确定制备物为基本上纯的,如果其看起来不含通过本领域技术人员用来检测这样的纯度的标准分析方法如薄层层析(TLC)、凝胶电泳和高效液相层析(HPLC)可容易地检测的杂质,或者纯度足以使得进一步的纯化不会可检测地改变所述物质的物理和化学特性,例如蛋白水解和生物学活性。用于纯化化合物以产生基本上化学纯的化合物的方法是本领域技术人员已知的。然而,基本上化学纯的化合物可以是立体异构体的混合物。在这样的情况下,进一步的纯化可以增加所述化合物的特定活性。
术语基本上不含细胞物质包括瓦伦烯合酶或萜烯产物,其中所述瓦伦烯合酶或萜烯与其分离自的或产生自的细胞的细胞组分分开。在一个实施方案中,术语基本上不含细胞物质包括制备瓦伦烯合酶或萜烯产物,其具有少于约30%、20%、10%、5%或更少(以干重计)的非瓦伦烯合酶或萜烯蛋白或产物,包括细胞培养基。
如本文所用,使用重组DNA方法通过重组方法产生指的是使用公知的分子生物学方法表达克隆的DNA编码的蛋白质。
如本文所用,载体(或质粒)指的是独立的DNA元件,其用于将异源核酸导入细胞以表达或复制所述异源核酸。载体一般保持为附加形式(episomal),但可以设计为有效整合其基因或部分进入基因组的染色体中。还考虑的是人工染色体载体,例如细菌人工染色体,酵母人工染色体和哺乳动物人工染色体。这样的载体的选择和使用时本领域技术人员公知的。
如本文所用,表达指的是核酸转录为mRNA并翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果核酸衍生自基因组DNA,如果选择合适的真核宿主细胞或生物体,表达可以包括加工,例如mRNA的剪接。
如本文所用,表达载体包括能够表达和调控序列可操作地连接的DNA的载体,所述调控序列,例如启动子区域,能够影响这样的DNA片段的表达。这样的额外的区段可以包括启动子和终止子序列,以及任选地可以包括一或多个复制起点、一或多个可选择标记、增强子、多腺苷酸信号等等。表达载体通常衍生自质粒或病毒DNA,或可以含有两者的元件。因此,表达载体指的是重组DNA或RNA构建体,例如质粒、噬菌体、重组病毒或其它载体,其在导入至合适宿主细胞时,导致所述克隆的DNA的表达。合适的表达载体是本领域技术人员熟知的并包括那些可在真核细胞和/或原核细胞中复制的载体和那些保持附加形式或整合进宿主细胞基因组的载体。
如本文所用,载体还包括“病毒载体(virus vector)或“病毒载体(viral vector)”。病毒载体是改造的病毒,其可操作地连接外源基因以将所述外源基因转移(作为载体或运输工具)入细胞中。
如本文所用,腺病毒指的是一组含DNA病毒,其在人中导致结膜炎和上呼吸道感染。
如本文所用,裸露DNA指的是无组蛋白DNA,其可用于疫苗和基因疗法。裸露DNA是遗传物质,其在称作转化或转染的基因转移过程中从细胞传递到细胞。在转化和转染中,被受体细胞摄取的纯化的或裸露的DNA将给予所述受体细胞新的特性或表型。
如本文所用,当提及DNA区段时可操作地或可操纵地连接指的是排列所述区段使得它们协调一致发挥功能以实现它们的目的,如,在启动子起始转录并前进通过编码区段至终止子。
如本文所用,“嵌合蛋白”或“融合蛋白”指的是与不同多肽可操作地连接的多肽。本文提供的嵌合蛋白或融合蛋白可以包括一或多个瓦伦烯合酶或其部分,以及一或多个其它多肽,所述其它多肽用于转录/翻译控制信号、信号序列、定位标签、纯化标签、免疫球蛋白G结构域的一部分和/或靶向剂的任意一或多种。嵌合瓦伦烯合酶多肽还包括那些其中内源结构域或区域和另外的多肽交换的多肽。这些嵌合蛋白或融合蛋白包括那些通过重组蛋白产生的,如融合蛋白;那些通过化学方法产生的,如通过化学偶联,例如偶联至巯基基团;和那些通过另外的方法产生的,由此至少一个多肽(即瓦伦烯合酶)或其部分与另外的多肽直接或通过接头间接连接。
如本文所用,提及多肽基本上由提及的氨基酸序列组成指的是仅仅存在全长多肽被提及的部分或其片段。多肽可以任选地,且通常会包括来自另外的来源的额外的氨基酸或可以被***至另外的多肽中。
如本文所用,除非上下文另外指明,单数形式的“一(a)”“一(an)”“所述(the)”包括复数指示物。因此,例如,提及多肽,其包含“氨基酸置换”时,包括具有一或多个氨基酸置换的多肽。
如本文所用,范围和量可以表达为“约”具体值或范围。约还包括准确的量。所以,“约5%指“约5%”以及“5%”。
如本文所用,“任选存在的”或“任选地”指的是所描述的事件或情形存在或不存在,并且指该描述包括所述事件或情形存在的实例和其不存在的实例。例如,任选存在的分离瓦伦烯的步骤指的是所述瓦伦烯被分离或没有被分离。
如本文所用,除非另有指明,任何保护基团、氨基酸和其它化合物的缩写遵循它们的通常用法,公认的缩写或根据IUPAC-IUB生化命名委员会(见,(1972)Biochem.11:1726)。
B.瓦伦烯合酶
瓦伦烯合酶是类型1的植物萜烯环化酶,或萜烯合酶、异戊二烯类合酶或萜类环化酶,其将法尼基二磷酸转换成倍半萜瓦伦烯。瓦伦烯然后可以通过氧化转变成为诺卡酮。瓦伦烯和诺卡酮均是柑橘属(如橙和葡萄柚)油的天然组分,并且广泛用作香水和香料工业中的成分。
在柑橘属水果、葡萄花、芹菜(Apium graveolens)、芒果(Mangifera indica)、橄榄(Olea europea)和珊瑚中鉴定出了瓦伦烯。至今,已从柑橘属水果、葡萄花和紫苏(greenshiso)中分离了瓦伦烯合酶。柑橘属瓦伦烯合酶已经在Citrus sinensis(甜橙)外果皮(outerpeel)(SEQ ID NO:2、289、290)和Citrus x paradisi(葡萄柚)(SEQ ID NO:291和752)中鉴定(见,Chappell(2004)Trends Plant Sci.,9:266;Sharon-Asa et al.,(2003)The PlantJournal36:664-674;AF411120和U.S.Patent Nos.7,273,735;7,442,785;7,790,426;和国际PCT申请号WO2005021705和WO2003025193)。已经描述了含有氨基酸置换A517I/I518V的变体瓦伦烯合酶(Eyal,E.Masters Thesis,Department of Plant Sciences,Weizmann Institute of Science,Rehovot,Israel;January,2001;示于SEQ ID NO:886)。也从葡萄花中鉴定和分离出瓦伦烯合酶,包括Vitis vinifera L.cv.Gewürztraminer和Vitisvinifera L.cv.Cabernet Sauvignon(见,Lucker et al.,(2004)Phytochemistry65(19):2649-59and Martin et al.,(2009)Proc.Natl.Acad.Sci,USA106:7245-7250)(SEQ ID NO:346和347)。也从红桧(Chamaecyparis nootkatensis pendula)分离出瓦伦烯合酶(见例如国际PCT申请号WO2011074954;SEQ ID NO:882和883,以及SEQ ID NO:884和885分别所示的编码核酸)。
a.结构
类型1植物萜烯环化酶包括不同组的单体萜烯合酶,其共有称作类型1萜类环化酶折叠的α螺旋结构(见,如,Christianson,D.W.,(2008)Curr Opin Chem Biol12(2):141-150和Bohlmann et al.,(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:4126-4133)。尽管存在相对小的总体序列相似性,类型1萜烯环化酶具有同源结构以及一些高度保守的基序和/或残基。在其催化位点,每种萜烯环化酶提供结合柔性异戊二烯底物的模板,其方向和构象使得在环化时形成特定的分子间碳-碳键。因此,每种酶的催化位点的结构限定所获得的环化单萜、二萜和倍半萜。
烟草5-epi-aristolochene合酶和pentalenene合酶的X-射线晶体结构显示类型1植物萜烯环化酶完全由通过短连接环和转角互联的α螺旋组成(见,如,Starks et al.,(1997),Science277:1815-1820和Lesburg et al.,(1997),Science277:1820-1824;也见图2)。这些酶含有两种不同的结构域,N-端结构域,其结构组装成糖基水解酶的催化核心但其功能大部分未知;以及C-端催化结构域。所述催化结构域含有两个保守金属结合基序T,即,天冬氨酸富含区其负责酶催化活性。该催化位点含有大的中央腔,其主要由反平行α螺旋形成,两个天冬氨酸富含区位于相对的壁上。所述天冬氨酸富含区通过桥接Mg2+离子介导底物二磷酸的结合随后的底物结合诱导构象改变,使得N-端区域形成催化核心上的帽,其使活性位点对溶剂封闭,由此稳定活性碳阳离子中间体。
保守的α螺旋C、D、F、G和H组成类型1植物萜烯合酶的催化位点或活性位点。所述活性位点是排列芳香残基的疏水性口袋以容纳底物的烯烃链。所述芳香残基稳定通过π-阳离子相互作用稳定碳阳离子中间体。天冬氨酸富含区1位于螺旋D并且特征在于保守序列DDxxD,其也起结合Mg2+的功能(see,,Starks et al.,(1997),Science277:1815-1820)。第二个保守金属结合区域位于螺旋H并且特征在于保守的序列[N/D]xxx[S/T]xxxE,也称作“NSE/DTE基序”。这两个保守的金属结合基序配位三个Mg2+离子与异戊二烯二磷酸的结合。
b.功能
瓦伦烯合酶催化从普遍存在的焦磷酸中间体法尼基二磷酸(FPP)形成瓦伦烯,法尼基二磷酸作为真菌和动物中的甲羟戊酸依赖的异戊二烯生物合成途径和细菌和高级职务中的非甲羟戊酸依赖的异戊二烯生物合成途径的部分产生。瓦伦烯(1,2,3,5,6,7,8,8a-八氢-7-异丙烯基l-1,8a-二甲基-萘)然后通过氧化被转化成诺卡酮(4,4a,5,6,7,8-六氢-6-异丙烯基-4,4-a-二甲基-2(3H)-萘酮)。图3显示了该生化途径。
类型1植物萜烯环化酶例如瓦伦烯合酶是金属依赖的环化酶,其将线性全反式异戊烯基二磷酸,例如香叶基二磷酸、法尼基二磷酸和香叶基-香叶基二磷酸,转化为环状单萜、二萜和倍半萜。环化反应经由亲电烷化进行,其中新的碳-碳单键通过高反应性的缺电子烯丙基碳阳离子和富电子碳-碳双键的反应形成。
萜烯合酶在酶的活性中心含有酶催化所需的二价金属离子,一般是Mg2+离子或有时是Mn2+。更具体地,其是焦磷酸离去所需的。通常,所述酶含有列于催化位点的两个保守的金属结合基序,包括天冬氨酸富含的DDxxD基序(其配位两个Mg2+离子的结合)和NSE/DTE基序(其配位第三个Mg2+离子)(见,Starks et al.,(1997),Science277:1815-1820和Lesburg et al.,(1997),Science277:1820-1824)。所述催化活性位点的天冬氨酸富含区通过桥接Mg2+离子介导异戊烯基二磷酸的结合(Mg2+)3-PPi的结合诱导构象改变使得N-端区域形成所述催化核心上的帽并由此以封闭构象稳定所述活性位点,其不接触大量溶剂。从酶结合的底物失去焦磷酸(PPi)导致高反应性的烯丙基碳阳离子,其亲电攻击分子间双键至萜烯链以实现环闭合。当结合于闭合的合酶构象内时,PPi阴离子从保守碱性残基接受氢键,芳香残基排列形成的疏水口袋支起异戊二烯基侧链并很可能通过形成特性底物构象以及通过π-堆叠相互作用稳定碳阳离子来进行环化反应(Noel et al.,(2010)ACS Chemical Biology5(4):377-392)。
c.柑橘属瓦伦烯合酶
柑橘属瓦伦烯合酶是在柑橘属水果(如橙和葡萄柚)中发现的倍半萜合酶,其将全反式法尼基二磷酸(FPP)转化成倍半萜瓦伦烯。至今已鉴定并分离了若干种杆菌属瓦伦烯合酶。柑橘属瓦伦烯合酶的氨基酸序列不一定是物种特异的,分离自特定物种(如Citrus sinensis)的合酶可以与分离自相同物种的另一合酶具有相同或不同的序列,并可与分离自不同物种(如Citrus paradisi)的合酶具有相同的或不同的序列。
至今分离并测序的柑橘属瓦伦烯合酶包括如本文描述的分离自Citrus sinensis cv.Valencia(瓦伦西亚橙)的瓦伦烯合酶(见实施例1),其是548个氨基酸的多肽,具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列(由SEQ ID NO:1所示的cDNA序列编码)。该合酶与分离自Citrus paradisi(葡萄柚:见美国专利号7,273,735)的瓦伦烯合酶和分离自腈橙(Citrussinensis cv.Cara Cara;Genbank登录号ACX70155)的瓦伦烯合酶具有100%的核苷酸序列相同性。该描述了所述全部三种萜烯合酶的核苷酸序列示于SEQ ID NO:1(也见Genbank登录号GQ988384)。相应的多肽氨基酸序列示于SEQ ID NO:2。另一种来自Citrus paradisi的瓦伦烯合酶也描述于美国专利号7,273,735,其与SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶相比含有4个氨基酸取代;I92N,D95H,R98S和A99P(SEQ ID NO:752,由SEQ ID NO:753所示cDNA编码)。另一种分离自Citrus sinensis cv.Valencia外果皮(outer peel)的瓦伦烯合酶与SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶相比含有2个氨基酸取代;V123G和Y221C(SEQ ID NO:289,由SEQ ID NO:292所示cDNA编码;Genbank登录号AAQ04608和AF441124;见,Sharon-Asa et al.,(2003)The Plant Journal36:664-674).另一种分离自Citrus x paradisi的瓦伦烯合酶与SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶相比含有2个不同的氨基酸取代;Q87L和L239P(SEQ ID NO:290,由SEQ ID NO:293所述cDNA编码;见,美国专利号7,442,785);且另一种分离自Citrus x paradisi的瓦伦烯合酶与SEQID NO:2所示的瓦伦烯合酶相比含有额外(总共3个)的氨基酸取代;Q87L,L239P和N493D(SEQ ID NO:291,由SEQ ID NO:294所示cDNA编码;见,Genbank登录号AAM00426和AF411120)。
如上文所述,柑橘属瓦伦烯合酶含有N-端结构域(SEQ ID NO:2的氨基酸1-266)和C-端催化结构域(SEQ ID NO:2的氨基酸267-548)。尽管瓦伦烯合酶并不一定与其它萜烯合酶具有高百分比的同源性,所述催化结构域确实和其它萜烯合酶共有相同的三维结构(描述于,如,美国专利号6,465,772,6,495,354和6,559,297)。当和烟草5-epi-aristolochene合酶(TEAS;描述于Starks et al.(1999)Science277:1815-1820)比对和比较时,显然柑橘属瓦伦烯合酶含有以下结构性结构域:无结构环1(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸1-29);α螺旋1(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸30-39和44-52);无结构环2(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸53-58);α螺旋2(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸59-71);无结构环3(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸72-78);α螺旋3(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸79-93);无结构环4(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸94-100);α螺旋4(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸101-114);无结构环5(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸115-141);α螺旋5(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸142-152);无结构环6(相应于SEQ IDNO:2的氨基酸153-162);α螺旋6(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸163-173);无结构环7(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸174-184);α螺旋7(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸185-194);无结构环8(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸195-201);α螺旋8(相应于SEQID NO:2的氨基酸202-212);无结构环9(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸213-222);α螺旋A(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸223-253);A-C环(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸254-266);α螺旋C(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸267-276);无结构环11(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸277-283);α螺旋D(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸284-305);无结构环12(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸306-309);α螺旋D1(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸310-322);无结构环13(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸323-328);α螺旋D2(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸329);无结构环14(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸330-332);α螺旋E(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸333-351);无结构环15(相应于SEQ IDNO:2的氨基酸352-362);α螺旋F(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸363-385);无结构环16(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸386-390);α螺旋G1(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸391-395);无结构环17(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸396-404);α螺旋G2(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸405-413);无结构环18(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸414-421);α螺旋H1(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸422-428);无结构环19(相应于SEQID NO:2的氨基酸429-431);α螺旋H2(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸432-447);无结构环20(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸448-450);α螺旋H3(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸451-455);无结构环21(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸456-461);α螺旋a-1(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸462-470);无结构环22(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸471-473);α螺旋I(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸474-495);无结构环23(相应于SEQ IDNO:2的氨基酸496-508);α螺旋J(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸509-521);J-K环(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸522-534);α螺旋K(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸535-541);和无结构环25(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸542-548)。所述结构域示于图2。
在所述C-端催化结构域内是保守的金属结合位点,含有天冬氨酸富含区1和2。天冬氨酸富含区1,含有保守的DDxxD基序,相应于SEQ ID NO:2的氨基酸D301、D302、T303、Y304和D305。Asp301和Asp305通过和Mg2+配位结合FPP的二磷酸部分天冬氨酸富含区2,含有NSE/DTE基序,相应于SEQ ID NO:2的氨基酸D445、D446、M447、Q448、G449、H450、E451、F452和E453。该区域通过氨基酸Asp445、Gly449和Glu453结合额外的Mg2+离子。
如上所述,瓦伦烯合酶的活性位点底物结合口袋是疏水的且含有芳香残基。来自所述天冬酰胺富含区的氨基酸残基D301、D305、D445、G449和E453以及SEQ IDNO:2的氨基酸残基R264、W273、N294、I296、L297、S298、Y376、C402、C441、R442、L443、D446、Y522、D526和Y528形成所述瓦伦烯合酶的底物结合口袋。这些残基架起法尼基侧链,迫使底物形成导致产生瓦伦烯的构象。结合(Mg2+)3-PPi后,瓦伦烯合酶经历从开放至闭合活性位点的结构改变,其中N-端区域形成活性位点上的帽或盖。所述活性位点盖残基相应于SEQ ID NO:2的N-端结构域氨基酸残基R8、P9、T10、A11、D12、F13、H14和P15以及SEQ ID NO:2的C-端结构域氨基酸残基F452、E453、K455、R456、G457、A460、S461、A462、I463、D525、D526、G527和Y528。
位于瓦伦烯合酶活性位点附近并在艾里莫芬酮-型倍半萜中保守的其它残基包括SEQ ID NO:2的氨基酸残基L270、Y376、S401、C402、A403、Y404、V407、C441、I518、I521和T529(见,Greenhagen et al.,(2006)Proc.Natl.Acad.Sci.USA103:9826-9831和美国专利号7,442,785)。这些残基帮助定位反应中间体,使得瓦伦烯是主要形成的产物。其它可以由瓦伦烯合酶从FPP产生的产物包括但不限于大根香叶烯A、β-榄香烯(β-榄香烯通过大根香叶烯的自发分解形成)、β-芹子烯、τ-芹子烯和7-表-α-芹子烯。SEQ ID NO:2的氨基酸残基A517和I518被鉴定为在反应后期在C1-C10环化后起作用,由于它们突变至A517I/I518V导致β-榄香烯反应产物,其可能由于正常反应的中断而来自大根香叶烯(见例如Eran Eyal(2001)Computer Modelling of the Enzymatic ReactionCatalysed by5-epi-aristolochene cyclase.Doctoral Dissertation.Retrieved from LibraryCatalog Wiezmann Institute of Science.(System No.000083214)。
C.修饰的瓦伦烯合酶多肽和编码核酸分子
本文提供了修饰的瓦伦烯合酶多肽。本文还提供了编码任一本文提供的瓦伦烯合酶多肽的核酸分子。本文提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽催化从任何合适的无环焦磷酸萜烯前体(包括但不限于FPP、GPP和GGPP)形成瓦伦烯和/或其它萜烯。一般而言,所述修饰的瓦伦烯合酶多肽催化从FPP形成瓦伦烯。可以在瓦伦烯合酶的任何区域或结构域中进行所述修饰,只要所获得的修饰的瓦伦烯合酶多肽至少保留瓦伦烯合酶活性(即催化从无环焦磷酸萜烯前体,一般为FPP,形成瓦伦烯的能力)。
所述修饰可以是单氨基酸修饰,例如单氨基酸置换(取代)、***或缺失,或多氨基酸修饰,例如多氨基酸置换、***或缺失。在一些实例中,完整的或部分的结构域或区域,例如本文如下描述的任何结构域或区域,和来自另一萜烯合酶的相应结构域或区域或其部分交换。示例性的修饰是氨基酸置换,包括单或多氨基酸置换。例如,与不含有修饰的瓦伦烯合酶多肽相比,本文提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽可以含有至少或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、90、95、100、105、110、115、120个或更多的修饰的位置。
本文所描述的修饰可以位于任意瓦伦烯合酶多肽内。一般而言,在来自柑橘属的柑橘属瓦伦烯合酶(CVS)中进行修饰。例如,本文描述的修饰可以位于SEQ ID NO:2、289-291、346、347、752、882或883任一所示的瓦伦烯合酶或其任意变体,包括本领域描述的任意与SEQ ID NOS:2、289-291、346、347、752、882或883任一所示的瓦伦烯合酶多肽具有至少60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列相同性的瓦伦烯合酶或其变体。示例性的瓦伦烯合酶示于SEQ ID NO:886。具体地,本文提供的是修饰的来自柑橘属的瓦伦烯合酶多肽,其与SEQ ID NO:2、289-291、752或886任一所示的瓦伦烯合酶相比含有一或多个修饰。此外,应当理解SEQ ID NO:3-127、350、351、723-731、732-745、746-751、810-866、887-890、895、944、946、948、950、952,954、956、958、960、962、964、966、968、970、972、974、976、978、980、982、984、986、988、990、992、994、996和998所示的变体中的任一可以被进一步修饰,例如通过包括本文上述的任意修饰。
具体地,本文提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽相对于SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶多肽含有氨基酸置换或取代、添加或缺失、截短或它们的组合。通常本文是以参考SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶的CVS编号来指代修饰(包括氨基酸置换)的位置和氨基酸。本领域技术人员能够在瓦伦烯合酶如SEQ ID NO:2、289-291、346、347、752、882或883所示的任一或其任意变体中进行此类修饰。例如,图1和图4示出示例性瓦伦烯合酶两个或多个之间的CVS编号和相应位置。基于该描述,本领域技术人员能够产生含有任意一或多个所描述的突变的瓦伦烯合酶并测试各自的本文描述的瓦伦烯合酶活性。
而且,在一些实例中,本文提供瓦伦烯合酶多肽的修饰的活性片段,其含有本文提供的任意修饰。这样的片段保留野生型瓦伦烯合酶的一或多种特性。一般而言,所述修饰的活性片段表现瓦伦烯合酶活性(即催化从无环焦磷酸萜烯前体如FPP形成瓦伦烯)。
瓦伦烯合酶多肽中的修饰也可以在还含有其他修饰的瓦伦烯合酶多肽进行,所述其它修饰包括一级序列的修饰和不在多肽一级序列的修饰。例如,本文描述的修饰可以位于瓦伦烯合酶多肽中,所述瓦伦烯合酶多肽是是融合多肽或嵌合多肽,包括不同瓦伦烯合酶多肽或不同萜烯合酶的杂合物(如含有来自另一种萜烯合酶的疑惑多个结构域或区域)以及基于已知多肽的序列重组制备的或合成的或通过本领域已知的其它方法构建的合成瓦伦烯合酶多肽。
本文提供的瓦伦烯合酶多肽通常显示与SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶多肽至少62%氨基酸序列相同性。例如,本文提供的瓦伦烯合酶多肽通常显示与SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶多肽至少或至少约65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、95%、95%、96%、97%、98%或99%氨基酸序列相同性。在具体实例中,所述瓦伦烯合酶多肽还显示与SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶多肽少于95%序列相同性。因此,例如,本文提供的瓦伦烯合酶多肽显示与SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶多肽至少或大于62%序列相同性并且显示与SEQ ID NO:2所示的野生型瓦伦烯合酶多肽少于或少于约94.7%、94.6%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、84%、83%、82%、81%79%、78%、77%、76%、74%、73%、72%或71%序列相同性。通常,本文提供的瓦伦烯合酶多肽显示与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列75%-95%或约75%-95%、75%-94%或约75%-94%、74%-93%或约74%-93%、75%-92%或约75%-92%、80%-95%或约80%-95%、80%-94%或约80%-94%、80%-93%或约80%-93%、80%-92%或约80%-92%、85%-95%或约85%-95%、85%-94%或约85%-94%、85%-93%或约85%-93%,或85%-92%或约85%-92%(各自为包含性的)的序列相同性。
在一些实例中,所述修饰的瓦伦烯合酶多肽与SEQ ID NO:3所示的修饰的瓦伦烯合酶多肽具有少于100%或具有100%的相同性。在另外的实例中,所述修饰的瓦伦烯合酶多肽与SEQ ID NO:4所示的修饰的瓦伦烯合酶多肽具有少于100%或具有100%的相同性。在另外的实例中,所述修饰的瓦伦烯合酶多肽与SEQ ID NO:5所示的修饰的瓦伦烯合酶多肽具有少于100%或具有100%的相同性。例如,本文提供了修饰的瓦伦烯合酶多肽,其具有与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示修饰的瓦伦烯合酶多肽具有至少80%相同性的氨基酸序列,例如与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示修饰的瓦伦烯合酶多肽具有至少或至少约81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%相同性。
百分比相同性可以由本领域技术人员使用标准算法程序确定。例如,本领域技术人员使用标准算法程序可以确定,含有37个氨基酸置换(例如K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/P281S/Q292K/L313C/S314T/L315M/T317S/Q321A/E333D/K336R/L337I/A345T/G357R/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E,例如所述修饰的瓦伦烯合酶多肽命名为V75,示于SEQID NO:5,如下文所述)的修饰的瓦伦烯合酶多肽显示与SEQ ID NO:2所示瓦伦烯合酶约93.2%同源性。在另外的实例中,本文提供的瓦伦烯合酶多肽含有至少80、81、82、83或84个修饰,包括置换、***和/或缺失,使得获得的多肽与SEQ ID NO:2所示的野生型瓦伦烯合酶多肽具有少于85%或具有85%或具有约85%的相同性。在另外的实例中,本文提供的瓦伦烯合酶多肽含有至少107、108、109、110、或111个修饰(如置换、***和/或缺失)使得获得的多肽与SEQ ID NO:2所示的野生型瓦伦烯合酶多肽具有少于80%或具有80%或具有约80%的相同性。
所述修饰可以在N-端结构域(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸1-266)内和/或一或多个修饰在C-端催化结构域(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸267-548)内.在一些实例中,所述修饰为氨基酸置换。在另外的实例中,本文提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽在例如以下的结构域中含有一或多个修饰:无结构环1(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸1-29);α螺旋1(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸30-39和44-52);无结构环2(相应于SEQID NO:2的氨基酸53-58);α螺旋2(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸59-71);无结构环3(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸72-78);α螺旋3(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸79-93);无结构环4(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸94-100);α螺旋4(相应于SEQ IDNO:2的氨基酸101-114);无结构环5(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸115-141);α螺旋5(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸142-152);无结构环6(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸153-162);α螺旋6(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸163-173);无结构环7(相应于SEQID NO:2的氨基酸174-184);α螺旋7(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸185-194);无结构环8(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸195-201);α螺旋8(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸202-212);无结构环9(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸213-222);α螺旋A(相应于SEQID NO:2的氨基酸223-253);A-C环(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸254-266);α螺旋C(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸267-276);无结构环11(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸277-283);α螺旋D(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸284-305);无结构环12(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸306-309);α螺旋D1(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸310-322);无结构环13(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸323-328);α螺旋D2(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸329);无结构环14(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸330-332);α螺旋E(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸333-351);无结构环15(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸352-362);α螺旋F(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸363-385);无结构环16(相应于SEQ IDNO:2的氨基酸386-390);α螺旋G1(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸391-395);无结构环17(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸396-404);α螺旋G2(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸405-413);无结构环18(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸414-421);α螺旋H1(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸422-428);无结构环19(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸429-431);α螺旋H2(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸432-447);无结构环20(相应于SEQID NO:2的氨基酸448-450);α螺旋H3(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸451-455);无结构环21(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸456-461);α螺旋a-1(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸462-470);无结构环22(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸471-473);α螺旋I(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸474-495);无结构环23(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸496-508);α螺旋J(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸509-521);J-K环(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸522-534);α螺旋K(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸535-541);和/或无结构环25(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸542-548)。如本文其它地方描述,所述域或结构域的修饰可以是被来自另一种萜烯合酶的相应异源残基置换。
