CN103282483B - 利用生产麻风树油甲酯(jme)的副产品生产用于脂质提取的含油小球藻的综合方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种由麻风树脱油渣饼水解产物(JOCH)和粗甘油副产物流(GL7和GL8)(WO2011/027353)与用自来水(1∶2)稀释的海水一起制备海洋微藻类小球藻脂肪酸甲酯(CME)的更简单且更节能的方法。在JME的情况下，为了甘油洗涤，对小部分粗甘油层进行处理以回收甘油，将另外的成问题的釜脚用于微生物合成PHA，而剩余部分用于将JME副产品微藻转化成CME。将甲醇贫化的甘油层的剩余部分，与麻风树脱油渣饼(JOCH)一起，用于由海洋微藻类分离物(小球藻)进行的单阶段微藻脂质生产，而无需任何其它营养物。来自微藻工艺的废物流可以直接排放到农田中作为生物肥料，或再循环回到规模化培养中。

Description

利用生产麻风树油甲酯(JME)的副产品生产用于脂质提取的含油小球藻的综合方法
技术领域
本发明涉及利用由整粒麻风树种子生产麻风树油甲酯(JME)的副产品生产用于脂质提取的含油小球藻的综合方法。
本发明进一步涉及以经济的方式由麻风树油甲酯(JME)副产品制备小球藻甲酯(CME)的综合方法。
本发明进一步涉及在富含营养物(C/N/P)的JME废产物上混合营养型生长微藻类(光合自养生物)的替代方法。
背景技术
可以参考期刊“Journal of Applied Phycology，2009，21：第493-507页”，其中描述了在该文献中可获得的包括17种绿藻类、11种硅藻类和5种蓝细菌以及其它类别的55种微藻类物种的微藻生长率、脂质含量和脂质生产率的信息。
可以参考2009年Tom Bruton起草的关于Sustainable EnergyIreland的报告(www.sei.ie/algaereport)。存在至少30,000种已知的微藻物种，其是非常异质的群体，并且未得到全面研究。在大量已知的海洋和淡水物种中，目前只有少数具有商业意义。这些包括小球藻、螺旋藻和红球藻。这些之中，只有杜氏藻主要是海洋物种。因此，需要研究和开发来自海洋生态***的微藻。
可以参考Ito等的期刊“J.Bioscience&Bioengineering，2005，100，第260-265页”，其中描述了从生物柴油制备工艺后排放的含甘油废物生化制备氢和乙醇。据报道其生物化学活性远低于采用纯甘油的情况，原因在于废物中高盐含量的存在。
可以参考名称为“Production of biofuels using algae”的专利WO/2008/083352，其描述了通过促进连续光合自养和异养生长，从藻类生产生物燃料的两阶段工艺，所述工艺包括培养产油藻类。他们在第一阶段共培养固氮蓝细菌以提供营养物氮，然后添加由水解淀粉和纤维素获得的糖类。没有具体提及本申请的主题。
可以参考A.H.Scragg等的期刊“Enzyme and MicrobialTechnology 2003，33，第884-889页”，其中描述了细胞大小为3-10μm范围内的微藻如小球藻，其在柴油发动机中燃烧是很理想的；还描述了由生物柴油(酯交换的菜籽油)乳液、表面活性剂和小球藻细胞(生物质浆料)组成的液体燃料，其用作用于电力供应的未修改固定式柴油机。
可以参考Chen的综述论文(Trends Biotechnology 1996，14，421-426)，其描述了藻类的油脂生产以及在其中有机碳(如糖类和有机酸)用作碳源的异养条件下培养微藻的可能性。
可以参考Xiaoling Miao等的论文(Bioresource Technology2006，97，第841-846页)，其描述了异养培养的原始小球藻(采用10g/l的葡萄糖和0.1g/l的甘氨酸)积聚了多达其干重的55％的油脂，相比之下，在光合自养生长的细胞中只有14％。该专利分别采用昂贵且可食用的糖类如葡萄糖和氨基酸如甘氨酸。
可以参考Hazelbeck等的名称为“Photosynthetic oil productionin a two-stage reactor”的专利US0086937A1，其描述了在溶解有CO2和涉及大量能量输入的持续搅拌下，用于在藻类混合营养物中培养和生产油脂的两段式反应器，所述营养物含有磷、硫、氮、碳酸盐、许多微量元素。
可以参考Han Xu等的论文(Journal of Biotechnology 2006；126，第499-507页)，其描述了在5L生物发酵器中在3L培养基中使用粗脂质含量为55.2％的玉米粉水解产物进行原始小球藻的异养生长。在5L的搅拌罐式生物发酵器中建立CPH给料(CPH feeding)下原始小球藻的高密度异养培养。在所述生物发酵器中培养的藻类细胞中的脂质含量为46.1％，其比在锥形烧瓶中培养的藻类细胞的脂质含量(55.3％)略低。在用CPH基质培养144小时之后，细胞生长达到最大值(3.92g/L)，而在连续振摇(180rpm)和空气流下，位于暗处的28±1℃的含300mL培养基的锥形烧瓶中，使用葡萄糖基质的最大值为3.74g/L。这表明，使用CPH作为有机碳培养小球藻是可行的。
