CN103278635B - 动物布鲁氏菌病竞争elisa 抗体检测试剂盒 - Google Patents
动物布鲁氏菌病竞争elisa 抗体检测试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103278635B CN103278635B CN201310213811.5A CN201310213811A CN103278635B CN 103278635 B CN103278635 B CN 103278635B CN 201310213811 A CN201310213811 A CN 201310213811A CN 103278635 B CN103278635 B CN 103278635B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- brucella
- kit
- strain
- monoclonal antibody
- brucellosis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 206010006500 Brucellosis Diseases 0.000 title claims abstract description 28
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title claims abstract description 21
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 title claims abstract description 9
- 241000589562 Brucella Species 0.000 claims abstract description 50
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 31
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 31
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 241001333951 Escherichia coli O157 Species 0.000 claims abstract description 13
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims abstract description 11
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims description 22
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 claims description 22
- 239000004744 fabric Substances 0.000 claims description 16
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 11
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 6
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims description 5
- 241000607447 Yersinia enterocolitica Species 0.000 claims description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 3
- 230000004907 flux Effects 0.000 claims description 3
- 229940098232 yersinia enterocolitica Drugs 0.000 claims description 3
- 241001148106 Brucella melitensis Species 0.000 claims description 2
- 229940038698 brucella melitensis Drugs 0.000 claims description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 8
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 abstract description 4
- 241001148111 Brucella suis Species 0.000 abstract description 3
- 230000007547 defect Effects 0.000 abstract description 3
- 208000010227 enterocolitis Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 abstract 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 abstract 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 abstract 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 49
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 43
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 21
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 description 19