为了保留瓦伦烯合酶活性,修饰一般不在对改变较不耐受的那些位置进行。这样的位置可以位于为从FPP至瓦伦烯的催化和/或底物结合所需的结构域或区域内。在一些实例中,所述位置在高度保守的区域内,例如金属结合天冬氨酸富含基序(DDxxD)。例如,如图3C所示,相应于SEQ ID NO:2的301、302、303、305和306位的位置(其是第一金属结合天冬氨酸富含基序的部分或邻近第一金属结合天冬氨酸富含基序)以及相应于445、446、和449位的位置(其是第二天冬氨酸富含区的部分)通常对修饰较不耐受且一般造成具有降低的瓦伦烯合酶活性的多肽。类似地,相应于SEQ IDNO:2的267、269、270、271、273、295、298、441和442位的位置,其很可能参与形成底物结合口袋,通常也对修饰较不耐受并且一般导致具有降低的瓦伦烯合酶活性的多肽。其它在实施例3.C中显示的对改变较不耐受的位置包括但不限于相应于SEQID NO:2的8、9、178、203、277、287、312、394、398、401、402、403、404、407、408、454和457位的位置。
因此,本文提供了修饰的瓦伦烯合酶多肽,具体为表现增加的瓦伦烯产量的修饰的瓦伦烯合酶,其在SEQ ID NO:2的氨基酸残基8、9、178、203、267、269、270、271、273、277、287、295、298、301、302、303、305、306、312、394、398、401、402、403、404、407、408、441、442、445、446、449、454和457任一处不含有修饰(例如氨基酸置换或取代)。在一些实例中,其它很可能对改变较不耐受的位置可能包括例如第20、264、266、376、436、448、512、515、516、519、520、527、528和529位(美国专利公开号US20100216186)。在一些实例中,本文提供的具有增加的瓦伦烯产量的修饰的瓦伦烯合酶一般在相应于SEQ ID NO:2的20、178、203、264、266、267、269、270、271、273、277、287、295、298、301、302、303、305、306、312、376、394、398、401、402、403、404、407、408、436、441、442、445、446、448、449、454、457、512、515、516、519、520、527、528和529位的任一位置处不含有修饰。应当理解者仅是指导,并且当在这些位置的修饰通常导致与野生型瓦伦烯合酶相比具有降低活性的瓦伦烯合酶时,这样的修饰可以被包括在本文提供的任意修饰的瓦伦烯合酶中。例如,本领域技术人员理解保守性氨基酸取代,例如那些在表2中提供的取代,可以用于降低修饰导致活性降低的可能性,例如与野生型瓦伦烯合酶相比从FPP产生瓦伦烯的量的降低。而且,在一些实例中,当修饰是由于和另外的合酶多肽相应结构域所示的氨基酸进行结构域交换时,可以在这些位置中的任一进行修饰。
因此,可以通过例如氨基酸置换或取代修饰的示例性位置包括但不限于相应于CVS编号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、50、53、54、55、56、57、58、60、62、69、77、78、82、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、111、113、114、116、117、118、120、121、122、124、125、127、129、130、132、135、136、138、139、141、142、144、146、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、162、163、165、166、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、186、187、188、189、190、191、193、194、195、196、197、198、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、227、228、229、238、252、257、263、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、305、306、307、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、329、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、375、377、378、380、381、382、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、422、423、424、428、429、434、435、436、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、451、452、454、457、465、468、473、474、484、492、495、496、499、500、501、506、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、536和/或539位的位置,所述CVS编号参考SEQ ID NO:2的氨基酸位置。
这些用于修饰的位置仅是示例性的。应当理解在所述瓦伦烯合酶多肽中的许多其它位置可以被修饰而没有不利地影响所述多肽从FPP产生瓦伦烯的能力。例如,所述无结构环中的其它位置可以被修饰而没有不利地影响瓦伦烯产生。
所述修饰可以是氨基酸置换、***或缺失。一般而言,所述修饰是氨基酸置换,其可以是保守性取代,例如表2所示的保守性取代,或非保守性取代。本领域技术人员理解,通常保守性氨基酸取代降低修饰不利地影响活性的可能,例如与野生型瓦伦烯合酶相比从FPP产生瓦伦烯的量的降低。相反地,非保守性取代通常更可能影响活性,由此导致与野生型瓦伦烯合酶相比从FPP产生瓦伦烯的量的增加或减少。可以使用本文描述的和本领域已知的测定来鉴定导致从FPP产生的瓦伦烯产量增加的修饰,由此使得可以鉴定具有改善的从FPP产生瓦伦烯的能力的修饰的瓦伦烯合酶多肽。
可以包括在提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽的示例性氨基酸取代(或置换)包括但不限于相应于CVS编号M1T、S2R、S2K、S2E、S2Q、S2P、S2T、S2L、S2H、S2A、S2V、S2N、S2C、S2G、S3D、S3R、S3G、S3I、S3E、S3V、S3A、S3T、S3L、S3M、S3P、S3N、G4K、G4V、G4N、G4I、G4R、G4S、G4P、G4A、G4E、G4F、G4C、G4T、G4L、G4Q、E5A、E5G、E5S、E5T、E5D、E5H、E5I、E5P、E5L、E5N、E5V、E5R、T6R、T6V、T6D、T6L、T6A、T6E、T6K、T6S、T6G、T6C、T6M、T6Y、T6I、F7C、F7A、F7Q、F7K、F7S、F7G、F7T、F7L、F7R、F7P、F7N、F7D、F7E、F7V、T10V、A11T、D12N、S16N、L17I、R19K、R19P、R19G、N20D、H21Q、L23I,L23S、K24A、K24Q、K24Y、K24T、G25Y、A26T、S27P、D28G、D28E、F29D、D33T、H34R、T35A、A36C、T37K、Q38V、Q38A、Q38N、Q38E、R40Q、H41I、R50G、T53L、T53R、D54A、D54P、D54C、A55T、A55P、A55R、A55V、A55Q、E56G、E56P、E56F、E56A、E56T、E56Q、D57R、D57P、D57S、D57Q、D57A、K58Q、K58R、K58P、K58E、K58A、V60I、V60G、K62R、V69I、F78L、I82V、A85M、I86L、Q87D、K88Q、K88A、K88H、L89I、C90Y、P91N、I92Y、I92N、I92S、Y93H、Y93F、Y93F、I94E、I94H、D95A、S96H、S96C、N97D、N97E、R98K、R98Y、R98D、A99N、A99M、H102Y、L106A、L106S、L106K、L106F、L111S、Q113R、I116Y、K117T、V122I、E124N、K125A、K125Q、K127T、D129E、E130R、R132G、S135E、S136A、N139S、Q142R、S146G、Y152H、M153N、M153G、H159Q、H159K、H159R、E163D、K173E、K173Q、K173A、Q178A、D179P、V181L、T182K、P183S、K184R、K184P、Q188R、I189A、I189V、I189P、T200Q、P202S、F209I、F209H、F209E、F209L、F209T、M210T、M212R、M212D、M212N、M212S、M212A、M212Y、M212K、M212F、M212H、M212Q、M212I、M212S、M212V、I213Y、I213M、I213A、I213R、I213S、I213L、I213F、I213S、I213P、I213Q、I213N、I213K、I213V、I213Y、N214D、N214E、N214S、N214L、N214Y、N214V、N214P、N214H、N214C、N214A、N214T、N214R、N214Y、N214Q、S215H、S215G、S215K、S215R、S215P、S215A、S215N、S215T、S215L、S215V、S215Q、S215D、T216Q、T216Y、T216E、T216P、T216R、T216C、T216V、T216K、T216D、T216A、T216S、T216K、S217R、S217K、S217F、S217I、S217T、S217G、S217Y、S217N、S217H、S217E、S217F、S217C、S217E、S217D、D218I、D218G、D218V、D218C、D218P、D218M、D218R、D218L、D218S、D218A、D218Y、D218K、D218E、H219D、H219A、H219L、H219C、H219W、H219R、H219S、H219F、H219E、H219G、H219Q、H219A、L220V、L220S、L220T、L220P、L220M、L220A、L220H、L220E、L220G、L220D、L220F、Y221C、Y221V、Y221Q、Y221F、Y221S、Y221N,Y221T、Y221P、Y221L、Y221K、Y221W、Y221E、Y221V、Y221H、N227S、E238D、K252A、K252Q、T257A、D274M、D274N、D274S、D274F、D274G、D274H、D274E、F279S、F279I、F279P、F279D、F279L、F279N、F279M、F279H、F279C、F279A、F279G、F279W、E280L、P281S、P281H、P281K、P281A、P281W、P281L、P281Y、Q282L、Q282S、Q282A、Q282I、Q282R、Q282Y、Q282G、Q282W、Q282P、Q282E、Y283F、Y283N、A284T、A284G、A284P、A284V、A284R、A284D、A284E、A284S、A284H、A284K、A284I、A284W、A284M、Q292K、I299Y、Y307H、L310H、E311P、E311T、L313C、S314A、S314T、L315M、F316L、T317S、E318K、A319T、V320D、V320G、V320S、Q321A、W323R、N324S、I325T、E326K、E333D、K336R、L337I、L343V、A345V、A345T、N347L、N347S、E348A、E348S、E350K、G357R、H360L、H360A、C361R、V362A、E367G、N369I、Q370D、Q370H、Q370G、K371G、A375D、S377Y、Y387C、I397V、L399S、T405R、T409G、N410S、F424L、N429S、N429G、A436S、V439L、Q448L、C465S、K468Q、S473Y、K474T、E484D、I492V、E495G、K499E、P500L、T501P、P506S、D536E、或A539V的氨基酸置换,所述CVS编号参考SEQ ID NO:2的位置。
所述修饰的瓦伦烯合酶多肽可以含有任意一或多个所记载的氨基酸取代,以任意组合,具有或不具有额外的修饰。通常,本领域技术人员可以组合本文提供的多个修饰,只要所述修饰的多肽保留催还从任何合适的无环焦磷酸萜烯前体(包括但不限于FPP、GPP和GGPP)形成瓦伦烯和/或其它萜烯的能力。一般地,所获得的修饰的瓦伦烯合酶多肽表现与野生型瓦伦烯合酶相比相似的或增加的来自FPP的瓦伦烯的产量。在一些实例中,所获得的修饰的瓦伦烯合酶多肽表现与野生型瓦伦烯合酶相比降低的来自FPP的瓦伦烯的产量。
本文还提供了编码任一本文提供的瓦伦烯合酶多肽的核酸分子。在具体的实例中,所述核酸序列可以被密码子优化,例如,以增加所编码的序列的表达。特定的密码子使用取决于所述修饰的多肽在其中被表达的宿主生物体。本领域技术人员熟悉用于在细菌或酵母(包括例如大肠杆菌或酿酒酵母)表达的优化的密码子。例如,密码子使用信息可以从Codon Usage Database获得,其从kazusa.or.jp.codon获得(见Richmond(2000)Genome Biology,1:241对该数据库的描述).也见,Forsburg(2004)Yeast,10:1045-1047;Brown et al.(1991)Nucleic Acids Research,19:4298;Sharp et al.(1988)NucleicAcids Res.,12:8207-8211;Sharp et al.(1991)Yeast,657-78。在本文的实例中,本文提供的核酸序列基于酿酒酵母中的密码子使用进行密码子优化。
本文提供的修饰的多肽和编码核酸分子可以通过本领域技术人员已知的标准重组DNA技术产生。可以采用本领域已知的任何方法来实现靶蛋白中任意一或多个氨基酸的突变。方法包括编码核酸分子的标准定点诱变或随机诱变,或固相多肽合成方法。例如,如本文所描述,编码瓦伦烯合酶多肽的核酸分子可以进行诱变,例如所述编码核酸的随机诱变(其通过易错PCR)、定点诱变、重叠PCR、基因改组或其它重组方法。编码所述多肽的核酸然后可以被导入宿主细胞以异源地表达。因此,本文还提供了编码任一本文提供的修饰的多肽的核酸分子。在一些实例中,所述修饰的瓦伦烯合酶多肽可以合成产生,例如使用固相或溶液相肽合成。
本文提供的所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽表现瓦伦烯合酶活性。当以合适的测定进行测试时(在相同条件下),如下文所述,所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽与SEQID NO:2所示的野生型瓦伦烯合酶多肽相比可以从FPP产生大约相同量或增加的量或更多的瓦伦烯。例如,与由SEQ ID NO:2的瓦伦烯合酶从FPP产生的瓦伦烯的量相比,本文提供的修饰的瓦伦烯多肽通常从FPP产生至少40%的瓦伦烯的量,例如至少45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、105%、110%、115%,或120%的量。
一般而言,与SEQ ID NO:2所示野生型瓦伦烯合酶的产量相比,本文提供的修饰的多肽表现从FPP产生瓦伦烯的产量的增加。例如,当以合适的测定进行测试时(在相同条件下),所述修饰的瓦伦烯合酶多肽与SEQ ID NO:2所示的野生型瓦伦烯合酶多肽相比可以从FPP产生更多的或更大量的或或增加的瓦伦烯。在一些实例中,与SEQ IDNO:2的野生型瓦伦烯合酶从FPP产生的瓦伦烯的量相比,本文提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽可以从FPP多产生例如110%-5000%,例如150%-2000%,例如150%-1000%、500%-2000%或200%-500%的瓦伦烯的量。例如,本文提供的修饰的瓦伦烯合酶从FPP产生的瓦伦烯的量比SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶从FPP产生的瓦伦烯的量增加至少或至少约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、250%、300%、350%、400%、500%或更多。应当理解瓦伦烯产量10%的增加或多产生10%瓦伦烯,例如,指的是由修饰的多肽产生的瓦伦烯的水平是由SEQ ID NO:2所示的野生型瓦伦烯合酶产生的瓦伦烯水平的110%或约110%。作为产生的瓦伦烯的倍数增加,本文提供的所述修饰的瓦伦烯合酶从FPP产生瓦伦烯的量是SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶从FPP产生的瓦伦烯的量的至少1.1倍,通常至少1.5倍或至少2倍。例如,本文提供的所述修饰的瓦伦烯合酶从FPP产生瓦伦烯的量是SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶从FPP产生的瓦伦烯的量的至少或至少约或1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多。
基于本文的描述,本领域技术人员能够鉴定比野生型瓦伦烯合酶产生更多瓦伦烯的修饰的瓦伦烯合酶。例如,如本文所述,可以针对导致与野生型瓦伦烯合酶的产量相比增加的从FPP产生瓦伦烯的产量来选择修饰的瓦伦烯合酶。这在本文实施例中进行了示例。例如,实施例3描述产生编码修饰的瓦伦烯合酶多肽的突变体瓦伦烯合酶核酸分子并且选择转化子,所述转化子与含有野生型基因的相比产生升高水平的瓦伦烯。对选出的转化子的DNA进行测序确定所编码的变体瓦伦烯合酶中赋予增加的特性的氨基酸改变。本领域技术人员能够产生并筛选突变体并选择那些具有本文所述的改变的特性的突变体。F部分描述了评估不同特性和活性的测定,例如,瓦伦烯或诺卡酮的产生。
在一些实例中,本文提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽与野生型瓦伦烯合酶相比表现改变的底物特异性和/或产物选择性,和/或改变的产物分布(即改变的萜烯量和/或类型)。在另一些实例中,本文提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽与SEQ ID NO:3(V18)或SEQID NO:4(V19)所示的变体瓦伦烯合酶多肽相比表现改变的底物特异性和/或产物选择性,和/或改变的产物分布(即改变的萜烯量和/或类型)。野生型瓦伦烯合酶产生的萜烯的产物分布包括瓦伦烯,以及多种其它萜烯产物(如萜烯副产物或由其衍生的产物)包括,例如,β-芹子烯、τ-芹子烯、艾里莫芬酮、7-表-α-芹子烯、大根香叶烯A和β-榄香烯。如本文实施例8所描述,野生型瓦伦烯合酶产生的作为总萜烯百分比的萜烯产物分布的比例与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的变体瓦伦烯合酶多肽类似。
本文提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽包括那些表现改变的产物分布的瓦伦烯合酶多肽,使得产生占总萜烯产物百分比的更高百分比的瓦伦烯,而产生降低百分比的另一或多种萜烯产物(如萜烯副产物或由其衍生的产物)。例如,本文提供了修饰的瓦伦烯合酶多肽,其比SEQ ID NO:2所示野生型瓦伦烯合酶产生更高百分比的瓦伦烯,所述百分比为占所产生的萜烯总量的百分比。所产生的瓦伦烯的量占总萜烯的百分比增加0.01%-90%,例如1%-10%,例如增加大于或约0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。在一些实例中,本文提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽比SEQ ID NO:2所示野生型瓦伦烯合酶或SEQ ID NO:3或4所示的变体瓦伦烯合酶产生更少总萜烯百分比的除瓦伦烯外的萜烯产物。除瓦伦烯外的产物的百分比可以被降低大于或约或0.01%-90%,1%-80%,5%-80%,10%-60%或0.01%-20%,例如降低大约或约0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。例如,本文提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽比SEQ ID NO:2、3或4所示的瓦伦烯合酶多肽产生降低的β-榄香烯占所产生的总萜烯的百分比。β-榄香烯占所产生的总萜烯的百分比可以被降低大于或约或0.01%-50%、(即β-榄香烯的量减少0.01%-50%),0.01%-20%,例如,1%-10%,例如降低大于或约0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%,10%、20%、30%、40%或50%。基于本文描述和实施例8,本领域技术人员能够坚定这样的修饰的瓦伦烯合酶。这样的显示改变的产物分布如降低的β-榄香烯形成的修饰的瓦伦烯合酶多肽的例子示于下文C.3部分。
本文提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽还可以显示其他活性和/或特性。所述修饰的瓦伦烯合酶多肽可以显示,例如,增加的催化活性、增加的底物(如FPP)结合、增加的稳定性和/或增加的在宿主细胞中的表达。这样的改变的活性和特性可以导致从FPP产生瓦伦烯的增加。在另外的实例中,所述修饰的瓦伦烯合酶多肽可以催化从任何合适的底物(如FPP、GPP、GGPP)形成除瓦伦烯外的萜烯。例如,所述修饰的瓦伦烯合酶可以产生一或多种单萜或二萜,或一或多种除瓦伦烯外的倍半萜。一般地,所述修饰的瓦伦烯合酶多肽产生比任何其它萜烯都更多的瓦伦烯。
在下面的小节中,描述了本文示例性的修饰的瓦伦烯合酶多肽和编码核酸分子。
1.修饰的瓦伦烯合酶多肽-示例性氨基酸置换
本文本文提供了修饰的瓦伦烯合酶多肽,其在瓦伦烯合酶多肽中含有一或多个氨基酸置换,并且显示瓦伦烯合酶活性。与不含有所述氨基酸置换的瓦伦烯合酶多肽相比和/或与SEQ ID NO:2所示野生型瓦伦烯合酶多肽相比,所述修饰的瓦伦烯合酶多肽可以显示50%-5000%,例如50%-120%,100%-500%或110%-250%的瓦伦烯从FPP的产生。
一般地,与不含有所述氨基酸置换的瓦伦烯合酶多肽相比,例如与SEQ ID NO:2所示野生型瓦伦烯合酶多肽相比,本文提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽显示瓦伦烯从FPP产生的增加。例如,所述修饰的瓦伦烯合酶多肽可以以这样的量从FPP产生瓦伦烯,所述量是SEQ ID NO:2所示野生型瓦伦烯合酶在相同条件下从FPP产生的瓦伦烯的量的至少或约至少101%、102%、103%、104%、105%、106%、107%、108%、109%、110%、115%、120%、125%、130%、135%、140%、145%、150%、160%、170%、180%、200%、250%、300%、350%、400%、500%、1500%、2000%、3000%、4000%、5000%。例如,瓦伦烯产量被增加至少或约至少1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍或更多。
在具体的实例中,所述修饰的瓦伦烯合酶多肽在鉴定为与增加的瓦伦烯产量相关的一或多个氨基酸位置处含有氨基酸置换。可以使用鉴定那些导致增加瓦伦烯产量的位置的诱变和选择或筛选方法来鉴定这样的位置。例如,如本文实施例3所描述,通过易错PCR产生瓦伦烯合酶突变体和编码核酸并对其筛选以鉴定那些瓦伦烯合酶突变体,其导致与SEQ ID NO:2所示瓦伦烯合酶产生的瓦伦烯相比升高的瓦伦烯水平。变体V18和V19,其含有此类突变的组合,与野生型相比至少多10倍的瓦伦烯产量(见实施例3B)。另外的示例性突变体描述于实施例中,其与V18和V19和/或SEQ IDNO:2所示野生型瓦伦烯合酶多肽相比显示增加的瓦伦烯产量。
所述修饰的瓦伦烯合酶多肽可以含有至少或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48,49、50、51、53、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、59,70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、82、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115或更多个氨基酸置换。也可以包括额外的修饰,例如***或缺失。所述修饰的多肽通常含有至少29个氨基酸置换。所示氨基酸置换可以位于SEQ ID NO:2、289-291、346、347、752、882或883任一所示的瓦伦烯合酶或其任何变体中。例如,所述置换可以位于任何柑橘属瓦伦烯合酶多肽中,例如SEQ ID NO:2、289-291、752或886中任一所示的多肽或其变体。如上所述,所述修饰的瓦伦烯合酶多肽显示与SEQ ID NO:2所示瓦伦烯合酶具有少于95%的序列相同性,例如62%-94.9%或约62%-94.9%序列相同性,并可以与SEQ ID NO:2所示瓦伦烯合酶多肽含有至少75%序列相同性和少于80%、81%、82%、83%、85%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%或94%序列相同性。例如,本文提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽显示与SEQ ID NO:2具有至少或约或82%以及少于95%的序列相同性。
例如,本文提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽在相应于SEQ ID NO:2所示瓦伦烯合酶的位置1、2、3、4、5、6、7、11、19、20、23、24、28、38、50、53、54、55、56、57、58、60、62、69、78、82、88、93、97、98、102、106、111、113、125、132、152、153、159、163、173、184、188、189、200、202、209、210、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、227、238、252、257、274、279、280、281、282、283、284、292、297、299、307、310、311、313、314、315、316、317、318、319、320、321、323、324、325、326、333、336、337、343、345、347、348、350、357、360、361、362、367、369、370、371、375、377、387、397、399、405、409、410、424、429、436、439、448、465、468、473、474、484、492、495、499、500、501、506、536或539的一或多个位置处含有氨基酸置换(取代)。
例如,本文提供的修饰的瓦伦烯合酶在相应于CVS编号位置M1、S2、S3、G4、E5、T6、F7、A11、R19、N20、L23、K24、D28、Q38、R50、T53、D54、A55、E56、D57、K58、V60、K62、V69、F78、I82、K88、Y93、N97、R98、H102、L106、L111、Q113、K125、R132、Y152、M153、H159、E163、K173、K184、Q188、I189、T200、P202、F209、M210、M212、I213、N214、S215、T216、S217、D218、H219、L220、Y221、N227、E238、K252、T257、D274、F279、E280、P281、Q282、Y283、A284、Q292、N297、I299、Y307、L310、E311、L313、S314、L315、F316、T317、E318、A319、V320、Q321、W323、N324、I325、E326、E333、K336、L337、L343、A345、N347、E348、E350、G357、H360、C361、V362、E367、N369、Q370、K371、A375、S377、Y387、I397、L399、T405、T409、N410、F424、N429、V439、A436、Q448、C465、K468、S473、K474、E484、I492、E495、K499、P500、T501、P506、D536或A539的一或多个氨基酸位置处含有氨基酸置换(取代),所述CVS编号参考SEQ ID NO:2所示瓦伦烯合酶。应当理解可以对其它瓦伦烯合酶多肽内相应位置的天然或内源残基进行本文所述的任何氨基酸置换,所述其它瓦伦烯合酶多肽包括例如SEQ ID NO:2、289-291、752或886任一所示的瓦伦烯合酶多肽或其变体.如图1所示,相应的位置和氨基酸置换可以通过与SEQ ID NO:2的比对来确定。可以用任何氨基酸残基置换在该位置处的天然或内源残基。一般而言,所述氨基酸残基是不降低或消除酶促活性的氨基酸残基。在一些实例中,所述氨基酸取代是保守性取代,例如表2所示的取代。在另外的实例中,所述氨基酸取代不是保守性取代。例如,所述氨基酸可以被精氨酸(R)、赖氨酸(K)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、脯氨酸(P)、苏氨酸(T)、亮氨酸(L)、组氨酸(H)、天冬氨酸(D)、甘氨酸(G)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)、天冬酰胺(N)、丝氨酸(S)、半胱氨酸(C)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、酪氨酸(Y)、或色氨酸(W)置换。
可以包括在提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽的示例性氨基酸取代(或置换)包括但不限于CVS编号M1T、S2R、S2K、S2E、S2Q、S2P、S2T、S2L、S2H、S2A、S2V、S3D、S3R、S3G、S3I、S3E、S3V、S3A、S3T、S3L、S3M、S3N、G4K、G4V、G4N、G4I、G4R、G4S、G4P、G4A、G4E、G4F、G4C、G4T、G4L、E5A、E5G、E5S、E5T、E5D、E5H、E5I、E5P、E5L、E5N、T6R、T6V、T6D、T6L、T6A、T6E、T6K、T6S、T6G、T6C、T6M、T6Y、F7C、F7A、F7Q、F7K、F7S、F7G、F7T、F7L、F7R、F7P、A11T、R19K、R19P、N20D、L23S、K24A、K24Q、K24Y、D28G、Q38V、Q38A、Q38N、R50G、T53L、T53R、D54A、D54P、D54C、A55T、A55P、A55R、A55V、A55Q、E56G、E56P、E56F、E56A、E56T、E56Q、D57R、D57P、D57S、D57Q、D57A、K58Q、K58R、K58P、K58E、K58A、V60I、V60G、K62R、V69I、F78L、I82V、K88Q、K88A、Y93H、N97D、R98K、H102Y、L106A、L106S、L106K、L106F、L111S、Q113R、K125A、K125Q、R132G,Y152H、M153N、M153G、H159Q、H159K、H159R、E163D、K173E、K173Q、K173A、K184R、Q188R、I189A、I189V、I189P、T200Q、P202S、F209I、F209H、F209E、F209L、F209T、M210T、M212R、M212D、M212N、M212S、M212A、M212Y、M212K、M212F、M212H、M212Q、I213Y、I213M、I213A、I213R、I213S、I213L、I213F、I213S、I213P、I213Q、I213N、I213K、I213V、N214D、N214E、N214S、N214L、N214Y、N214V、N214P、N214H、N214C、N214A、N214T、N214R、S215H、S215G、S215K、S215R、S215P、S215A、S215N、S215T、S215L、S215V、S215Q、T216Q、T216Y、T216E、T216P、T216R、T216C、T216V、T216K、T216D、T216A、T216S、S217R、S217K、S217F、S217I、S217T、S217G、S217Y、S217N、S217H、S217E、S217F、S217C、D218I、D218G、D218V、D218C、D218P、D218M、D218R、D218L、D218S、D218A、D218Y、D218K、H219D、H219A、H219L、H219C、H219W、H219R、H219S、H219F、H219E、L220V、L220S、L220T、L220P、L220M、L220A、L220H、L220E、L220G、L220D、Y221C、Y221V、Y221Q、Y221F、Y221S、Y221N,Y221T、Y221P、Y221L、Y221K、Y221W、Y221E、Y221V、N227S、E238D、K252A、K252Q、T257A、D274M、D274N、D274S、D274F、D274G、D274H、D274E、F279S、F279I、F279P、F279D、F279L、F279N、F279M、F279H、F279C、F279A、F279G、F279W、E280L、P281S、P281H、P281K、P281A、P281W、P281L、P281Y、Q282L、Q282S、Q282A、Q282I、Q282R、Q282Y、Q282G、Q282W、Q282P、Q282E、Y283F、Y283N、A284T、A284G、A284P、A284V、A284R、A284D、A284E、A284S、A284H、A284K、A284I、A284W、A284M、Q292K、I299Y、Y307H、L310H、E311P、E311T、L313C、S314A、S314T、L315M、F316L、T317S、E318K、A319T、V320D、V320G、V320S、Q321A、W323R、N324S、I325T、E326K、E333D、K336R、L337I、L343V、A345V、A345T、N347L、N347S、E348A、E348S、E350K、G357R、H360L、H360A、C361R、V362A、E367G、N369I、Q370D、Q370H、Q370G、K371G、A375D、S377Y、Y387C、I397V、L399S、T405R、T409G、N410S、F424L、N429S、N429G、A436S、V439L、Q448L、C465S、K468Q、S473Y、K474T、E484D、I492V、E495G、K499E、P500L、T501P、P506SD536E或A539V,所述CVS编号参考SEQ ID NO:2所示位置。