可以参考Fu-Ying Feng等的论文“Process Biochemistry 2005；40；1315-1318”，其中描述了培养基中的葡萄糖、硫代硫酸钠以及这两种化合物的组合对小球藻的生长动力学和脂肪酸生产的影响。对于培养基中的两种组分，使用了两种不同浓度(2.5mmol和5.0mmol)。他们提示适当浓度的葡萄糖与硫代硫酸钠的组合可以提高小球藻细胞的脂质积聚。
可以参考Liang，Yanna等的论文“Biotechnology Letters 2009；7；1043-1049”，其描述了细胞脂质含量(38％)的自养生长，与使用醋酸酯、葡萄糖或甘油的异养生长的那些相比，所述脂质生产率低得多。使用1％(w/v)的葡萄糖实现了最佳的细胞生长(2g/l)和脂质生产率(54mg/l/天)，然而更高浓度的葡萄糖和甘油是抑制性的。
可以参考Chih-Hung Hsieh等的论文“Bioresource Technology2009，100(17)，pp3921-3926”，其描述了在多种培养模式下培养小球藻以评价生物质和脂质生产率。在分批模式中，在含有0.025-0.200g/L尿素的培养基中培养的小球藻的生物质浓度和脂质含量分别是0.464-2.027g/L和0.661-0.326g/g。在含有0.100g/L尿素的培养基中，出现了0.124g/d/L的最大脂质生产率。在分批补料培养中，在静止期期间，通过给料0.025g/L的尿素获得了最高的脂质含量，但脂质生产率没有显著提高。然而，每当培养达到初期静止期时，通过收集培养物和每次补充0.025g/L的尿素进行半连续方法。与分批和分批补料培养的那些相比，半连续培养中0.139g/d/L的最大脂质生产率是最高的。可以参考Mandal等的论文(Applied Microbiology Biotechnology 2009，84：281-291)，其描述了在氮和磷缺乏的条件下，微藻如斜生栅藻在细胞内积聚脂质。在氮缺乏情况下，所述脂质含量显著增加到高达细胞干重的43％。
可以参考Demirbas的论文“Energy Sources，Part A，31：163-168，2009”，其描述了原始小球藻和脆弱刚毛藻的对比脂质分析，所述原始小球藻和脆弱刚毛藻分别含有29.4％细胞干重和14.2％细胞干重的脂质。
可以参考Cheng等的论文“Journal of chemicaltechnology&Biotechnology 2009；84，5；第777-781页”，其描述了在4天规模的培养中，利用洋姜块茎(菊芋)的水解产物作为碳源的原始小球藻在体内积聚脂质，脂质含量高达44％cdw，碳源转化成脂质的比率约为25％。提取脂质，然后通过酯交换转变成生物柴油。所生产的生物柴油的主要成分是十六烷酸甲酯、亚油酸甲酯和油酸甲酯。不饱和脂肪酸甲酯占所述生物柴油总含量的82％以上。
可以参考Bertoldi等的论文“Grasas Y Aceites 2006；57(3)第270-274页”，其中，在工业和农业废水中培养的小球藻的脂质、脂肪酸组合物和类胡萝卜素，所述结果表明脂质含量不存在显著差异。使用溶液培养的废水作为替代的培养基用于培养小球藻对于生产脂质、脂肪酸和类胡萝卜素来说产生良好的前景。
可以参考Xiufeng Li等的论文“Biotechnology andBioengineering 2007，98(4)第764-771页”，其描述了生物反应器中按比例扩大发酵的异养原始小球藻，通过基质给料和发酵工艺控制，在5L、750L和11,000L的生物反应器中，原始小球藻的细胞密度分别达到15.5g/L、12.8g/L和14.2g/L。由于异养代谢，来自5L、750L和11,000L生物反应器的样品的脂质含量分别达到细胞干重的46.1％、48.7％和44.3％。
可以参考Wei等的论文“Journal of Industrial MicrobiologyBiotechnology DOI 10.1007/s 10295-009-0624-x”，其描述了使用木薯淀粉水解产物即CSH作为有机碳源的原始小球藻的异养生长，所述木薯淀粉水解产物通过释放出淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的两步酶工艺制得，得到的最高生物质和最大总脂质产量是15.8g/L和4.19g/L，与使用葡萄糖作为有机碳源相比，其分别增加了42.3％和27.7％。
从现有技术明显可见还未公开从生物柴油副产物流生产微藻生物质的经济的方法，即使采用昂贵的共营养物和繁琐的两步工艺。本发明试图克服所有基本限制并研究出一种新颖、简化和经济的由从麻疯树整粒种荚(seed capsule)开始的甲酯过程的甘油副产物流产生的微藻生物质制备脂质的方法。除包括最初提高生物质生产率，然后提高脂质含量即脂质生产率的分批补料方法之外，所述方法中几个相关改进，例如有问题的废物，特别是甘油蒸馏过程的油和釜脚的机械排除过程中产生的油泥的最佳利用，也构成本发明的一部分。
发明目的
