CN103278637A - 一种检测幽门螺旋杆菌的碳纳米管检测试纸及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测幽门螺旋杆菌的碳纳米管检测试纸及其制备方法，具体来说，涉及一种用于免疫层析技术检测螺旋幽门杆菌的碳纳米管法检测试剂材料。其特征在于：该试纸底板上依次粘贴有样品垫、碳纳米管胶体金垫、碳纳米管膜、硝酸纤维素膜以及吸样垫；所述的碳纳米管胶体金垫上附着有碳纳米管胶体金复合物标记的螺旋幽门杆菌单克隆抗体1，所述的碳纳米管膜为吸附了碳纳米管的滤纸，所述的硝酸纤维素膜上包被有螺旋幽门杆菌单克隆抗体2的检测线以及质控线。本发明的目的在于提供一种碳纳米管胶体金复合物，作为示踪标记材料，用于标记幽门螺旋杆菌抗体，再经过碳纳米管膜，能改善吸附分离蛋白质的性能，提高检测的灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测幽门螺旋杆菌的碳纳米管检测试纸及其制备方法 ，具体来说，涉及一种用于免疫层析技术检测螺旋幽门杆菌的碳纳米管法检测试剂材料。
背景技术
免疫层析技术广泛用于疾病标记物检测、食品检测、科学研究等多个领域，所选用的示踪标记材料一般为胶体金、乳胶颗粒等，层析材料一般为纤维素膜，包括硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、混合纤维素膜等，其中最常用的是硝酸纤维素膜。在目前的技术条件下，使用胶体金等示踪材料和硝酸纤维素膜作为载体很难再提高检测灵敏度。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种碳纳米管胶体金复合物，作为示踪标记材料，用于标记幽门螺旋杆菌抗体，再经过碳纳米管膜，能改善吸附分离蛋白质的性能，提高检测的灵敏度。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种检测幽门螺旋杆菌的碳纳米管检测试纸，其特征在于：该试纸底板上依次粘贴有样品垫、碳纳米管胶体金垫、碳纳米管膜、硝酸纤维素膜以及吸样垫；所述的碳纳米管胶体金垫上附着有碳纳米管胶体金复合物标记的螺旋幽门杆菌单克隆抗体1，所述的碳纳米管膜为吸附了碳纳米管的滤纸，所述的硝酸纤维素膜上包被有螺旋幽门杆菌单克隆抗体2的检测线以及质控线。
所用的碳纳米管为单壁碳纳米管、多壁碳纳米管、羟基化碳纳米管、羧基化碳纳米管、水溶性碳纳米管中的一种。
碳纳米管胶体金复合物为碳纳米管和胶体金通过组装形成碳纳米管胶体金复合物。
所述的碳纳米管膜用滤纸膜吸附碳纳米管混悬液，干燥后既得。
水溶性碳纳米管是经强氧化剂处理后的碳纳米管，所用的强氧化剂为硫酸-硝酸、过氧化苯甲酰中的一种。
所用的滤纸膜为硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、混酯膜、普通滤纸中的一种。
一种如上所述检测幽门螺旋杆菌的碳纳米管检测试纸的制备方法，其特征在于：在试纸底板上依次粘贴样品垫、碳纳米管胶体金垫、碳纳米管膜、硝酸纤维素膜以及吸样垫；然后分别制备：
（1）、碳纳米管的制备：
将质量百分比为0.1～99.9%的碳纳米管用表面活性剂或壳聚糖、海藻酸钠用超声波使其充分分散悬浮，将质量百分比为0.1～99.9%的胶体金加入其中，搅拌匀浆，离心分离，干燥即得；
或将质量百分比为0.1～99.9%的碳纳米管用表面活性剂或壳聚糖、海藻酸钠用超声波使其充分分散悬浮，将滤纸膜浸入其中，吸附碳纳米管，取出，用水将未吸附的碳纳米管洗去，干燥即得；