所述修饰的瓦伦烯合酶多肽可以含有任意一或多个所记载的氨基酸取代,以任意组合,具有或不具有额外的修饰。
在一些实例中,本文提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽在一或多个相应于60、97、209、212、214、221、238、292、333、345、369、405、429、473和/或536位(参照SEQ ID NO:2所示的位置)的位置处含有氨基酸置换。例如,可以包括在所提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽中的氨基酸取代(或置换)包括但不限于CVS编号的V60I、V60G、N97D、F209I、F209H、F209E、F209L、F209T、M212R、M212D、M212N、M212S、M212A、M212Y、M212K、M212F、M212H、M212Q、N214D、N214E、N214S、N214L、N214Y、N214V、N214P、N214H、N214C、N214A、N214T、N214R、Y221C、Y221V、Y221Q、Y221F、Y221S、Y221N、Y221T、Y221P、Y221L、Y221K、Y221W、Y221E、Y221V、E238D、Q292K、N97D、E333D、A345V、A345T、N369I、T405R、N429S、N429G、S473Y、和/或D536E,所述CVS编号是参考SEQ ID NO:2所示位置的编号。
其它氨基酸置换液可以包含在本文提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽中。例如,本文提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽在一或多个相应于24、38、58、60、88、93、97、98、125、173、184、209、212、214、219、221、238、252、292、321、333、345、369、377、405、429、436、501和/或536(参照SEQ ID NO:2所示的位置)的位置处含有氨基酸置换。如本文实施例3所述,这样的氨基酸位置通过实验或建模鉴定为诱变的靶残基。例如,所述残基定位为表面残基和/或鉴定为耐受的(如对酶活具有中性效应)或导致改善的瓦伦烯产量。例如,可以包括在所提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽中的氨基酸取代(或置换)包括但不限于CVS编号的K24A、K24Q、D28G、Q38V、Q38A、Q38N、K58Q、K58R、K58P、K58E、K58A、V60I、V60G、K88Q、K88A、Y93H、N97D、R98K、K125A、K125Q、K173E、K173Q、K173A、K184R、F209I、F209H、F209E、F209L、F209T、M212R、M212D、M212N、M212S、M212A、N214D、N214E、N214S、N214L、N214Y、N214V、M212Y、M212K、M212F、M212H、M212Q、H219D、H219A、H219L、H219C、H219W、H219R、H219S、H219F、H219E、Y221C、Y221V、Y221Q、Y221F、Y221S、Y221N、Y221T、Y221P、Y221L、Y221K、Y221W、Y221E、Y221V、N227S、E238D、K252Q、Q292K、Q321A、E333D、A345V、A345T、N369I、S377Y、T405R、N429S、N429G、A436S、T501P、和/或D536E,所述CVS编号是参考SEQ ID NO:2所示位置的编号。
在本文一些实例中,修饰的瓦伦烯合酶多肽在60、209、238和292位含有氨基酸置换。例如,可以包括在所提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽的氨基酸取代(或置换)包括但不限于,在位置V60的置换,例如氨基酸置换V60I或V60G;在位置F209的置换,例如氨基酸置换F209I、F209H、F209E、F209L、F209T;在位置E238的置换,例如氨基酸置换E238D;和在位置Q292的置换,例如氨基酸置换Q292K,各自编号是参考SEQ ID NO:2所示位置的CVS编号。在本文另一些实例中,修饰的瓦伦烯合酶多肽在60、125、173、209、238、252和292位含有氨基酸置换。例如,可以包括在所提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽的氨基酸取代(或置换)包括但不限于,在位置V60的置换,例如氨基酸置换V60I或V60G;在位置K125的置换,例如氨基酸置换K125A或K125Q;在位置K173的置换,例如氨基酸置换K173E、K173Q或K173A;在位置F209的置换,例如氨基酸置换F209I、F209H、F209E、F209L、F209T;在位置E238的置换,例如氨基酸置换E238D;在位置K252的置换,例如氨基酸置换K252Q;和在位置Q292的置换,例如氨基酸置换Q292K,各自编号参考SEQ ID NO:2所示位置。
表3提供在鉴定的位置处的示例性氨基酸置换的非限制性实例,相应于SEQ IDNO:2所示的瓦伦烯合酶多肽的氨基酸位置。其中包括的是示例性单突变和组合突变。提及这样的突变时,第一个氨基酸(单字母缩写)相应于被置换的氨基酸,编号相应于SEQ ID NO:2所示瓦伦烯合酶多肽的位置,而第二个氨基酸(单字母缩写)相应于选定的氨基酸,其在该位置置换第一氨基酸。这些突变可以被并入任何瓦伦烯合酶,包括,例如,SEQ ID NO:2、289-291、752或886所示的野生型瓦伦烯合酶或其变体。在一些实例中,所述修饰被并入SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶。这获得表中提供的示例性瓦伦烯合酶突变体,以及编码核酸分子。还提供了序列标识符(SEQ ID NO),其示出示例性氨基酸序列和所述修饰的瓦伦烯合酶多肽的编码核酸序列。
2.结构域交换
本文提供了修饰萜烯合酶多肽,尤其是修饰的瓦伦烯合酶多肽,其是含有交换(缺失和***)的嵌合多肽,其通过缺失其中一或多个结构域的氨基酸残基或其部分并***异源氨基酸序列。在一些实例中,所述异源序列是随机化的氨基酸序列。在另外的实例中,所述异源序列是来自另一种萜烯合酶多肽的相应结构域或区域或其部分的连续的氨基酸序列。被置换或***的异源序列通常包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40个或更多的氨基酸。在所述异源序列为来自另一萜烯合酶的相应结构域或其部分的实例中,所述异源序列通常包括所述相应结构域或区域或部分的至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多的连续氨基酸。在此类实例中,邻近所述异源相应结构域或区域或其部分的残基也可以包括在本文提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽中。
在本文提供的交换突变体的一个实例中,瓦伦烯合酶的至少一个结构域或区域或其部分被来自另一萜烯合酶多肽的相应结构域或区域或其部分的连续氨基酸序列置换。在一些实例中,2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多的结构域或区域或其部分被来自另一萜烯合酶多肽的相应结构域或区域或其部分的连续氨基酸序列置换。
瓦伦烯合酶多肽的任何结构域或区域或其部分可以被异源氨基酸序列置换,例如来自另一萜烯合酶的相应结构域或区域的异源序列。结构域或区域可以是结构性结构域或功能性结构域。本领域技术人员熟悉萜烯合酶中的结构域或区域。功能性结构域包括,例如,催化结构域或其部分。功能性结构域还可以包括被鉴定为与底物特异性和产物分布相关的功能性结构域,例如,Aristolochene特异性结构域、比例决定结构域、Vestispiradiene特异性结构域、底物结合结构域或莨菪属特异性结构域或其它合酶中的其它类似结构域(见例如美国专利号5,824,774)。结构性结构域可以包括无结构环1;α螺旋1;无结构环2;α螺旋2;无结构环3;α螺旋3;无结构环4;α螺旋4;无结构环5;α螺旋5;无结构环6;α螺旋6;无结构环7;α螺旋7;无结构环8;α螺旋8;无结构环9;α螺旋A;A-C环;α螺旋C;无结构环11;α螺旋D;无结构环12;α螺旋D1;无结构环13;α螺旋D2;无结构环14;α螺旋E;无结构环15;α螺旋F;无结构环16;α螺旋G1;无结构环17;α螺旋G2;无结构环18;α螺旋H1;无结构环19;α螺旋H2;无结构环20;α螺旋H3;无结构环21;α螺旋a-1;无结构环22;α螺旋I;无结构环23;α螺旋J;J-K环;α螺旋K;和/或无结构环25的全部或一部分(见例如图2)。
本领域技术人员熟悉多种萜烯合酶并能够鉴定其相应结构域或区域或部分氨基酸。下表5B示出示例性萜烯合酶的序列。在本文具体的实例中,本文提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽结构域交换突变体含有来自萜烯合酶多肽的相应结构域或区域或其部分的异源序列,所述萜烯合酶多肽是葡萄瓦伦烯合酶(SEQ ID NO:346和347)、烟草5-epi-aristolochene合酶(TEAS;SEQ ID NO:295或941)或埃及莨菪(Hyoscyamus muticus)premnaspirodiene合酶(HPS;SEQ ID NO:296或942)。
一般地,所获得的修饰的瓦伦烯合酶显示瓦伦烯合酶活性以及从FPP产生瓦伦烯的能力。例如,与不含有修饰(如氨基酸置换或结构域或区域的氨基酸残基交换)的瓦伦烯合酶多肽相比和/或与SEQ ID NO:2所示野生型瓦伦烯合酶多肽相比,所述修饰的瓦伦烯合酶多肽可以显示50%-5000%,例如50%-120%,100%-500%或110%-250%的瓦伦烯从FPP的产生。一般地,如本文实施例所示,与不含有所述修饰的瓦伦烯合酶多肽相比,例如与SEQ ID NO:2所示野生型瓦伦烯合酶相比,所述修饰的瓦伦烯合酶多肽显示瓦伦烯从FPP产生的增加。例如,所述修饰的瓦伦烯合酶多肽可以以这样的量从FPP产生瓦伦烯,所述量是不含有所述修饰的野生型瓦伦烯合酶在相同条件下从FPP产生的瓦伦烯的量的至少或约101%、102%、103%、104%、105%、106%、107%、108%、109%、110%、115%、120%、125%、130%、135%、140%、145%、150%、160%、170%、180%、200%、250%、300%、350%、400%、500%、1500%、2000%、3000%、4000%、5000%。例如,所述瓦伦烯产量被增加至少1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍或更多。
在本文具体的实例中,本文提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽是交换突变体,其中一或多个结构性结构域的全部或部分被另一萜烯多肽的相应结构性结构域置换。下表4A用基于TEAS编号或CVS编号标示出结构性结构域,所述编号是对全部萜烯合酶的常见编号方案,其基于所述合酶分别与TEAS或CVS的比对(见例如图4)。因此,可以在其它萜烯合酶中鉴定出所述相应的结构域。本文图2进一步示出示例性萜烯合酶中的结构性结构域和区域,以及各自相应的氨基酸残基。
表4B示出本文提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽中被置换的示例性结构性结构域或结构域或其部分,并示出来自另外的萜烯合酶的示例性的相应置换残基。瓦伦烯合酶中如下的任意结构域或区域或其部分可以摆来自另一萜烯合酶的相应区域置换,包括但不限于葡萄瓦伦烯合酶(SEQ ID NO:346和347)、TEAS(SEQ ID NO:295和941)或HPS(SEQ ID NO:296和942)。
例如,在本文提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽中,瓦伦烯合酶无结构环1的一或多个部分和α螺旋1(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸3-41)可以被来自葡萄Vitis vinifera的相应区域置换(相应于SEQ ID NO:346的氨基酸3-51);瓦伦烯合酶的无环结构2(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸53-58)可以被来自TEAS的相应区域(相应于SEQ IDNO:295或941的氨基酸58-63)置换;α螺旋3的一部分(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸85-89)被HPS(SEQ ID NO:942)的氨基酸残基93-97置换;α螺旋3的一部分和无结构环4(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸85-99)被HPS(SEQ ID NO:942)的氨基酸残基93-110置换;瓦伦烯合酶无结构环5和邻近残基(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸115-146)被来自葡萄的相应区域(相应于SEQ ID NO:346的氨基酸128-159)置换;无结构环6和邻近残基(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸152-163)被来自HPS的相应区域(相应于SEQID NO:942的氨基酸163-174);无结构环7(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸174-184)被来自HPS的相应区域(相应于SEQ ID NO:942的氨基酸185-193)置换;无结构环9和邻近残基(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸212-221)被来自HPS的相应区域(相应于SEQ IDNO:942的氨基酸221-228)置换;α螺旋D1(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸310-322)被来自HPS的相应区域(相应于SEQ ID NO:942的氨基酸317-329)置换;和/或J-K环(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸522-534)被来自HPS的相应区域(相应于SEQ ID NO:942的氨基酸527-541)置换。造成的修饰可以是氨基酸***、缺失或氨基酸置换。例如,示例性氨基酸置换包括但不限于CVS编号的S3T、G4Q、E5V、T6K、F7N、T10V、D12N、S16N、L17I、R19G、N20D、H21Q、L23I、K24T、G25Y、A26T、S27P、D28E、F29D、D33T、H34R、T35A、A36C、T37K、Q38E、R40Q、H41I、T53L、D54A、A55T、E56G、D57R、A85M、I86L、Q87D、K88H、L89I、C90Y、P91N、I92Y、I92N、I92S、Y93F、Y93F、I94E、I94H、D95A、S96H、S96C、N97E、R98Y、R98D、A99N、A99M、I116Y、K117T、V122I、E124N、K127T、D129E、E130R、S135E、S136A、N139S、Q142R、S146G、Q178A、D179P、V181L、T182K、P183S、K184P、M212I、M212S、M212V、I213Y、N214Y、N214Q、S215D、T216K、S217E、S217D、D218E、H219G、H219Q、H219A、L220F、Y221K或Y221H,所述CVS编号是参考SEQ ID NO:2所示位置的编号。
示例性的交换修饰,即缺失瓦伦烯合酶中的结构域或区域并***来自另一萜烯合酶相应结构域或区域的异源氨基酸,示于表4C。指明了相应于SEQ ID NO:2所示瓦伦烯合酶的残基的被置换(缺失)氨基酸,以及来自其他萜烯合酶相应结构域或区域的***的氨基酸。应理解尽管该表提及根据SEQ ID NO:2所示的CVS编号的瓦伦烯合酶氨基酸位置时,通过鉴定相应的氨基酸残基和区域,可以在其它瓦伦烯合酶进行类似的交换,特别是在其它柑橘属来源的瓦伦烯合酶(见例如图1和图2)。因此,这样的修饰可以在野生型瓦伦烯合酶,例如SEQ ID NO:2、289-291、346、347、752、882或883任一所示的瓦伦烯合酶或其任何变体中进行。例如,交换可以在上面表3所示的任何瓦伦烯合酶多肽中进行。例如,上述结构域取代可以对SEQ ID NO:3-66、68-127、348、723-731、734-742、746-751、810-832或857所示的修饰的瓦伦烯合酶多肽中的任一进行。在一实例中,对SEQ ID NO:4所示的瓦伦烯合酶进行上述的结构域取代。
可以使用本领域已知的用于产生嵌合多肽的任何方法来用第二萜烯合酶的相应结构域的全部或连续的部分置换第一萜烯合酶的结构域的全部或连续的部分。例如,任意两种萜烯合酶的相应结构域或区域可以使用本领域已知的任何合适的重组方法或通过体外合成来交换。示例性的重组方法是两步法重叠PCR方法,例如实施例3.D所描述的。在这样的方法中,可采用在编码第一萜烯合酶靶结构域或其部分的核酸的多个密码子位置处导入突变的引物,其中所述突变一起来自所述异源区域(即来自第二萜烯合酶的相应区域)。或者,例如,可以使用随机化的氨基酸来置换特性结构域或区域。应当理解克隆或重组方法中的引物错误、PCR错误和/或其它错误可以造成错误使得获得的交换或置换的区域或结构域并不显示与第二萜烯合酶相应区域相同的氨基酸序列。
在一示例性的基于PCR的方法中,第一步PCR使用(i)退火至被置换的区域下游的下游引物(如引物7-10.4,描述于实施例5;SEQ ID NO:339),和诱变引物,其包括在待交换或随机化的结构域或区域每侧在被引入靶基因的区域侧翼的同源序列大约15个(或足以实现退火的有效数目,如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、20、25个核苷酸或更多)核苷酸,和(ii)退火至被置换的区域上游的上游引物(如引物7-10.3,描述于实施例5;SEQ ID NO:338)以及相反链诱变引物,其也包括在待交换或随机化的结构域或区域每侧在被引入靶基因的区域侧翼的同源序列大约15个(或足以实现退火的有效数目,如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、20、25个核苷酸或更多)核苷酸。如果进行这样的置换,其中第一萜烯合酶基因的结构域或区域被第二萜烯合酶的相应结构域或区域置换,在第一萜烯合酶侧翼区之间的诱变引物中的核苷酸含有第二萜烯合酶相应区域的密码子。在要随机化结构域或区域中的氨基酸的实例中,在第一萜烯合酶侧翼区之间的诱变引物中的核苷酸含有随机核苷酸。然后使用上游和下游寡核苷酸(如引物7-10.3and7-10.4)进行重叠PCR连接两个片段。获得的PCR产物然后可以克隆进合适的载体以表达修饰的萜烯合酶。
此外,含有本文的交换突变的任意修饰的瓦伦烯合酶多肽可以含有一或多个另外的氨基酸置换。可以被包括在所提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽中的示例性氨基酸取代(或置换)包括但不限于M1T、S2R、S2K、S2E、S2Q、S2P、S2T、S2L、S2H、S2A、S2V、S3D、S3R、S3G、S3I、S3E、S3V、S3A、S3T、S3L、S3M、S3N、G4K、G4V、G4N、G4I、G4R、G4S、G4P、G4A、G4E、G4F、G4C、G4T、G4L、E5A、E5G、E5S、E5T、E5D、E5H、E5I、E5P、E5L、E5N、T6R、T6V、T6D、T6L、T6A、T6E、T6K、T6S、T6G、T6C、T6M、T6Y、F7C、F7A、F7Q、F7K、F7S、F7G、F7T、F7L、F7R、F7P、A11T、R19K、R19P、N20D、L23S、K24A、K24Q、K24Y、D28G、Q38V、Q38A、Q38N、R50G、T53L、T53R、D54A、D54P、D54C、A55T、A55P、A55R、A55V、A55Q、E56G、E56P、E56F、E56A、E56T、E56Q、D57R、D57P、D57S、D57Q、D57A、K58Q、K58R、K58P、K58E、K58A、V60I、V60G、K62R、V69I、F78L、I82V、K88Q、K88A、Y93H、N97D、R98K、H102Y、L106A、L106S、L106K、L106F、L111S、Q113R、K125A、K125Q、R132G、Y152H、M153N、M153G、H159Q、H159K、H159R、E163D、K173E、K173Q、K173A、K184R、Q188R、I189A、I189V、I189P、T200Q、P202S、F209I、F209H、F209E、F209L、F209T、M210T、M212R、M212D、M212N、M212S、M212A、M212Y、M212K、M212F、M212H、M212Q、I213Y、I213M、I213A、I213R、I213S、I213L、I213F、I213S、I213P、I213Q、I213N、I213K、I213V、N214D、N214E、N214S、N214L、N214Y、N214V、N214P、N214H、N214C、N214A、N214T、N214R、S215H、S215G、S215K、S215R、S215P、S215A、S215N、S215T、S215L、S215V、S215Q、T216Q、T216Y、T216E、T216P、T216R、T216C、T216V、T216K、T216D、T216A、T216S、S217R、S217K、S217F、S217I、S217T、S217G、S217Y、S217N、S217H、S217E、S217F、S217C、D218I、D218G、D218V、D218C、D218P、D218M、D218R、D218L、D218S、D218A、D218Y、D218K、H219D、H219A、H219L、H219C、H219W、H219R、H219S、H219F、H219E、L220V、L220S、L220T、L220P、L220M、L220A、L220H、L220E、L220G、L220D、Y221C、Y221V、Y221Q、Y221F、Y221S、Y221N,Y221T、Y221P、Y221L、Y221K、Y221W、Y221E、Y221V、N227S、E238D、K252A、K252Q、T257A、D274M、D274N、D274S、D274F、D274G、D274H、D274E、F279S、F279I、F279P、F279D、F279L、F279N、F279M、F279H、F279C、F279A、F279G、F279W、E280L、P281S、P281H、P281K、P281A、P281W、P281L、P281Y、Q282L、Q282S、Q282A、Q282I、Q282R、Q282Y、Q282G、Q282W、Q282P、Q282E、Y283F、Y283N、A284T、A284G、A284P、A284V、A284R、A284D、A284E、A284S、A284H、A284K、A284I、A284W、A284M、Q292K、I299Y、Y307H、L310H、E311P、E311T、L313C、S314A、S314T、L315M、F316L、T317S、E318K、A319T、V320D、V320G、V320S、Q321A、W323R、N324S、I325T、E326K、E333D、K336R、L337I、L343V、A345V、A345T、N347L、N347S、E348A、E348S、E350K、G357R、H360L、H360A、C361R、V362A、E367G、N369I、Q370D、Q370H、Q370G、K371G、A375D、S377Y、Y387C、I397V、L399S、T405R、T409G、N410S、F424L、N429S、N429G、A436S、V439L、Q448L、C465S、K468Q、S473Y、K474T、E484D、I492V、E495G、K499E、P500L、T501P、P506S、D536E或A539V,所述编号是参考SEQ ID NO:2所示位置的CVS编号。
除本文上述的交换修饰外,所述修饰的瓦伦烯合酶多肽可以含有任意一或多个所记载的氨基酸取代,以任意组合。
下表5A示出示例性的修饰的瓦伦烯合酶多肽,其含有一或多个交换修饰。第一个氨基酸(单字母缩写)相应于被置换的氨基酸,CVS编号相应于SEQ ID NO:2所示瓦伦烯合酶多肽的位置,而第二个氨基酸(单字母缩写)相应于选定的氨基酸,其在该位置置换第一氨基酸。应理解由于所述交换和***新结构域或区域,修饰的瓦伦烯合酶与不含所述交换的未修饰瓦伦烯合酶相比可以含有更多或更少的氨基酸。因此,所述置换的氨基酸编号可以改变。出于本文的目的,根据CVS编号来提及氨基酸置换(见例如图4)。因此,例如,在命名为V239的突变体中,在表5A中命名为F209→I210的氨基酸置换具有相对于SEQ ID NO:743所示瓦伦烯合酶多肽的突变F210I或根据CVS编号的F209I。还提供了序列标识符(SEQ ID NO),其示出示例性氨基酸序列和所述修饰的瓦伦烯合酶多肽的编码核酸序列。
3.产物分布突变体
可选地或除了实现上述增加的瓦伦烯产量外,本文提供的修饰的瓦伦烯合酶可以显示其它改变的特性。例如,本文提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽与SEQ ID NO:2所示的野生型瓦伦烯合酶相比显示改变的底物特异性和/或产物选择性,和/或改变的产物分布(即改变的萜烯相对量和/或类型)。在另一些实例中,本文提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽与SEQ ID NO:3(V18)或SEQ ID NO:4(V19)所示的变体瓦伦烯合酶多肽相比表现改变的底物特异性和/或产物选择性,和/或改变的产物分布(即改变的萜烯相对量和/或类型)。这样修饰的瓦伦烯合酶多肽可以用于改善瓦伦烯产生或生成的方法中,通过增加瓦伦烯的产物分布(与其它萜烯产物相比)。这获得这样的方法,其导致增加的或改善的瓦伦烯组合物瓦伦烯组合物,增加的或改善的瓦伦烯从反应介质的回收和/或导致易于分离瓦伦烯的方法。而且,这可以获得这样的方法,其还导致增加的通过氧化瓦伦烯的诺卡酮的回收。
例如,本文提供了修饰的瓦伦烯合酶多肽,与SEQ ID NO:2、3或4所示的瓦伦烯合酶多肽产生的β-榄香烯占总萜烯的百分比相比,其产生降低的β-榄香烯占总萜烯的百分比。β-榄香烯是大根香叶烯A的降解产物,并且是产生的大根香叶烯A的量度。因此,本文还提供了修饰的瓦伦烯合酶多肽,与其SEQ ID NO:2、3或4所示的瓦伦烯合酶多肽产生的大根香叶烯占总萜烯的百分比相比,其产生降低的大根香叶烯占总萜烯的百分比。例如,与由SEQ ID NO:2所示野生型瓦伦烯合酶产生的β-榄香烯以及由此的大根香叶烯A相比,本文提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽产生95%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%或更低水平的β-榄香烯和大根香叶烯A。β-榄香烯以及由此的大根香叶烯A占总萜烯产物的百分比被降低大于或约或0.01%至90%,如1%至80%,5%至80%,10%至60%或0.01%至20%。例如,萜烯β-榄香烯以及由此的大根香叶烯占总萜烯的百分比被降低至少或至少约0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。与SEQ ID NO:2所示野生型瓦伦烯合酶相比,本文提供的修饰的瓦伦烯合酶导致总瓦伦烯萜烯产量(占反应中产生的总萜烯的百分比)的增加的或改善。产生的或回收的瓦伦烯的重量百分比大于68%,例如大于或至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%或更多。
示例性的这样的修饰的瓦伦烯多肽是在相应于残基281、313、314、315、317、336、337和/或357的位置处含有氨基酸修饰的多肽,所述编号是参考SEQ ID NO:2所示位置的CVS编号。例如,氨基酸置换可以是在上述任一位置处的置换,其是P281S、P281H、P281K、P281A、P281W、P281L、P281Y、L313C、S314T、L315M、T317S、K336R、L337I、N347L、和/或G357R。示例性的氨基酸取代或置换相应于P281S、L313C、S314T、L315M、T317S、K336R、L337I、N347L和/或G357R,所述编号为参考SEQ ID NO:2所示位置的CVS编号。例如,本文提供的显示减少的或降低的β-榄香烯形成的修饰的瓦伦烯合酶多肽含有相应于P281S、L313C、S314T、L315M、T317S、K336R、L337I和G357R的氨基酸取代(置换),所述编号是参考SEQ ID NO:2所示位置的CVS编号。在一些实例中,本文提供的显示减少的或降低的β-榄香烯形成的修饰的瓦伦烯合酶多肽含有相应于P281S、L313C、S314T、L315M、T317S、K336R、L337I、N347L和G357R的氨基酸取代(置换),所述编号是参考SEQ ID NO:2所示位置的CVS编号。应该理解可以包括另外的或额外的氨基酸修饰,只要所述修饰的瓦伦烯合酶多肽显示改变的底物分布。
例如,示例性的显示改变的底物分布和降低的β-榄香烯形成的瓦伦烯合酶多肽包括下面所示的那些。因此,所示示例性瓦伦烯合酶多肽也产生更少的大根香叶烯A。例如:
K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/P281S/Q292K/L313C/S314T/L315M/T317S/Q321A/E333D/K336R/A345T/N347LG357R/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/P281S/Q292K/L313C/S314T/L315M/T317S/Q321A/E333D/K336R/L337I/A345T/N347L/G357R/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/P281S/Q292K/L313C/S314T/L315M/T317S/Q321A/E333D/K336R/L337I/A345T/G357R/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E
K24Q/Q38N/T53L/D54A/A55T/E56G/D57R/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/P281S/Q292K/L313C/S314T/L315M/T317S/Q321A/E333D/K336R/L337I/A345T/N347L/G357R/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24Q/Q38N/T53L/D54A/A55T/E56G/D57R/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/P281S/Q292K/L313C/S314T/L315M/T317S/Q321A/E333D/K336R/L337I/A345T/G357R/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
R19K/K24Q/Q38N/T53L/D54A/A55T/E56G/D57R/V60I/A85M/I86L/Q87D/K88H/L89I/C90Y/---→R91/---→A92/---→D93/I92→Y95/Y93→F96/I94→E97/D95→A98/S96→H99/N97→E100/R98→Y101/A99→N102/K125→Q128/K173→Q176/L175→---/V176→---/Q178→A179/D179→P180/V181→L182/T182→K183/P183→S184/K184→P185/F209→I210/M212→R213/N214→D215/H219→D220/Y221→V222/E238→D239/K252→Q253/P281→S282/Q292→K293/L313→C314/S314→T315/L315→M316/T317→S318/Q321→A322/E333→D334/K336→R337/L337→I338/A345→T346/G357→R358/N369→I370/S377→Y378/T405→R406/N429→G430/A436→S437/E484→D485/T501→P502/D536→E537;和/或
S3T/G4Q/E5V/---→S6/---→A7/---→S8/---→S9/---→L10/---→A11/---→Q12/---→I13/---→P14/---→Q15/---→P16/T6→K17/F7→N18/T10→V21/D12→N23/S16→N27/L17→I28/R19→G30/N20→D31/H21→Q32/L23→I34/K24→T35/G25→Y36/A26→T37/S27→P38/D28→E39/F29→D40/T31→---/D33→T43/H34→R44/T35→A45/A36→C46/T37→K47/Q38→E48/R40→Q50/H41→I51/T53→L63/D54→A64/A55→T65/E56→G66/D57→R67/V60→I70/A85→M95/I86→L96/Q87→D97/K88→H98/L89→I99/C90→Y100/---→R101/---→A102/---→D103/I92→Y105/Y93→F106/I94→E107/D95→A108/S96→H109/N97→E110/R98→Y111/A99→N112/K125→Q138/K173→Q186/L175→---/V176→---/Q178→A189/D179→P190/V181→L192/T182→K193/P183→S194/K184→P195/F209→I220/M212→V223/I213→Y224/N214→---/S215→---/T216→Q225/S217→D226/D218→E227/H219→A228/L220→F229/Y221→H230/E238→D247/K252→Q261/P281→S290/Q292→K301/L313→C322/S314→T323/L315→M324/T317→S326/Q321→A330/E333→D342/K336→R345/L337→I346/A345→T354/G357→R366/N369→I378/S377→Y386/T405→R414/N429→G438/A436→S445/E484→D493/T501→P510/D536→E545。
示例性的这样的多肽包括SEQ ID NO:5、61、63、350、351、744或887所示的或由SEQ ID NO:130、197、198、352、353、714或891任一所示的核酸序列或其简并密码子编码的多肽。
D.产生修饰的萜烯合酶和编码核酸分子的方法
还提供了产生修饰的萜烯合酶多肽的方法。所述方法可用于产生具有所需特性的萜烯合酶,包括但不限于,在与无环焦磷酸萜烯前体,例如FPP、GPP或GGPP反应时增加的萜烯产量;改变的产物分布;改变的底物特异性;和/或改变的位置选择性和/或立体选择性。可以使用任何本领域已知的方法产生修饰的萜烯合酶,并且任选地,筛选期望的的特性。在具体实例中,具有期望特性的修饰的萜烯合酶根据本文示范的方法通过突变产生。因此,本文提供了修饰的萜烯合酶和编码所述修饰的萜烯合酶的核酸分子,其是使用本文描述的方法产生。
本文提供的示例性方法是这样的方法,所述方法中通过用第二萜烯合酶相应结构域或区域(即异源结构域或区域)置换第一萜烯合酶的一或多个内源结构域或区域。在另外的实例中,第一萜烯合酶的两个或更多个内源结构域或区域被来自两种或更多种其它萜烯合酶,例如第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十萜烯合酶的相应的异源结构域或区域置换。因此,获得的修饰的萜烯合酶可以包括来自1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多种不同萜烯合酶的异源结构域或区域。在另外的实例中,所述方法还包括或改为用随机化的氨基酸残基置换第一萜烯合酶的一或多个结构域或区域。
本文提供的方法中可以使用任何的萜烯合酶。第一萜烯合酶(即待修饰的萜烯合酶)和第二(或第三、第四、第五等)萜烯合酶(即所述异源结构域或区域衍生自的萜烯合酶)可以属于相同或不同的类别。例如,本文提供的方法中包括这样的方法,其中待修饰的萜烯合酶是单萜、二萜或倍半萜合酶,并且所述一或多个异源结构域或区域所来自的萜烯合酶是单萜、二萜或倍半萜合酶。在一些实例中,本文提供的方法中使用的萜烯合酶全部是倍半萜合酶。示例性的倍半萜合酶包括但不限于,瓦伦烯合酶、TEAS、HPS和檀香烯合酶。可以用于本文方法的示例性萜烯合酶,包括其示例性氨基酸和和核酸序列,包括但不限于任何示于表5B中的。
在所提供的方法中,第一萜烯合酶的内源结构域的全部或连续的部分可以被被第二萜烯合酶相应异源结构域的全部或连续的部分置换。例如,来自第一萜烯合酶中的结构域或区域的3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个连续的氨基酸可被来自第二萜烯合酶相应区域的3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个连续氨基酸置换。在一些实例中,邻近所述第一萜烯合酶内源结构域的一或多个氨基酸残基也被置换,和/或邻近素数异源结构域的一或多个氨基酸残基也用于所述置换。此外,本文提供的方法还包括这样的方法,其中第一结构域的全部或连续的部分和第二邻近结构域的全部或连续的部分被来自另外的萜烯合酶的相应结构域(或其部分)置换。