本发明的主要目的是提供利用由整粒种子生产麻风树油甲酯(JME)的副产品生产用于脂质提取的含油小球藻的综合方法。
本发明的另一目的是提供由从麻风树整个干果获得的麻风树油甲酯(JME)副产品经济地制备用于混合营养型生长小球藻的培养基的综合方法。
本发明的另一目的是提供在用于制备脂肪酸甲酯的麻风树油甲酯副产品中通过微藻(小球藻)的混合营养型生长提高脂质生产率的综合方法。
本发明的另一目的是以最小能量输入和几乎零流出物排放生产微藻生物柴油。
本发明的还另一目的是利用去除甲醇后的粗甘油作为用于以经济的方式微藻生长和生产油脂/脂质的生长与生产培养基中的碳源和营养物源。
本发明的另一目的是在户外规模化培养期间，特别是在印度的夏季(40℃-50℃)，通过添加紫外线专用染料(紫外线吸收剂)保护小球藻不受紫外线损伤，保持所述培养物的活力。
本发明的另一目的是利用由麻风树种子榨油之后得到的渣饼作为生长培养基中氨基酸及其他营养物的来源，从而无需使用复合培养基如Zarrouk培养基、M4N培养基、ASNIII培养基和其他含糖生长培养基。
本发明的另一目的是表明据显示存在于所述油渣饼中的有毒杂质如佛波酯和泻果素不妨碍本发明方法中油脂的生产。
本发明的另一目的是阐明具有期望品质的脂肪酸的脂质的生产。
本发明的另一目的是表明通过将培养物直接接种到含有碱性粗甘油层和得自脱油的麻疯油渣饼的水解产物的培养基中，而不使用任何其他的营养物/微量营养物且没有任何其他干预(例如喷射、pH调节、温度控制、搅拌、曝气等)，来自印度海岸的海洋小球藻分离物产生相对于细胞干重20-35％的产率。
本发明的另一目的是以最简单和最廉价的方式并且在可能的最短时间内实现此类脂质的生产。
发明简述
因此，本发明提供一种利用由整个麻风树干果生产麻风树油甲酯(JME)的副产品生产用于脂质提取的含油小球藻的综合方法；并且所述方法包括以下步骤：
i.通过已知方法提供含有4-6％(w/w)氮的麻风树种子的脱油渣饼；
ii.用热的酸性水溶液水解步骤(i)提供的所述脱油渣饼，然后用碱性物质调节pH至5.5-8.5的范围内，以得到富氮麻风树油渣饼水解产物(JOCH)；
iii.通过已知方法提供1-5％(w/v)的含有粗甘油的甲醇贫化的甘油层(GL7和GL8)，作为海洋小球藻的生长与生产培养基；
iv.将1-10％(v/v)的所述海洋小球藻种子培养物接种到步骤(iii)提供的生长与生产培养基和1-10％(v/v)的步骤(ii)制备的麻风树油渣饼水解产物中，并在温度为25-40℃、pH为7.0-8.0下培养7至15天的时间，以得到含脂质的生物质；
v.任选地，将1-10％(v/v)的所述海洋小球藻种子培养物在种子培养物接种的第1天用自来水接种，在初始的4至10天只用海水或在自来水中1∶2稀释的海水培养，随后在第4至10天之后添加GL7，以得到含脂质的生物质；
vi.任选地，将1-10％(v/v)的所述海洋小球藻种子培养物在种子培养物接种的第1天用自来水接种，在初始的4至10天只用海水或在自来水中1∶2稀释的海水培养，随后在第4至10天之后添加GL8，以得到含脂质的生物质；
vii.在太阳下干燥步骤(iv-vi)得到的所述生物质，或直接将湿的生物质用于脂质提取；
viii.通过已知方法从步骤(vii)得到的生物质中提取脂质。
在本发明的实施方式中，使用的酸选自H3PO4/H2SO4。
在本发明的再另一实施方式中，碱性物质选自粗甘油层、氢氧化钾和氢氧化镁。
在本发明的再另一实施方式中，在户外规模化期间，特别是在印度的夏季(40℃至50℃)，添加2，5-双(5-叔丁基-1，3-苯并噁唑-2-基)噻酚紫外线专用染料，以免受紫外线损伤，保持所述培养物的活力。
在本发明的再另一实施方式中，甲醇贫化的甘油层通过已知方法从所述甘油层中去除所述乙醇而得到。
在本发明的再另一实施方式中，相对于细胞干重，所述脂质的产率在20至35％的范围内。
附图说明
图1代表pH对所述小球藻的沉淀以及小球藻的按比例放大工艺的影响。图1中还显示了本发明的综合流程图。
图2显示小球藻脂肪酸甲酯的GCMS。
发明详述
光合作用的生化过程使藻类能够通过叶绿素作为天线吸收构建其食物所需要的辐射将太阳能转化为化学能。在细胞生长期间，该化学能用于驱动合成反应，如糖类的形成或将氮固定入氨基酸用于蛋白质合成。过量的化学能以脂肪和油脂如甘油三酸酯的形式储存。因此，可见细胞生长和甘油三酸酯生产竞争同样的化学能。结果，生长和油脂生产的同步速度是负相关的。
本发明提供由从整个麻风树干果获得的麻风树油甲酯(生物柴油)副产品经济地制备用于混合营养型生长小球藻的营养培养基的综合方法，所述方法包括以下步骤：
a.将晒干的果实机械去壳，并分别收集壳和种子；
b.通过已知工艺从所述种子中机械压榨出油脂；根据现有技术[(Ghosh等美国专利授权前公开第2006/0080891A1号)(1838/DEL/2009，申请日2009年9月7日)]得到脱油渣饼；
c.将少量的以上(b)中生成的废油脂用作压块所述种子壳的粘合剂；
d.用酸处理以上(b)中得到的部分脱油渣饼，以水解所述渣饼并得到富氮水解产物；