或将碳纳米管用强氧化剂硫酸-硝酸或过氧化苯甲酰处理，得到水溶性碳纳米管，然后将纤维素膜置于水溶性碳纳米管中浸泡，取出后干燥即得；
（2）、碳纳米管胶体金复合物的制备：
取质量百分比为0.01%的40nm胶体金溶液50ml，加入上述水溶性碳纳米管溶液中，搅拌10分钟，12000rpm离心30分钟，分离上清液，沉淀用pH值为7.4的PBS缓冲液复溶至50ml，即得；
（3）、碳纳米管膜的制备：
将 100mg的短壁碳纳米管加入50ml、0.5%的吐温-20水溶液中，超声5分钟使其充分分散悬浮，将普通滤纸浸入其中，取出，用水冲洗掉未吸附碳纳米管，干燥，切条备用；
（4）、碳纳米管胶体金标记螺旋幽门杆菌单克隆抗体1的制备：
取50ml碳纳米管胶体金溶液于烧杯内，用0.1mol/L的 K2CO3 溶液调至pH8.2，向溶液中加入0.5mg螺旋幽门杆菌单克隆抗体1，室温搅拌30分钟，加入重量百分比为5％的牛血清白蛋白（BSA）封闭1小时，12000rpm、4℃离心30分钟，弃上清，用缓冲液复溶至50ml，按1ml溶液铺30cm2的比例，将溶液均匀的铺在玻璃纤维膜上，37℃干燥30分钟，制成碳纳米管胶体金垫；
（5）、硝酸纤维素膜的包被：
将与抗体1配对的螺旋幽门杆菌抗体2溶解在0.01M、 pH8.2磷酸缓冲液配制成0.1mg/ml的溶液，用喷膜仪在硝酸纤维素膜以1μl/cm的参数进行划线，为检测线，同时在远端喷划二抗作为质控线，划线后将硝酸纤维素膜在室温干燥8小时；
（6）、检测试纸的组装：
在干燥室内，温度20～25℃，湿度小于30%，将样品垫、碳纳米管胶体金垫、碳纳米管膜、硝酸纤维素膜以及吸水纸依次粘贴在底板上，其中硝酸纤维素膜位于底板中部，硝酸纤维素膜包被有T线的一端与碳纳米管胶体金垫的1/3搭接，包被有C线的一端与吸样垫的1/10搭接，碳纳米管膜放在碳纳米管胶体金垫下方，并延伸到硝酸纤维素膜上4mm，样品垫与胶体金垫的1/5搭接；最后切成宽度为4mm的试纸条，也可将试纸条装入一个塑料卡中制成检测卡。
在步骤（1）中水溶性碳纳米管的制备：
称取 0.3克过氧化苯甲酰于50ml的三角烧瓶中，并加入 10ml无水乙醇，超声波振荡至完全溶解， 将0.003克的多壁碳纳米管加入其中，于80℃回流 5 h 后冷却至4℃，过滤 ，用无水乙醇冲洗至滤液达到中性，收集滤液，用水定容至50ml，即得。
本申请的碳纳米管是一种新型纳米材料，重量轻，六边形结构连接完美，具有许多异常的力学、电学和化学性能。 碳纳米管在免疫分析方面已有不少研究，主要集中在免疫传感器领域，能大幅度提高检测灵敏度。碳纳米管分为单壁碳纳米管、多壁碳纳米管、羟基化碳纳米管、羧基化碳纳米管，经处理后也可得到水溶性碳纳米管，具有良好的吸附分离性能，功能化的碳纳米管更易和蛋白质结合。碳纳米管和胶体金的复合物标记蛋白质，再经过碳纳米管膜，能改善吸附分离蛋白质的性能，提高检测的灵敏度。
具体实施方式：
一种检测幽门螺旋杆菌的碳纳米管检测试纸及其制备方法，该试纸底板上依次粘贴有样品垫、碳纳米管胶体金垫、碳纳米管膜、硝酸纤维素膜以及吸样垫；所述的碳纳米管胶体金垫上附着有碳纳米管胶体金复合物标记的螺旋幽门杆菌单克隆抗体1，所述的碳纳米管膜为吸附了碳纳米管的滤纸，所述的硝酸纤维素膜上包被有螺旋幽门杆菌单克隆抗体2的检测线以及质控线。
方法1：将质量百分比为0.1～99.9%的碳纳米管用表面活性剂或壳聚糖、海藻酸钠用超声波使其充分分散悬浮，将质量百分比为0.1～99.9%的胶体金加入其中，搅拌匀浆，离心分离，干燥即得。
方法2：将质量百分比为0.1～99.9%的碳纳米管用表面活性剂或壳聚糖、海藻酸钠用超声波使其充分分散悬浮，将滤纸膜浸入其中，吸附碳纳米管，取出，用水将未吸附的碳纳米管洗去，干燥即得。