可以被置换的结构域或区域包括功能性结构域或结构性结构域。萜烯合酶中可以用本文描述的方法置换的示例性的结构域或区域包括,但不限于:无结构环1(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸1-29);α螺旋1(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸30-39和44-52);无结构环2(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸53-58);α螺旋2(相应于SEQ IDNO:2的氨基酸59-71);无结构环3(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸72-78);α螺旋3(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸79-93);无结构环4(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸94-100);α螺旋4(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸101-114);无结构环5(相应于SEQ IDNO:2的氨基酸115-141);α螺旋5(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸142-152);无结构环6(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸153-162);α螺旋6(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸163-173);无结构环7(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸174-184);α螺旋7(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸185-194);无结构环8(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸195-201);α螺旋8(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸202-212);无结构环9(相应于SEQ IDNO:2的氨基酸213-222);α螺旋A(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸223-253);A-C环(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸254-266);α螺旋C(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸267-276);无结构环11(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸277-283);α螺旋D(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸284-305);无结构环12(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸306-309);α螺旋D1(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸310-322);无结构环13(相应于SEQID NO:2的氨基酸323-328);α螺旋D2(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸329);无结构环14(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸330-332);α螺旋E(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸333-351);无结构环15(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸352-362);α螺旋F(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸363-385);无结构环16(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸386-390);α螺旋G1(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸391-395);无结构环17(相应于SEQID NO:2的氨基酸396-404);α螺旋G2(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸405-413);无结构环18(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸414-421);α螺旋H1(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸422-428);无结构环19(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸429-431);α螺旋H2(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸432-447);无结构环20(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸448-450);α螺旋H3(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸451-455);无结构环21(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸456-461);α螺旋a-1(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸462-470);无结构环22(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸471-473);α螺旋I(相应于SEQ IDNO:2的氨基酸474-495);无结构环23(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸496-508);α螺旋J(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸509-521);J-K环(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸522-534);α螺旋K(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸535-541);和无结构环25(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸542-548)。这些结构域或区域,或其部分中的任一或多个可以使用本文提供的方法用来自另外的萜烯合酶的相应结构域置换。这些结构域是能够使用本领域公知的方法在任意萜烯合酶中鉴定的区域,例如,使用本领域技术人员已知的方法进行比对(见,例如图2)。这样的方法一般使匹配最大化,并包括方法例如使用人工比对和使用可获得的数字比对程序(例如BLASTP)和其它本领域技术人员已知的方法。通过比对SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶和任意其它萜烯合酶,可以在任意萜烯合酶中鉴定上述记载的任一结构域或区域。
在本文提供的方法的一些实例中、第一萜烯合酶中相应于瓦伦烯合酶无结构环1和α螺旋1的部分的区域(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸3-41)被第二萜烯合酶的相应区域置换;第一萜烯合酶中相应于无结构环2的区域(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸53-58)被第二萜烯合酶的相应区域置换;第一萜烯合酶中相应于α螺旋3的部分的区域(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸85-89)被第二萜烯合酶的相应区域置换;第一萜烯合酶中相应于α螺旋3和无结构环4的部分的区域(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸85-99)被第二萜烯合酶的相应区域置换;第一萜烯合酶中相应于无结构环6以及邻近残基的区域(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸152-163)被第二萜烯合酶的相应区域置换;第一萜烯合酶中相应于无结构环7的区域(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸174-184)被第二萜烯合酶的相应区域置换;第一萜烯合酶中相应于无结构环9以及邻近残基的区域(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸212-221)被第二萜烯合酶的相应区域置换;第一萜烯合酶中相应于α螺旋D1的区域(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸310-322)被第二萜烯合酶的相应区域置换;和/或第一萜烯合酶中相应于J-K环的区域(相应于SEQ ID NO:2的氨基酸522-534)被第二萜烯合酶的相应区域置换。
例如,本文提供了方法,其中瓦伦烯合酶的无结构环1的部分和α螺旋1(相应于SEQ ID NO:2氨基酸3-41)被SEQ ID NO:346所示葡萄的氨基酸3-51置换;第一萜烯合酶相应于无结构环2的区域(相应于SEQ ID NO:2氨基酸53-58)被SEQ ID NO:295或941所示TEAS多肽的氨基酸58-63置换;相应于α螺旋3的部分(相应于SEQ IDNO:2氨基酸85-89)被SEQ ID NO:942所示HPS的氨基酸残基93-97置换;第一萜烯合酶相应于α螺旋3的部分的区域和无结构环4(相应于SEQ ID NO:2基酸85-99)被SEQ ID NO:942所示的HPS的氨基酸残基93-110置换;第一萜烯合酶相应于无结构环6的区域和邻近残基(相应于SEQ ID NO:2基酸152-163)被SEQ ID NO:942所示的HPS的氨基酸163-174置换;第一萜烯合酶相应于无结构环7的区域(相应于SEQ ID NO:2基酸174-184)被SEQ ID NO:942所示的HPS的氨基酸185-193置换;第一萜烯合酶相应于无结构环9的区域和邻近残基(相应于SEQ ID NO:2基酸212-221)被SEQ IDNO:942所示的HPS的氨基酸221-228置换;第一萜烯合酶相应于α螺旋D1的区域(相应于SEQ ID NO:2基酸310-322)被SEQ ID NO:942所示HPS的氨基酸317-329置换;和/或第一萜烯合酶J-K环(相应于SEQ ID NO:2基酸522-534)被SEQ ID NO:942所示的HPS的氨基酸527-541置换。
在本文,使用如C.2部分所述本领域已知的重组方法,第一萜烯合酶的内源结构域的全部或连续的部分可以被第二萜烯合酶相应异源结构域的全部或连续的部分置换。
E.修饰的瓦伦烯合酶多肽和编码核酸分子的产生
可以使用本领域公知的用于重组蛋白产生和表达的方法获得萜烯合酶多肽及其活性片段,包括瓦伦烯合酶及其活性片段。这样的多肽可以用于在所述合酶被表达的宿主中或纯化所述合酶后在体外从任何合适的无环焦磷酸萜烯前体(如FPP、GPP或GGPP)产生瓦伦烯。本领域技术人员已知的任何用于鉴定编码期望的基因的核酸的方法可以用于获得编码萜烯合酶(如瓦伦烯合酶)的核酸。例如,编码未修饰的或野生型瓦伦烯合酶多肽的核酸可以使用公知的方法从植物来源,例如柑橘属中获得(例如橙或葡萄柚)。然后可以改造修饰的瓦伦烯合酶,其使用本领域已知的将突变导入未修饰的或野生型瓦伦烯合酶中的任何方法,包括本文描述的任何方法,例如通过易错PCR随机诱变所述编码核酸、定点诱变、重叠PCR或其它重组方法。编码所述多肽的核酸然后可以被导入宿主细胞以异源地表达。
在一些实例中,本文提供的萜烯合酶,包括修饰的瓦伦烯合酶多肽通过合成产生,例如使用固相或液相肽合成。
1.编码萜烯合酶的核酸的分离
编码萜烯合酶如瓦伦烯合酶的核酸可使用本领域已知的用于克隆和分离核酸分子的任何合适方法进行克隆和分离。这样的方法包括核酸的PCR扩增和文库筛选,包括核酸杂交筛选。在一些实例中,用于扩增核酸的方法可以用于分离编码瓦伦烯合酶多肽的核酸分子,包括例如聚合酶链反应(PCR)方法。可以使用含核酸的材料作为起始材料,从中可以分离出编码瓦伦烯合酶的核酸分子。例如,来自柑橘属水果,包括但不限于橙(Citrus sinensis)和葡萄柚(Citrus paradisi)的DNA和mRNA制备物可以用于获得瓦伦烯合酶基因。核酸文科也可以用作起始材料来源。可以设计引物以扩增萜烯合酶编码分子,例如瓦伦烯合酶编码分子。例如,可以基于已知的编码萜烯合酶如瓦伦烯合酶的核酸序列涉及引物,所述核酸序列例如示于SEQ ID NO:1和292-294的那些,或来自瓦伦烯合酶氨基酸序列的回译。通过扩增产生的核酸分子可以测序并确认为编码瓦伦烯合酶多肽。
可以将额外的核苷酸序列加至瓦伦烯合酶编码核酸分子,包括含限制性内切酶位点的接头序列,其用于将所合成的基因克隆进载体,例如蛋白表达载体或设计用于扩增核心蛋白编码DNA序列的载体。此外,代表功能性DNA原件的额外核苷酸序列可以可操作地与瓦伦烯合酶编码核酸分子连接。此外,还可以包括编码其它部分或结构域的核酸使得所获得的合酶是融合蛋白。例如,编码其它酶的核酸,例如FPP合酶,或标签,例如His标签。
2.突变体或修饰的核酸的生成
使用本领域已知的实现突变的任何方法可以制备或产生编码修饰的萜烯合酶如修饰的瓦伦烯合酶的核酸。用于修饰的方法包括编码核酸分子的标准理性诱变和/或随机诱变(使用如,易错PCR、随机定点饱和诱变或理性定点诱变,例如诱变试剂盒(如可从Stratagene获得的QuikChange))。另外,可以利用常规重组DNA技术产生编码含有异源氨基酸的多肽的核酸。例如,编码嵌合多肽或含有异源氨基酸序列的多肽的核酸可以使用2步PCR方法产生(如上或实施例5中所描述),合伙使用限制性酶和用于常规亚克隆所期望的嵌合多肽组分的克隆方法学。
一旦产生,所述核酸分子可以使用本领域已知任何方法在细胞中表达以产生修饰的萜烯合酶多肽。修饰的萜烯合酶多肽,例如修饰的瓦伦烯合酶多肽,然后可以通过筛选期望的特性或活性进行评估,例如,筛选从底物产生萜烯的能力。在具体实例中,具有期望特性的修饰的萜烯合酶根据本文示范的方法通过突变并筛选特性产生。一般地,如果产生了修饰的瓦伦烯合酶,所示修饰的瓦伦烯合酶多肽从FPP产生瓦伦烯。
因此,本文提供了编码本文描述的任一修饰的萜烯合酶,包括上述或本文描述的任一修饰的瓦伦烯合酶多肽的核酸。本文提供的任何核酸分子可以使用本领域公知的方法分离或纯化,或可以包含在载体或细胞中。本文提供的示例性核酸分子是表3或5A所示的任一核酸分子,或其简并物。例如本文提供的示例性核酸分子是任何编码本文提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽的核酸分子,例如任何编码SEQ ID NO:3-127、350、351、723-731、732-745、746-751、810-866、887-890和895任一所示的多肽的核酸分子,或其简并物。在一种实施方式中,本文提供的核酸分子具有至少50、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、或99%序列相同性,或在中或高严格性条件下与编码本文提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽的任一核酸全长的至少70%杂交。例如,本文提供的核酸分子与SEQ ID NO:1所示的核酸序列具有至少或至少约至少50、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、或99%的序列相同性。在另一实施方式中,核酸分子可以包括具有编码本文提供的任一瓦伦烯合酶多肽的简并密码子序列的那些核酸分子。表3和5A示出本文提供的示例性修饰的瓦伦烯合酶多肽的示例性的核酸序列。
3.载体和细胞
为了本文提供的一或多种修饰的萜烯合酶多肽的重组表达,可以将含有编码所述合酶的核苷酸序列的全部或部分的核酸***合适的表达载体,即,含有对于所***的蛋白编码序列的转录和翻译必要的元件的载体。取决于所用的表达***,也可以通过瓦伦烯合酶基因的天然启动子和/或他们的侧翼区域提供必要的转录和翻译信号。因此,本文还提供了载体,其含有编码所述修饰的瓦伦烯合酶多肽的核酸。还提供了含有所述载体的细胞,包括原核和真核细胞。这样的细胞包括细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、古细菌、植物细胞、昆虫细胞核动物细胞。在具体实例中,所诉细胞时酵母,例如酿酒酵母,其表达无环焦磷酸萜烯前体,如FPP。所述细胞用于产生萜烯合酶,例如瓦伦烯合酶多肽或修饰的瓦伦烯合酶多肽,通过在使得所述编码的瓦伦烯合酶被所述细胞表达的条件下生长上述细胞。在一些实例中,所表达的合酶是纯化的。其另外的实例中,所表达的合酶,例如瓦伦烯合酶,在宿主细胞中将FPP转变为一或多种萜烯(如瓦伦烯)。
可以使用本领域技术人员已知的任何用于将DNA片段***载体的方法来构建含有嵌合基因的表达载体,所述嵌合基因含有合适的转录/翻译控制信号和蛋白编码序列。这些方法可以包括体外重组DNA和合成技术以及体内重组(遗传重组)。编码瓦伦烯合酶多肽或修饰的瓦伦烯合酶多肽或其结构域、衍生物、片段或同源物的核酸序列的表达可以被第二核酸序列调控,使得所述基因或其片段在以所述重组DNA分子转化的宿主中表达。例如,蛋白的表达可以被本领域已知的任何启动子/增强子控制。在具体的实施方式中,所述启动子对瓦伦烯合酶蛋白的基因不是天然的。可以使用的启动子包括但不限于原核、酵母、哺乳动物和植物启动子。启动子类型取决于所使用的表达***,在下面更详细的描述。
在一具体实施方式中,使用含有与编码瓦伦烯合酶多肽或修饰的瓦伦烯合酶多肽或其结构域、衍生物、片段或同源物的核酸可操作地连接的启动子,一或多个复制起点,和任选存在的一或多个可选择标记(如抗生素抗性基因)的载体。描述了用于表达瓦伦烯合酶多肽的载体和***。
4.表达***
萜烯合酶多肽,包括瓦伦烯合酶多肽(修饰的和未修饰的)可以通过本领域已知的任何用于产生蛋白的方法产生,包括体外或体内方法,例如将编码所述萜烯合酶(如瓦伦烯合酶)的核酸分子导入宿主细胞或宿主植物以体内产生或体外从编码所述萜烯合酶(如瓦伦烯合酶)的核酸分子表达。萜烯合酶如瓦伦烯合酶和修饰的瓦伦烯合酶多肽可以在任何适于产生所需量和形式的所示合酶多肽的生物体中表达。表达宿主包括原核和真核生物体,例如大肠杆菌i、酵母、植物、昆虫细胞、哺乳动物细胞(包括人细胞系和转基因动物)。表达宿主在它们的蛋白产生水平以及所表达的蛋白的转录后修饰上可以不同。表达宿主的选择可以基于这些和其它因素,例如调控和安全考虑、生产成本和纯化的需要和方法。
在真核宿主中的表达可以包括在酵母如来自酵母菌属(如酿酒酵母)和毕赤酵母属(如巴氏毕赤酵母(Pichia pastoria))的酵母中的表达,在昆虫细胞如果蝇(Drosophila)细胞和鳞翅类细胞中的表达,在植物和植物细胞如柑橘属、烟草、玉米、稻、藻类和浮萍中的表达。用于表达的真核细胞还包括哺乳动物细胞系例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或幼仑鼠肾(BHK)细胞。真核表达宿主还包括在转基因动物中的生产,例如在血清、乳和卵中的生产。
对于萜烯合酶如瓦伦烯合酶的表达,本领域技术人员可获得并已知许多表达载体。表达载体的选择受宿主表达***的影响。本领域技术人员的水平足以进行这样的选择。通常,表达载体可以包括转录启动子和任选存在的增强子、翻译信号和转录和翻译终止信号。用于稳定表达的表达载体一般具有可选择标记,其允许选择和维持转化的细胞。在一些例子中,可以使用复制起点来在所述细胞中扩增所述载体的拷贝数。
萜烯合酶,包括瓦伦烯合酶和修饰的瓦伦烯合酶多肽,还可作为蛋白融合物来利用或表达。例如,可以产生融合物以向多肽添加额外的功能性。融合蛋白的实例包括但不限于,信号序列、标签和用于指导蛋白分泌和/或膜关联的序列的融合物,所述标签例如用于定位的标签如his6标签或myc标签,或用于纯化的标签,如GST融合物。在另外的实例中,倍半萜合酶如瓦伦烯合酶或修饰的瓦伦烯合酶多肽可以与FPP合酶融合,如Brodelius等所述(Eur.J.Biochem.(2002)269:3570-3579)。
产生萜烯合酶多肽包括瓦伦烯合酶多肽的方法可以包括在宿主细胞中共表达无环焦磷酸萜烯前体,如FPP。在一些实例中,所述宿主细胞天然地表达FPP。这样的细胞可以被修饰以表达更大量的FPP(见如US6531303)。在另外的实例中,不天然地产生FPP的宿主细胞被遗传学修饰以产生FPP。
a.原核细胞
原核生物,尤其是大肠杆菌,提供了用于产生大量本文提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽的***。大肠杆菌的转化时本领域技术人员公知的简单且快速的技术。示例性的用于转化大肠杆菌细胞的表达载体包括。例如,pGEM表达载体、pQE表达载体和pET表达载体(见,美国专利4,952,496;可从NOVAGEN,Madison,WI获得;也见Novagenee发表的描述该***的文献)。这样的质粒包括pET11a,其含有T7lac启动子、T7终止子、可诱导的大肠杆菌lac操纵子和lac阻遏物基因;pET12a-c,其含有T7启动子、T7终止子和大肠杆菌ompT分泌信号;以及pET15b和pET19b(NOVAGEN,Madison,WI),其含有用于用His柱纯化的His-TagTM前导序列和允许在柱上纯化后的切割的凝血酶切割位点、T7-lac启动子区和T7终止子。
大肠杆菌表达载体可以含有可诱导启动子,其对于诱导高水平的蛋白表达和对于表达对宿主细胞具有某些毒性的蛋白来说是有用的。示例性的原核启动子包括,例如β-内酰胺酶启动子(Jay et al.,(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:5543)和tac启动子(DeBoer et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:21-25(1983));也见“Useful Proteins fromRecombinant Bacteria”:in Scientific American242:79-94(1980))。可诱导启动子的实例包括lac启动子、trp启动子、杂合tac启动子、T7和SP6RNA启动子和温度调控的λPL启动子。
萜烯合酶,包括瓦伦烯合酶可以在大肠杆菌细胞质环境中表达。细胞质是还原性环境且对于某些分子,这可以造成形成不可溶的包涵体。还原剂如二硫苏糖醇和β-巯基乙醇和变性剂(如,盐酸胍和尿素)可以用于重溶蛋白。可选的方法是在细菌的周质空间表达瓦伴侣蛋白类和伦烯合酶,所述周质空间提供氧化性环境且伴侣蛋白类和二硫化物异构酶导致产生可溶的蛋白。一般而言,将前导序列与待表达的蛋白融合,其将所述蛋白导向周质。所述前导序列然后被周质中的信号肽酶移除。周质靶向的前导序列的实例包括来自果胶裂合酶基因的pelB前导序列和衍生自碱性磷酸酶基因的前导序列。在一些实例中,周质表达使得所表达的蛋白可以渗漏至培养基中。蛋白的分泌使得可以迅速和简单地从培养物上清液中纯化。不分泌的蛋白可以通过渗透压裂解从周质中获得。类似于细胞质表达,在一些情况下蛋白会变得不可溶,可以使用变性剂和还原剂来促进溶解和重折叠。诱导和生长的温度也可以影响表达水平和可溶性。一般而言,使用25°C至37°C的温度。也可以使用突变来增加所表的蛋白的可溶性。一般而言,细菌产生非糖基化的蛋白。
b.酵母细胞
所述萜烯合酶,例如瓦伦烯合酶多肽,包括本文提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽,可以使用酵母表达,例如来自酵母菌属(如酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces pombe)、子囊菌酵母属(Yarrowia lipolytica)、乳克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)和巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)的酵母。可以用附加型复制载体或通过稳定染色体整合(通过同源重组)转化酵母。在一些实例中,使用可诱导启动子来调控基因表达。用于在酵母中表达瓦伦烯合酶多肽的示例性启动子序列包括,除了别的外,金属硫蛋白、3-磷酸甘油酸酯激酶(Hitzeman et al.,J.Biol.Chem.255:2073,1980)、或其它糖酵解酶(Hess et al.,J.Adv.Enzyme Reg.7:149,1968;和Holland et al.,Biochem.17:4900,1978)(如烯醇酶、磷酸甘油醛脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、果糖磷酸激酶、葡萄糖磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸酯变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡糖异构酶和葡糖激酶)的启动子。
其它适于在酵母表达中使用的载体和启动子在Hitzeman,EPA-73,657或在Fleer etal.,Gene,107:285-195(1991)和van den Berg et al.,Bio/Technology,8:135-139(1990)中进一步描述。另外的选择包括但不限于,Russell et al.(J.Biol.Chem.258:2674,1982)和Beier et al.(Nature300:724,1982)描述的葡萄糖可抑制的ADH2启动子,会修饰的ADH1启动子。通过例如,将来自pBR322的用于在大肠杆菌中选择和复制的DNA序列(Ampr基因和复制起点)***上述的酵母载体来构建可在酵母和大肠杆菌E.coli两者中复制的穿梭载体。示例性的酵母穿梭载体是YEp-CVS-ura,描述于下面实施例1.
酵母表达载体可以包含可选择标记,例如LEU2、TRP1、HIS3和URA3,用于选择和维持转化的DNA。在酵母中表达的蛋白经常是可溶的且和伴侣蛋白(如Bip和蛋白二硫化物异构酶)的共表达能够改善表达水平和可溶性。另外,使用分泌信号肽融合物(例如来自酿酒酵母的酵母结合型α因子分泌信号)以及和酵母细胞表面蛋白(例如Aga2p接合粘附受体或Arxula adeninivorans葡糖淀粉酶)的融合物,可以将在酵母中表达的蛋白导向分泌。可以设计蛋白酶切割位点(如,Kex-2蛋白酶)以在脱离分泌途径时从所述多肽去除融合的序列。
酵母天然地表达甲羟戊酸依赖的类异戊二烯生物合成途径的所需蛋白,包括FPP合酶(其可产生FPP)。因此,在酵母细胞中表达修饰的萜烯合酶,包括本文提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽可以导致萜烯例如瓦伦烯从FPP的产生。用于表达萜烯合酶,包括修饰的瓦伦烯合酶多肽的示例性酵母细胞包括修饰为表达增加水平的FPP的酵母。例如,酵母细胞可以被修饰以产生较少鲨烯合酶或较少活性鲨烯合酶(如erg9突变体;见如美国专利号6,531,303和6,689,593)。这造成FPP在宿主细胞中与野生型酵母细胞相比以更高水平积累,其进而导致增加的萜烯(如瓦伦烯)产量。示例性的修饰的酵母细胞包括但不限于,修饰的酿酒酵母菌株CALI5-1(ura3,leu2,his3,trp1,Δerg9::HIS3,HMG2cat/TRP1::rDNA,dpp1,sue)、ALX7-95(ura3,his3,trp1,Δerg9::HIS3,HMG2cat/TRP1::rDNA,dpp1sue)、ALX11-30(ura3,trp1,erg9def25,HMG2cat/TRP1::rDNA,dpp1,sue)和描述于美国专利号6,531,303、6,689,593、和公开的美国专利申请号US20040249219的那些。
c.植物和植物细胞
可以使用转基因植物细胞和植物来表达萜烯合酶,包括修饰的瓦伦烯合酶多肽。一般使用直接的DNA转移(例如微粒轰击和PEG-介导的转移至原生质体),以及使用农杆菌介导的转化将表达构建体转移至植物。表达载体可以包括启动子和增强子序列、转录终止元件、和翻译控制元件。通常在双子叶宿主(如拟南芥和烟草)以及单子叶宿主(如玉米和稻)之间划分表达载体和转化技术。用于表达的植物启动子的实例包括花椰菜花叶病毒启动子、胭脂碱合酶启动子、核糖二磷酸羧化酶启动子和泛素和UBQ3启动子。经常使用可选择的标记例如潮霉素、磷酸甘露糖异构酶和新霉素磷酸转移酶以利于选择和维持转化的细胞。转化的植物细胞可以作为细胞、聚集体(愈伤组织)在培养中维持或被再生为完整植物。转基因植物细胞还可以包括设计为生产蛋白的藻类(见,例如Mayfield et al.(2003)PNAS100:438-442)。转化的植物包括,例如,选自烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、高粱属(Sorghum)、拟南芥属(Arabidopsis)、苜蓿属(Medicago)(紫花苜蓿)、棉属(Gossypium)(棉花)、芸苔属(Brassica)(油菜)的植物。在一些实例中,所述植物属于烟草(Nicotiana tabacum)物种,并且用过表达瓦伦烯合酶和法尼基二磷酸合酶的载体转化,如美国专利号20090123984中所描述。
d.昆虫和昆虫细胞
昆虫和昆虫细胞,尤其使用杆状病毒表达***,可以用于表达萜烯合酶,包括修饰的瓦伦烯合酶多肽(见,例如Muneta et al.(2003)J.Vet.Med.Sci.65(2):219-23)。昆虫细胞和昆虫幼虫,包括在血淋巴的表达,表达高水平的蛋白斌企鹅能够进行大部分高等真核生物使用的翻译后修饰。杆状病毒具有限制性宿主范围,其改善安全性并降低真和生物表达的调控顾虑。一般而言,表达载体使用用于高水平表达的启动子例如杆状病毒的多角体蛋白启动子。常用的杆状病毒***包括杆状病毒例如Autographa californica核多角体病毒(AcNPV)和家蚕(Bombyx mori)核多角体病毒(BmNPV)以及昆虫细胞系,例如衍生自草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的Sf9、Pseudaletia unipuncta(A7S)和Danausplexippus(DpN1)。为了高水平表达,待表达分子的核苷酸序列融合于所述病毒多角体蛋白起始密码子的直接下游。哺乳动物分泌信号在昆虫细胞中被精确地加工,并可以用于将表达的蛋白分泌进培养基。此外,细胞系Pseudaletia unipuncta(A7S)和Danausplexippus(DpN1)产生具有类似于哺乳动物细胞***的糖基化模式的蛋白。
可选的昆虫细胞中的表达***是使用稳定转化的细胞。可以使用细胞系例如Schnieder2(S2)和Kc细胞(黑腹果蝇(Drosophila melanogaster))和C7细胞(Aedesalbopictus)进行表达。在用镉或铜的重金属诱导存在下,可以使用果蝇金属硫蛋白启动子来诱导高水平的表达。一般使用可选择标记如新霉素或潮霉素维持表达载体。
e.哺乳动物表达
可以使用哺乳动物表达***表达萜烯合酶,包括修饰的瓦伦烯合酶多肽。可以通过病毒(如腺病毒)感染或通过直接DNA转移(如脂质体、磷酸钙、DEAE葡聚糖和通过物理手段如电穿孔和显微注射)将表达构建体转移至哺乳动物细胞。哺乳动物细胞表达载体一般包括mRNA加帽位点、TATA盒、转录起始序列(Kozak共有序列)和多腺苷化元件。这样的载体经常包括用于高水平表达的转录启动子-增强子,例如SV40启动子-增强子、人巨细胞病毒(CMV)启动子和Rous肉瘤病毒(RSV)长末端重复。这些启动子-增强子在许多细胞类型中是活性的。组织和细胞类型启动子和增强子区域也可以用于表达。示例性的启动子/增强子区域包括但不限于,来自例如弹性蛋白酶I、胰岛素、免疫球蛋白、鼠***瘤病毒、白蛋白、甲胎蛋白、α抗胰蛋白酶、β珠蛋白、髓磷脂碱蛋白、肌球蛋白轻链2和***释放激素基因控制的基因的那些。可以使用可选择标记来选择和维持具有所述表达构建体的细胞。可选择标记基因的实例包括但不限于,潮霉素B磷酸转移酶、腺苷脱氨酶、黄嘌呤-腺嘌呤磷酸核糖转移酶、氨基葡糖苷磷酸转移酶、二氢叶酸还原酶和胸苷激酶。和细胞表面信号分子例如TCR-ζ和FcεRI-γ融合能够知道所述表达以活性状态在细胞表面表达。
可获得许多用于哺乳动物表达的细胞系,包括小鼠、大鼠、人、猴、和鸡和仓鼠细胞。示例性的细胞系包括但不限于,BHK(即i.e.BHK-21细胞)、293-F、CHO、CHOExpress(CHOX;Excellgene)、Balb/3T3、HeLa、MT2、小鼠NS0(非分泌)和其它骨髓瘤细胞系、杂交瘤和异杂交瘤细胞系、淋巴细胞、成纤维细胞、Sp2/0、COS、NIH3T3、HEK293、293S、293T、2B8、和HKB细胞。也可以获得适于无血清培养基的细胞系,其有利于从细胞培养基纯化分泌的蛋白。一个这样的实例是无血清EBNA-1细胞系(Pham et al.,(2003)Biotechnol.Bioeng.84:332-42)。
5.纯化
从宿主细胞纯化萜烯合酶,例如瓦伦烯合酶,包括修饰的瓦伦烯合酶的方法取决于所选的宿主细胞和表达***。对于分泌的分子,通常在去除所述细胞后从培养基纯化蛋白。对于细胞内表达,可以裂解细胞并从提取物纯化所述蛋白。当使用转基因生物体例如转基因植物和动物进行表达时,可以使用组织或器官作为制备裂解细胞提取物的起始材料。此外,转基因动物生产可以包括在可收集的乳和卵中生产多肽,且如果必要,可以提取所述蛋白并进一步使用本领域标准方法纯化。
萜烯合酶,包括瓦伦烯合酶,可以使用本领域已知的标准蛋白纯化技术进行纯化,包括但不限于,SDS-PAGE、尺寸分级和尺寸排阻层析、硫酸铵沉淀、螯合层析和离子交换层析。也可以改造表达构建体以向蛋白添加亲和标签例如myc表位、GST融合物或His6并分别用myc抗体、谷胱甘肽树脂和Ni-树脂亲和纯化。可以使用本领域已知的任何方法评估纯度,包括凝胶电泳和染色以及分光光度技术。
6.融合蛋白
也提供了含有修饰的萜烯合酶(包括修饰的瓦伦烯合酶多肽)和一或多种其它多肽的融合蛋白。萜烯合酶多肽和另一多肽的连接可以直接或通过接头间接实现。在一个实例中,连接可以通过化学连接,例如通过异双功能剂或硫醇连接或其它这样的连接。融合还可以通过重组手段实现。萜烯合酶,例如瓦伦烯合酶多肽与其它多肽的融合可以融合至所述瓦伦烯合酶多肽的N-端或C-端。
可以通过标准重组技术产生融合蛋白。例如,编码不同多肽序列的DNA片段可以根据常规技术符合读框地连接在一起,例如,通过采用钝末端或交错末端进行连接,限制性没消化以提供合适的末端,恰当地填充粘性末端,碱性磷酸酶处理以避免不期望的连接,和酶促连接。在另一实施方式中,融合基因可以通过常规技术,包括自动化DNA合成仪合成。可选地,可以使用锚定引物进行基因片段的PCR扩增,获得两个顺序的基因片段间的互补突出端,其随后可以退火并再次扩增以生成嵌合的基因序列(见,例如,Ausubel et al.(eds.)Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,1992)。此外,许多表达载体商业可得,其已经编码融合部分(如,GST多肽)。编码瓦伦烯合酶多肽的核酸可以被克隆进这样的表达载体使得所述融合部分与所述瓦伦烯合酶蛋白符合读框地连接。
F.使用和评价萜烯合酶的方法
本文提供的修饰的萜烯合酶可以被用于从任何合适的无环焦磷酸萜烯前体(包括但不限于,法尼基二磷酸(FPP)、香叶基二磷酸(GPP)或香叶基-香叶基二磷酸(GGPP))产生萜烯(包括单萜、二萜和倍半萜),且可以评价其此种能力。一般而言,本文提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽催化从FPP形成瓦伦烯。本领域技术人员已知的任何方法可以用于利用本文提供的修饰的萜烯合酶(如修饰的瓦伦烯合酶)产生萜烯(包括瓦伦烯)。本文提供的修饰的合酶催化从FPP或其它底物形成瓦伦烯或其它萜烯的能力可以使用这些方法评价。在一些实例中,将使用所述修饰的合酶从FPP或另外的底物产生的萜烯如瓦伦烯的量与使用野生型或未修饰的合酶从相同底物产生的萜烯如瓦伦烯的量进行比较。
所述修饰的萜烯合酶如修饰的瓦伦烯合酶的其它活性和特性还可以使用本领域公知的方法和测定进行评价。除了评价所述修饰的合酶的活性及其催化萜烯形成的能力外,与野生型或未修饰的萜烯合酶相比的反应动力学、修饰的区域选择性化学或立体化学、改变的底物利用和/或改变的产物分布(即从FPP或另外的底物产生的不同萜烯的改变的量)可以使用本领域公知的方法评价。例如,由所述修饰的萜烯合酶多肽从FPP、GPP或GGPP产生的各种萜烯的类型和量可以通过气相色谱方法(如GC-MS)评价,如下文和实施例5中所描述。在一些实例中,可以由所述修饰的瓦伦烯合酶多肽从FPP产生的萜烯包括但不限于,瓦伦烯、大根香叶烯A、β-榄香烯、β-芹子烯、τ-芹子烯和7-表-α-芹子烯。
下文提供使用本文提供的修饰的瓦伦烯合酶从FPP产生瓦伦烯和诺卡酮的方法。这样的方法可以被本领域技术人员修改以通过本文提供的其它修饰的萜烯合酶从FPP、GPP和/或GGPP产生其它萜烯并评价。
1.瓦伦烯的产生
所述修饰的瓦伦烯合酶多肽可以用于催化从无环焦磷酸萜烯前体如FPP形成瓦伦烯。在一些实例中,本文提供的修饰的瓦伦烯合酶在产生或过度产生FPP的细胞中表达,使得瓦伦烯通过上面描述的途径产生。在另外的实例中,本文提供的修饰的瓦伦烯合酶从任何合适的宿主细胞表达并纯化,如D部分所描述。所纯化的合酶然后体外和FPP合并以产生瓦伦烯。
在一些实例中,本文提供的修饰的瓦伦烯合酶被过表达并如D部分所述进行纯化。所述修饰的瓦伦烯合酶然后和底物法尼基二磷酸孵育,产生瓦伦烯。含FPP和瓦伦烯合酶的溶液的pH可以影响所产生的瓦伦烯的量(见如美国专利公开号20100216186)。加入有机溶剂将瓦伦烯分配进有机相用于分析。然后使用本文提供的任何方法,例如气相色谱(如GC-MS)使用内标测定瓦伦烯的产生和定量产物的量。可选地,所述修饰的瓦伦烯合酶在也产生FPP的宿主细胞中表达,从而产生瓦伦烯。然后用有机溶剂从细胞培养基中萃取瓦伦烯且随后用任何已知方法(例如柱层析或HPLC)分离和纯化,对所回收的瓦伦烯的量和纯度进行评价。在一些实例中,在纯化之前或之后通过氧化将瓦伦烯转变为诺卡酮。