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 17
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 17
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 16
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 10
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 9
- 241001148129 Yersinia ruckeri Species 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 7
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000004523 agglutinating effect Effects 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 5
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 4
- 229940005654 nitrite ion Drugs 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 4
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 3
- 241000589567 Brucella abortus Species 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- 241001416149 Ovis ammon Species 0.000 description 3
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 3
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 3
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 3
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 3
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- IICCLYANAQEHCI-UHFFFAOYSA-N 4,5,6,7-tetrachloro-3',6'-dihydroxy-2',4',5',7'-tetraiodospiro[2-benzofuran-3,9'-xanthene]-1-one Chemical compound O1C(=O)C(C(=C(Cl)C(Cl)=C2Cl)Cl)=C2C21C1=CC(I)=C(O)C(I)=C1OC1=C(I)C(O)=C(I)C=C21 IICCLYANAQEHCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 241000577483 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi B Species 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 229940056450 brucella abortus Drugs 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N carbonic acid Chemical compound OC(O)=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 2
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 2
- 229930187593 rose bengal Natural products 0.000 description 2
- 229940081623 rose bengal Drugs 0.000 description 2
- STRXNPAVPKGJQR-UHFFFAOYSA-N rose bengal A Natural products O1C(=O)C(C(=CC=C2Cl)Cl)=C2C21C1=CC(I)=C(O)C(I)=C1OC1=C(I)C(O)=C(I)C=C21 STRXNPAVPKGJQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- KGRVJHAUYBGFFP-UHFFFAOYSA-N 2,2'-Methylenebis(4-methyl-6-tert-butylphenol) Chemical compound CC(C)(C)C1=CC(C)=CC(CC=2C(=C(C=C(C)C=2)C(C)(C)C)O)=C1O KGRVJHAUYBGFFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 8 μ L2.5mMdNTPs Substances 0.000 description 1
- 206010000234 Abortion spontaneous Diseases 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 235000010149 Brassica rapa subsp chinensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000000536 Brassica rapa subsp pekinensis Nutrition 0.000 description 1