e.将较大部分所述甲醇贫化的甘油层用作海洋小球藻的脂质生产培养基，通过海洋细菌MTCC 5345，将剩余的残余物用于生产可生物降解的聚合物，即聚羟基链烷酸酯(PHA)(如在2009年9月7日提交的专利1838/DEL/2009中那样)；
f.将1-10％(v/v)的所述海洋小球藻种子培养物接种到含有1-5％(w/v)的步骤(1)的粗甘油和1-10％(v/v)的步骤(d)制备的麻风树油渣饼水解产物的生长与生产培养基中，并在温度为25-40℃、pH为7.0-8.0下，培养一段时间(7-15天)；
g.将1-10％(v/v)的如上的麻风树油渣饼水解产物中的所述海洋小球藻在种子培养物接种的第1天用自来水接种，在初始(4-10天)的培养中只用海水和在自来水中1∶2稀释的海水，随后在第4-10天之后添加GL7用于脂质生产。
h.将1-10％(v/v)的如上的麻风树油渣饼水解产物中的所述海洋小球藻在种子培养物接种的第1天用自来水接种，在初始(4-10天)的培养中只用海水和在自来水中1∶2稀释的海水，随后在第4-10天之后添加GL8用于脂质生产。
i.在太阳下干燥所述生物质，或直接将所述湿的生物质用于脂质提取和制备生物柴油。
通过用热的酸性水溶液H3PO4/H2SO4处理含有4-6％(w/w)氮的麻风树油渣饼来提取步骤(d)得到的所述水解产物，之后用碱性物质如粗甘油层、氢氧化钾和氢氧化镁调节pH至5.5-8.5，以得到具有缓冲作用并有助于所述水解产物的营养价值的盐，而不是作为妨碍现有技术的生物转化过程的有问题的电解质。
在如Ghosh等的名称为“An improved process for thepreparation of fatty acid methyl ester(Biodiesel)from triglycerides oilthrough transesterification”的美国专利(授权前公开号为2006/0080891A1，申请日为2006年4月20日)所描述的方法中，从所述甘油层中去除甲醇；成功的循环之后留下的主要由在进一步可蒸馏的溶剂/产物方面没有价值的固体和游离液体组成的残余物被认为是良好的营养物源。
用海洋小球藻分离物进行步骤(d-i)的微藻转化过程的生产，且相对于细胞干重，脂质产率在(20至35％)的范围内。
上述步骤可同样应用于各种微藻属。
使微藻在Zarrouk培养基中生长，然后接种到含有1-5％的甘油釜脚和其他必需营养物的生产培养基中，使所述内容物在静止环境条件下培养7-15天。
使微藻在海水、自来水、比率为1∶2的海水和自来水、1-5％(w/v)的GL8和其他必需营养物中生长，使所述内容物在静止和搅拌条件(100-300rpm)下培养7-15天。
使微藻在只有海水、只有自来水以及1∶2的海水和自来水的组合、1-5％(w/v)的甘油釜脚(分别是GL7和GL8)和其他必需营养物中生长，使所述内容物在静止环境条件下培养7-15天。
使微藻在海水、自来水和1∶2的海水与自来水、1-10％(w/v)的含其它微量营养物的JOCH中在静态条件下生长7-15天。
使微藻在海水、自来水和1∶2的海水与自来水、1-5％(w/v)的含其它微量营养物的GL7中在静态条件下生长7-15天。
使微藻在海水、自来水和1∶2的海水与自来水、1-5％(w/v)的含其它微量营养物的GL8中在静态条件下生长7-15天。
使微藻在海水、自来水以及含有海水中的1-10％的麻风树脱油渣饼水解产物(JOCH)和1-5％(w/v)的甘油釜脚的混合物的1∶2的海水与自来水、含有其它必需营养物的自来水和含有其它必需营养物的比率为1∶2的海水与自来水的混合物中生长，使所述内容物在静止环境条件下培养7-15天。
使微藻在初始具有1-10％(v/v)的麻风树油渣饼水解产物(JOCH)的海水、自来水、以及1∶2的海水与自来水，随后在第4和第10天后添加GL7在静态条件下生长15天。
根据已知方法(参考Bligh，E.G.和Dyer，W.J.1959.A rapidmethod for total lipid extraction and purification.Can.J.Biochem.Physiol.37：911-917)提取所述脂质。所述脂肪酸曲线显示了所述脂质在制备生物柴油中的适用性。
本发明的目标是开发一种利用麻风树油甲酯副产品生产微藻生物质的综合方法。关于所述脱油麻风树渣饼和粗甘油层，出现了在其有效使用中可能的最高水平简化是什么的问题。如本发明所公开的，如果甘油层中的过量甲醇可通过简单的方式移除，那么剩余的量可直接用于通过简单和经济的方式制备微藻中的脂质。一旦像现有技术(Ghosh等，美国授权前公开号2006/0080891A1)(1838/DEL/2009申请日2009年9月7日)那样去除甲醇，甘油层被证明是对通过在本发明过程中分离的海洋小球藻培养物高效和经济地制备脂质而言极好的营养物来源。由通过用热磷酸/硫酸反应萃取获得的麻疯树榨油渣饼产生的水解产物被证明是粗甘油的理想补充伴体，这两种物质协力提供在环境条件下通过海洋小球藻培养物制备脂质所需的营养物。这两种物质一起也有助于彼此中和(酸-碱)达到一定程度从而降低中和成本。还有若干另外的发明，例如将常规的两阶段过程合并成单步骤、通过由水解物和甘油层获得除碳和氮外的必要磷酸盐缓冲剂和必要元素而免除所有营养物/微量营养物。在分散化操作中，在这样的工厂将建在农田附近的情况下，除在微藻规模化培养(户外)中再循环之外，在回收可收获的生物质之后的上清液可被直接排入田间以给土壤施肥或甚至可用作叶面喷施物。