a.用于产生瓦伦烯的示例性细胞
瓦伦烯可以通过在作为甲羟戊酸依赖型类异戊二烯生物合成途径一部分产生FPP(如真菌,包括酵母细胞核动物细胞)或作为甲羟戊酸不依赖型类异戊二烯生物合成途径一部分产生FPP(如细菌和高等植物)的细胞系中表达本文提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽而产生。在具体实例中,通过在被修饰以过量产生FPP的细胞系中表达本文提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽而产生瓦伦烯。示例性的这样的细胞是修饰的酵母细胞。例如,被修饰以产生较少鲨烯合酶或较少活性鲨烯合酶(如erg9突变体;见如美国专利号6,531,303和6,689,593)的酵母细胞可用于本文提供的方法一产生瓦伦烯。降低的鲨烯合酶活性造成FPP在宿主细胞中与野生型酵母细胞相比以更高水平积累,其进而导致增加的瓦伦烯产量。示例性的修饰的酵母细胞包括但不限于,修饰的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae菌株CALI5-1(ura3,leu2,his3,trp1,Δerg9::HIS3,HMG2cat/TRP1::rDNA,dpp1)、ALX7-95(ura3,his3,trp1,Δerg9::HIS3,HMG2cat/TRP1::rDNA,dpp1sue)、ALX11-30(ura3,trp1,erg9def25,HMG2cat/TRP1::rDNA,dpp1,sue)和描述于美国专利号6,531,303、6,689,593、和公开的美国专利申请号US20040249219的那些。
酿酒酵母菌株CALI5-1是SW23B#74(描述于美国专利号6,531,303和6,689,593,以及Takahashi et al.(2007)(Biotechnol Bioeng.97(1):170–181)的衍生物,SW23B#74本身来源于野生型菌株ATCC28383(MATa)。CALI5-1被产生为具有降低的Dpp1磷酸酶活性(见如美国专利申请公开号US20040249219)。酿酒酵母菌株CALI5-1含有,除其他突变外,erg9突变(Δerg9::HIS3等位基因)以及支持好氧甾醇摄取增强的突变(sue)。其还含有大约8拷贝的截短的HMG2基因。HMG2的截短形式由GPD启动子驱动并因此不再在严格调控下,造成至FPP的碳流的增加。其还在编码二酰基甘油焦磷酸(DGPP)磷酸酶的基因(dpp1)中含有缺失,其限制了FPP的去磷酸化。
ALX7-95和ALX11-30.1是CALI5-1的衍生物。ALX7-95通过用功能性leu基因校正CALI5-1的Δleu2缺陷而衍生自CALI5-1,使得亮氨酸不需要补充至培养基(见如US2010/0151519)。通过若干步骤从CAL5-1构建ALX11-30,如下面的实施例2所描述。
b.培养用于产生瓦伦烯的细胞
在示例性方法中,本文提供的修饰的瓦伦烯合酶在宿主细胞中表达,所述宿主细胞被修饰以过表达法尼基二磷酸,由此在表达所述修饰的瓦伦烯合酶是,法尼基二磷酸被转变为瓦伦烯。使用本领域公知的任何合适方法培养所述宿主细胞。在一些实例中,例如用于高通量筛选表达不同的修饰的瓦伦烯合酶的细胞的实例中,表达所述修饰的瓦伦烯合酶的细胞在96-孔板的单个孔中培养(见如下面的实施例3C)。在另外的其中所述宿主细胞时酵母的实例中,表达所述修饰的瓦伦烯合酶多肽和FPP的细胞使用例如在下面实施例所描述的发酵方法培养。
多种发酵方法学可以用于从表达本文提供修饰的瓦伦烯合酶多肽的酵母细胞生产瓦伦烯。例如,大规模生产可以通过分批或连续发酵实现。典型的分批发酵是封闭的***,其中培养基组合物在发酵开始时设置而在发酵过程中不进行人工改变。因此,在发酵开始时用所需的微生物接种培养基且使发酵发生而不额外添加营养物。一般而言,限制分批发酵中碳源的浓度,且例如pH和氧浓度的因素是受控的。在分批***中,***的代谢物和生物质组成不断改变直至发酵停止。在分批培养中,细胞一般从静止停滞期转至高生长对数期并最终至其中生长速率减少或停止的静止期。如果未处理,静止期的细胞将最终死亡。
标准分批***的变化时补料分批***,其类似于典型的分批***,除了随着发酵的进行添加营养物。当代谢产物抑制倾向抑制细胞的代谢和如果期望培养基具有有限量的底物,分批补料***是有用的。而且,相比于分批发酵工艺,供给营养物的能力会经常导致补料分批***中的更高细胞密度。在补料分批发酵中通常测量并控制例如pH、溶解氧、营养物浓度和废气如CO的分压。
还可以用连续发酵实现瓦伦烯的生产。连续发酵是开放的***,其中将成分明确的发酵培养基连续添加至生物反应器且同时去除等量的条件培养基。该***通常将培养物维持在恒定的高密度,其中细胞主要处于其对数生长期。连续发酵允许调节任何数目的影响细胞生长或终产物浓度的因素。例如,一种方法将以固定的比率维持限定的营养物如碳源或氮水平且允许调节全部其他参数。在另外的***中,可以连续地改变多种影响生长的因素,而通过培养基浊度测量的细胞浓度保持恒定。连续***旨在维持稳态生长条件,且因此由于去除培养基造成的细胞损失必须针对发酵中的细胞生长速率进行平衡。本领域公知调节连续发酵工艺的营养物和生长因素的方法以及最大化产物形成速率的技术。
在细胞培养后,可以收获细胞培养基以获得所产生的瓦伦烯。
在一种示例性方法中,表达所述修饰的瓦伦烯合酶多肽的宿主细胞(如酿酒酵母菌株CALI5-1、ALX7-95或ALX11-30)在28°C、pH4.5于3L发酵罐中生长约132小时,保持葡萄糖在0至1g/L(见实施例2)。发酵后,加入硫酸钠至终浓度10-15。还加入大豆油并搅拌,含有瓦伦烯(或其它萜烯)的由通过离心回收。
c.分离和评价瓦伦烯
使用上述方法用本文提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽产生的瓦伦烯可以由本领域已知的任何方法进行分离和评价。在一个实例中,用有机溶剂萃取细胞培养基以将产生的瓦伦烯和任何其它萜烯分配至有机层。可以使用本领域已知的任何方法例如气相色谱评价瓦伦烯产生和/或从其它产物分离瓦伦烯。例如,可以通过气相色谱使用雪松烯和十六烷作为内标分析所述有机层。该方法示例于下面的实施例2。
所产生的瓦伦烯的量可以通过任何已知用于分离和分析有机化合物的标准层析技术测定。例如,瓦伦烯的产生可以通过用于检测和定量烃类(如瓦伦烯和其它萜烯)的层析技术测定,包括但不限于,气相层析质谱(GC-MS),使用火焰离子化检测器的气相层析(GC-FID)、毛细管GC-MS、高效液相层析(HPLC)和柱层析。一般地,这些技术在已知内标(如雪松烯或十六烷)存在下进行,其用于定量产生的萜烯的量。例如,可以通过与在气相层析中用质谱法检测的可靠标准品的停留时间及质谱的比较来鉴定萜烯,包括倍半萜如瓦伦烯。典型的标准品包括但不限于,雪松烯和十六烷。在另外的实施例中,可以通过用火焰离子化检测的气相层析实现定量,其基于已知量的可靠标准品的校准曲线和归一化至内标的峰面积。这些层析技术使得可以鉴定所述有机层中存在的任何萜烯,包括例如所述修饰的瓦伦烯合酶产生的其它萜烯,包括例如大根香叶烯A、β-芹子烯、τ-芹子烯和7-表-α-芹子烯(见如实施例8)。
在具体实例中,本文提供的修饰的瓦伦烯合酶多肽从FPP产生的瓦伦烯的量是SEQ ID NO:2所示的野生型瓦伦烯合酶多肽从FPP产生的瓦伦烯的量的至少或约110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、250%、300%、350%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%或更多。一般而言,使用上文描述的和在下面实施例中示例的方法产生的瓦伦烯的量是至少或约0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L1.0g/L、1.1g/L、1.2g/L、1.3g/L、1.4g/L、1.5g/L、2.0g/L、2.5g/L、3.0g/L、3.5g/L、4.0g/L、4.5g/L或5.0g/L或更多。
在一些实例中,瓦伦烯产生的动力徐可以通过合酶测定来确定,其中放射性类异戊二烯底物如3H FPP或14C FPP被不同浓度的合酶利用。将产物萃取进有机层并使用液体闪烁计数器测量放射性。从Michaelis-Menton方程与数据的直接拟合确定动力学常数。
2.诺卡酮的产生
本文提供的修饰的瓦伦烯合酶产生瓦伦烯,其然后可以被氧化成诺卡酮。诺卡酮,主要的葡萄柚香味,是瓦伦烯的氧化产物。瓦伦烯可以经历位置选择性羟基化形成2-羟基瓦伦烯,其进一步被氧化形成诺卡酮。瓦伦烯的氧化可以通过化学或生物合成手段进行(见如美国专利号5,847,226、欧洲专利号EP1083233;Girhard et al.,(2009)Microb.Cell.Fact.8:36;Fraatz et al.,(2009)Appl Microbiol Biotechnol.83(1):35-41;Furusawa et al.(2005)Chem Pharm.Bull.53:1513-1514;Salvador et al.,(2002)GreenChemistry,4,352–356)。生化氧化可以由漆酶、羟化酶或其它氧化酶实现。在一些实例中,使用三氧化铬或二氧化硅膦酸酯固定化的铬催化剂将瓦伦烯转变为诺卡酮(见如实施例7)。可以通过本文描述的任何层析技术确认和/或定量诺卡酮形成。
G.实施例
下列实施例仅仅出于阐述的目的而包括进来,并不旨在限制本发明的范围。
实施例1
克隆野生型瓦伦烯合酶
使用之前与美国专利号7,442,785的实施例1描述的方法从分离自新鲜收获的瓦伦西亚橙的汁囊的RNA克隆来自甜橙Citrus sinensis cv.Valencia(瓦伦西亚橙)的瓦伦烯合酶基因(CVS)。
首先,生成Yep-GW-URA(Takahashi et al.,(2007)Biotechnol Bioeng.97(1):170-181),其通过将gateway克隆盒(RfB)以attR1-CmR-ccdB基因-attR2(Hartley et al.,(2000)Genome Res.10:1788-1795)的形式***YEp352-URA(SEQ ID NO:692,Bio-TechnicalResources)的SmaI限制位点,YEp352-URA含有URA3可选择标记、ADH1启动子和ADH1终止子(侧翼有两个BamHI位点,一个在ADH1启动子5',另一个在ADH终止子3')、2-μori、氨苄青霉素抗体基因和colE1复制起点。获得的载体命名为YEp-CVS-URA。
从分离自新鲜收获的瓦伦西亚橙的汁囊的RNA扩增CVS基因(示于SEQ IDNO:1,且编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO:2)为含有限制性位点以亚克隆进酵母穿梭表达载体Yep-GW-URA。用EcoRI和XbaI消化Yep-GW-URA后,将扩增产物克隆进所述酵母穿梭表达载体Yep-GW-URA。
通过在缺乏尿嘧啶的SD基本培养基在28°C选择来在酿酒酵母中维持YEp-CVS-ura载体。还通过在含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基上选择抗性来在大肠杆菌中维持所述载体。
实施例2
瓦伦烯的产生
为了筛选瓦伦烯的产生,使用酿酒酵母细胞株CALI5-1(ura3,leu2,his3,trp1,Δerg9::HIS3,HMG2cat/TRP1::rDNA,dpp1,sue)、ALX7-95(ura3,his3,trp1,Δerg9::HIS3,HMG2cat/TRP1::rDNA,dpp1,sue)或ALX11-30(ura3,trp1,erg9def25,HMG2cat/TRP1::rDNA,dpp1,sue)。
CALI5-1菌株(见美国专利申请公开号US20040249219;美国专利号6,531,303和6,689,593)具有Δleu2缺失,需要在其培养基中引入亮氨酸。ALX7-95衍生自CALI5-1,其通过用功能性LEU2基因校正CALI5-1的Δleu2缺陷(见美国专利公开号US2010/0151519)。
如US2010/0151519所述,从CALI5-1在若干步骤从ALX7-175.1构建ALX11-30。简言之,通过将含埃及莨菪(Hyoscyamus muticus)premnaspirodiene合酶(HPS)的质粒转化进ALX7-95菌株获得ALX7-95HPS。通过将HPS的基因克隆进Yep-GW-URA来给出YEp-HPS-ura(YEp-HPS),获得YEp-HPS基因。然后,进行ERG9基因的易错PCR反应,获得的DNA转化至携带YEpHPS的ALX7-95。转化体涂布与缺乏麦角固醇的YP培养基并筛选premnaspirodiene产生。保存产生高水平premnaspirodiene的那些转化体。一菌株,ALX7-168.25[ura3,trp1,his3,erg9def25,HMG2cat/TRP1::rDNA,dpp1,sue,YEpHPS]用完整HIS3的PCR片段转化以产生功能性HIS3基因。分离能够在不存在组氨酸的培养基中生长的转化体。从该转化中分离到ALX7-175.1[ura3,trp1,erg9def25,HMG2cat/TRP1::rDNA,dpp1,sue YEpHPS]。最后,通过在YPD(10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖)生长ALX7-175.1若干代去除质粒YEpHPS并将细胞涂布在YPD平板。鉴定不能在没有尿嘧啶的SD培养基(0.67Bacto无氨基酸酵母氮源、2%葡萄糖、0.14%无尿嘧啶酵母合成drop-out培养基)生长的菌落。该菌株命名为ALX11-30。
为了筛选由瓦伦烯合酶或突变体产生的瓦伦烯,将含有CVS基因或修饰版本的CVS基因的YEp-CVS-ura质粒使用醋酸锂酵母转化试剂盒(Sigma-Aldrich)转化进上述酵母菌株。ALX7-95和ALX11-30菌株通常比CALI5-1菌株产生更多瓦伦烯。CALI5-1用于在小瓶中的初始筛选(如实施例3所描述)和在发酵器中生产。随后,ALX7-95或ALX11-30用于小瓶中筛选和发酵器。一般而言,ALX7-95用于在小瓶中筛选而ALX11-30用于发酵器。
在SDE-ura培养基(0.67Bacto无氨基酸酵母氮源、2%葡萄糖、0.14%无尿嘧啶酵母合成drop-out培养基、和如果需要,40mg/L麦角固醇)上选择转化体。挑取菌落并使用下面描述的微培养测定筛选瓦伦烯的产生。
瓦伦烯产生在3-L发酵罐中(New Brunswick Bioflow110)进行。制备1升的发酵培养基并在发酵罐中高压灭菌(20g(NH4)2SO4,20g KH2PO4,1g NaCl,MgSO4·7H2O,4gSolulys玉米浆固体(Roquette))。然后加入下列组分:20ml矿物溶液(0.028%FeSO4·7H2O,0.029%ZnSO4·7H2O,0.008%CuSO··5H2O,0.024%Na2MoO4·2H2O,0.024%CoCl2·6H2O,0.017%MnSO4·H2O,1mL HCl);10mL50%葡萄糖;30mL维生素溶液(0.001%生物素;0.012%泛酸钙,0.06%肌醇,0.012%盐酸吡多辛,0.012%盐酸硫胺素thiamine-HCl);10mL10%CaCl2,和20mL高压灭菌的大豆油(在当地杂货商购买)。对于需要甾醇的菌株,包括CALI5-1和ALX7-95,在培养基中包括50mg/L胆固醇或40mg/L麦角固醇。
通过用含所述YEp-CVS-ura质粒的CALI5-1、ALX7-95或ALX11-30接种50mL SDE-ura-trp培养基(见实施例3.C.2.)制备用于接种发酵培养基的种子培养物。该培养物在28°C生长直至静止期早期(24-48小时)。将1mL该培养物接种入500mLSDE-ura-trp并在28°C生长24小时。50mL的等分(5%接种物)用于接种发酵罐中的培养基。
发酵器保持在28°C。气流为1vvm而通过调节搅拌将dO2保持在30%以上。用磷酸和NaOH或NH4OH将pH保持在4.5。
当葡萄糖浓度降至1g/L以下,启动补料方案使得发酵器中的葡萄糖保持在0-1g/L。葡萄糖补料由60%葡萄糖(w/v)组成。
在发酵结束(通常在接种后约132小时),加入硫酸钠至10-15%终浓度以及额外50mL大豆油,发酵器内的内容物搅拌1小时。在使发酵容器内容物沉降之后,通过离心回收所述油,测定油中的瓦伦烯含量。
为了测定瓦伦烯,将3mL的上清液置于小瓶中,加入3mL含20mg/L雪松烯的丙酮。涡旋后,用6mL含10mg/L十六烷的己烷萃取混合物,随后额外涡旋。将有机相转移至第二个小瓶中用于通过气相层析分析,使用雪松烯和十六烷分别作为萃取效率和注射的内标。发现含Yep-CVS-ura并表达瓦伦烯合酶的CALI5-1、ALX7-95或ALX11-30酿酒酵母产生瓦伦烯。
实施例3
产生瓦伦烯合酶突变体
通过瓦伦烯合酶基因的易错PCR(epPCR)产生瓦伦烯合酶突变体。然后使用高通量筛选测定针对其产生瓦伦烯的能力筛选所述突变体。
A.通过eqPCR产生瓦伦烯合酶突变体
对于CVS基因的易错PCR,使用整个YEp-CVS-ura质粒或含有所述CVS基因的3kbBamHI DNA片段(从质粒切下并凝胶纯化)。等价于270-360ng的CVS基因的DNA用作使用GeneMorph II随机诱变试剂盒(Stratagene)的易错PCR的模板。PCR条件为30循环的96°C1min、55°C退火1min、72°C延伸2min,使用正向引物CVSpcrF1(5’-CATTCACGCACACTACTCTCT-3’,SEQ ID NO:344)和反向引物CVSpcrR1(5’-GCCGACAACCTTGATTGGAG-3’,SEQ ID NO:345)。使用EcoRI和XbaI对PCR反应产物的消化提供了经诱变的CVS基因的文库,其用于使用相同限制性内切酶取代YEp-CVS-ura中的野生型CVS基因。通过将DNA传递进大肠杆菌制备质粒文库。该DNA文库然后用于转化酵母菌株CALI5-1或ALX7-95。酵母转化体然后如实施例2所描述进行筛选。那些与含有野生型基因的转化体相比产生升高水平的瓦伦烯(>110%)的转化体(野生型水平的110%,即,相对野生型10%的增加)在小瓶、摇瓶和发酵培养中重新测试以确认更高水平的瓦伦烯的产生。从确认产生更高水平瓦伦烯的菌株分离质粒DNA,进行测序以测定变体瓦伦烯合酶中的氨基酸改变。
表6示出使用易错PCE产生的瓦伦烯合酶突变体。该表包括核苷酸突变和造成的氨基酸突变(如果有),以及与野生型瓦伦烯合酶相比瓦伦烯产量的百分比增加(使用在摇瓶中培养的转化体进行评价)。当在摇瓶中培养时,克隆V8比野生型CVS多产生287%的瓦伦烯。
然后使用多种方法产生额外的瓦伦烯合酶突变体(示于表7)。在第一种方法中,使用标准重组DNA和PCR方法组合突变体V1和V2的氨基酸突变以产生命名为V9的变体。类似地,通过重组V1、V2和V3中的突变产生变体V10。V9或V10都不含有V1中发现的S473Y突变,由于该突变在用于组合V1和V2或V3的限制性酶切中被消除。然后使用上面描述的方法对来自变体V9的质粒DNA进行易错PCR,产生变体V12、V13、V14和V15。来自变体V12的质粒DNA然后在429位进行饱和诱变,产生变体V16,而来自变体V16的质粒DNA随后在221位进行饱和诱变产生变体V17。表7示出具有组合突变的瓦伦烯合酶突变体,并包括核苷酸突变和造成的氨基酸突变(如果有),以及与野生型瓦伦烯合酶相比,或对于V9和V10而言与V1变体相比,或对于变体V16而言与V12相比,或对于变体V17而言与V16相比,瓦伦烯产量的百分比增加(使用在摇瓶中培养的转化体进行评价)。当在摇瓶中培养时,克隆V10比克隆V1多产生88%的瓦伦烯。
下表8示出野生型CVS和若干上述鉴定的CVS变体在3L发酵器中发酵的按g/L的发酵滴度。对每个实验,所述变体在CALI5-1中表达且发酵条件相同。因此,在单个实验内观察到瓦伦烯发酵产量的差异可以归咎于被表达的瓦伦烯合酶基因的差异。如表8所示,全部CVS变体相比于野生型CVS产生增加量的瓦伦烯。
含有突变体瓦伦烯合酶基因的酵母转化体产生增加的瓦伦烯产量表明在氨基酸位置60、97、209、212、214、221、238、292、333、345、369、405、429、473和536的突变,其单独或组合,是耐受的或导致改善的瓦伦烯产量。这些位置中的一些在独立的变体中鉴定到多次。例如,野生型酶60位的缬氨酸在变体V12中被异亮氨酸取代或在变体V15中被甘氨酸取代;345位的丙氨酸在变体V12中被苏氨酸取代或在变体V3中被缬氨酸取代;和221位的酪氨酸在变体V4中被半胱氨酸取代或在变体V17中被缬氨酸取代。位置60、97、209、212、214、221、和238位于酶的与糖基水解酶具有同源性的非催化结构域中。
B.用突变组合产生瓦伦烯合酶突变体
将上面实施例3A中和在上述类似的易错PCR实验中鉴定的氨基酸变化组合于单一酶中。还包括SEQ ID NO:2所述瓦伦烯合酶的24、38、58、88、125、173和252位处的突变,其根据瓦伦烯合酶三维结构的模型位于蛋白表面上。合成了两种变体酶,各自具有29个氨基酸变化。变体CVS V18(SEQ ID NO:3)和CVS V19(SEQ ID NO:4)各自含有之前通过易错PCR鉴定为对酶活性具有有益或中性效果的22个突变,以及还具有在表面残基的7个突变。V18含有各表面残基突变为丙氨酸的突变,而V19含有各表面残基突变为谷氨酰胺或天冬酰胺的突变。表9示出在靶位置的氨基酸残基。表10示出CVS V19与野生型CVS相比的氨基酸和核苷酸变化。表11示出密码子优化的CVS V19(SEQ ID NO:129)与野生型CVS(SEQ ID NO:1)相比的沉默核苷酸变化。
密码子优化的CVS V18(SEQ ID NO:128)和CVS V19(SEQ ID NO:129)基因被克隆进YEp-CVS-ura质粒并转化进ALX11-30酿酒酵母。各转化体的瓦伦烯产生如上实施例2所述在发酵后进行评价。各转化体以和变体V12可比的水平产生瓦伦烯。变体V12产生瓦伦烯是在CALI5-1细胞中进行,预期在ALX7-95细胞中的产生是类似的,由于这两种菌株仅有的差异在于存在leu标记。与表达野生型瓦伦烯合酶的ALX7-95酿酒酵母相比,个转化体也产生大约10倍的滴度。一般而言,突变体的瓦伦烯产量是野生型产量水平的10-20倍。
C.CVS V18和V19的饱和诱变
对CVS V18基因进行N端结构域和C端催化结构域(氨基酸267-462)的不同残基进行饱和诱变以鉴定对改变顺从的,提供对活性正影响或中性影响(如通过瓦伦烯产率测量)的氨基酸。诱变后,含有突变体基因的质粒DNA被转化进酿酒酵母菌株ALX7-95。然后针对瓦伦烯产量筛选转化体克隆。然后,对来自显示比含有CVS V18基因的转化体的瓦伦烯产量高110%的转化体的质粒DNA进行测序。
1.诱变
使用重叠PCR在基因不同位置产生突变。对于每个待突变的位置,合成一对互补的诱变引物,各自在待突变的氨基酸位置每侧含有同源15个碱基对而在靶密码子含有随机核苷酸用于诱变。
用于期望的密码子变化的诱变引物和上游引物11-157.7(5’-AAGGTACCATTTAAAAAAATGTC-3’;SEQ ID NO:297)或下游引物11-157.8(5’-TTTCTCTAGATTAAAATGGAACA-3’;SEQ ID NO:298)用于PCR反应以产生两种PCR产物,各自在期望的密码子含有随机核苷酸。该两种PCR片段使用重叠PCR连接,其中两种片段以等摩尔比混合并进行没有引物的5循环PCR扩增。PCR条件是1循环的96°C,2分钟以及然后5个循环的94°C30秒,38°C30秒,和72°C2分钟。然后在引物11-157.7和11-157.8存在下在相同的PCR条件进行20或30个额外的循环。
然后用乙醇沉淀PCR反应物,通过缓和0.1体积3M乙酸钠和2体积100%乙醇并在微量离心机离心15分钟。获得的DNA沉淀用70%乙醇洗涤。将DNA溶解于16μLmilli Q纯化水,之后和1μL KpnI、1μL XbaI和2μL10x消化缓冲液混合。然后在37°C孵育消化反应物。完成后,对限制性消化物进行1%琼脂糖凝胶电泳并从凝胶中切出1.6kb片段。然后用Freezen Squeeze洗脱柱(Bio-Rad)洗脱DNA。将DNA片段连接至YEp-CVS-ura的KpnI和XbaI位点,获得的质粒电转化至DH10B大肠杆菌E.coli细胞(Invitrogen)。将十分之一的转化培养物涂布与LB氨苄青霉素(100μg/mL)平板上,剩余细胞接种进液体LB氨苄青霉素(100μg/mL)用于制备质粒DNA。平板和培养物在37°C生长过夜。对于在LB氨苄青霉素平板上具有多于200个菌落的转化物,离心3mL的LB培养物用于质粒DNA提取。每个获得的质粒DNA制备物含有突变体基因库,每个库在相同的单一密码子的核苷酸具有随机突变。
来自每个库的质粒DNA被转化进酿酒酵母菌株ALX7-95中,使用Sigma-Aldrich的醋酸锂酵母转化试剂盒。28-30°C生长3天后在SDE琼脂培养基上(0.67%Bacto无氨基酸氮源、2%葡萄糖、0.14%没有尿嘧啶的酵母合成drop-out培养基、亮氨酸、组氨酸、色氨酸、40mg/L麦角固醇)选择转化体。
2.筛选
为了筛选用于生产瓦伦烯的转化体,应用了使用微瓶培养的高通量筛选方法。将转化体酵母菌落接种入填充200μL SDE的96孔微量滴定板的单个孔中。平板在28°C生长2-3天。在生长至饱和后,来自每孔的10μL用于接种含有250μL示于生长和瓦伦烯产生的培养基的2mL玻璃小瓶。所述小瓶用血清塞(serum stopper)盖封口,然后在28°C震荡孵育2-3天。通过首先穿过所述血清塞引入250μL丙酮并涡旋,随后加入500μL n-己烷并涡旋萃取产物。在相分离后,将小瓶置于气相层析自动进样器的相同托盘上,其移除1微升有机相进行倍半萜分析。用于萃取的丙酮和己烷各自掺入内标以帮助样品的定量。萃取的样品通过气相层析分析,瓦伦烯的量从峰面积计算。
相对于CVS V18产生>110%瓦伦烯的那些突变体还在摇瓶中进行筛选。SDE培养基中的10mL种子培养物生长24hr,2.5mL用于接种在250无挡板瓶中的50mL发酵培养基(2%硫酸铵,2%磷酸钾,0.1%NaCl,0.6%MgSO4·7H2O,0.4%酵母提取物,1mL矿物溶液[FeSO4·7H2O0.028%,ZnSO4·7H2O0.029%,CuSO4·5H2O0.008%,Na2MoO4·2H2O0.024%,CoCl2·6H2O0.024%,MnSO4·H2O0.017%,HCl1mL],0.5ml50%葡萄糖,1.5ml维生素溶液[生物素0.001%,泛酸0.012%,肌醇0.06%,盐酸吡哆辛0.012%,盐酸硫胺素0.012%],0.5ml10%CaCl2)。培养物在28°C生长。接种16hr后,向培养物补料3.6ml50%葡萄糖和0.667ml12.5%酵母提取物。初始补料后每24进行补料。通过添加30%NaOH每24小时将培养物的pH调节为4.5。在接种大约88小时后,加入0.1ml的IGEPAL CA-630,培养物震荡孵育至植物油完全乳化。30分钟后,取2mL培养物样品。样品用2mL丙酮/雪松烯溶液萃取,然后用4mL己烷/十六烷萃取。通过GC分析一等分并测定瓦伦烯的量。
3.结果
a.对突变耐受的初始筛选
下表12提供了氨基酸位置和它们对突变的总体耐受(通过其瓦伦烯产量确定)总结。表12示出了突变的氨基酸的位置,各氨基酸存在的二级结构,和与亲本CVS V18产生的瓦伦烯百分比相比,产生<30%瓦伦烯和>90%瓦伦烯的样品的百分比。着重显示了与亲本CVS V18相比,50%的样品产生<30%或>90%瓦伦烯≥的氨基酸位置。例如,在氨基酸位置271,与亲本CVS V18产生的瓦伦烯相比,测试的96个样品中的72个(75%)产生<30%瓦伦烯而测试的96个样品中的3个(3.13%)产生>90%瓦伦烯。因此认为该位置是不变的或几乎不变的。相反,在氨基酸位置282,91.56%的样品(88个样品)产生与亲本CVS V18相比>90%的瓦伦烯,而仅仅4.17%产生<30%瓦伦烯。该位置认为是对改变中等耐受。因此,如下表12所示,氨基酸位置267、269、270、271、273、295、298、301、302、303、305、306、312、403、404、407、442、445和446具有大比例的具有低活性的变体,这些位置被认为是相对不变的。相反,氨基酸位置92、166、171、184、202、218、281、282、293、320、333、337、344、347、352、353、355、357、360、361、362、363、364、366、367、386、415和428具有大比例的具有高活性的变体,这些位置被认为是对改变特别耐受。
b.不变和耐受氨基酸的进一步分析
为了测定随机化的总体效果,随机选择在氨基酸270突变的19个独立细菌克隆并测序鉴定突变。在这19个独立细菌分离株中,没有一个保留原始密码子。两个分离株由改变的密码子编码野生型氨基酸亮氨酸(沉默突变),一个分离株在氨基酸270具有终止密码子。剩余的克隆编码不同的其它氨基酸。
进一步分析在氨基酸残基270(确定为不变的或几乎不变的)的个体突变分离株。如上表所示,在氨基酸270的仅仅11.46%的分离株产生与亲本CVS V18水平相比多于30%的瓦伦烯。这些样品中的两个是两个CVS V18对照。因此,94个突变体样品中的仅仅10个(10.63%)产生显著水平的瓦伦烯。对这些分离株,加上一个不产瓦伦烯的分离株的突变体质粒进行DNA测序。产生瓦伦烯的分离株中的9个编码亮氨酸,不过原始密码子从TTG突变为CTC、CTA、CTT或TAA。唯一的另一产生瓦伦烯的分离株编码野生型Leu270,但在氨基酸269具有突变,其由于在DNA引物序列内的明显错误或在PCR扩增期间导入。所测序的不产生瓦伦烯的分离株含有突变L270E。
进一步分析来自在饱和诱变筛选中鉴定为对改变中等耐受的5个氨基酸位置的个体突变分离株。针对氨基酸位置274、279、281、282和284鉴定的最高产瓦伦烯的突变体分离株在微瓶培养中重新生长且如上实施例3.C.2所述测定它们的瓦伦烯产量。此外,对多达24个独立克隆测序仪确定准确的氨基酸突变。
表13示出所鉴定的突变体。这些突变的每个和CVS V18中的29个突变(描述于上述实施例3.B)一起存在。该表还包括在初始微培养中产生的瓦伦烯的量和相对于CVSV18产生的瓦伦烯的瓦伦烯产量水平(来自3个或更多个微瓶培养物的平均)。在一些实例中,保留野生型氨基酸密码子。在另外的实例中,所述核酸突变是沉默的使得获得的瓦伦烯合酶的氨基酸序列与CVS V18的相同。沉默突变以斜体示出。在另外的实例中,观察到除靶突变外的突变,很可能是由于在PCR扩增期间导入的错误。
在初始筛选中,在氨基酸残基274筛选的94个突变体中的67.71%,与亲本CVSV18产生的瓦伦烯相比相比,产生>90%瓦伦烯。鉴定出的突变的高数目很可能是转化亲本CVS V18突变体的细胞产生低于正常量的瓦伦烯的结果。进行重复筛选,其中从转化CVS V18的细胞产生的瓦伦烯的量更有代表性,鉴定到较少的突变体。在重复测试中,对14个独立突变体分离株的测序表明仅有的与亲本CVS V18相比具有>90%瓦伦烯产量的分离株为含有野生型残基D274的分离株(见,例如突变体V84和V92)。总体上,鉴定了7个不同的突变,14个突变体分离株中的8个含有突变D274M、D274N或D274G。
在初始筛选中,在氨基酸残基279筛选的94个突变体中的54.17%,与亲本CVSV18产生的瓦伦烯相比相比,产生>90%瓦伦烯。重复测试和对24个独立突变体分离株的测序表明编码11种不同氨基酸的23个重复培养物中的19个与亲本CVS V18相比产生>90%的瓦伦烯。
在初始筛选中,在氨基酸残基281筛选的94个突变体中的88.54%,与亲本CVSV18产生的瓦伦烯相比相比,产生>90%瓦伦烯,且被认为是对改变中等耐受。20个独立突变体分离株的重复测试表明全部突变体分离株与亲本CVS V18相比产生≥90%瓦伦烯。20个突变体分离株中的11个含有突变P281A、P281L、P281S或P281K。
在初始筛选中,在氨基酸残基282筛选的94个突变体中的91.67%,与亲本CVSV18产生的瓦伦烯相比相比,产生>90%瓦伦烯。18个独立突变体分离株的测序表明18个突变体分离株中的11个含有氨基酸突变Q282S、Q282A、Q282R、Q282P或Q282L。
在初始筛选中,在氨基酸残基284筛选的94个突变体中的40.63%,与亲本CVSV18产生的瓦伦烯相比相比,产生>90%瓦伦烯。重复测试和对23个独立突变体分离株的测序表明编码11种不同氨基酸的23个重复培养物中的14个与亲本CVS V18相比产生>90%的瓦伦烯。三个分离株编码野生型氨基酸A284。
c.增加瓦伦烯产生的分离株
从在上面实验中鉴定为相对于含有CVS V18基因的转化体产生110%的瓦伦烯(即,相对CVS V18的10%的增加)的转化体提取质粒,并确定所述CVS的核苷酸序列。下表14显示符合该标准的分离的突变体的结果。表14示出通过测序发现的氨基酸和核苷酸变化。这些突变的每个和CVS V18中的29个突变(描述于上述实施例3.B)一起存在。表中还包括相对于CVS V18的瓦伦烯产量水平(从摇瓶培养物测量)。在一些实例中,所述核酸突变是沉默的使得获得的瓦伦烯合酶的氨基酸序列与CVS V18的相同。沉默突变以斜体示出。在另外的实例中,观察到除靶突变外的突变,很可能是由于在PCR扩增期间导入的错误。克隆V40含有氨基酸突变A38V。亲本基因CVSV18含有突变Q38A。因此克隆V40中的突变相应于野生型CVS的Q38V。
实施例4
组合突变体
在该实施例中,产生含有实施例3中鉴定的突变的组合的CVS变体。此外,产生多种额外的突变体。
A.组合通过饱和诱变鉴定的有益突变
如上实施例3所述鉴定的有益突变使用重叠PCR方法(见,Xiong et al.,(2004)Nucleic Acids Research32(12):e98)用CVS V19作为模板进行组合。表15示出产生的一系列38种寡核苷酸,其含有在上表14中鉴定的位置处的突变。表15列出的寡核苷酸覆盖了V19基因从唯一的内部NdeI限制性位点至唯一BglII限制性位点的区域。所述寡核苷酸中的每个属于8个重叠序列组之一。所述序列组示于下表16。单一序列组内的每一寡核苷酸提供指定氨基酸的野生型密码子或突变体密码子。组间重叠的序列设计为给出40-50°C的解链温度。
为了从所述NdeI和BglII区域获得完整的、诱变的DNA片段,在不同PCR反应中组合来自8个序列组中每个的一或多个寡核苷酸。在每个PCR反应,来自组1和组8的寡核苷酸以30pmol每50μL反应的总浓度使用。来自组2至组7的寡核苷酸以1.5pmol每50μL反应每寡核苷酸组的总浓度使用。初始变性循环是95°C2分钟。使用“降落PCR”热循环方案,其中初始退火温度46°C在酶两个循环后降低2度直至达到最终38°C的退火温度。完成总共30个PCR循环,包括22个具有38°C退火温度的循环。每个步骤由30秒的变性步骤、30秒的退火步骤和2分钟的延伸步骤组成。PCR方案以7分钟的延伸步骤结束。全部PCR反应产物使用Qia-quick凝胶提取柱(Qiagen)或Freeze and Squeeze柱(Bio-Rad)从1.2%琼脂糖凝胶中纯化。干净的PCR产物用限制性酶NdeI和BglII消化,且连接至YEp-CVS-UVA的NdeI和BglII位点。连接物被电穿孔进大肠杆菌E.coli DH10B,如上实施例3.C.2所述。
使用如上实施例3.C.2所述的微瓶方法筛选突变体,进一步在摇瓶培养物中筛选具有>110%的V19瓦伦烯产率的突变体。用如上实施例3.C.2所述的微瓶方法使用酿酒酵母的ALX11-30菌株(ura3,trp1,erg9def25,HMG2cat/TRP1::rDNA,dpp1,sue)额外地筛选各种突变体。
下表17示出鉴定的突变体,包括核苷酸和氨基酸突变,以及在摇瓶培养物中的瓦伦烯产量,其相对于含有CVS V19基因的转化体的瓦伦烯产量。表中示出的突变是除了CVS V19中的29个突变(描述于上述实施例3.B)外的突变。在一些实例中,所述核酸突变是沉默的使得获得的瓦伦烯合酶的氨基酸序列与CVS V19的相同。沉默突变以斜体示出。例如,在ALX-95细胞中,变体V58与CVS V19的瓦伦烯产量相比产生99.91的瓦伦烯。测序获得V180和V181仅仅部分序列数据。
B.产生额外的瓦伦烯合酶突变体
然后使用标准重组DNA和PCR方法产生额外的瓦伦烯合酶突变体(示于表19)。表中示出的突变是除了CVS V19中的29个突变(描述于上述实施例3.B)外的突变。在突变体V46、V43和V41中鉴定的氨基酸突变(见上表14)使用标准重组DAN和PCR方法组合以产生命名为V184和V185的变体。为产生V184和V185,在单一PCR中使用引物21-73.39和7-10.4(见下表18),以来自突变体V41的质粒DNA作为模板。
通过V62和V66中的突变的重组产生变体V73和V74。通过V62和V67中的突变的重组产生变体V75和V746。变体V73、V74、V75和V76全部使用实施例3C中所述的重叠PCR技术产生,除以下例外。在第一部,在一个反应中使用引物7-10.3和21-71.42扩增V62的一部分而使用引物21-71.41和7-10.4在部分PCR中扩增V66或V67的一部分。然后使用引物7-10.3和7-10.4从该两种第一步产物产生全长基因。
使用上文实施例3.C.2所述的微瓶方法在ALX7-95或ALX11-30中筛选突变体,且在摇瓶培养物中进一步筛选具有>110%的V19瓦伦烯产率的突变体(即,比野生型产生的瓦伦烯多10%)。下表19示出鉴定的突变体,包括核苷酸和氨基酸突变,以及在摇瓶培养物中的瓦伦烯产量,其相对于含有CVS V19基因的转化体的瓦伦烯产量。表中示出的突变是除了CVS V19中的29个突变(描述于上述实施例3.B)外的突变。在一些实例中,所述核酸突变是沉默的使得获得的瓦伦烯合酶的氨基酸序列与CVS V19的相同。沉默突变以斜体示出。发现V75具有改善的产物分布,导致副产物大根香叶烯A(以β-榄香烯测量)产量的大致50%的减少。
ND:未测定
C.产生额外的瓦伦烯合酶突变体
更多的额外的瓦伦烯合酶突变体使用多种方法产生。如下子部分a-e所述产生所述突变体。