- 241000499436 Brassica rapa subsp. pekinensis Species 0.000 description 1
- 206010011409 Cross infection Diseases 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 241000726221 Gemma Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010006464 Hemolysin Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 244000208060 Lawsonia inermis Species 0.000 description 1
- 244000131099 Macrotyloma uniflorum Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 206010029803 Nosocomial infection Diseases 0.000 description 1
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000282376 Panthera tigris Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical class [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101000980463 Treponema pallidum (strain Nichols) Chaperonin GroEL Proteins 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000004500 asepsis Methods 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- 101150028926 bp26 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 235000020247 cow milk Nutrition 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000002875 fluorescence polarization Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013905 glycine and its sodium salt Nutrition 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000003228 hemolysin Substances 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 208000015994 miscarriage Diseases 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 101150004747 omp31 gene Proteins 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000013094 purity test Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 208000000995 spontaneous abortion Diseases 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 230000002277 temperature effect Effects 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及一种动物布鲁氏菌病竞争ELISA抗体检测试剂盒。该试剂盒使用了一种能与布鲁氏菌特异性结合的3E4株单克隆抗体，检测中该单克隆抗体能与布鲁氏菌产生的抗体产生特异性竞争，而与其它病原细菌无竞争性，特别是与布鲁氏菌有强烈交叉反应的小肠结肠炎耶尔森氏菌O9和大肠杆菌O157抗血清无竞争性，有效解决了目前商品化布病竞争ELISA试剂盒无法区分小肠结肠炎耶尔森氏菌O9和大肠杆菌O157的缺陷，提高了检测特异性；本试剂盒使用了对猪牛羊均具有良好反应原性的猪种布鲁氏菌S2株LPS作为包被抗原，既提高了LPS的产量，降低生产成本，又提高了检测敏感性。
Description
技术领域 本发明涉及一种动物布鲁氏菌病诊断方法——动物布鲁氏菌病竞争ELISA抗体检测试剂盒，属生物制品检测技术领域。
技术背景
布鲁氏菌病（布病）是由布鲁氏菌或称布鲁氏菌（Brucella）引起的以流产和发热为特征的***共患病，严重地威胁着人和多种动物的生命健康。本病不但对动物的繁殖和生产性能具有严重危害，更重要的是，人感染布鲁氏菌后，往往难以治愈，从而造成严重的公共卫生问题。因此在布鲁氏菌流行的国家，消除布病一直是公共卫生计划中最重要的目标之一。
布病在世界存在已有久远的历史，人类对该病的研究认识逐步加深，诊断水平不断提高，随着动物布病的研究进展，动物布病血清学的检测方法不断改进和提高。传统的凝集试验（如：虎红抗原平板凝集试验、试管抗原凝集试验、乳环凝集试验）逐渐被敏感性高、特异性强的ELISA方法、荧光偏振试验（FPA）等新的检测技术所取代。