进一步证明甘油回收后保留的釜脚对通过海洋微藻培养物制备脂质而言是同样有效的营养物和促进剂，其制备效率高于纯甘油近两倍。因此，发现成问题的废物是理想的营养物源。
所有这些发明合起来形成由太阳晒干的麻疯树整粒种荚制备甲酯并有益地利用副产物流的改进的综合方法。
用于本发明的菌株分离自印度西海岸(位于北纬20°41.341’和东经70°53.734’之间)。
按照布达佩斯条约的规定，已经在美国ATCC进行了用于本发明的生物材料即小球藻的保藏。
然而，直到目前，本申请人未能取得关于所述保藏的保藏号。一旦从美国ATCC获得所述菌株的保藏号，我们将提供所述保藏号。
用于本发明所述目的的小球藻种与已报导过的小球藻菌株具有98％的相似性。可见用于本发明的小球藻菌株可以与可在ATCC以编号50258获得的小球藻菌株(NC64A)互换使用。
本发明的创造性特征
(1)分离强壮的海洋微藻类，其能以比所述微藻的光合自养生长下更有利的混合营养方式由釜脚生产脂质，从而将成问题的废物转化成脂质，所述脂质是制备脂肪酸甲酯(生物柴油)有用的原料。
(2)通过筛选微藻的过程鉴定高效分离物，其有效地直接利用较大体积的粗甘油层与麻疯树种除油渣饼的水解产物一起作为导致相对于细胞干重(20-40％)的脂质生产的过程中仅有的营养物。此外，将脂质生产的常规过程中分别进行的生长和生产步骤合并成单个操作，并因此简化了工艺。在证明该过程对在28-38℃内的温度变化的耐受性之后，其也无需进行温度控制。
(3)认识到在制备用于微藻工艺的除油渣饼水解产物的过程中，有利的是使用磷酸并之后用碱性甘油层本身(可能需要额外的KOH/Mg(OH)2)来中和酸萃取物，以便所得盐有助于而非阻碍脂质的生产率。
(4)所述微藻可以在初始具有1-10％(v/v)的麻风树油渣饼水解产物(JOCH)的海水、自来水以及1∶2的海水与自来水，随后在第4-10天后添加GL7在静态条件下生长15天。
(5)利用少量剩余的微藻生物质，像现有技术(Ghosh等，美国授权前公开号为2006/0080891A1)(1838/DEL/2009，申请日2009年9月7日)那样，以由空壳制备更致密和强度更高的饼块，所述生物质在机械除油过程中不可避免地产生并引起在水产饲料/家禽饲料/家畜饲料中的处理问题。
通过微藻由麻风树生物柴油废渣制备的脂质
下表是显示GL7和GL8的元素分析的电感耦合等离子体(ICP)结果
分析物(mg/L) GL7 GL8
钙 3.263 8.189
镉 0.002 0.002
钴 0.000 0.002
铬 0.005 0.023
铜 0.075 0.046
铁 0.360 0.554
钾 48.90 21.63
镁 2.183 3.552
锰 0.022 0.040
钼 0.004 0.004
钠 17.21 38.24
镍 0.006 0.022
铅 0.015 0.152
锌 0.814 0.131
生物柴油废渣(BWR3)
实施例
为了例证给出以下实施例，因而其不应该被解释为限制本发明的范围。
实施例1
小球藻被认为是最有效的藻类之一，并且已用于本发明。配制200ml Zarrouk培养基，其包含溶于1升蒸馏水的16.8克碳酸氢钠、0.5克磷酸氢二钾、2.5克硝酸钠、0.2克硫酸镁、1.0克氯化钠、0.01克硫酸亚铁、1.0克硫酸钾、0.04克氯化钙和0.08g EDTA。然后在121℃下高压灭菌处理所述培养基20分钟。用20％的小球藻培养物(540nm下OD为1.4-1.6)接种所述培养基。保持烧瓶在30℃下并处于静止状态。以3天的规律间隔监测培养物的光密度。21天后，通过离心收集所述细胞，在60℃下烘干所得的沉淀，以得到0.801g的细胞干重，脂质含量为0.13克且为细胞干重的16.22％。
实施例2
使小球藻在200ml海水中在静止状态、光照培养下生长。用分光光度计(540nm下的OD)测量生长速率直到16天。16天之后，在30℃下以11,000rpm离心10min来收集所述细胞团块，细胞沉淀用蒸馏水洗涤两次，并在烘箱(60℃)中干燥16小时。使用氯仿∶甲醇(2∶1)从干燥生物质中提取脂质，蒸发溶剂之后，得到全部脂质。得到的生物质为0.347克，脂质含量为0.0506克且为细胞干重的14.58％。
实施例3
使小球藻在海水中在静止状态、黑暗条件下生长。用分光光度计(540nm下的OD)测量生长速率直到16天。16天之后，在28℃下以11,000rpm离心10分钟来收集所述细胞团块，细胞沉淀用蒸馏水洗涤两次，并在60℃的烘箱中干燥16小时。使用氯仿∶甲醇(2∶1)从干燥生物质中提取脂质，蒸发溶剂之后，得到全部脂质。得到的生物质为0.217克，脂质含量为0.0312克且为细胞干重的14.37％。
实施例4