使用上文实施例3.C.2所述的微瓶方法在ALX7-95中筛选全部产生的突变体,且在摇瓶培养物中进一步筛选具有>110%的CVS V19瓦伦烯产率的突变体(即,比CVSV19产生的瓦伦烯增加10%)。在一些实例中,在摇瓶培养物中筛选具有至少90%的V19滴度的突变体、具有其它期望的性质(如增加的酶特异性)的突变体。对所鉴定的突变体测序。下表20-24示出鉴定的突变体,包括核苷酸和氨基酸突变,以及在初始微培养和摇瓶培养物中的瓦伦烯产量百分比(%),其相对于含有CVS V19基因的转化体的瓦伦烯产量。
如果示出,表中示出的突变是除了CVS V19中的29个突变(描述于上述实施例3.B)外的突变。在一些实例中,所述核酸突变是沉默的使得获得的瓦伦烯合酶的氨基酸序列与CVS V19的相同。此外,编码所述突变体CVS V19的核酸(SEQ ID NO:129)针对酵母密码子优化。因此,一些沉默突变导致与野生型CVS相同的密码子。例如,突变体V182中,亮氨酸293由野生型CVS密码子TTA编码,而亲本CVS V19密码子是TTG。全部沉默突变以斜体示出。若干突变体含有突变Q58K。亲本基因CVS V19含有突变K58Q。因此,相比于野生型CVS,该突变是沉默的,虽然具有核酸密码子改变(野生型CVS中AAG,突变体CVS中AAA)。
a.V186、V77、V187、V78、V188、V189、V190、V79、V191、V192、V193、V194和V195
使用正向寡核苷酸mutCVS2-7(SEQ ID NO:337)和反向寡核苷酸7-10.4(SEQ IDNO:339)通过单一PCR反应从CVS V19产生CVS变体V186、V77、V187、V78、V188、V189、V190、V79、V191、V192、V193、V194和V195。PCR净化、限制性消化、连接、转化和测试如上面部分A所述进行。所述突变是除了CVS V19(SEQ ID NO:4)中存在的29个突变(描述于上面实施例3.B)外的突变。下表20示出所述变体,包括相对野生型CVS和CVS V19的氨基酸和核苷酸改变,以及相对CVS V19的瓦伦烯产量百分比。
b.V196、V197、V198、V200、V201、V202、V203、V204、V205、V206、V207、V212、V213、V214、V215、V216和V217
CVS变体V196、V197、V198、V200、V201、V202、V203、V204、V205、V206、V207、V212、V213、V214、V215、V216和V217在不同氨基酸含有突变,包括L106、R132、M153、H159、Q188、I189、P202、I213、H219、I397和K474。这些突变体如实施例3C.1所述通过CVS V19基因氨基端非催化结构域的单一氨基酸位置的饱和诱变产生,例外是使用外部引物7-10.3和7-10.4(见表18)分别代替引物11-157.7和11-157.8。PCR净化、限制性消化、连接、转化和测试如上面部分A所述进行。下表21示出所述变体,包括相对野生型CVS和CVS V19的氨基酸和核苷酸改变,以及相对CVS V19的瓦伦烯产量百分比。所述突变是除了CVS V19(SEQ ID NO:4)中存在的29个突变(描述于上面实施例3.B)外的突变,变体V202是例外。如下表21所示,野生型CVS在残基219含有组氨酸且CVS V19在残基219含有天冬氨酸,而V202在残基219含有丙氨酸。
c.V199、V208、V209、V210和V211
CVS变体V199、V208、V209、V210和V211在氨基酸53至58含有突变,且是通过使用正向寡核苷酸21-108-1(SEQ ID NO:340)和反向寡核苷酸21-108-2(SEQ IDNO:341)(见表18)在单一PCR反应中从CVS V19基因产生。下表22示出所述变体,包括相对野生型CVS和CVS V19的氨基酸和核苷酸改变,以及相对CVS V19的瓦伦烯产量百分比。V209在L106额外含有突变,其在PCR扩增期间导入。
d.V220、V221、V222、V223、V224、V225和V226
CVS变体V220、V221、V222、V223、V224和V225使用V75基因作为模板通过类似于实施例4.C.a的两步重叠PCR方案产生。V226使用V19基因作为模板,其作为与以V75作为模板产生的变体的比较。第一步PCR反应使用诱变引物21-140.1和外部引物7-10.4,或诱变引物21-140.2和外部引物7-10.3(见表18)。这些诱变引物同时随机化CVS V19或其衍生物包括V75的氨基酸212-221的氨基酸密码子。第二步PCR反应使用引物-10.3和7-10.4。PCR净化、限制性消化、连接、转化和测试如上面部分A所述进行。下表23示出所述变体,包括相对野生型CVS和CVS V19的氨基酸和核苷酸改变,以及相对CVS V19的瓦伦烯产量百分比。V223不含有在V75发现的P281S突变,
而V224具有额外的A319T突变。这些突变在PCR扩增期间导入。
e.CVS变体V227
通过使用在残基F209处引入突变的正向和反向引物的单一PCR反应从V75基因产生CVS变体V227。下表24示出CVS变体V227,包括相对野生型CVS和CVS V19的氨基酸和核苷酸改变,以及相对CVS V19的瓦伦烯产量%。
实施例5
含有来自其他萜烯合酶的结构域或区域的变体
在该实施例中,产生含有来自烟草(Nicotiana tabacum)5-epi-aristolochene合酶(TEAS,SEQ ID NO:941)、埃及莨菪(Hyoscyamus muticus)premnaspirodiene合酶(HPS,SEQ ID NO:942)或葡萄瓦伦烯合酶(SEQ ID NO:346)的异源氨基酸的CVS变体。如下子部分a-k所述产生所述突变体。
一般地,通过如上实施例3.C.1所述的PCR方法的修改,使用在多个密码子位置同时导入突变的引物产生所述CVS变体。
使用重叠PCR在V75、V19或这些变体之后的衍生物的特定表面环中产生多突变。对于待突变的每一环,合成一对互补的诱变引物,各引物在待交换的氨基酸位置每侧含有15-20个具有序列相同性的碱基对。在一些例子中,在诱变靶向的环中的多个密码子存在随机核苷酸。
用于期望的环变化的诱变引物和上游引物11-154.3(SEQ ID NO:928)或下游引物11-154.4(SEQ ID NO:927)用于PCR反应以产生两种PCR产物,各自在期望的密码子含有随机核苷酸或来自异源瓦伦烯合酶基因的密码子。PCR条件是1循环的96°C2分钟以及然后20-30个循环的94°C30秒,50°C30秒,和72°C2分钟。各反应仅进行一步PCR。各获得的PCR产生的基因片段与YEp-CVS-ura载体在外部末端具有30-200核苷酸的重叠,相容的(compatible)PCR产物在内部末端。
PCR反应物进行1%琼脂糖凝胶电泳,从所述凝胶切下含有设计的片段大小的条带。然后用Qiaquick柱(Qiagen)洗脱DNA。YEp-CVS-ura载体用限制性酶KpnI和XbaI消化并在1%琼脂糖凝胶纯化,从所述凝胶切下含~6.4kb片段的条带。然后用Qiaquick柱(Qiagen)洗脱DNA。
混合约250ng的洁净的、经消化的质粒DNA和250ng各洁净的PCR产物,混合物使用来自Sigma-Aldrich的醋酸锂酵母转化试剂盒直接转化至酿酒酵母菌株Alx7-95。28-30°C生长3天后在SDE琼脂培养基上(0.67%Bacto无氨基酸氮源、2%葡萄糖、0.14%没有尿嘧啶的酵母合成drop-out培养基、亮氨酸、组氨酸、色氨酸、40mg/L麦角固醇)选择通过酵母同源重组产生完整质粒的转化体。
使用上文实施例3.C.2所述的微瓶方法在ALX7-95中筛选全部产生的突变体,且在摇瓶培养物中进一步筛选具有>110%的CVS V19瓦伦烯产率的突变体(即,比CVSV19产生的瓦伦烯增加10%)。对所鉴定的突变体测序。下表26-37示出鉴定的突变体,包括核苷酸和氨基酸突变,以及在初始微培养和摇瓶培养物中的瓦伦烯产量百分比(%),其相对于含有CVS V19基因的转化体的瓦伦烯产量。
在一些实例中,所述核酸突变是沉默的使得获得的瓦伦烯合酶的氨基酸序列与CVSV19的相同。此外,编码所述突变体CVS V19的核酸(SEQ ID NO:129)针对酵母密码子优化。不同于CVS V19中发现的沉默突变(见表11)以斜体示出。若干突变体含有突变Q58K。亲本基因CVS V19含有突变K58Q。因此,相比于野生型CVS,该突变是沉默的,虽然具有核酸密码子改变(野生型CVS中AAG,突变体CVS中AAA)。在下表中,横线代表缺失或***。例如,相应于L175和V176的核苷酸在V232中缺失,因此获得的变体比野生型CVS短两个氨基酸。相反,V239在残基R91、A92和D93处含有3个氨基酸***。
a.V228、V229、V230和V231
在CVS变体V228、V229、V230和V231,CVS氨基酸53-58被TEAS(SEQ ID NO:295)的氨基酸58-63如上所述用引物7-10.4和7-10.3(见表25)置换。通过使用标准重组DNA和PCR方法重组变体V228和V73中的突变产生CVS变体V229。通过V228和V75中的突变的重组产生CVS变体V230和V231。下表26-27示出所述变体,包括相对野生型CVS和CVS V19的氨基酸和核苷酸改变,以及相对CVS V19的瓦伦烯产量百分比。
b.V232、V233、V234、V235、V236、V237和V238
在CVS变体V232、V233、V234、V235、V236、V237和V238中,使用诱变引物21-134.9和21-134.10以及外部引物11-154.3和11-54.4(见表25)通过如上所述的直接酵母重组方法用来自HPS的等价氨基酸(SEQ ID NO:942的氨基酸185-193)置换氨基酸174-184。CVS变体V232、V233、V234、V235和V236使用V75(SEQ ID NO:130)作为模板产生。CVS变体V237通过V235和V236的突变的重组产生。该变体在E484额外含有由随机PCR错误产生的突变。从Alx7-95分离V237并测序。平行地,将V237转化进Alx11-30以在该菌株进行测试。从Alx11-30再分离V238。下表28示出所述变体,包括相对野生型CVS和CVS V19的氨基酸和核苷酸改变,以及相对CVS V19的瓦伦烯产量百分比。由于HPS相应的序列比CVS短2个氨基酸,全部的这些CVS变体含有两个氨基酸缺失。
c.V239、V240、和V241
在CVS变体V239、V240和V241中,通过如上所述的直接酵母重组(见表25),氨基酸53-58被TEAS(SEQ ID NO:941)的氨基酸58-63置换,氨基酸85-99被HPS(SEQID NO:942)的氨基酸93-110置换,和氨基酸174-184被HPS(SEQ ID NO:942)的氨基酸185-193或TEAS(SEQ ID NO:941)的氨基酸177-185置换。HPS的氨基酸185-193与TEAS的氨基酸177-185相同。这些突变体产生自两种PCR片段。为产生第一种片段,V228变体用作模板,使用寡核苷酸11-154.3和诱变引物21-130.4。为产生第二种片段,V237/V228变体用作模板,使用外部寡核苷酸11-154.4和诱变引物21-130.3。
下表29示出所述变体,包括相对野生型CVS和CVS V19的氨基酸和核苷酸改变,以及相对CVS V19的瓦伦烯产量百分比。使用HPS的环置换氨基酸85-99和174-184分别导致3个氨基酸残基的添加和2个氨基酸残基的缺失,获得比野生型CVS长1个氨基酸的蛋白。除了来自V228和V237/V238的设计的突变,V239在L111含有突变,被认为是PCR错误的结果。同样,V240也在R19具有突变。
d.V242
在CVS变体V242中,氨基酸212-222通过上文所述的直接酵母重组(见表25)用HPS的氨基酸221-228置换。该CVS变体使用外部引物11-154.3和诱变引物21-141.6,以及11-154.4和诱变引物21-141.5从作为模板的V75产生。下表30示出所述变体,包括相对野生型CVS和CVS V19的氨基酸和核苷酸改变,以及相对CVS V19的瓦伦烯产量百分比。由于HPS相应的序列比CVS短2个氨基酸,该CVS变体含有两个氨基酸缺失。
大量克隆的筛选显示除V242外的全部具有V19的~77%的滴度,而V242具有V19滴度的95%。测序表明突变体V242含有序列IYEEEGFK,而HPS的氨基酸221-228是IYEEEEFK。该偏差最可能在寡核苷酸合成中出现。
e.V243、V244、V245和V255
在CVS变体V243、V244和V255中,通过如上所述的直接酵母重组(见表27),氨基酸53-58被TEAS(SEQ ID NO:941)的氨基酸58-63置换,氨基酸85-99被HPS(SEQID NO:942)的氨基酸93-110置换,和氨基酸174-184被HPS(SEQ ID NO:942)的氨基酸185-193或TEAS(SEQ ID NO:295)的氨基酸177-185置换。这些变体额外含有来自V75的突变。此外,氨基酸212-221被1)TEAS的氨基酸213-221或2)葡萄瓦伦烯合酶(SEQ ID NO:346)的氨基酸223-230置换。这些CVS变体用上文表25所示引物,使用V240作为模板产生。
用诱变引物21-145.1和21-145.5以及外部寡核苷酸11-154.3和11-154.4(见表25),使用V240作为模板产生V243和V244。用上文表25所示诱变引物21-145.3和21-145.4,使用V240作为模板产生V245和V255CVS变体。
下表31示出所述变体,包括相对野生型CVS和CVS V19的氨基酸和核苷酸改变,以及相对CVS V19的瓦伦烯产量百分比。V244含有没有在V243发现的突变I325T,假设是在PCR期间引入的。变体V245和V255,其各自在CVS位置212-221具有葡萄瓦伦烯合酶序列,具有单一核苷酸变化的不同,所述单一核苷酸变化假设是在PCR期间产生,导致V255中不期望的Q448至L447的突变。
f.V246、V247、V248、V249、V250、V251、V252、V253、V254和V272
在CVS变体V246、V247、V248、V249、V250、V251、V252、V253、V254和V272中,如上所述,氨基酸53-58被TEAS(SEQ ID NO:941)的氨基酸58-63置换,氨基酸85-99被HPS(SEQ ID NO:942)的氨基酸93-110置换,和氨基酸174-184被HPS(SEQID NO:942)的氨基酸185-193或TEAS(SEQ ID NO:941)的氨基酸177-185置换。此外,氨基酸212-222被随机氨基酸置换。
CVS变体V246、V247、V248、V249、V250、V253和V254如实施例4C.d.所述产生,使用V240和V19作为两个PCR反应的模板,其使用上文表25所示的寡核苷酸。例如,使用随机诱变寡核苷酸21-140.1和21-140.2以及外部寡核苷酸11-154.3和11-154.4来修饰氨基酸位置212-221,产生V246。用11-154.3和21-140.2的PCR反应使用V240作为模板,但第二个反应使用V19作为模板。如实施例4C.a.所述产生CVS变体V251和V252,使用V241和V19作为两个PCR反应的模板。如实施例4C.d.所述产生V272,例外是使用V240作为两个PCR反应的模板。
下表32示出所述变体,包括相对野生型CVS和CVS V19的氨基酸和核苷酸改变,以及相对CVS V19的瓦伦烯产量百分比。鉴定了若干额外的分离株,其产生约77%的CVS V19的瓦伦烯滴度,但额外地产生大量的b-榄香烯。
g.V256、V257、V258、V259、V261、V263、V264、V262、V260、V265、V266和V273
在CVS变体V256、V257、V258、V259、V261、V263、V264、V262、V260、V265、V266和V273中,如上所述,氨基酸53-58被TEAS(SEQ ID NO:941)的氨基酸58-63置换,氨基酸85-99被HPS(SEQ ID NO:942)的氨基酸93-110置换,和氨基酸174-184被HPS(SEQ ID NO:942)的氨基酸185-193或TEAS(SEQ ID NO:941)的氨基酸177-185置换。一些使用V243或V244作为模板产生的变体还含有被TEAS的氨基酸213-221置换的氨基酸212-221.这些变体额外含有来自V75的突变。此外,氨基酸2-7被随机氨基酸置换。这些CVS变体通过直接酵母重组产生,使用诱变引物mutCVS2-7和revAA2-7rnd(见表18),使用V240、V243或V244作为模板。下表33示出所述变体,包括相对野生型CVS和CVS V19的氨基酸和核苷酸改变,以及相对CVS V19的瓦伦烯产量百分比。
h.V267、V268、V269、V270和V271
在CVS变体V267、V268、V269、V270和V271中,如上所述,氨基酸53-58被TEAS(SEQ ID NO:941)的氨基酸58-63置换,氨基酸85-99被HPS(SEQ ID NO:942)的氨基酸93-110置换,和氨基酸174-184被HPS(SEQ ID NO:942)的氨基酸185-193或TEAS(SEQ ID NO:941)的氨基酸177-185置换。这些变体额外地在L106(V267)或F209(V268-271)含有随机突变。CVS变体V267、V268、V269、V270和V271用上文表25所示引物,使用V240作为模板产生。下表34示出所述变体,包括相对野生型CVS和CVS V19的氨基酸和核苷酸改变,以及相对CVS V19的瓦伦烯产量百分比。
i.V274和V277
在CVS变体V274和V277中,氨基酸3-41被葡萄(SEQ ID NO:346)的氨基酸3-51置换,氨基酸53-58被TEAS(SEQ ID NO:941)的氨基酸58-63置换,氨基酸85-99被HPS(SEQ ID NO:942)的氨基酸93-110置换,和氨基酸174-184被HPS(SEQ IDNO:942)的氨基酸185-193或TEAS(SEQ ID NO:941)的氨基酸177-185置换。CVS变体V274用上文表25所示引物,使用V240作为模板通过直接酵母重组产生。CVS变体V277用上文表25所示引物,使用V245作为模板通过直接酵母重组产生。下表35示出所述变体,包括相对野生型CVS和CVS V19的氨基酸和核苷酸改变,以及相对CVS V19的瓦伦烯产量百分比。
j.V275和V276
在CVS变体V275和V276中,氨基酸85-99如上文所述(见表25)用葡萄(SEQ IDNO:346)的氨基酸96-113置换。CVS变体V275和V276使用V75作为模板通过直接酵母重组产生。诱变寡核苷酸21-141.7和寡核苷酸11-154.4在单一PCR反应使用,诱变寡核苷酸21-141.8和寡核苷酸11-154.3在单一PCR反应使用,寡核苷酸示于上文表25。下表36示出所述变体,包括相对野生型CVS和CVS V19的氨基酸和核苷酸改变,以及相对CVS V19的瓦伦烯产量百分比。V275和V276由一个突变的不同,V276中的Y387→C389。
k.V278、V279、V280和V281
CVS变体V278、V279、V280和V281通过实施例3.a中所述使用V240和V245作为模板通过易错pCR产生,具有以下例外。首先,PCR反应中使用引物11-154.3和11-154.4(见表25)。然后,如实施例5.1通过直接酵母重组完成克隆。下表37示出所述变体,包括相对野生型CVS和CVS V19的氨基酸和核苷酸改变,以及相对CVS V19的瓦伦烯产量百分比。
实施例6
产生和筛选另外的瓦伦烯合酶突变体
更多的额外的瓦伦烯合酶突变体使用多种方法产生。如下子部分a-f所述产生所述突变体。
使用上文实施例3.C.2所述的微瓶方法在ALX7-95中筛选突变体,且在摇瓶培养物中进一步筛选具有>110%的CVS V19瓦伦烯产率的突变体(即,比CVS V19产生的瓦伦烯增加10%)。下表38-40示出基于所设计的序列的氨基酸变化,尽管对突变体测序的尝试不成功。这些表还示出在初始微培养和摇瓶培养中的瓦伦烯产量相对于含有CVSV19基因的转化体的瓦伦烯产量的百分比。
a.V282
使用CVS V19(SEQ ID NO:129)作为模板产生V282。在CVS变体V282中,氨基酸53-58被TEAS(SEQ ID NO:941)的氨基酸58-63置换,氨基酸85-99被HPS(SEQ IDNO:942)的氨基酸93-110置换,和氨基酸174-184被HPS(SEQ ID NO:942)的氨基酸185-193或TEAS(SEQ ID NO:941)的氨基酸177-185置换,和氨基酸212-221被如上所述的随机氨基酸(见表27)置换。该突变体如上实施例5f所述制备。
b.V283
使用V241作为模板,如上用于CVS变体V246的实施例5f所述产生CVS变体V283。鉴定了若干额外的分离株,其与CVSV19相比产生>77%的瓦伦烯,但额外地产生大量的b-榄香烯。
c.V284和V285
使用V240作为模板,如上用于CVS变体V246的实施例5f所述产生CVS变体V284和V285。鉴定了若干额外的分离株,其产生大于约77%的CVS V19的瓦伦烯滴度,但额外地产生大量的b-榄香烯。
d.含有来自氨基酸212-221的随机化残基的变体
使用CVS V19和V75作为模板产生额外的含有来自氨基酸212-221的随机化残基的CVS变体。这些变体如之前实施例5f所述产生。使用CVS V19作为模板产生的8个分离物鉴定为与CVS V19相比产生>80%瓦伦烯。使用CVS V75作为模板产生的12个分离物鉴定为与CVS V19相比产生>74%瓦伦烯。
e.含有定点突变的变体
如上所述通过单一PCR反应使用上面表25所示正向和反向寡核苷酸从模板基因产生在位置L310、H360或Q370含有点突变的额外的CVS变体。
产生含有点L310H的变体,由此V75和V240被修饰为具有突变L310H。在微培养中测试所述变体的瓦伦烯产量。结果显示V75+L310H平均产生95.5%的变体V19的瓦伦烯产量,而V240+L310H平均产生77.7%的变体V19的瓦伦烯产量。结果提示L310H在V240背景并没有正影响。
此外,使用V19作为模板产生在氨基酸H360或Q370的点突变,8个单独的分离物被鉴定为产生与CVS V19相比68-100%瓦伦烯。
f.在N-端含有交换的变体
通过用来自三种异源萜烯合酶基因各自相应序列置换编码CVS残基1-15的核苷酸,产生在CVS最N-端含有交换的额外的CVS变体。所述三种异源萜烯合酶为烟草(Nicotiana tabacum)5-epi-aristolochene合酶(TEAS,SEQ ID NO:941)、埃及莨菪(Hyoscyamus muticus)premnaspirodiene合酶(HPS,SEQ ID NO:942)或葡萄瓦伦烯合酶(SEQ ID NO:346)。使用CVS变体V240、V243、和V245作为模板产生所述突变体。测定瓦伦烯产量,结果显示这些突变体导致与V19相比降低的瓦伦烯产量。
实施例7
诺卡酮的产生
通过实施例2所述的发酵产生的含瓦伦烯的大豆油使用刮膜式蒸馏在100°C和350mTorr浓缩和纯化以产生含有以重量计大约68%瓦伦烯的油。该材料通过下述的两种不同方法转变为诺卡酮。
A.使用三氧化铬将瓦伦烯氧化为诺卡酮
如上所述产生的瓦伦烯蒸馏物使用三氧化铬和吡啶在二氯甲烷中如下氧化成诺卡酮。分成部分将三氧化铬(369g,3.69mol,22eq)添加至吡啶(584g,7.4mol,44eq)在5L二氯甲烷的溶液。混合物搅拌10分钟,在4分钟加入50克瓦伦烯蒸馏物(68%w/w,0.167mol,1eq),混合物在22°C搅拌18小时。从容器排去液体,固体用2L甲基叔丁醚(MTBE)洗涤两次。合并的有机层然后用2L MTBE稀释并连续用1.25L的5%氢氧化钠洗涤三次,用2L的5%盐酸洗涤两次以及用2L的盐水洗涤一次。有机相用200克无水硫酸钠干燥,过滤并蒸发浓缩,获得36.8粗诺卡酮(48%w/w,0.081mol,48%产率)。
B.使用膦酸二氧化硅固定化的铬(III)催化剂将瓦伦烯氧化成诺卡酮
膦酸二氧化硅铬(III)树脂(48.9g,PhosphonicS,Ltd.)置于装有冷凝器、热电偶套管、高架搅拌器和喷射管的5L圆底烧瓶。添加2L的叔丁醇和瓦伦烯蒸馏物(68%,500g,1.67摩尔,1eq),将内容物加热至45°C,搅拌异质悬浮液同时将氧气喷射通过所述溶液且用氮气冲洗顶部空间。在2小时向所述溶液添加水中70%的叔-丁基氢过氧化氢(TBHP,315g,2.45摩尔,1.47eq),反应温度加热并维持在60±5°C。搅拌反应物直至>90%的瓦伦烯被消耗(如通过气相层析测定)。然后使反应物冷却至室温并通过过滤去除二氧化硅催化剂。用500mL异丙醇洗涤烧瓶和树脂。向合并的有机溶液(叔丁醇和异丙醇)加入1L去离子水,减压蒸发浓度哦混合物,生产琥珀色油。所述油溶解在3L的甲苯中并用3.125L的15%硫酸剧烈搅动洗涤15分钟。去除水性层并用1L甲苯重萃取。合并的甲苯层然后用2.5L的1M氢氧化钠洗涤3次,用500mL的饱和氯化钠洗涤2次,并用无水硫酸镁干燥。过滤后,减压蒸发去除溶剂获得378g的粘稠琥珀色的油(33重量%诺卡酮,0.57摩尔,34%产率)。
实施例8
分析CVS变体的萜烯产物分布
在该实施例中,使用气相层析测定由变体瓦伦烯合酶产生的萜烯的产物分布。通过气相层析对表达瓦伦烯合酶的酵母菌株产生的产物的分析表明所述酶产生瓦伦烯为主要产物。还产生了多种副产物,包括称为峰1(试验性地鉴定为β芹子烯)、峰2(试验性地鉴定为τ-s芹子烯)、峰3(鉴定为雅榄蓝烯)、峰4(鉴定为7-表-α-芹子烯)和峰5(鉴定鉴定)的化合物,以及β-榄香烯和多种次要额外产物。β-榄香烯几乎必然是中间体大根香叶烯的降解产物,经由科普(Cope)重排形成(de Kraker etal.1251930-1940)。
结果示于下表41和42,其以占产生的萜烯总量的百分比示出萜烯产物的分布,所述萜烯总量在本文定义为通过GC峰面积测定瓦伦烯、β-榄香烯、峰1-5的量的总和。表41示出变体CVS V19、V71、V73、V75、V229和V231(见上文表19和27)从摇瓶培养中产生的产物的分布。相比于变体CVS V19的66%,在变体V71、V73和V75中产生的瓦伦烯的量占萜烯总量的百分比为约71%。观察到这些变体形成的β-榄香烯的量的相应降低,提示所述变体酶更有效地推动反应完全而不是停止在大根香叶烯中间体。来自所述瓦伦烯合酶变体的其它副产物的分布在所述变体酶之间类似。与变体CVSV19产生的瓦伦烯占产物混合物的比例相比(67.66%),在变体V229和V231中瓦伦烯同样占产物混合物的更大比例(72.8%)。使用V229和V231,观察到β-榄香烯和峰3的比例降低。
下表42显示在3L发酵培养中生长的表达瓦伦烯合酶变体的酵母菌株的类似比较。观察到在发酵器培养中的变体CVS V19的产物分布与在摇瓶培养中的类似但不相同。变体V73和V75具有改变的产物分布,导致更大百分比的总产物为瓦伦烯在这些变体的每个中,观察到的β-榄香烯的量少于变体CVS V19的量,再次提示所述酶更有效推动反应完全而不是停止在中间体大根香叶烯。由这些变体产生的峰1-4的量均与CVS V19变体类似。有趣的是,与CVS V19相比,变体V75产生更多的峰5化合物,但V73产生较少的峰5产物。这提示培养条件的差异可能也影响这种为鉴定的副产物的产物分布。
大体上,观察到一些变体瓦伦烯合酶产生的产物比例不同于野生型酶或变体V18和V19(其产物谱类似于野生型瓦伦烯合酶)。具体地,一些变体产生的瓦伦烯的比例高于V19中观察到的比例。这些数据表明可以通过向瓦伦烯合酶导入突变产生具有改变的产物选择性的变体,且一些变体产生反应混合物中更高比例的瓦伦烯。
实施例9
额外的瓦伦烯合酶变体
以上文的瓦伦烯合酶作为模板,通过与上文描述类似的易错PCR和重叠PCR方法,使用在多个密码子位置同时导入突变的引物,导入进一步的氨基酸置换或交换,产生额外的瓦伦烯合酶突变体。例如,一些额外的突变体以瓦伦烯合酶V19、V240或V245作为模板使用表25所示的引物在PCR反应中产生。如上所述针对瓦伦烯产量筛选所产生的突变体。下表示出所产生的变体,包括相对野生型CVS和CVS V19的氨基酸和核苷酸改变,以及相对CVS V19的瓦伦烯产量百分比。
从V240作为模板产生CVS变体V293、V299、V300、V304、V305、V306、V307和V308,使得所述变体如上所述氨基酸53-58被TEAS(SEQ ID NO:941)的氨基酸58-63置换,氨基酸85-99被HPS(SEQ ID NO:942)的氨基酸93-110置换,和氨基酸174-184被HPS(SEQ ID NO:942)的氨基酸185-193或TEAS(SEQ ID NO:941)的氨基酸177-185置换。此外,所述变体与V240相比均含有一或多个氨基酸置换例如M1T、S2A、S3G、G4E、E5A、F7G、A11T、N20D、L23S、Y152H(Y152→H155)、E163D(E163→D166)、K173E(K173→E176)、M210T(M210→T211)、C361R(C361→R362)、Q448L(Q448→L449)、C465S(C465→S466)、K468Q(K468→Q469)、K499E(K499→E500)、P500L(P500→L501)和/或A539V(A539→V540)。
CVS变体V292以V245作为模板序列产生,该变体氨基酸53-58被TEAS(SEQ IDNO:941)的氨基酸58-63置换,氨基酸85-99被HPS(SEQ ID NO:942)的氨基酸93-110置换,和氨基酸174-184被HPS(SEQ ID NO:942)的氨基酸185-193或TEAS(SEQ IDNO:941)的氨基酸177-185置换,和氨基酸212-221被葡萄(SEQ ID NO:346)氨基酸223-230置换。此外,所述变体与V245相比含有氨基酸置换V439L(V439→L438)。
CVS变体V311和V312以V19作为模板序列产生。此外,在所述变体中,CVS的氨基酸90-99被SEQ ID NO:346所示葡萄的氨基酸101-113通过上述的直接酵母重组并使用V19作为模板(见表25)置换。诱变寡核苷酸21-141.3和寡核苷酸11-154.4在单一PCR反应使用,诱变寡核苷酸21-141.4和寡核苷酸11-154.3在单一PCR反应使用,寡核苷酸示于上文表25。V311和V312由两个突变的不同,V312中的I82V和L399→S401。
在CVS变体314中,通过如上所述的直接酵母重组(见表25),氨基酸3-41被葡萄(SEQ ID NO:346)的氨基酸3-51置换,氨基酸53-58被TEAS(SEQ ID NO:941)的氨基酸58-63置换,氨基酸85-99被葡萄(SEQ ID NO:346)的氨基酸96-112置换,和氨基酸174-184被HPS(SEQ ID NO:942)的氨基酸185-193或TEAS(SEQ ID NO:941)的氨基酸177-185置换,和氨基酸212-221被葡萄(SEQ ID NO:346)氨基酸223-230置换。
CVS变体V297和V313分别使用V240或V314作为模板,通过用葡萄(SEQ IDNO:346)的氨基酸128-159置换氨基酸115-146产生。通过如上所述的直接重组(见表25)合并三种PCR片段。第一种PCR片段以V240或V314作为模板,使用寡核苷酸11-154.3和诱变引物21-145.30。第二种PCR片段以葡萄(SEQ ID NO:346)作为模板,使用诱变引物21-145.29和21-145.40。第三种PCR片段以V240作为模板,使用寡核苷酸11-154.4和诱变引物21-145.39。因此,对于CVS变体V313,除了V314中的交换,V313中的氨基酸114-146被葡萄(SEQ ID NO:346)氨基酸128-159通过如上所述的直接酵母重组(见表25)置换。此外,该变体与V314相比含有氨基酸置换H102Y(H102→Y114)。CVS变体V2197,其以V240作为模板产生,氨基酸53-58被TEAS(SEQID NO:941)的氨基酸58-63置换,氨基酸85-99被HPS(SEQ ID NO:942)的氨基酸93-110置换,氨基酸114-146被葡萄(SEQ ID NO:346)的氨基酸128-159置换,和氨基酸174-184被HPS(SEQ ID NO:942)的氨基酸185-193或TEAS(SEQ ID NO:941)的氨基酸177-185置换。
V260(V259)、V263和V277用作模板在氨基酸196、197、198、200、348或399产生点突变易产生CVS变体V287、V288、V289、V290、V294、V295、V296、V298、V301、V302、V303、V309、V310、V315。一些由所设计的突变策略产生的经鉴定的突变导致与模板无差异、沉默突变或返回野生型序列。
上述各变体,包括相对野生型CVS和CVS V19的氨基酸和核苷酸改变,以及相对CVS V19的瓦伦烯产量百分比(在摇瓶培养中评估),示于表43。没有提供变体V299、V300、V304、V305、V306、V307、V308的瓦伦烯产量数据,因为这些变体仅仅在微培养中而没有在摇瓶培养中测试瓦伦烯产量。
由于修改对于本领域技术人员来说是显而易见的,本发明仅仅收到所附权利要求的限制。
Claims (186)
1.编码修饰的瓦伦烯合酶多肽的核酸分子,其中:
所述修饰的瓦伦烯合酶多肽包含与SEQ ID NO:3所示的修饰的瓦伦烯合酶多肽具有少于100%相同性或具有100%相同性的氨基酸序列;
所述修饰的瓦伦烯合酶多肽包含与SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶多肽具有少于95%相同性的氨基酸序列;和
所述修饰的瓦伦烯合酶多肽包含与SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶多肽具有大于62%相同性的氨基酸序列。
2.权利要求1的核酸分子,其中:
所述修饰的瓦伦烯合酶多肽在瓦伦烯合酶多肽中包含氨基酸修饰;由此
所述修饰的瓦伦烯合酶多肽包含与SEQ ID NO:3所示的修饰的瓦伦烯合酶多肽具有少于100%相同性的氨基酸序列;
所述修饰的瓦伦烯合酶多肽包含与SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶多肽具有少于95%相同性的氨基酸序列;和
所述修饰的瓦伦烯合酶多肽包含与SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶多肽具有大于62%相同性的氨基酸序列。
3.权利要求1或权利要求1的核酸分子,其中所述修饰的瓦伦烯多肽包含与SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶具有至少82%的序列相同性的氨基酸序列。
4.权利要求1-2任一项的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽中与不含修饰的瓦伦烯合酶或SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶多肽相比的修饰的数目是29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136或137。
5.权利要求1-4任一项的核酸分子,其中所述修饰的瓦伦烯合酶多肽包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶的序列相同性选自小于95%且大于75%、小于94%且大于75%、小于93%且大于75%、小于92%且大于75%、小于95%且大于80%、小于94%且大于80%、小于93%且大于80%、小于92%且大于80%、小于95%且大于85%、小于94%且大于85%、小于93%且大于85%、以及小于92%且大于85%。
6.权利要求1-5任一项的核酸分子,其中所述修饰的瓦伦烯合酶多肽包含与SEQID NO:2所示的瓦伦烯合酶具有小于或约94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%或75%的相同性的氨基酸序列。
7.权利要求1-6任一项的核酸分子,其中所述修饰的瓦伦烯合酶多肽包含与SEQID NO:3所示的修饰的瓦伦烯合酶多肽具有至少80%相同性的氨基酸序列。
8.权利要求1-7任一项的核酸分子,其中所述修饰的瓦伦烯合酶多肽包含与SEQID NO:3所示的瓦伦烯合酶具有至少或约81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、76%或99%的相同性的氨基酸序列。
9.编码修饰的瓦伦烯合酶多肽的核酸分子,其中:
所述修饰的瓦伦烯合酶多肽不含有SEQ ID NO:289-291、346、347、752、882、883或886任一所示的氨基酸序列;和
所述修饰的瓦伦烯合酶多肽与SEQ ID NO:2所示瓦伦烯合酶相比包含氨基酸修饰;由此所述修饰的瓦伦烯合酶多肽包含与SEQ ID NO:2所示瓦伦烯合酶多肽具有少于100%且大于62%相同性的氨基酸序列。
10.权利要求9的核酸分子,其中所述修饰的瓦伦烯合酶多肽不含有SEQ IDNO:6-8、14-16和348任一所示的氨基酸序列。
11.权利要求9的核酸分子,其中所述修饰的瓦伦烯合酶多肽不含有SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列。
12.权利要求9的核酸分子,其中所述修饰的瓦伦烯合酶多肽不含有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
13.权利要求1-12任一项的核酸分子,其中所述修饰的瓦伦烯合酶多肽催化从无环焦磷酸萜烯前体形成瓦伦烯。
14.权利要求13的核酸分子,其中所述无环焦磷酸萜烯前体是法尼基二磷酸(FPP)。
15.权利要求1-14任一项的核酸分子,其中所述修饰的瓦伦烯合酶多肽在宿主细胞中从FPP产生瓦伦烯的量大于由SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶在相同宿主细胞中及在相同条件下从FPP产生瓦伦烯的量,其中所述宿主细胞是产生FPP的细胞。
16.权利要求15的核酸分子,其中所述宿主细胞是酵母细胞。
17.权利要求16的核酸分子,其中所产生的瓦伦烯的量通过以下评估:
在相同条件下和在相同酵母菌株中单独地培养表达所述修饰的瓦伦烯合酶多肽和SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶的酵母细胞;和
比较所产生的瓦伦烯的量.