凝集试验是布鲁氏菌病诊断的一种常用的方法，包括血清凝集实验、乳环沉淀试验和抗人免疫球蛋白试验，其中经典的标准试管凝集试验(STAT)、平板凝集试验(PAT)，以上方法在发达国家已经基本停止使用，取而代之的是缓冲布鲁氏菌抗原凝集试验如虎红平板凝集试验(RBPT)。虎红平板凝集抗原是用抗原性良好的布鲁氏菌菌株经培养，灭活，离心收集菌体后用虎红染料染色后悬浮于乳酸缓冲液中制成，该方法灵敏度高，价格便宜，操作方便，检测快速，适于动物群体布鲁氏菌病的普查。在国际贸易中是牛、羊、猪布鲁氏菌病检测的指定试验，在我国也用于人布鲁氏菌病监测的初筛。乳环沉淀试验依然是乳牛布鲁氏菌监测的主要方法，该方法直接对牛乳进行检测，可以对奶牛群体进行筛检，该方法简便快速。凝集试验主要检测抗布鲁氏菌LPS-O链的抗体，而布鲁氏菌的LPS-O链是多种革兰氏阴性菌的共同抗原，因此布鲁氏菌与其他革兰氏阴性菌存在的交叉感染用试管凝集试验无法鉴别，这也是布鲁氏菌病诊断存在的一大难题。
在布鲁氏菌病血清学检验中一致认为补体结合试验（CFT）在特异性上优于其他方法，常被用来对试管凝集试验和虎红平板凝集试验检测为阳性或可疑的病例进行定性检测。补体结合试验一直被认为是最有效的布病诊断方法，至今尚没有一种诊断方法能取代补体结合试验在血清学诊断中的地位。但补体结合试验所需要的溶血素的制备困难，试验操作繁琐，难以在临床上普遍使用，而且由于猪体内的补体会干扰豚鼠补体的作用，导致敏感性下降。
ELISA是一种与CFT效果相当的诊断方法，该方法操作方便，灵敏度高，特异性较好，一次可以完成大量样品的检测，既可以作为筛选试验应用于动物群体检疫，还可以作为确诊试验。ELISA不仅可以应用于血清抗体的检测，还可应用于乳样中抗体的检测。牛的布鲁氏菌病ELISA检测方法已是国际贸易中指定的检测方法之一，其他种布鲁氏菌的ELISA检测方法也是研究的热点。目前，用于布鲁氏菌病检测的ELISA有间接ELISA（iELISA）和竞争ELISA（cELISA）两种。
由于cELISA使用的是针对布鲁氏菌LPS的特异性单克隆抗体与待检动物血清中针对布病的抗体进行竞争，使用的二抗是针对小鼠IgG的酶标抗体，所以相对于iELISA而言，cELISA可以同时检测猪、牛和羊的血清，而目iELISA只能是针对其中某一种分别建立诊断试剂盒。因此，cELISA试剂盒具有更广泛的宿主适应性。但目前商业化的cELISA试剂盒存在的主要技术缺陷在于不能有效排除耶尔森氏菌O9和大肠杆菌O157感染动物的血清干扰，从而使其特异性受到一定程度影响。
由耶尔森氏菌O9和大肠杆菌O157（特别是O157：H7型）细菌中脂多糖（LPS）与布鲁氏菌LPS具有极高的同源性，干扰了布鲁氏菌病的诊断。到目前为止，无论是传统的凝集试验，还是现在被广泛使用的ELISA试剂盒，都不能有效区分以上2种细菌感染动物的血清，因而给布病的诊断带来了潜在的非特异性。有研究拟使用布鲁氏菌的外膜蛋白OMP28、OMP31等蛋白建立布鲁氏菌的诊断试剂盒，但均因以上蛋白特异性抗体的产生与感染细菌的种属及被感染动物的品种存在严格的依赖性，导致其使用范围严重受限，从而失去了其进一步被开发成试剂盒的可能。
本发明的目的在于另外，国外同类技术抗原多采用牛种布鲁氏菌A99株，主要用于检测牛布鲁氏菌病。
发明内容
本发明的目的在于制备一种能有效排除小肠结肠炎耶尔森氏菌O9和大肠杆菌O157对布鲁氏菌病检测的干扰和对猪、牛、羊的布鲁氏菌病均能检测的检测试剂盒。
本发明的技术路线是选取我国独有的布鲁氏菌S2株，对猪、牛、羊都具有良好的抗原性，是一株可用于猪、牛和羊的布鲁氏菌病疫苗株，以此菌株提取的LPS，对猪、牛、羊的布鲁氏菌病检测，均有更好的敏感性，同时也更适合我国布鲁氏菌病防控需求。本研究同时发现以布鲁氏菌S2株提取LPS其产量高于以A99和S1119株的产量，能有效降低生产成本；
本发明按常规单克隆抗体制备技术，利用布鲁氏菌S2株作为免疫原，免疫Balb/C小鼠，取其脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP20融合后，以布鲁氏菌凝集抗原筛选获得了127株特异性单克隆抗体细胞株，进一步通过耶尔森氏菌O9和大肠杆菌933株（O157：H7型）进行凝集试验筛选，最终筛选获得了一株只与布鲁氏菌有凝集反应，而与耶尔森氏菌O9和大肠杆菌O157（H7型）无凝集反应的单克隆抗体细胞株在此基础上研发的布病cELISA诊断试剂盒，弥补了现有的商品化竞争试剂盒的缺陷，提高了检测的特异性。因此：
1.该试剂盒主要含有：猪种布鲁氏菌S2株LPS抗原包被板和特异性布鲁氏菌单克隆抗体3E4，其中：
（1）该试剂盒中使用的包被抗原为猪种布鲁氏菌S2株提取的LPS，该LPS对猪、牛、羊布鲁氏菌病的病原菌具有良好的敏感性，提高了试剂盒检测的敏感性；
（2）该试剂盒中使用了特异性布鲁氏菌单克隆抗体3E4，该单克隆抗体能够能特异性识别布鲁氏菌脂多糖，能有效排除小肠结肠炎耶尔森氏菌O9和大肠杆菌O157对布鲁氏菌病检测的干扰；制备布鲁氏菌单克隆抗体3E4的布鲁氏菌单克隆抗体细胞株已于2013年05月31日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所内中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.7706。
2.使用该试剂盒能对猪、牛和羊布布鲁氏菌病进行高通量检测。本发明实施方式：
1.本申请涉建立了抗原制备用菌种猪种布鲁氏菌S2株（B.suisS2）的质量标准。
（1）菌落形态菌落边缘整齐、圆润，露滴状，斜光照射，逆光观察微带蓝色乳光。
（2）染色形态为球杆菌，单个散在，不形成芽孢和荚膜。大小在0.3～0.6μm之间。革兰氏染色为阴性，柯氏染色为红色。
（3）纯粹按现行《中国兽药典》附录进行，应纯粹。
（4）特异性
1）血清学特异性以培养物制成抗原，与光滑型布鲁氏菌阳性血清应出现凝集，与粗糙型血清不出现凝集。
2）PCR特异性合成如下4条引物，将其配成引物混合储存液，各引物浓度均为25μM。
Feri：5’-GCGCCGCGAAGAACTTATCAA-3’（序列1）
Reri:5’-CGCCATGTTAGCGGCGGTGA-3’（序列2）
Fsuis:5’-GCGCGGTTTTCTGAAGGTTCAGG-3’（序列3）
RIS711:5’-TGCCGATCACTTAAGGGCCTTCAT-3’（序列4）
模板：S2培养菌落或试剂盒提取的S2基因组DNA。
PCR反应体系：50μL的反应体系中，含5μL10×Buffer，8μL2.5mMdNTPs，混合引物储存液2μL，Taq酶2U，模板DNA1μL（或挑取菌落少许）。