使小球藻在含有1％的麻风树生物柴油废渣(GL8/BWR3)的海水中，搅拌条件下，在冷白色荧光灯管提供的60μE m-2s-1的光强度下，以12∶12小时的黑暗∶光照的周期生长。用分光光度计(540nm下的OD)测量生长速率直到16天。16天之后，在30℃下以11,000rpm离心10分钟来收集所述细胞团块，细胞沉淀用蒸馏水洗涤两次，并在60℃的烘箱中干燥16小时。使用氯仿∶甲醇(2∶1)从干燥物质中提取脂质，蒸发溶剂之后，得到全部脂质。从0.367克干的小球藻生物质中得到0.054克的脂质含量，即细胞干重的14.71％。
实施例5
使小球藻在含有2％的麻风树生物柴油废渣(GL8/BWR3)的海水中，搅拌条件下，在冷白色荧光灯管提供的60μE m-2s-1的光强度下，以12∶12小时的黑暗∶光照的周期生长。用分光光度计(540nm下的OD)测量生长速率直到16天。16天之后，在27℃下以11,000rpm离心10分钟来收集所述细胞团块，细胞沉淀用蒸馏水洗涤两次，并在60℃的烘箱中干燥16小时。使用氯仿∶甲醇(2∶1)从干燥物质中提取脂质，蒸发溶剂之后，得到全部脂质。从0.420克干的小球藻生物质中得到0.077克脂质含量，即细胞干重的18.33％。
实施例6
使小球藻在含有1％的麻风树生物柴油废渣(GL8/BWR3)的稀释海水(在自来水中1∶2)中，在搅拌条件、光照培养下生长。用分光光度计(540nm下的OD)测量生长速率直到16天。16天之后，在26℃下以11,000rpm离心10分钟来收集所述细胞团块，细胞沉淀用蒸馏水洗涤两次，并在60℃的烘箱中干燥16小时。使用氯仿∶甲醇(2∶1)从干燥生物质中提取脂质，蒸发溶剂之后，得到全部脂质。得到的生物质为0.387克，脂质含量为0.087克且为细胞干重的22.48％。
实施例7
使小球藻在含有2％的麻风树生物柴油废渣(GL8/BWR3)的稀释海水(在自来水中1∶2)中，在搅拌条件、光照培养下生长。用分光光度计(540nm下的OD)测量生长速率直到16天。16天之后，在30℃下以11,000rpm离心10分钟来收集所述细胞团块，细胞沉淀用蒸馏水洗涤两次，并在60℃的烘箱中干燥16小时。使用氯仿∶甲醇(2∶1)从干燥生物质中提取脂质，蒸发溶剂之后，得到全部脂质。得到的生物质为0.453克，脂质含量为0.097克且为细胞干重的21.41％。
实施例8
使小球藻在含有1％的麻风树生物柴油废渣(GL8/BWR3)的海水中，在静止状态、光照培养下生长。用分光光度计(540nm下的OD)测量生长速率直到16天。16天之后，在30℃下以11,000rpm离心10分钟来收集所述细胞团块，细胞沉淀用蒸馏水洗涤两次，并在60℃的烘箱中干燥16小时。使用氯仿∶甲醇(2∶1)从干燥生物质中提取脂质，蒸发溶剂之后，得到全部脂质。得到的生物质为0.447克，脂质含量为0.085克且为细胞干重的19.01％。
实施例9
使小球藻在含有2％的麻风树生物柴油废渣(GL8/BWR3)的海水中，在静止状态、光照培养下生长。用分光光度计(540nm下的OD)测量生长速率直到16天。16天之后，在30℃下以11,000rpm离心10分钟来收集所述细胞团块，细胞沉淀用蒸馏水洗涤两次，并在60℃的烘箱中干燥16小时。使用氯仿∶甲醇(2∶1)从干燥生物质中提取脂质，蒸发溶剂之后，得到全部脂质。得到的生物质为0.407克，脂质含量为0.074克且为细胞干重的18.18％。
实施例10
使小球藻在含有1％的麻风树生物柴油废渣(GL8/BWR3)的稀释海水(在自来水中1∶2)中，在静止状态、光照培养下生长。用分光光度计(540nm下的OD)测量生长速率直到16天。16天之后，在30℃下以11,000rpm离心10分钟来收集所述细胞团块，细胞沉淀用蒸馏水洗涤两次，并在60℃的烘箱中干燥16小时。使用氯仿∶甲醇(2∶1)从干燥生物质中提取脂质，蒸发溶剂之后，得到全部脂质。得到的生物质为0.463克，脂质含量为0.125克且为细胞干重的26.99％。
实施例11
使小球藻在含有2％的麻风树生物柴油废渣(GL8/BWR3)的稀释海水(在自来水中1∶2)中，在静止状态、光照培养下生长。用分光光度计(540nm下的OD)测量生长速率直到16天。16天之后，在30℃下以11,000rpm离心10分钟来收集所述细胞团块，细胞沉淀用蒸馏水洗涤两次，并在60℃的烘箱中干燥16小时。使用氯仿∶甲醇(2∶1)从干燥生物质中提取脂质，蒸发溶剂之后，得到全部脂质。得到的生物质为0.487克，脂质含量为0.163克且为细胞干重的33.47％。
实施例12
使小球藻在含有1％的麻风树生物柴油废渣(GL8/BWR3)的稀释海水(在自来水中1∶2)中，在静止状态、黑暗培养下生长。用分光光度计(540nm下的OD)测量生长速率直到16天。16天之后，在30℃下以11,000rpm离心10分钟来收集所述细胞团块，细胞沉淀用蒸馏水洗涤两次，并在60℃的烘箱中干燥16小时。使用氯仿∶甲醇(2∶1)从干燥生物质中提取脂质，蒸发溶剂之后，得到全部脂质。得到的生物质为0.398克，脂质含量为0.0863克且为细胞干重的21.68％。
实施例13