方法3：将碳纳米管用强氧化剂硫酸-硝酸或过氧化苯甲酰处理，得到水溶性碳纳米管，然后将纤维素膜置于水溶性碳纳米管中浸泡，取出后干燥，即得。
实施例；
水溶性碳纳米管的制备：
称取 0.3克过氧化苯甲酰于50ml的三角烧瓶中，并加入 10ml无水乙醇，超声波振荡至完全溶解， 将0.003克的多壁碳纳米管加入其中，于80℃回流 5 h 后冷却至4℃，过滤 ，用无水乙醇冲洗至滤液达到中性．收集滤液，用水定容至50ml，即得。
碳纳米管胶体金复合物的制备：
取质量百分比为0.01%的40nm胶体金溶液50ml，加入上述水溶性碳纳米管溶液中，搅拌10分钟，12000rpm离心30分钟，分离上清液，沉淀用pH值为7.4的PBS缓冲液复溶至50ml，即得。
碳纳米管膜的制备：
将 100mg的短壁碳纳米管加入50ml、0.5%的吐温-20水溶液中，超声5分钟使其充分分散悬浮，将普通滤纸浸入其中，取出，用水冲洗掉未吸附碳纳米管，干燥即得。切条备用。
碳纳米管胶体金标记螺旋幽门杆菌单克隆抗体1
取50ml碳纳米管胶体金溶液于烧杯内，用0.1mol/L的 K2CO3 溶液调至pH8.2，向溶液中加入0.5mg螺旋幽门杆菌单克隆抗体1，室温搅拌30分钟，加入重量百分比为5％的牛血清白蛋白（BSA）封闭1小时，12000rpm、4℃离心30分钟，弃上清，用缓冲液复溶至50ml，按1ml溶液铺30cm2的比例，将溶液均匀的铺在玻璃纤维膜上，37℃干燥30分钟，制成碳纳米管胶体金垫。
硝酸纤维素膜的包被：
将与抗体1配对的螺旋幽门杆菌抗体2溶解在0.01M、 pH8.2磷酸缓冲液（PBS）配制成0.1mg/ml的溶液，用喷膜仪在硝酸纤维素膜以1μl/cm的参数进行划线，为检测线（T线），同时在远端喷划二抗作为质控线（C线），划线后将硝酸纤维素膜在室温干燥8小时。
检测试纸的组装：
在干燥室内，温度20～25℃，湿度小于30%，将样品垫、碳纳米管胶体金垫、碳纳米管膜、硝酸纤维素膜以及吸水纸依次粘贴在底板上，其中硝酸纤维素膜位于底板中部，硝酸纤维素膜包被有T线的一端与碳纳米管胶体金垫的1/3搭接，包被有C线的一端与吸样垫的1/10搭接，碳纳米管膜放在碳纳米管胶体金垫下方，并延伸到硝酸纤维素膜上4mm，样品垫与胶体金垫的1/5搭接。最后切成宽度为4mm的试纸条，也可将试纸条装入一个塑料卡中制成检测卡。
灵敏度检验
配制不同浓度的螺旋幽门杆菌抗原，用本检测试纸检测，结果表明本检测试纸灵敏度为0.5ng/ml。可用于唾液做样本的幽门螺旋杆菌检测。
Claims (8)
1.一种检测幽门螺旋杆菌的碳纳米管检测试纸，其特征在于：该试纸底板上依次粘贴有样品垫、碳纳米管胶体金垫、碳纳米管膜、硝酸纤维素膜以及吸样垫；所述的碳纳米管胶体金垫上附着有碳纳米管胶体金复合物标记的螺旋幽门杆菌单克隆抗体1，所述的碳纳米管膜为吸附了碳纳米管的滤纸，所述的硝酸纤维素膜上包被有螺旋幽门杆菌单克隆抗体2的检测线以及质控线。
2. 根据权利要求1所述的一种检测幽门螺旋杆菌的碳纳米管检测试纸，其特征在于：所用的碳纳米管为单壁碳纳米管、多壁碳纳米管、羟基化碳纳米管、羧基化碳纳米管、水溶性碳纳米管中的一种。
3. 根据权利要求1所述的一种检测幽门螺旋杆菌的碳纳米管检测试纸，其特征在于：碳纳米管胶体金复合物为碳纳米管和胶体金通过组装形成碳纳米管胶体金复合物。
4. 根据权利要求1所述的一种检测幽门螺旋杆菌的碳纳米管检测试纸，其特征在于：所述的碳纳米管膜用滤纸膜吸附碳纳米管混悬液，干燥后既得。