18.权利要求15-17任一项的核酸分子,其中由所述修饰的瓦伦烯合酶从FPP产生的瓦伦烯的量比由SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶从FPP产生瓦伦烯的量多10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、250%、300%、350%、400%、500%或更多;或比由SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶从FPP产生瓦伦烯的量多10%-500%、10%-250%、50%-250%、100%-500%或100%-250%。
19.权利要求1-18任一项的核酸分子,其中由所述修饰的瓦伦烯合酶多肽产生的瓦伦烯在酵母细胞培养基中的量是至少或约0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L1.0g/L、1.1g/L、1.2g/L、1.3g/L、1.4g/L、1.5g/L、2.0g/L、2.5g/L、3.0g/L、3.5g/L、4.0g/L、4.5g/L、5.0g/L或更多;或在酵母培养基中的量是0.1g/L-5.0g/L、0.1g/L-3.0g/L、0.5g/L-5.0g/L、1.0g/L-5.0g/L或1.0g/L-3.0g/L。
20.权利要求1-19任一项的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶在瓦伦烯合酶多肽中相应于选自CVS编号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、50、53、54、55、56、57、58、60、62、69、77、78、82、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、111、113、114、116、117、118、120、121、122、124、125、127、129、130、132、135、136、138、139、141、142、144、146、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、162、163、165、166、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、186、187、188、189、190、191、193、194、195、196、197、198、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、227、228、229、238、252、257、263、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、305、306、307、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、329、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、375、377、378、380、381、382、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、422、423、424、428、429、434、435、436、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、451、452、454、457、465、468、473、474、484、492、495、496、499、500、501、506、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、536和539位的位置处包含至少一个氨基酸修饰,所述CVS编号参考SEQ ID NO:2所示氨基酸位置。
21.权利要求1-20的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽包含至少一个修饰,所述修饰是氨基酸置换,其选自相应于CVS编号M1T、S2R、S2K、S2E、S2Q、S2P、S2T、S2L、S2H、S2A、S2V、S3D、S3R、S3G、S3I、S3E、S3V、S3A、S3T、S3L、S3M、S3N、G4K、G4V、G4N、G4I、G4R、G4S、G4P、G4A、G4E、G4F、G4C、G4T、G4L、G4Q、E5A、E5G、E5S、E5T、E5D、E5H、E5I、E5P、E5L、E5N、E5V、T6R、T6V、T6D、T6L、T6A、T6E、T6K、T6S、T6G、T6C、T6M、T6Y、F7C、F7A、F7Q、F7K、F7S、F7G、F7T、F7L、F7R、F7P、F7N、T10V、A11T、D12N、S16N、L17I、R19K、R19P、R19G、N20D、H21Q、L23I、L23S、K24A、K24Q、K24Y、K24T、G25Y、A26T、S27P、D28G、D28E、F29D、D33T、H34R、T35A、A36C、T37K、Q38V、Q38A、Q38N、Q38E、R40Q、H41I、R50G、T53L、T53R、D54A、D54P、D54C、A55T、A55P、A55R、A55V、A55Q、E56G、E56P、E56F、E56A、E56T、E56Q、D57R、D57P、D57S、D57Q、D57A、K58Q、K58R、K58P、K58E、K58A、V60I、V60G、K62R、V69I、F78L、I82V、A85M、I86L、Q87D、K88Q、K88A、K88H、L89I、C90Y、P91N、I92Y、I92N、I92S、Y93H、Y93F、Y93F、I94E、I94H、D95A、S96H、S96C、N97D、N97E、R98K、R98Y、R98D、A99N、A99M、H102Y、L106A、L106S、L106K、L106F、L111S、Q113R、I166Y、K117T、V122I、E124N、K125A、K125Q、K127T、D129E、E130R、R132G、S135E、S136A、N139S、Q142R、S146G、Y152H、M153N、M153G、H159Q、H159K、H159R、E163D、K173E、K173Q、K173A、Q178A、D179P、V181L、T182K、P183S、K184R、K184P、Q188R、I189A、I189V、I189P、T200Q、P202S、F209I、F209H、F209E、F209L、F209T、M210T、M212R、M212D、M212N、M212S、M212A、M212Y、M212K、M212F、M212H、M212Q、M212I、M212S、M212V、I213Y、I213M、I213A、I213R、I213S、I213L、I213F、I213S、I213P、I213Q、I213N、I213K、I213V、I213Y、N214D、N214E、N214S、N214L、N214Y、N214V、N214P、N214H、N214C、N214A、N214T、N214R、N214Y、N214Q、S215H、S215G、S215K、S215R、S215P、S215A、S215N、S215T、S215L、S215V、S215Q、S215D、T216Q、T216Y、T216E、T216P、T216R、T216C、T216V、T216K、T216D、T216A、T216S、T216K、S217R、S217K、S217F、S217I、S217T、S217G、S217Y、S217N、S217H、S217E、S217F、S217C、S217E、S217D、D218I、D218G、D218V、D218C、D218P、D218M、D218R、D218L、D218S、D218A、D218Y、D218K、D218E、H219D、H219A、H219L、H219C、H219W、H219R、H219S、H219F、H219E、H219G、H219Q、H219A、L220V、L220S、L220T、L220P、L220M、L220A、L220H、L220E、L220G、L220D、L220F、Y221C、Y221V、Y221Q、Y221F、Y221S、Y221N,Y221T、Y221P、Y221L、Y221K、Y221W、Y221E、Y221V、Y221H、N227S、E238D、K252A、K252Q、T257A、D274M、D274N、D274S、D274F、D274G、D274H、D274E、F279S、F279I、F279P、F279D、F279L、F279N、F279M、F279H、F279C、F279A、F279G、F279W、E280L、P281S、P281H、P281K、P281A、P281W、P281L、P281Y、Q282L、Q282S、Q282A、Q282I、Q282R、Q282Y、Q282G、Q282W、Q282P、Q282E、Y283F、Y283N、A284T、A284G、A284P、A284V、A284R、A284D、A284E、A284S、A284H、A284K、A284I、A284W、A284M、Q292K、I299Y、Y307H、L310H、E311P、E311T、L313C、S314A、S314T、L315M、F316L、T317S、E318K、A319T、V320D、V320G、V320S、Q321A、W323R、N324S、I325T、E326K、E333D、K336R、L337I、L343V、A345V、A345T、N347L、N347S、E348A、E348S、E350K、G357R、H360L、H360A、C361R、V362A、E367G、N369I、Q370D、Q370H、Q370G、K371G、A375D、S377Y、Y387C、I397V、L399S、T405R、T409G、N410S、F424L、N429S、N429G、A436S、V439L、Q448L、C465S、K468Q、S473Y、K474T、E484D、I492V、E495G、K499E、P500L、T501P、P506S、D536E和A539V的氨基酸置换,所述CVS编号参考SEQ ID NO:2所示位置。
22.权利要求1-19任一项的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽包含至少一个修饰,所述修饰是氨基酸置换,并且至少一个氨基酸置换位于相应于选自CVS编号1、2、3、4、5、6、7、11、19、20、23、24、28、38、50、53、54、55、56、57、58、60、62、69、78、82、88、93、97、98、102、106、111、113、125、132、152、153、159、163、173、184、188、189、200、202、209、210、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、227、238、252、257、274、279、280、281、282、283、284、292、297、299、307、310、311、313、314、315、316、317、318、319、320、321、323、324、325、326、333、336、337、343、345、347、348、350、357、360、361、362、367、369、370、371、375、377、387、397、399、405、409、410、424、429、436、439、448、465、468、473、474、484、492、495、499、500、501、506、536和539位的位置,所述CVS编号参考SEQ IDNO:2所示位置。
23.权利要求1-20任一项的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽包含至少一个修饰,所述修饰是氨基酸置换,其选自相应于CVS编号M1T、S2R、S2K、S2E、S2Q、S2P、S2T、S2L、S2H、S2A、S2V、S3D、S3R、S3G、S3I、S3E、S3V、S3A、S3T、S3L、S3M、S3N、G4K、G4V、G4N、G4I、G4R、G4S、G4P、G4A、G4E、G4F、G4C、G4T、G4L、E5A、E5G、E5S、E5T、E5D、E5H、E5I、E5P、E5L、E5N、T6R、T6V、T6D、T6L、T6A、T6E、T6K、T6S、T6G、T6C、T6M、T6Y、F7C、F7A、F7Q、F7K、F7S、F7G、F7T、F7L、F7R、F7P、A11T、R19K、R19P、N20D、L23S、K24A、K24Q、K24Y、D28G、Q38V、Q38A、Q38N、R50G、T53L、T53R、D54A、D54P、D54C、A55T、A55P、A55R、A55V、A55Q、E56G、E56P、E56F、E56A、E56T、E56Q、D57R、D57P、D57S、D57Q、D57A、K58Q、K58R、K58P、K58E、K58A、V60I、V60G、K62R、V69I、F78L、I82V、K88Q、K88A、Y93H、N97D、R98K、H102Y、L106A、L106S、L106K、L106F、L111S、Q113R、K125A、K125Q、R132G、Y152H、M153N、M153G、H159Q、H159K、H159R、E163D、K173E、K173Q、K173A、K184R、Q188R、I189A、I189V、I189P、T200Q、P202S、F209I、F209H、F209E、F209L、F209T、M210T、M212R、M212D、M212N、M212S、M212A、M212Y、M212K、M212F、M212H、M212Q、I213Y、I213M、I213A、I213R、I213S、I213L、I213F、I213S、I213P、I213Q、I213N、I213K、I213V、N214D、N214E、N214S、N214L、N214Y、N214V、N214P、N214H、N214C、N214A、N214T、N214R、S215H、S215G、S215K、S215R、S215P、S215A、S215N、S215T、S215L、S215V、S215Q、T216Q、T216Y、T216E、T216P、T216R、T216C、T216V、T216K、T216D、T216A、T216S、S217R、S217K、S217F、S217I、S217T、S217G、S217Y、S217N、S217H、S217E、S217F、S217C、D218I、D218G、D218V、D218C、D218P、D218M、D218R、D218L、D218S、D218A、D218Y、D218K、H219D、H219A、H219L、H219C、H219W、H219R、H219S、H219F、H219E、L220V、L220S、L220T、L220P、L220M、L220A、L220H、L220E、L220G、L220D、Y221C、Y221V、Y221Q、Y221F、Y221S、Y221N,Y221T、Y221P、Y221L、Y221K、Y221W、Y221E、Y221V、N227S、E238D、K252A、K252Q、T257A、D274M、D274N、D274S、D274F、D274G、D274H、D274E、F279S、F279I、F279P、F279D、F279L、F279N、F279M、F279H、F279C、F279A、F279G、F279W、E280L、P281S、P281H、P281K、P281A、P281W、P281L、P281Y、Q282L、Q282S、Q282A、Q282I、Q282R、Q282Y、Q282G、Q282W、Q282P、Q282E、Y283F、Y283N、A284T、A284G、A284P、A284V、A284R、A284D、A284E、A284S、A284H、A284K、A284I、A284W、A284M、Q292K、I299Y、Y307H、L310H、E311P、E311T、L313C、S314A、S314T、L315M、F316L、T317S、E318K、A319T、V320D、V320G、V320S、Q321A、W323R、N324S、I325T、E326K、E333D、K336R、L337I、L343V、A345V、A345T、N347L、N347S、E348A、E348S、E350K、G357R、H360L、H360A、C361R、V362A、E367G、N369I、L399S、Q370D、Q370H、Q370G、K371G、A375D、S377Y、Y387C、I397V、T405R、T409G、N410S、F424L、N429S、N429G、A436S、V439L、Q448L、C465S、K468Q、S473Y、K474T、E484D、I492V、E495G、K499E、P500L、T501P、P506S、D536E和A539V的氨基酸置换,所述CVS编号参考SEQ ID NO:2所示位置。
24.权利要求1-23任一项的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶在相应于选自60、97、209、212、214、221、238、292、333、345、369、405、429、473和/或536位的位置处包含氨基酸置换,所述编号为相对于SEQ ID NO:2所示瓦伦烯合酶多肽的编号。
25.权利要求24的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽包含氨基酸置换,其选自相应于CVS编号V60I、V60G、N97D、F209I、F209H、F209E、F209L、F209T、M212R、M212D、M212N、M212S、M212A、M212Y、M212K、M212F、M212H、M212Q、N214D、N214E、N214S、N214L、N214Y、N214V、N214P、N214H、N214C、N214A、N214T、N214R、Y221C、Y221V、Y221Q、Y221F、Y221S、Y221N、Y221T、Y221P、Y221L、Y221K、Y221W、Y221E、Y221V、E238D、Q292K、E333D、A345V、A345T、N369I、T405R、N429S、N429G、S473Y、和/或D536E的氨基酸置换,所述CVS编号参考SEQ ID NO:2所示位置。
26.权利要求9-25任一项的核酸分子,其中所述修饰的瓦伦烯合酶多肽包含选自CVS编号N214D/S473Y;T405R;A345V/D536E;Y221C;E238D;F209I;N97D;E333D/N369I;N214D/T405R;N214D/A345V/T405R/D536E;R98K/N214D/N227S/T405R;V60I/N214D/A345T/T405R;N214D/T405R/N429S;N214D/Q292K/T405R;V60G/N214D/T405R;V60I/N214D/A345T/T405R/N429S;V60I/M212R/N214D/Y221V/A345T/T405R/N429G的氨基酸置换,所述CVS编号具有相对于SEQ ID NO:2所示位置的编号。
27.权利要求1-25任一项的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶在相应于CVS编号60、209、238和292位的位置处具有氨基酸置换,所述CVS编号具有相对于SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶的位置的编号。
28.权利要求27的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽包含:
位于位置V60处的置换,其是V60I或V60G;
位于位置F209处的置换,其是F209I、F209H、F209E、F209L或F209T;
位于位置E238处的置换,其是E238D;和
位于位置Q292处的置换,其是Q292K,各编号是具有相对于SEQ ID NO:2的位置的编号的CVS编号。
29.权利要求1-28任一项的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶在相应于60、125、173、209、238、252和292位的位置处具有氨基酸置换,所述编号是相对于SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶的编号。
30.权利要求29的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽包含:
位于位置V60处的置换,其是V60I或V60G;
位于位置K125处的置换,其是K125A或K125Q;
位于位置K173处的置换,其是K173E、K173Q或K173A;
位于位置F209处的置换,其是F209I、F209H、F209E、F209L或F209T;
位于位置E238处的置换,其是E238D;
位于位置K252处的置换,其是K252Q;和
位于位置Q292处的置换,其是Q292K,各编号是具有相对于SEQ ID NO:2的位置的编号的CVS编号。
31.权利要求1-30任一项的核酸分子,其中所述修饰的瓦伦烯合酶包含氨基酸置换,其选自相应于:
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/Q292K/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/V320S/Q321A/E326K/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24A/Q38A/R50G/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/V320G/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/L315M/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
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K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209H/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/P281S/Q292K/L313C/S314T/L315M/T317S/Q321A/E333D/K336R/L337I/A345T/G357R/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E的置换,各编号相对于SEQ ID NO:2所示的位置。
32.权利要求1-31任一项的核酸分子,其包含SEQ ID NO:128-202、204-288、693-701、704-712、716-722、754-775和800任一所示的核酸序列;与SEQ IDNO:128-202、204-288、693-701、704-712、716-722、754-775和800任一所示的核酸序列具有至少95%序列相同性的核酸序列;和其简并序列。
33.权利要求1-32的核酸分子,其包含SEQ ID NO:128-202、204-288、693-701、704-712、716-722、754-775和800任一所示的核酸序列。
34.权利要求1-33任一项的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶包含SEQ ID NO:3-66、68-127、723-731、734-742、746-751、810-832和857任一所示的氨基酸序列,和与SEQ ID NO:3-66、68-127、723-731、734-742、746-751、810-832和857任一所示的氨基酸序列具有至少95%序列相同性的氨基酸序列。
35.权利要求1-34任一项的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶包含SEQ ID NO:3-66、68-127、723-731、734-742、746-751、810-832和857任一所示的氨基酸序列。
36.权利要求1-35任一项的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽包含一或多个来自一或多种萜烯合酶的异源结构域或其部分,其中所述结构域选自无结构环1;α螺旋1;无结构环2;α螺旋2;无结构环3;α螺旋3;无结构环4;α螺旋4;无结构环5;α螺旋5;无结构环6;α螺旋6;无结构环7;α螺旋7;无结构环8;α螺旋8;无结构环9;α螺旋A;A-C环;α螺旋C;无结构环11;α螺旋D;无结构环12;α螺旋D1;无结构环13;α螺旋D2;无结构环14;α螺旋E;无结构环15;α螺旋F;无结构环16;α螺旋G1;无结构环17;α螺旋G2;无结构环18;α螺旋H1;无结构环19;α螺旋H2;无结构环20;α螺旋H3;无结构环21;α螺旋a-1;无结构环22;α螺旋I;无结构环23;α螺旋J;J-K环;α螺旋K;和/或无结构环25。
37.编码修饰的瓦伦烯合酶多肽的核酸分子的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽包含一或多个来自一或多种萜烯合酶的异源结构域或其部分,其中所述结构域选自无结构环1;α螺旋1;无结构环2;α螺旋2;无结构环3;α螺旋3;无结构环4;α螺旋4;无结构环5;α螺旋5;无结构环6;α螺旋6;无结构环7;α螺旋7;无结构环8;α螺旋8;无结构环9;α螺旋A;A-C环;α螺旋C;无结构环11;α螺旋D;无结构环12;α螺旋D1;无结构环13;α螺旋D2;无结构环14;α螺旋E;无结构环15;α螺旋F;无结构环16;α螺旋G1;无结构环17;α螺旋G2;无结构环18;α螺旋H1;无结构环19;α螺旋H2;无结构环20;α螺旋H3;无结构环21;α螺旋a-1;无结构环22;α螺旋I;无结构环23;α螺旋J;J-K环;α螺旋K;和/或无结构环25。
38.权利要求36或37的核酸分子,其中所述异源结构域或其连续部分置换不含所述异源结构域的瓦伦烯合酶的相应天然结构域的全部或连续部分。
39.权利要求36-38任一项的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶包含不同的萜烯合酶的异源结构域的全部。
40.权利要求36-39任一项的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶包含来自一或多种萜烯合酶的异源结构域的至少50%、60%、70%、80%、90%、或95%的连续氨基酸。
41.权利要求36-40任一项的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽包含异源结构域,所述异源结构域是所述无结构环2结构域的全部或连续的部分。
42.权利要求41的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽含有异源无结构环2结构域或其连续的部分,其中相应于SEQ ID NO:2所示瓦伦烯合酶多肽53-58位氨基酸残基的天然无结构环2结构域被来自不同的萜烯合酶的相应区域的全部或部分置换。
43.权利要求36-42任一项的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽包含异源结构域,所述异源结构域是所述α螺旋3结构域的全部或连续的部分。
44.权利要求43的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽含有异源α螺旋3结构域或其连续的部分,其中相应于SEQ ID NO:2所示瓦伦烯合酶多肽79-93位氨基酸残基的天然α螺旋3结构域被来自不同的萜烯合酶的相应区域的全部或部分置换。
45.权利要求36-44任一项的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽包含异源结构域,所述异源结构域是所述无结构环5结构域的全部或连续的部分。
46.权利要求45的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽含有异源无结构环5结构域或其连续的部分,其中相应于SEQ ID NO:2所示瓦伦烯合酶多肽115-141位氨基酸残基的天然无结构环5结构域被来自不同的萜烯合酶的相应区域的全部或部分置换。
47.权利要求36-46任一项的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽包含异源结构域,所述异源结构域是所述无结构环6结构域的全部或连续的部分。
48.权利要求47的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽含有异源无结构环6结构域或其连续的部分,其中相应于SEQ ID NO:2所示瓦伦烯合酶多肽153-162位氨基酸残基的天然无结构环6结构域被来自不同的萜烯合酶的相应区域的全部或部分置换。
49.权利要求36-48任一项的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽包含异源结构域,所述异源结构域是所述无结构环7结构域的全部或连续的部分。
50.权利要求49的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽含有异源无结构环7结构域或其连续的部分,其中相应于SEQ ID NO:2所示瓦伦烯合酶多肽174-184位氨基酸残基的天然无结构环7结构域被来自不同的萜烯合酶的相应区域的全部或部分置换。
51.权利要求36-50任一项的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽包含异源结构域,所述异源结构域是所述无结构环9结构域的全部或连续的部分。
52.权利要求51的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽含有异源无结构环9结构域或其连续的部分,其中相应于SEQ ID NO:2所示瓦伦烯合酶多肽213-222位氨基酸残基的天然无结构环9结构域被来自不同的萜烯合酶的相应区域的全部或部分置换。
53.权利要求36-52任一项的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽包含异源结构域,所述异源结构域是所述α螺旋D1结构域的全部或连续的部分。
54.权利要求53的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽含有异源α螺旋D1结构域或其连续的部分,其中相应于SEQ ID NO:2所示瓦伦烯合酶多肽310-322位氨基酸残基的天然α螺旋D1结构域被来自不同的萜烯合酶的相应区域的全部或部分置换。
55.权利要求36-54任一项的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽包含异源结构域,所述异源结构域是所述J-K环结构域的全部或连续的部分。
56.权利要求55的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽含有异源J-K环结构域或其连续的部分,其中相应于SEQ ID NO:2所示瓦伦烯合酶多肽522-534位氨基酸残基的天然J-K环结构域被来自不同的萜烯合酶的相应区域的全部或部分置换。
57.权利要求36-56任一项的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽包含异源结构域,所述异源结构域是所述无结构环1结构域的全部或连续的部分。
58.权利要求57的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽含有异源无结构环1结构域或其连续的部分,其中相应于SEQ ID NO:2所示瓦伦烯合酶多肽1-29位氨基酸残基的天然无结构环1结构域被来自不同的萜烯合酶的相应区域的全部或部分置换。
59.权利要求36-58任一项的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽包含异源结构域,所述异源结构域是所述α螺旋1结构域的全部或连续的部分。
60.权利要求59的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽含有异源α螺旋1结构域或其连续的部分,其中相应于SEQ ID NO:2所示瓦伦烯合酶30-39位和44-52位氨基酸残基的天然α螺旋1结构域被来自不同的萜烯合酶的相应区域的全部或部分置换。
61.权利要求36-60任一项的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽包含异源结构域,所述异源结构域是所述无结构环4结构域的全部或连续的部分。
62.权利要求61的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽含有异源无结构环4结构域或其连续的部分,其中相应于SEQ ID NO:2所示瓦伦烯合酶94-100位氨基酸残基的天然无结构环4结构域被来自不同的萜烯合酶的相应区域的全部或部分置换。
63.权利要求36-62任一项的核酸分子,其中所述不同的萜烯合酶是表5B所示的萜烯合酶。
64.权利要求36-63任一项的核酸分子,其中所述不同的萜烯合酶选自:葡萄(Vitis vinifera)瓦伦烯合酶,烟草epi-aristolochene合酶(TEAS)和埃及莨菪(Hyoscyamus muticus)premnaspirodiene合酶(HPS)。
65.权利要求36-64任一项的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽包含异源无结构环2结构域或其连续部分,其中相应于SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶多肽的53-58位的氨基酸残基被SEQ ID NO:295或941所示的TEAS多肽的58-63位氨基酸残基置换。
66.权利要求36-65任一项的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽包含异源α螺旋3结构域或其连续部分和异源无结构环4结构域或其连续部分,其中相应于SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶多肽的85-89位的氨基酸残基被SEQ IDNO:942所示的HPS多肽的93-97位氨基酸残基置换。
67.权利要求36-66任一项的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽包含异源α螺旋3结构域或其连续部分和异源无结构环4结构域或其连续部分,其中相应于SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶多肽的85-99位的氨基酸残基被SEQ IDNO:346所示的葡萄瓦伦烯合酶多肽的96-112位氨基酸残基置换。
68.权利要求36-67任一项的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽具有异源无结构环5结构域或其连续部分,其中相应于所述瓦伦烯合酶多肽的115-146位的氨基酸残基被SEQ ID NO:346所示的葡萄瓦伦烯合酶的128-129位氨基酸残基置换。
69.权利要求36-68任一项的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽包含异源无结构环7结构域或其连续部分,其中相应于SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶多肽的174-184位的氨基酸残基被SEQ ID NO:942所示的HPS多肽的185-193位氨基酸残基置换。
70.权利要求36-69任一项的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽包含异源无结构环9结构域或其连续部分,其中相应于SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶多肽的212-221位的氨基酸残基被SEQ ID NO:942所示的HPS多肽的221-228位氨基酸残基置换。
71.权利要求36-69任一项的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽包含异源无结构环9结构域或其连续部分,其中相应于SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶多肽的212-221位的氨基酸残基被SEQ ID NO:295所示的TEAS多肽的213-221位氨基酸残基置换。
72.权利要求36-71任一项的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽包含异源无结构环9结构域或其连续部分,其中相应于SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶多肽的212-221位的氨基酸残基被SEQ ID NO:346所示的葡萄瓦伦烯合酶的223-230位氨基酸残基置换。
73.权利要求36-72任一项的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽包含异源无结构环1结构域或其连续部分和异源α螺旋1结构域或其连续部分,其中相应于SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶多肽的3-41位的氨基酸残基被SEQ IDNO:346所示的葡萄瓦伦烯合酶多肽的3-51位氨基酸残基置换。
74.权利要求36-73任一项的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽包含异源无结构环6结构域或其连续部分,其中相应于SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶多肽的152-163位的氨基酸残基被SEQ ID NO:942所示的HPS多肽的163-174位氨基酸残基置换。
75.权利要求36-74任一项的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽包含异源α螺旋D1结构域或其连续部分,其中相应于SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶多肽的310-322位的氨基酸残基被SEQ ID NO:942所示的HPS多肽的317-329位氨基酸残基置换。
76.权利要求36-75任一项的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽包含异源J-K环结构域或其连续部分,其中相应于SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶多肽的522-534位的氨基酸残基被SEQ ID NO:942所示的HPS多肽的527-541位氨基酸残基置换。
77.权利要求1-76任一项的核酸分子,其中所述修饰的瓦伦烯合酶包含修饰,所述修饰选自相应于:
K24Q/Q38N/T53L/D54A/A55T/E56G/D57R/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/
H219D/Y221V/E238D/K252Q/Q292K/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24Q/Q38N/T53L/D54A/A55T/E56G/D57R/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/P281S/Q292K/L313C/S314T/L315M/T317S/Q321A/E333D/K336R/L337I/A345T/N347L/G357R/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24Q/Q38N/T53L/D54A/A55T/E56G/D57R/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252Q/P281S/Q292K/L313C/S314T/L315M/T317S/Q321A/E333D/K336R/L337I/A345T/G357R/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;
K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/
L175→---/V176→---/Q178→A176/D179→P177/V181→L179/
T182→K180/P183→S181/K184→P182/F209→I207/M212→R210/N214→D212/H219→D217/Y221→V219/E238→D236/K252→Q250/P281→S279/Q292→K290/L313→C311/S314→T312/L315→M313/T317→S315/Q321→A319/E333→D331/K336→R334/L337→I335/A345→T343/G357→R355/N369→I367/S377→Y375/T405→R403/N429→G427/A436→S434/T501→P499/D536→E534;
S2R/S3D/G4K/E5G/F7C/K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/L175→---/V176→---/Q178→A176/D179→P177/
V181→L179/T182→K180/P183→S181/K184→P182/F209→I207/M212→R210/N214→D212/H219→D217/Y221→V219/E238→D236/K252→Q250/P281→S279/Q292→K290/L313→C311/S314→T312/L315→M313/T317→S315/Q321→A319/E333→D331/K336→R334/L337→I335/A345→T343/G357→R355/N369→I367/S377→Y375/T405→R403/N429→G427/A436→S434/E484→D482/T501→P499/D536→E534;
K24Q/Q38N/T53L/D54A/A55T/E56G/D57R/V60I/A85M/I86L/Q87D/K88H/L89I/C90Y/---→R91/---→A92/---→D93/I92→Y95/Y93→F96/I94→E97/
D95→A98/S96→H99/N97→E100/R98→Y101/A99→N102/L111→S114/K125→Q128/K173→Q176/L175→---/V176→---/Q178→A179/D179→P180/
V181→L182/T182→K183/P183→S184/K184→P185/F209→I210/M212→R213/N214→D215/H219→D220/Y221→V222/E238→D239/K252→Q253/P281→S282/Q292→K293/L313→C314/S314→T315/L315→M316/T317→S318/Q321→A322/E333→D334/K336→R337/L337→I338/A345→T346/G357→R358/N369→I370/S377→Y378/T405→R406/N429→G430/A436→S437/E484→D485/T501→P502/D536→E537;
R19K/K24Q/Q38N/T53L/D54A/A55T/E56G/D57R/V60I/A85M/I86L/Q87D/K88H/L89I/C90Y/---→R91/---→A92/---→D93/I92→Y95/Y93→F96/
I94→E97/D95→A98/S96→H99/N97→E100/R98→Y101/A99→N102/K125→Q128/K173→Q176/L175→---/V176→---/Q178→A179/D179→P180/
V181→L182/T182→K183/P183→S184/K184→P185/F209→I210/M212→R213/N214→D215/H219→D220/Y221→V222/E238→D239/K252→Q253/P281→S282/Q292→K293/L313→C314/S314→T315/L315→M316/T317→S318/Q321→A322/E333→D334/K336→R337/L337→I338/A345→T346/G357→R358/N369→I370/S377→Y378/T405→R406/N429→G430/A436→S437/E484→D485/T501→P502/D536→E537;
K24Q/Q38N/T53L/D54A/A55T/E56G/D57R/V60I/A85M/I86L/Q87D/K88H/L89I/C90Y/---→R91/---→A92/---
→D93/I92→Y95/Y93→F96/I94→E97/D95→A98/S96→H99/N97→E100/R98→Y101/A99→N102/K125→Q128/K173→Q176/L175→---/V176→---
/Q178→A179/D179→P180/V181→L182/T182→K183/P183→S184/K184→P185/F209→I210/M212→R213/N214→D215/H219→D220/Y221→V222/E238→D239/K252→Q253/P281→S282/Q292→K293/L313→C314/S314→T315/L315→M316/T317→S318/Q321→A322/E333→D334/K336→R337/L337→I338/A345→T346/G357→R358/N369→I370/S377→Y378/T405→R406/N429→G430/A436→S437/E484→D485/T501→P502/D536→E537;
K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/Y93H/N97D/R98K/K125Q/K173Q/K184R/F209I/M212I/I213Y/N214E/S215→---/T216→---
/S217→E215/D218→E216/H219→G217/L220→F218/Y221→K219/E238→D236/K252→Q250/P281→S279/Q292→K290/L313→C311/S314→T312/L315→M313/T317→S315/Q321→A319/E333→D331/K336→R334/L337→I335/A345→T343/G357→R355/N369→I367/S377→Y375/T405→R403/N429→G427/A436→S434/T501→P499/D536→E534;