使小球藻在含有2％的麻风树生物柴油废渣(GL8/BWR3)的稀释海水(在自来水中1∶2)中，在静止状态、黑暗培养下生长。用分光光度计(540nm下的OD)测量生长速率直到16天。16天之后，在30℃下以11,000rpm离心10分钟来收集所述细胞团块，细胞沉淀用蒸馏水洗涤两次，并在60℃的烘箱中干燥过夜。使用氯仿∶甲醇(2∶1)从干燥生物质中提取脂质，蒸发溶剂之后，得到全部脂质。得到的生物质为0.387毫克，脂质含量为0.0839克且为细胞干重的22.19％。
实施例14
使用废甘油层GL7作为微藻生产脂质的营养物来源。GL7直接用于微藻小球藻中脂质的积聚。通过用热的酸性水溶液H3PO4/H2SO4处理含有4-6％(w/w)氮的麻风树油渣饼，提取麻风树油渣饼水解产物(JOCH)，之后用碱性物质如粗甘油层、氢氧化钾和氢氧化镁适当调节pH，得到具有缓冲作用并且有助于所述水解产物的营养价值的盐。分离的微藻小球藻用于细胞内脂质的积聚，所述细胞使用所述GL-7和JOCH进行生长和生产。
实施例15
使小球藻和1％JOCH、2％JOCH、5％JOCH和10％JOCH与自来水一起，在静止状态和光照下生长，使小球藻的细胞生长。用分光光度计(540nm下的OD)测量生长速率直到21天。21天之后，在30℃下以11,000rpm离心10分钟来收集所述细胞团块，细胞沉淀用蒸馏水洗涤两次，并在烘箱(60℃)中干燥16小时。使用氯仿∶甲醇(2∶1)从称重过的干燥物质中提取脂质，蒸发溶剂之后，得到全部脂质。在1％JOCH中获得了最高的生物质，但脂质含量的百分数较低。
这个实施例教导我们，1％的JOCH对生物质生产是有用的，其可用于生物质生产而不是脂质生产。对于生物质提高之后的脂质积聚，可以实现脂质积聚。
表1
实施例16
使小球藻和1％GL7、2％GL7、5％GL7与自来水一起，在静止状态和光照下生长，使小球藻的细胞生长。用分光光度计(540nm下的OD)测量生长速率直到21天。21天之后，在30℃下以11,000rpm离心10分钟来收集所述细胞团块，细胞沉淀用蒸馏水洗涤两次，并在烘箱(60℃)中干燥16小时。使用氯仿∶甲醇(2∶1)从干燥生物质中提取脂质，蒸发溶剂之后，得到全部脂质。在2％GL7中获得了最高的生物质，但脂质含量的百分数较低。
表2
实施例17
使小球藻和2％、5％、10％JOCH与2％GL7的组合，在静止状态和光照下，在自来水中生长，使小球藻的细胞生长。用分光光度计(540nm下的OD)测量生长速率直到21天。21天之后，在30℃下以11,000rpm离心10分钟来收集所述细胞团块，细胞沉淀用蒸馏水洗涤两次，并在烘箱中(60℃)干燥16小时。使用氯仿∶甲醇(2∶1)从称重过的干燥物质中提取脂质，蒸发溶剂之后，得到全部脂质。在2％GL7且10％JOCH中得到了最高的生物质3.1克，脂质含量为22.58％(0.7克)。
表3
实施例18
使小球藻在200ml培养基中的含有不同浓度的GL7和JOCH的海水中，在静止状态和光照培养下生长。用分光光度计(540nm下的OD)测量生长速率直到21天。在一组中，开始时(0天)添加JOCH，以及生长10天之后添加GL-7，观察生物质和脂质组成的变化。21天之后，在30℃下以11,000rpm离心10分钟来收集所述细胞团块，细胞沉淀用蒸馏水洗涤两次，并在烘箱中干燥16小时。使用氯仿∶甲醇(2∶1)从称重过的干燥物质中提取脂质，蒸发溶剂之后，得到全部脂质。发现在海水中含有1％的JOCH(0天)和第10天添加GL7的培养基中，小球藻生物质和脂质含量最大。
表4
实施例19
通过使50ml的培养物暴露在空气层流的紫外线灯(30W)下12小时，保持培养物与紫外光源的距离为10cm和50cm，在实验室条件下研究以0.33％的浓度使用的染料2，5-双(5-叔丁基-1，3-苯并噁唑-2-基)噻酚类保护小球藻免受紫外线损伤。通过紫外-可见分光光度计(540nm下OD)和紫外荧光研究(在540nm下激发)定量测定细胞损伤；研究紫外线对小球藻的干细胞质量和脂质含量的影响，得到以下结果。
表5
实施例20
在印度，特别是在古吉拉特(Gujarat)夏季条件的高峰时间内，在露台上户外培养下，用以下辐射数据(表xy an)，将100ml培养物在阳光直射下暴露2天，研究以0.33％的浓度使用的染料2，5-双(5-叔丁基-1，3-苯并噁唑-2-基)噻酚类保护小球藻免受紫外线损伤。利用Eppley TUVR(如图所示)，以wm-2计量整个白天的紫外辐射总量。通过紫外-可见分光光度计(540nm下OD)和紫外荧光研究(在540nm下激发)定量测定细胞损伤。
表6
描述紫外辐射对小球藻生物质和脂质的影响的户外实验
实施例21
使小球藻在200ml培养基中含有不同浓度的生物柴油副产品(BWR6和JOCH)的海水中，在静止状态和光照培养下生长。用分光光度计(540nm下的OD)测量生长速率直到18天。开始时(0天)添加JOCH，以及生长10天之后添加BWR-6，观察生物质和脂质组成的变化。18天之后，在30℃下以11,000rpm离心10分钟来收集所述细胞团块，细胞沉淀用蒸馏水洗涤两次，并在烘箱中干燥16小时。使用氯仿∶甲醇(2∶1)从称重过的干燥物质中提取脂质，蒸发溶剂之后，得到全部脂质。
表7
实施例22