5. 根据权利要求2所述的一种检测幽门螺旋杆菌的碳纳米管检测试纸，其特征在于：水溶性碳纳米管是经强氧化剂处理后的碳纳米管，所用的强氧化剂为硫酸-硝酸、过氧化苯甲酰中的一种。
6. 根据权利要求4所述的一种检测幽门螺旋杆菌的碳纳米管检测试纸，其特征在于：所用的滤纸膜为硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、混酯膜、普通滤纸中的一种。
7.一种如权利要求1所述检测幽门螺旋杆菌的碳纳米管检测试纸的制备方法，其特征在于：在试纸底板上依次粘贴样品垫、碳纳米管胶体金垫、碳纳米管膜、硝酸纤维素膜以及吸样垫；然后分别制备：
（1）、碳纳米管的制备：
将质量百分比为0.1～99.9%的碳纳米管用表面活性剂或壳聚糖、海藻酸钠用超声波使其充分分散悬浮，将质量百分比为0.1～99.9%的胶体金加入其中，搅拌匀浆，离心分离，干燥即得；
或将质量百分比为0.1～99.9%的碳纳米管用表面活性剂或壳聚糖、海藻酸钠用超声波使其充分分散悬浮，将滤纸膜浸入其中，吸附碳纳米管，取出，用水将未吸附的碳纳米管洗去，干燥即得；
或将碳纳米管用强氧化剂硫酸-硝酸或过氧化苯甲酰处理，得到水溶性碳纳米管，然后将纤维素膜置于水溶性碳纳米管中浸泡，取出后干燥即得；
（2）、碳纳米管胶体金复合物的制备：
取质量百分比为0.01%的40nm胶体金溶液50ml，加入上述水溶性碳纳米管溶液中，搅拌10分钟，12000rpm离心30分钟，分离上清液，沉淀用pH值为7.4的PBS缓冲液复溶至50ml，即得；
（3）、碳纳米管膜的制备：
将 100mg的短壁碳纳米管加入50ml、0.5%的吐温-20水溶液中，超声5分钟使其充分分散悬浮，将普通滤纸浸入其中，取出，用水冲洗掉未吸附碳纳米管，干燥，切条备用；
（4）、碳纳米管胶体金标记螺旋幽门杆菌单克隆抗体1的制备：
取50ml碳纳米管胶体金溶液于烧杯内，用0.1mol/L的 K2CO3 溶液调至pH8.2，向溶液中加入0.5mg螺旋幽门杆菌单克隆抗体1，室温搅拌30分钟，加入重量百分比为5％的牛血清白蛋白（BSA）封闭1小时，12000rpm、4℃离心30分钟，弃上清，用缓冲液复溶至50ml，按1ml溶液铺30cm2的比例，将溶液均匀的铺在玻璃纤维膜上，37℃干燥30分钟，制成碳纳米管胶体金垫；
（5）、硝酸纤维素膜的包被：
将与抗体1配对的螺旋幽门杆菌抗体2溶解在0.01M、 pH8.2磷酸缓冲液配制成0.1mg/ml的溶液，用喷膜仪在硝酸纤维素膜以1μl/cm的参数进行划线，为检测线，同时在远端喷划二抗作为质控线，划线后将硝酸纤维素膜在室温干燥8小时；
（6）、检测试纸的组装：
在干燥室内，温度20～25℃，湿度小于30%，将样品垫、碳纳米管胶体金垫、碳纳米管膜、硝酸纤维素膜以及吸水纸依次粘贴在底板上，其中硝酸纤维素膜位于底板中部，硝酸纤维素膜包被有T线的一端与碳纳米管胶体金垫的1/3搭接，包被有C线的一端与吸样垫的1/10搭接，碳纳米管膜放在碳纳米管胶体金垫下方，并延伸到硝酸纤维素膜上4mm，样品垫与胶体金垫的1/5搭接；最后切成宽度为4mm的试纸条，也可将试纸条装入一个塑料卡中制成检测卡。
8.根据权利要求7所述检测幽门螺旋杆菌的碳纳米管检测试纸的制备方法，其特征在于：在步骤（1）中水溶性碳纳米管的制备：
称取 0.3克过氧化苯甲酰于50ml的三角烧瓶中，并加入 10ml无水乙醇，超声波振荡至完全溶解， 将0.003克的多壁碳纳米管加入其中，于80℃回流 5 h 后冷却至4℃，过滤 ，用无水乙醇冲洗至滤液达到中性，收集滤液，用水定容至50ml，即得。
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