R19K/K24Q/Q38N/T53L/D54A/A55T/E56G/D57R/V60I/A85M/I86L/Q87D/
K88H/L89I/C90Y/---→R91/---→A92/---→D93/I92→Y95/Y93→F96/
I94→E97/D95→A98/S96→H99/N97→E100/R98→Y101/A99→N102/K125→Q128/K173→Q176/L175→---/V176→---/Q178→A179/D179→P180/V181→L182/
T182→K183/P183→S184/K184→P185/F209→I210/M212→S213/N214→Y215/S215→D216/T216→K217/S217--/D218E/H219Q/L220S/Y221K/E238D/K252Q/P281S/Q292K/L313C/S314T/L315M/T317S/Q321A/E333D/K336R/L337I/A345T/G357R/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/E484D/T501P/D536ER19K/K24Q/Q38N/T53L/D54A/A55T/E56G/D57R/V60I/A85M/I86L/Q87D/K88H/L89I/C90Y/---→R91/---→A92/---→D93/I92→Y95/Y93→F96/I94→E97/D95→A98/
S96→H99/N97→E100/R98→Y101/A99→N102/K125→Q128/K173→Q176/L175→---/V176→---/Q178→A179/D179→P180/V181→L182/T182→K183/P183→S184/K184→P185/F209→I210/M212→S213/N214→Y215/S215→D216/T216→K217/S217--/D218E/H219Q/L220S/Y221K/E238D/K252Q/P281S/Q292K/L313C/S314T/L315M/T317S/Q321A/I325T/E333D/K336R/L337I/A345T/G357R/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/E484D/T501P/D536E;
R19K/K24Q/Q38N/T53L/D54A/A55T/E56G/D57R/V60I/A85M/I86L/Q87D/K88H/L89I/C90Y/--→R91/--→A92/--→D93/I92→Y95/Y93→F96/I94→E97/D95→A98/S96→H99/N97→E100/R98→Y101/A99→N102/K125→Q128/K173→Q176/L175→---/V176→---/Q178→A179/D179→P180/V181→L182/T182→K183/P183→S184/K184→P185/F209→I210/M212→V213/I213→Y214/N214→--/S215→--/T216→Q215/S217→D216/D218→E217/H219→A218/L220→F219/Y221→H220/E238→D237/K252→Q251/P281→S280/Q292→K291/L313→C312/S314→T313/L315→M314/T317→S316/Q321→A320/E333→D332/K336→R335/L337→I336/A345→T344/G357→R356/N369→I368/S377→Y376/T405→R404/N429→G428/A436→S435/E484→D483/T501→P500/D536→E535/
R19K/K24Q/Q38N/T53L/D54A/A55T/E56G/D57R/V60I/A85M/I86L/Q87D/K88H/L89I/C90Y/---→R91/---→A92/---→D93/I92→Y95/Y93→F96/
I94→E97/D95→A98/S96→H99/N97→E100/R98→Y101/A99→N102/K125→Q128/K173→Q176/L175→---/V176→---/Q178→A179/D179→P180/V181→L182/T182→K183/P183→S184/K184→P185/F209→I210/M212→Y213/I213→S214/N214→P215/S215→N216/T216→V217/S217→I218/H219→L220/L220→A221/Y221→P222/E238→D239/K252→Q253/Q292→K293/Q321→A322/E333→D334/A345→T346/N369→I370/S377→Y378/T405→R406/N429→G430/A436→S437/T501→P502/D536→E537;
R19K/K24Q/Q38N/T53L/D54A/A55T/E56G/D57R/V60I/A85M/I86L/Q87D/K88H/L89I/C90Y/---→R91/---→A92/---→D93/I92→Y95/Y93→F96/I94→E97/D95→A98/S96→H99/N97→E100/R98→Y101/A99→N102/K125→Q128/K173→Q176/L175→---/V176→---/Q178→A179/D179→P180/V181→L182/T182→K183/P183→S184/K184→P185/F209→I210/M212→K213/I213→P214/N214→V215/S215→T216/T216→R217/D218→L219/H219→S220/L220→A221/Y221→L222/E238→D239/K252→Q253/Q292→K293/V320→A321/Q321→A322/E333→D334/A345→T346/N369→I370/S377→Y378/T405→R406/N429→G430/A436→S437/T501→P502/D536→E537;
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S2C/S3M/G4T/E5G/T6E/F7S/R19K/K24Q/Q38N/T53L/D54A/A55T/E56G/D57R/V60I/A85M/I86L/Q87D/K88H/L89I/C90Y/---→R91/---→A92/---→D93/I92→Y95/Y93→F96/I94→E97/D95→A98/S96→H99/N97→E100/R98→Y101/A99→N102/K125→Q128/K173→Q176/L175→---/V176→---/Q178→A179/D179→P180/V181→L182/T182→K183/P183→S184/K184→P185/F209→I210/M212→S213/N214→Y215/S215→D216/T216→K217/S217→---/D218E/H219Q/L220S/Y221K/E238D/K252Q/P281S/Q292K/L313C/S314T/L315M/T317S/Q321A/E333D/K336R/L337I/A345T/E348S/G357R/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/E484D/T501P/D536E/;
K24Q/Q38N/K58Q/V60I/K88Q/P91N/I92S/Y93F/I94H/S96C/R98D/A99M/---→G101/---→D102/K125→Q127/K173→Q175/K184→R186/F209→I211/M212→R214/N214→D216/H219→D221/Y221→V223/E238→D240/K252→Q254/Q292→K294/Q321→A323/E333→D335/A345→T347/N369→I371/S377→Y379/T405→R407/N429→G431/A436→S438/T501→P503/D536→E538;
K24Q/Q38N/K58Q/V60I/I82V/K88Q/P91N/I92S/Y93F/I94H/S96C/R98D/A99M/---→G101/---→D102/K125→Q127/K173→Q175/K184→R186/F209→I211/M212→R214/N214→D216/H219→D221/Y221→V223/E238→D240/K252→Q254/Q292→K294/Q321→A323/E333→D335/A345→T347/N369→I371/S377→Y379/L399→S401/T405→R407/N429→G431/A436→S438/T501→P503/D536→E538;
S3T/G4Q/E5V/---→S6/---→A7/---→S8/---→S9/---→L10/---→A11/---→Q12/---→I13/---→P14/---→Q15/---→P16/T6→K17/F7→N18/T10→V21/D12→N23/S16→N27/L17→I28/R19→G30/N20→D31/H21→Q32/L23→I34/K24→T35/G25→Y36/A26→T37/S27→P38/D28→E39/F29→D40/T31→---/D33→T43/H34→R44/T35→A45/A36→C46/T37→K47/Q38→E48/R40→Q50/H41→I51/V48→I58/T53→L63/D54→A64/A55→T65/E56→G66/D57→R67/V60→I70/I86→L96/K88→H98/L89→I99/P91→N101/I92→S102/Y93→F103/I94→H104/S96→C106/R98→D108/A99→M109/---→G111/---→D112/H102→Y114/I116→Y128/K117→T129/V122→I134/E124→N136/K127→T139/D129→E141/E130→R142/S135→E147/S136→A148/N139→S151/Q142→R154/S146→G158/K173→Q185/L175→---/V176→---/Q178→A188/D179→P189/V181→L191/T182→K192/P183→S193/K184→P194/F209→I219/M212→V222/I213→Y223/N214→---/S215→---/T216→Q224/S217→D225/D218→E226/H219→A227/L220→F228/Y221→H229/E238→D246/K252→Q260/P281→S289/Q292→K300/L313→C321/S314→T322/L315→M323/T317→S325/Q321→A329/E333→D341/K336→R344/L337→I345/A345→T353/G357→R365/N369→I377/S377→Y385/T405→R413/N429→G437/A436→S444/E484→D492/T501→P509/D536→E544;
S3T/G4Q/E5V/---→S6/---→A7/---→S8/---→S9/---→L10/---→A11/---→Q12/---→I13/---→P14/---→Q15/---→P16/T6→K17/F7→N18/T10→V21/D12→N23/S16→N27/L17→I28/R19→G30/N20→D31/H21→Q32/L23→I34/K24→T35/G25→Y36/A26→T37/S27→P38/D28→E39/F29→D40/T31→---/D33→T43/H34→R44/T35→A45/A36→C46/T37→K47/Q38→E48/R40→Q50/H41→I51/T53→L63/D54→A64/A55→T65/E56→G66/D57→R67/V60→I70/I86→L96/K88→H98/L89→I99/P91→N101/I92→S102/Y93→F103/I94→H104/S96→C106/R98→D108/A99→M109/---→G111/---→D112/K125→Q137/K173→Q185/L175→---/V176→---/Q178→A188/D179→P189/V181→L191/T182→K192/P183→S193/K184→P194/F209→I219/M212→V222/I213→Y223/N214→---/S215→---/T216→Q224/S217→D225/D218→E226/H219→A227/L220→F228/Y221→H229/E238→D246/K252→Q260/P281→S289/Q292→K300/L313→C321/S314→T322/L315→M323/T317→S325/Q321→A329/E333→D341/K336→R344/L337→I345/A345→T353/G357→R365/N369→I377/S377→Y385/T405→R413/N429→G437/A436→S444/E484→D492/T501→P509/D536→E544;和
S3T/G4Q/E5V/---→S6/---→A7/---→S8/---→S9/---→L10/---→A11/---→Q12/---→I13/---→P14/---→Q15/---→P16/T6→K17/F7→N18/T10→V21/D12→N23/S16→N27/L17→I28/R19→G30/N20→D31/H21→Q32/L23→I34/K24→T35/G25→Y36/A26→T37/S27→P38/D28→E39/F29→D40/T31→---/D33→T43/H34→R44/T35→A45/A36→C46/T37→K47/Q38→E48/R40→Q50/H41→I51/T53→L63/D54→A64/A55→T65/E56→G66/D57→R67/V60→I70/A85→M95/I86→L96/Q87→D97/K88→H98/L89→I99/C90→Y100/---→R101/---→A102/---→D103/I92→Y105/Y93→F106/I94→E107/D95→A108/S96→H109/N97→E110/R98→Y111/A99→N112/K125→Q138/K173→Q186/L175→---/V176→---/Q178→A189/D179→P190/V181→L192/T182→K193/P183→S194/K184→P195/F209→I220/M212→V223/I213→Y224/N214→---/S215→---/T216→Q225/S217→D226/D218→E227/H219→A228/L220→F229/Y221→H230/E238→D247/K252→Q261/P281→S290/Q292→K301/L313→C322/S314→T323/L315→M324/T317→S326/Q321→A330/E333→D342/K336→R345/L337→I346/A345→T354/G357→R366/N369→I378/S377→Y386/T405→R414/N429→G438/A436→S445/E484→D493/T501→P510/D536→E545的修饰。
78.权利要求36-77任一项的核酸分子,其包括SEQ ID NO:203、352-353、702、703、713-715、776-799、801-809、891-894、896、945、947、949、951、953、955、957、959、961、963、965、967、969、971、973、975、977、979、981、983、985、987、989、991、993、995、997和999任一所示的核酸序列;与SEQ IDNO:203、352-353、702、703、713-715、776-799、801-809、891-894、896、945、947、949、951、953、955、957、959、961、963、965、967、969、971、973、975、977、979、981、983、985、987、989、991、993、995、997和999任一具有至少95%序列相同性的核酸序列;和其简并序列。
79.权利要求36-78任一项的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶包含SEQ ID NO:203、352-353、702、703、713-715、776-799、801-809、891-894、896、945、947、949、951、953、955、957、959、961、963、965、967、969、971、973、975、977、979、981、983、985、987、989、991、993、995、997和999任一所示的核酸序列。
80.权利要求36-79任一项的核酸分子,其中所述修饰的瓦伦烯合酶包含SEQID NO:67、350、351,732-733、743-745、833-856、858-866、887-890、895、944、946、948、950、952,954、956、958、960、962、964、966、968、970、972、974、976、978、980、982、984、986、988、990、992、994、996和998任一所示的氨基酸序列;和与SEQ ID NO:67、350、351,732-733、743-745、833-856、858-866、887-、895、944、946、948、950、952,954、956、958、960、962、964、966、968、970、972、974、976、978、980、982、984、986、988、990、992、994、996和998任一所示的氨基酸序列具有至少95%序列相同性的氨基酸序列。
81.权利要求36-80任一项的核酸分子,其中所述修饰的瓦伦烯合酶包含SEQID NO:67、350、351,732-733、743-745、833-856、858-866、887-890、895、944、946、948、950、952,954、956、958、960、962、964、966、968、970、972、974、976、978、980、982、984、986、988、990、992、994、996和998任一所示的氨基酸序列。
82.权利要求1-81任一项的核酸分子,其中所述修饰的瓦伦烯合酶多肽包含氨基酸置换,其相应于选自K24A/Q38A/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/V320S/Q321A/E326K/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E;和K24A/Q38A/R50G/K58A/V60I/K88A/Y93H/N97D/R98K/K125A/K173A/K184R/F209I/M212R/N214D/H219D/Y221V/E238D/K252A/Q292K/V320G/Q321A/E333D/A345T/N369I/S377Y/T405R/N429G/A436S/T501P/D536E的氨基酸置换;和
一或多种其它氨基酸置换。
83.权利要求1-82任一项的核酸分子,其中所述未修饰的瓦伦烯合酶多肽包含SEQ ID NO:2-4、289-291、346、347、752、882和883任一所示的氨基酸序列。
84.权利要求1-83任一项的核酸分子,其中与SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶产生的除瓦伦烯外的萜烯产物百分比相比,所述修饰的瓦伦烯合酶多肽产生降低百分比的相同萜烯产物,其中所述萜烯产物由所述合酶在产生FPP的宿主细胞中单独地产生。
85.权利要求84的核酸分子,其中所述除瓦伦烯外的萜烯产物选自β-芹子烯、τ-芹子烯、艾里莫芬酮、7-表-α-芹子烯、大根香叶烯A和β-榄香烯。
86.权利要求84或85的核酸分子,其中所述除瓦伦烯外的萜烯产物是β-榄香烯,其是产生的大根香叶烯A产物的量度。
87.权利要求84-86任一项的核酸分子,其中所述除瓦伦烯外的萜烯产物占所产生的总萜烯的百分比被降低0.01%-90%、1%-80%、5%-80%、10%-60%或0.01%-20%。
88.权利要求84-87任一项的核酸分子,其中所述除瓦伦烯外的萜烯产物占所产生的总萜烯的百分比被降低0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。
89.权利要求84-88任一项的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽在相应于CVS编号281、313、314、315、317、336、337、347或357位的位置处包含氨基酸置换,所述CVS编号相对于SEQ ID NO:2所示瓦伦烯合酶多肽的编号。
90.权利要求84-89任一项的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽在相应于置换P281S、P281H、P281K、P281A、P281W、P281L、P281Y、L313C、S314T、L315M、T317S、K336R、L337I、N347L或G357R的位置处包含氨基酸置换。
91.权利要求84-90任一项的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽在相应于CVS编号281、313、314、315、317、336、337和357位的位置处包含氨基酸置换,所述CVS编号为相对于SEQ ID NO:2所示瓦伦烯合酶多肽的编号。
92.权利要求91的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽在CVS编号347位处包含氨基酸置换,所述CVS编号为相对于SEQ ID NO:2所示瓦伦烯合酶多肽的编号。
93.权利要求84-92任一项的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽包含:
位于位置P281处的置换,其是P281S、P281H、P281K、P281A、P281W、P281L或P281Y;
位于位置L313处的置换,其是L313C;
位于位置S314处的置换,其是S313T;
位于位置L315处的置换,其是L315M;
位于位置T317处的置换,其是T317S;
位于位置K336处的置换,其是K336R;
位于位置L337处的置换,其是L337I;
位于位置G357处的置换,其是G357R;
94.权利要求84-93任一项的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽包含置换P281S、L313C、S314T、L315M、T317S、K336R、L337I和G357R。
95.权利要求84-94任一项的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽包含置换P281S、L313C、S314T、L315M、T317S、K336R、L337I、N347L和G357R。
96.权利要求1-95任一项的核酸分子,其中所述核酸编码修饰的柑橘属瓦伦烯合酶,其中所述修饰的瓦伦烯合酶与来自柑橘属的瓦伦烯合酶相比包含氨基酸差异。
97.权利要求1-96任一项的核酸分子,其中所述核酸编码修饰的葡萄柚或橙瓦伦烯合酶,其中所述修饰的瓦伦烯合酶与来自葡萄柚或橙的瓦伦烯合酶相比包含氨基酸差异。
98.权利要求96或97的核酸分子,其中所述来自柑橘属的瓦伦烯合酶包含SEQ ID NO:2、289-291、752和886任一所示的氨基酸序列。
99.权利要求98的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽是融合蛋白或嵌合蛋白。
100.权利要求99的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽与SEQ IDNO:2所示的瓦伦烯合酶相比显示增加的催化活性。
101.权利要求100的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽与SEQID NO:2所示的瓦伦烯合酶相比显示改变的底物特异性。
102.权利要求101的核酸分子,其中所编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽与SEQID NO:2所示的瓦伦烯合酶相比显示改变的产物分布。
103.修饰的瓦伦烯合酶多肽,其由权利要求102的核酸分子编码。
104.载体,其包含权利要求102的核酸分子。
105.权利要求104的载体,其中所述载体是原核载体、病毒载体或真核载体。
106.权利要求104或105的载体,其中所述载体是酵母载体。
107.权利要求104-106任一项的载体,其中所述载体是酵母表达载体。
108.细胞,其包含权利要求104-107任一项的载体。
109.权利要求108的细胞,其是原核细胞或真核细胞。
110.权利要求108或109的细胞,其选自细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。
111.权利要求108的细胞,其是酵母细胞并且是酵母菌(Saccharomyces)属细胞或毕赤酵母(Pichia)属细胞。
112.权利要求110的细胞,其是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞。
113.权利要求110的细胞,其是大肠杆菌细胞。
114.权利要求108-113任一项的细胞,其产生法尼基二磷酸(FPP)。
115.权利要求108-114任一项的细胞,其被修饰以比未修饰的细胞产生更多FPP。
116.权利要求108-115任一项的细胞,其在编码鲨烯合酶的基因中含有修饰,由此与未修饰的细胞相比,所述细胞中表达的鲨烯合酶的量或所述细胞中表达的鲨烯合酶的活性降低。
117.权利要求108-116任一项的细胞,其表达修饰的瓦伦烯合酶多肽。
118.由权利要求108-117任一项的细胞产生的修饰的瓦伦烯合酶。
119.转基因植物,其包含权利要求104-107任一项的载体。
120.权利要求119的转基因植物,其是柑橘属植物。
121.权利要求119的转基因植物,其是烟草植物。
122.产生修饰的瓦伦烯合酶多肽的方法,包括:
将权利要求1-102任一项的核酸分子或权利要求104-107任一项的载体导入细胞中;
在适于所述核酸或载体编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽表达的条件下培养所述细胞;和
任选地分离所述修饰的瓦伦烯合酶多肽。
123.产生瓦伦烯的方法,包括:
在适于从无环焦磷酸萜烯前体形成瓦伦烯的条件下,使所述无环焦磷酸萜烯前体和权利要求103或118的修饰的瓦伦烯合酶多肽或由权利要求1-102任一项的核酸分子编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽接触;和
任选地,分离所述瓦伦烯。
124.权利要求123的方法,其中使所述无环焦磷酸萜烯前体和所述修饰的瓦伦烯合酶多肽接触的步骤在体外或体内实现。
125.权利要求123或124的方法,其中所述无环焦磷酸萜烯前体选自法尼基二磷酸(FPP)、香叶基二磷酸(GPP)和香叶基-香叶基二磷酸(GGPP)。
126.权利要求123-125任一项的方法,其中所述无环焦磷酸萜烯前体是FPP。
127.产生瓦伦烯的方法,包括:
培养以权利要求1-102任一项的核酸分子或权利要求104-107任一项的载体转化的细胞;其中
所述细胞产生无环焦磷酸萜烯前体;
所述核酸分子或载体编码的修饰的瓦伦烯合酶多肽被表达;和
所述修饰的瓦伦烯合酶多肽催化从所述无环焦磷酸萜烯前体形成瓦伦烯。
128.权利要求127的方法,其中所述无环焦磷酸萜烯前体选自法尼基二磷酸(FPP)、香叶基二磷酸(GPP)和香叶基-香叶基二磷酸(GGPP)。
129.权利要求127或128的方法,其中所述无环焦磷酸萜烯前体是FPP。
130.权利要求127-129任一项的方法,其中所述细胞选自细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。
131.权利要求127-130任一项的方法,其中所述细胞是酵母细胞并且是酿酒酵母细胞。
132.权利要求127-131的方法,其中所述细胞被修饰以比未修饰的细胞产生更多FPP。
133.权利要求127-132的方法,其中所述细胞在编码鲨烯合酶的基因中含有修饰,由此与未修饰的细胞相比,所述细胞中表达的鲨烯合酶的量或所述细胞中表达的鲨烯合酶的活性降低。
134.权利要求127-133任一项的方法,其中所产生的瓦伦烯的量大于用编码SEQ ID NO:2所示的瓦伦烯合酶的核酸转化的相同的宿主细胞类型在相同条件下产生的瓦伦烯的量。
135.权利要求127-134任一项的核酸分子,其中所产生的瓦伦烯的量比由SEQID NO:2所示的瓦伦烯合酶在相同条件下产生的瓦伦烯的量多至少或约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、250%、300%、350%、400%、500%或更多;或比由SEQID NO:2所示的瓦伦烯合酶产生的瓦伦烯的量多10%-500%、10%-250%、50%-250%、100%-500%或100%-250%。
136.权利要求127-135任一项的方法,其中所产生的瓦伦烯在细胞培养上清液中的量是至少或约0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L1.0g/L、1.1g/L、1.2g/L、1.3g/L、1.4g/L、1.5g/L、2.0g/L、2.5g/L、3.0g/L、3.5g/L、4.0g/L、4.5g/L或5.0g/L;或在酵母培养基中是0.1g/L-5.0g/L、0.1g/L-3.0g/L、0.5g/L-5.0g/L、1.0g/L-5.0g/L或1.0-3.0g/L。
137.权利要求127-136任一项的方法,还包括分离所述瓦伦烯。
138.权利要求127-137任一项的方法,还包括氧化所述瓦伦烯以产生诺卡酮。
139.权利要求138的方法,其中氧化通过生物合成或化学进行。
140.权利要求138或139的方法,还包括分离所述诺卡酮。
141.产生包含异源结构域的修饰的瓦伦烯合酶多肽的方法,包括:
将第一萜烯合酶的结构域的全部或连续的部分用第二萜烯合酶相应结构域的全部或连续的部分置换,其中:
所述第一萜烯合酶和第二萜烯合酶的结构域或结构域连续部分的氨基酸序列至少有一个氨基酸残基不同;和
所述结构域选自无结构环1;α螺旋1;无结构环2;α螺旋2;无结构环3;α螺旋3;无结构环4;α螺旋4;无结构环5;α螺旋5;无结构环6;α螺旋6;无结构环7;α螺旋7;无结构环8;α螺旋8;无结构环9;α螺旋A;A-C环;α螺旋C;无结构环11;α螺旋D;无结构环12;α螺旋D1;无结构环13;α螺旋D2;无结构环14;α螺旋E;无结构环15;α螺旋F;无结构环16;α螺旋G1;无结构环17;α螺旋G2;无结构环18;α螺旋H1;无结构环19;α螺旋H2;无结构环20;α螺旋H3;无结构环21;α螺旋a-1;无结构环22;α螺旋I;无结构环23;α螺旋J;J-K环;α螺旋K;和/或无结构环25;
所述连续部分含有至少三个氨基酸残基;由此
与所述第一萜烯合酶相比,所述修饰的萜烯合酶的特性被改变。
142.权利要求141的方法,其中与所述第一萜烯合酶相比,所述修饰的萜烯合酶的特性被改进。
143.权利要求141或142的方法,来自所述第一萜烯合酶的结构域的至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20个或更多个氨基酸残基被来自所述第二萜烯合酶相应结构域的3、4、5、6、7、8、9、10、15、20个或更多个残基置换。
144.权利要求141-143任一项的方法,其中来自所述第一萜烯合酶的结构域的全部氨基酸残基被来自所述第二萜烯合酶相应结构域的全部残基置换。
145.权利要求141-144任一项的方法,其中无结构环1含有相应于SEQ IDNO:2氨基酸1-29的氨基酸残基;α螺旋1含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸30-39和44-52的氨基酸残基;无结构环2含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸53-58的氨基酸残基;α螺旋2含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸59-71的氨基酸残基;无结构环3含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸72-78的氨基酸残基;α螺旋3含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸79-93的氨基酸残基;无结构环4含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸94-100的氨基酸残基;α螺旋4含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸101-114的氨基酸残基;无结构环5含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸115-141的氨基酸残基;α螺旋5含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸142-152的氨基酸残基;无结构环6含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸153-162的氨基酸残基;α螺旋6含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸163-173的氨基酸残基;无结构环7含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸174-184的氨基酸残基;α螺旋7含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸185-194的氨基酸残基;无结构环8含有相应于SEQID NO:2氨基酸195-201的氨基酸残基;α螺旋8含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸202-212的氨基酸残基;无结构环9含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸213-222的氨基酸残基;α螺旋A含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸223-253的氨基酸残基;A-C环含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸254-266的氨基酸残基;α螺旋C含有相应于SEQ IDNO:2氨基酸267-276的氨基酸残基;无结构环11含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸277-283的氨基酸残基;α螺旋D含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸284-305的氨基酸残基;无结构环12含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸306-309的氨基酸残基;α螺旋D1含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸310-322的氨基酸残基;无结构环13含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸323-328的氨基酸残基;α螺旋D2含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸329的氨基酸残基;无结构环14含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸330-332的氨基酸残基;α螺旋E含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸333-351的氨基酸残基;无结构环15含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸352-362的氨基酸残基;α螺旋F含有相应于SEQ IDNO:2氨基酸363-385的氨基酸残基;无结构环16含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸386-390的氨基酸残基;α螺旋G1含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸391-395的氨基酸残基;无结构环17含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸396-404的氨基酸残基;α螺旋G2含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸405-413的氨基酸残基;无结构环18含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸414-421的氨基酸残基;α螺旋H1含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸422-428的氨基酸残基;无结构环19含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸429-431的氨基酸残基;α螺旋H2含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸432-447的氨基酸残基;无结构环20含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸448-450的氨基酸残基;α螺旋H3含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸451-455的氨基酸残基;无结构环21含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸456-461的氨基酸残基;α螺旋a-1含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸462-470的氨基酸残基;无结构环22含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸471-473的氨基酸残基;α螺旋I含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸474-495的氨基酸残基;无结构环23含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸496-508的氨基酸残基;α螺旋J含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸509-521的氨基酸残基;J-K环含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸522-534的氨基酸残基;α螺旋K含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸535-541的氨基酸残基;和无结构环25含有相应于SEQ ID NO:2氨基酸542-548的氨基酸残基。
146.权利要求141-145任一项的方法,其中第一萜烯合酶的两个或更多个结构域的全部或连续的部分被第二萜烯合酶相应结构域的全部或连续的部分置换。
147.权利要求141-146任一项的方法,其还包括置换所述第一萜烯合酶的结构域邻近的一或多个额外的残基。
148.权利要求141-147任一项的方法,其还包括置换所述第一萜烯合酶的结构域邻近的至少或约1、2、3、4、5个或更多个额外的残基。
149.权利要求141-148任一项的方法,其中所述第一萜烯合酶中相应于SEQID NO:2的氨基酸53-58的氨基酸被来自第二萜烯合酶的相应区域置换。
150.权利要求141-149任一项的方法,其中所述第一萜烯合酶中相应于SEQID NO:2的氨基酸85-99的氨基酸被来自第二萜烯合酶的相应区域置换。
151.权利要求141-150任一项的方法,其中所述第一萜烯合酶中相应于SEQID NO:2的氨基酸115-146的氨基酸被来自第二萜烯合酶的相应区域置换。
152.权利要求141-151任一项的方法,其中所述第一萜烯合酶中相应于SEQID NO:2的氨基酸152-163的氨基酸被来自第二萜烯合酶的相应区域置换。
153.权利要求141-152任一项的方法,其中所述第一萜烯合酶中相应于SEQID NO:2的氨基酸174-184的氨基酸被来自第二萜烯合酶的相应区域置换。
154.权利要求141-153任一项的方法,其中所述第一萜烯合酶中相应于SEQID NO:2的氨基酸213-222的氨基酸被来自第二萜烯合酶的相应区域置换。
155.权利要求141-154任一项的方法,其中所述第一萜烯合酶中相应于SEQID NO:2的氨基酸310-322的氨基酸被来自第二萜烯合酶的相应区域置换。
156.权利要求141-155任一项的方法,其中所述第一萜烯合酶中相应于SEQID NO:2的氨基酸522-534的氨基酸被来自第二萜烯合酶的相应区域置换。
157.权利要求141-156任一项的方法,其中所述第一萜烯合酶中相应于SEQID NO:2的氨基酸53-58的氨基酸被SEQ ID NO:295或941所示的TEAS多肽的氨基酸58-63置换;
158.权利要求141-157任一项的方法,其中所述第一萜烯合酶中相应于SEQID NO:2的氨基酸85-89的氨基酸被SEQ ID NO:942所示的HPS多肽的氨基酸93-97置换;
159.权利要求141-158任一项的方法,其中所述第一萜烯合酶中相应于SEQID NO:2的氨基酸85-99的氨基酸被SEQ ID NO:346所示的葡萄(Vitis vinifera)瓦伦烯合酶的氨基酸96-112置换。
160.权利要求141-159任一项的方法,其中所述第一萜烯合酶中相应于SEQID NO:2的氨基酸115-146的氨基酸被SEQ ID NO:346所示的葡萄瓦伦烯合酶的氨基酸128-159置换。
161.权利要求141-160任一项的方法,其中所述第一萜烯合酶中相应于SEQID NO:2的氨基酸152-163的氨基酸被SEQ ID NO:942所示的HPS多肽的氨基酸163-174置换;
162.权利要求141-161任一项的方法,其中所述第一萜烯合酶中相应于SEQID NO:2的氨基酸174-184的氨基酸被SEQ ID NO:942所示的HPS多肽的氨基酸185-193置换;
163.权利要求141-162任一项的方法,其中所述第一萜烯合酶中相应于SEQID NO:2的氨基酸212-221的氨基酸被SEQ ID NO:942所示的HPS多肽的氨基酸221-228置换;
164.权利要求141-163任一项的方法,其中所述第一萜烯合酶中相应于SEQID NO:2的氨基酸310-322的氨基酸被SEQ ID NO:942所示的HPS多肽的氨基酸317-329置换;
165.权利要求141-164任一项的方法,其中所述第一萜烯合酶中相应于SEQID NO:2的氨基酸522-534的氨基酸被SEQ ID NO:942所示的HPS多肽的氨基酸527-541置换;
166.权利要求141-165任一项的方法,其中所述第一萜烯合酶中相应于SEQID NO:2的瓦伦烯合酶多肽的氨基酸212-221的氨基酸被SEQ ID NO:295所示的TEAS多肽的氨基酸213-221置换;
167.权利要求141-166任一项的方法,其中所述第一萜烯合酶中相应于SEQID NO:2的瓦伦烯合酶多肽的氨基酸212-221或212-222的氨基酸被SEQ ID NO:346所示的葡萄瓦伦烯合酶的氨基酸223-230置换。
168.权利要求141-167任一项的方法,其中所述第一萜烯合酶中相应于SEQID NO:2的瓦伦烯合酶多肽的氨基酸3-41的氨基酸被SEQ ID NO:346所示的葡萄瓦伦烯合酶的氨基酸3-51置换。
169.权利要求141-168任一项的方法,其中所述第二萜烯是倍半萜。
170.权利要求141-169任一项的方法,其中所述第一萜烯是倍半萜。
171.权利要求169和170的方法,其中所述倍半萜选自瓦伦烯合酶、檀香烯合酶、TEAS和HPS。
172.权利要求171的方法,其中所述檀香烯合酶具有选自SEQ ID NO:481-485的氨基酸序列。
173.权利要求141-172任一项的方法,其中萜烯合酶的多个结构域被来自两种或更多种其它萜烯合酶的相应结构域置换。
174.权利要求141-173任一项的方法,其中所述修饰的萜烯合酶与第一萜烯合酶相比改变的或改进的特性选自总萜烯产量、比萜烯产量、催化活性、产物分布和底物特异性。
175.由权利要求141-174任一项的方法产生的修饰的萜烯合酶。
176.改进瓦伦烯生产的方法,包括:
将权利要求84-95任一项的核酸分子导入产生无环焦磷酸萜烯前体的宿主细胞中,其中所编码的瓦伦烯合酶多肽催化瓦伦烯作为主要产物从所述无环焦磷酸前体的形成;
在足以使所编码的瓦伦烯合酶多肽表达的条件下培养所述细胞以催化所述前体产生瓦伦烯;和
从细胞培养基回收瓦伦烯。
177.权利要求177的方法,其中通过用有机溶剂萃取来实现瓦伦烯的回收。
178.权利要求176或177的方法,其中所回收的瓦伦烯以溶液重量计大于68%。
179.权利要求177-178任一项的方法,其中所回收的瓦伦烯以溶液重量计约大于或大于70%、71%、72%、73%、75%、75%、76%、77%、78%、78%、79%、80%。
180.权利要求177-179任一项的方法,其中所述无环焦磷酸萜烯前体选自法尼基二磷酸(FPP)、香叶基二磷酸(GPP)和香叶基-香叶基二磷酸(GGPP)。
181.权利要求177-180任一项的方法,其中所述无环焦磷酸萜烯前体是FPP。
182.权利要求177-181任一项的方法,其中所述细胞选自细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。
183.权利要求177-182任一项的方法,其中所述细胞是酵母细胞并且是酿酒酵母细胞。
184.权利要求177-183任一项的方法,还包括氧化所述瓦伦烯以产生诺卡酮。
185.权利要求184的方法,其中氧化通过生物合成或化学进行。
186.权利要求184或185的方法,还包括分离所述诺卡酮。
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