使小球藻在200ml培养基中含有不同浓度的生物柴油副产品(BWR6和JOCH)的海水中，在静止状态和光照培养下生长。用分光光度计(540nm下的OD)测量生长速率直到10天。开始时(0天)添加JOCH，以及生长4天之后添加BWR-6，观察生物质和脂质组成的变化。10天之后，在30℃下以11,000rpm离心10分钟来收集所述细胞团块，细胞沉淀用蒸馏水洗涤两次，并在烘箱中干燥16小时。使用氯仿∶甲醇(2∶1)从称重过的干燥物质中提取脂质，蒸发溶剂之后，得到全部脂质。
表8
实施例23
使小球藻在敞开的塑料箱(长×宽×高：1.47m×0.74m×0.22m)中的100升培养基中的稀释的Zarrouk培养基(在自来水中1∶2)中，以540nm下OD为0.6的10％接种量生长。用分光光度计(540nm下的OD)测量生长速率直到16天。16天之后，通过用H3PO4调节pH至4.5使所述细胞团块沉淀，然后晒干所述脱水细胞。使用氯仿∶甲醇(2∶1)从干燥生物质中提取脂质，蒸发溶剂之后，得到全部脂质。在100升中，得到401.21克生物质，含有97.29克脂质含量，即24.25％细胞干重。
实施例24
使小球藻在敞开的塑料箱(长×宽×高：1.47m×0.74m×0.22m)中的100升培养基中的自来水中的2％BWR-3中，以540nm下OD为0.6的10％接种量生长。用分光光度计(540nm下的OD)测量生长速率直到16天。16天之后，通过用H3PO4调节pH至4.5使所述细胞团块沉淀，然后晒干所述脱水细胞。使用氯仿∶甲醇(2∶1)从干燥生物质中提取脂质，蒸发溶剂之后，得到全部脂质。在100升中，得到380.12克生物质，含有90.53克脂质含量，即23.81％细胞干重。
实施例25
使小球藻在敞开的塑料箱(长×宽×高：1.47m×0.74m×0.22m)中的100升培养基中的海水∶自来水(1∶2)中的2％BWR-3中，以540nm下OD为0.6的10％接种量生长。用分光光度计(540nm下的OD)测量生长速率直到16天。16天之后，通过用H3PO4调节pH至4.5使所述细胞团块沉淀，然后晒干所述脱水细胞。使用氯仿∶甲醇(2∶1)从干燥生物质中提取脂质，蒸发溶剂之后，得到全部脂质。在100升中，得到440.01克生物质，含有150.61克脂质含量，即34.23％细胞干重。
表9 藻类油脂中脂肪酸的百分比
序号 脂肪酸 百分比％
1 辛酸 0.047
2 肉豆蔻酸 0.413
3 十五酸 0.207
4 棕榈油酸 13.82
5 棕榈酸 34.46
6 十七酸 1.38
7 油酸 25.46
8 硬脂酸 23.28
9 11-二十烯酸 0.67
10 山嵛酸 0.24
本发明的优点
1.将麻风树油甲酯的共流(co-streams)用于微藻类的混合营养型生长，以高效且经济的方式转化成脂质。
2.通过添加染料保护小球藻的规模化培养免受紫外线损伤，并保持生物质生产率。
3.通过培养微藻培养物的分批补料***，其中开始时使用海水与自来水(1∶2)中的JOCH，几天之后再添加粗甘油，提高了产率和脂质总生产率，JOCH和粗甘油均作为麻风树生物柴油工艺期间的副产品得到。

Claims (4)

1.利用由麻风树整粒种子生产麻风树油甲酯(JME)的副产品生产用于脂质提取的含油小球藻的综合方法，所述方法包括以下步骤：
i.通过将麻风树果实机械去壳以获得麻风树种子，然后从所述种子中机械压榨出油脂来提供含有4-6％(w/w)氮的作为生产麻风树油甲酯(JME)副产品的麻风树种子的脱油渣饼；
ii.用热的酸性水溶液水解步骤(i)提供的所述脱油渣饼，然后用碱性物质调节pH至5.5-8.5的范围内，以得到富氮麻风树油渣饼水解产物(JOCH)；
iii.将1-5％(w/v)的含有粗甘油的甲醇贫化的甘油层添加到1-10％(v/v)的步骤(ii)得到的麻风树油渣饼水解产物，以制备用于小球藻的生长与生产培养基；
iv.将1-10％(v/v)的所述小球藻种子培养物接种到步骤(iii)得到的生长与生产培养基中以使小球藻混合营养型生长，并在温度为25-40℃，pH为7.0-8.0下，培养7至15天的时间，以得到含脂质的生物质；
或者可替换地，将1-10％(v/v)的所述小球藻种子培养物接种到步骤(iii)得到的生长与生产培养基中，并在户外生物质生产期间添加紫外线专用染料，以保护所述培养物在40℃-50℃的温度下不受紫外线损伤，保持所述培养物的活力，并在温度为25-40℃，pH为7.0-8.0下，培养7至15天的时间，以得到含脂质的生物质；
v.在太阳下干燥步骤(iv)得到的所述生物质，或直接将湿的生物质用于脂质提取；
vi.通过采用氯仿:甲醇从步骤(v)得到的生物质中提取脂质，然后蒸发溶剂。
2.如权利要求1所述的综合方法，其中所使用的酸选自H3PO4和H2SO4。
3.如权利要求1所述的综合方法，其中所述碱性物质选自氢氧化钾和氢氧化镁。
4.如权利要求1所述的综合方法，其中所使用的紫外线染料为2,5-双(5-叔丁基-1,3-苯并噁唑-2-基)噻酚。
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