PCR反应程序：95℃5min后，按94℃1min、60℃1.5min、72℃1.5min进行28个循环，最后72℃10min。
结果：扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳鉴定，应出现2条特异性PCR条带，大小分别为178bp和285bp（见附图1）。
2.本申请建立了包被抗原LPS的提取方法。
（1）菌悬液制备将鉴定合格的B.suisS2株二级种子接种于胰眎琼脂扁瓶中，37℃培养48小时后，每瓶加入含有0.5%苯酚的生理盐水20ml浸泡菌体表面10min以上，洗下培养物，收集于无菌玻璃瓶中。
（2）菌液灭活及灭活检验将收集好的菌悬液加热到80℃，维持120min，待其自然冷却后，存于4℃。对灭活菌液应进行灭活检验。取灭活菌液0.1ml涂布胰眎琼脂或TSA平板，37℃培养7天，不应无菌生长。
（3）抗原提取将灭活检验合格的菌悬液以10000g离心20min，收集沉淀。称量并计算菌体湿重，将菌体湿重按1:3（W/W）比例加入灭菌蒸馏水中，充分混匀后，加热到66℃，然后加入66℃预热的90%（V/V）苯酚溶液。在此温度下（66℃）持续搅拌15min，置室温自然冷却后，于4℃10000g离心15min。用一长管吸弃下层棕红色的酚相，将水相用Whatman1号滤纸过滤去除大菌体碎片。用量筒量取酚相体积，然后加入3倍体积-15℃以下预冷的甲醇（含1%甲醇饱和的醋酸钠），4℃孵育2小时，4℃10000g离心10min，弃上清，将沉淀用原水相1/2体积蒸馏水重悬，4℃10000g离心10min。收集上清液于4℃保存。将沉淀再用等体积灭菌蒸馏水重悬，4℃再搅拌2小时，依上法离心获上清液，并与前述上清液混合。随后，在上清液中加入终浓度为5%的三氯乙酸，室温搅拌15min后，10000g离心15min,弃去沉淀，上清液用蒸馏水透析过夜，换液2次（每一次至少4000ml），收集透析袋内容物，此即纯化的LPS。
3.本申请建立了包被抗原LPS的检验程序。
（1）纯度测定将纯化的sLPS作1:10稀释后，取10μL进行SDS-PAGE电泳，电泳完成后用考马斯亮蓝染液染色检测，应无蛋白条带。
（2）抗原冻干与分装取纯度检测合格的抗原按4ml/瓶分装10ml青霉素瓶，进行冻干。取出冻干抗原，称重，按绝对质量用含0.01%硫柳汞的0.05MpH9.6的碳酸缓冲液将其溶解，使其浓度为1mg/ml。将抗原分装，保存与-70℃以下，有效期暂定为24个月。
（3）效价测定将抗原用0.05MpH9.6的碳酸缓冲液分别作1:1000、1:2000和1:4000倍稀释后，包被96孔ELISA板，用ELISA强阳性（中国兽医药品监察所提供，布病阳性血清国家参照品，批号：201001）、弱阳性（1：100稀释的强阳性血清）和阴性血清（中国兽医药品监察所提供）各1份作为参照，进行间接ELISA方法检测（见附注1），终止反应后，测定OD450值。ELISA强阳性参考血清OD450≥1.0；ELISA弱阳性参考血清OD450为0.4～0.7，ELISA阴性参考血清OD450<0.1为合格。抗原效价应≥1:2000。
4.本申请建立了单抗腹水制备程序。
（1）单克隆抗体细胞株本发明按常规单克隆抗体制备技术，利用布鲁氏菌S2株作为免疫原，免疫Balb/C小鼠，取其脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP20融合后，以布鲁氏菌凝集抗原筛选获得了127株特异性单克隆抗体细胞株，进一步通过耶尔森氏菌O9和大肠杆菌933株（O157:H7型）进行凝集试验筛选，最终筛选获得了一株只与布鲁氏菌有凝集反应，而与耶尔森氏菌O9和大肠杆菌O157（H7型）无凝集反应的单克隆抗体细胞株，命名为3E4株，该单克隆抗体细胞株已于2013年05月31日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所内中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.7706。
（2）接种小鼠从液氮罐中取一支单克隆抗体细胞3E4株复苏，在完全1640培养基中培养48～72h后按1:4传代，将杂交瘤细胞扩大培养后收获细胞。收集扩大培养的杂交瘤细胞、计数（见附注2），腹腔接种8～10周龄雌性BALB/c鼠，接种剂量为以1×106杂交瘤细胞/只。
（3）腹水的收集约10d后用2.5mL注射器吸取小鼠腹腔内的腹水，每只小鼠可以收集几次，每次3～10mL不等，收集腹水至小鼠死亡。腹水中加入0.01%的硫柳汞抑菌，再12000g离心2次，以除去细胞碎片和脂类，分装，-70°C保存。
（4）腹水的检验
）纯度检验取5μL腹水样品进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色检验其纯度，合格腹水应为27KD和52KD2条蛋白条带。蛋白密度扫描两条链（重链和轻链）的含量应占总蛋白量的80%以上。
2）效价检验用cELISA（见附注3）检测腹水的效价。酶标仪测定OD450nm，按公式计算抑制率，确定腹水的效价。抑制率（%）（PI）=（未抑制空白照OD450nm－检测样品OD450nm）/未抑制空白照OD450nm×100%。当腹水的PI≥30%时的最大稀释倍数即为腹水效价。效价应大于1:400。
（5）单克隆抗体的纯化与检验
1）单抗腹水的纯化取经效价检测合格的腹水，采用沉淀法纯化单抗腹水。先后加入浓度为0.2mol/L NaCl和25mmol/L的CaCl2。滤纸过滤，加入100倍体积灭菌纯水置于4℃对滤液进行透析8～15h，换水1～2次。然后将滤液以22000g离心30min，弃上清；将沉淀溶于含有1mol/L NaCl的0.1moL/L Tris-HCl溶液中（pH8.0），重复上述的透析与离心1次；将沉淀的蛋白浓度调至5～10mg/mL。取5μL纯化的单克隆抗体进行SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色检测抗体的纯度，应≥95%。
2）按cELISA方法检测效价。效价为阻断率PI≥30%时单克隆抗体的最高稀释倍数，腹水效价≥1:800为合格。
3）分装与冻干以冷冻干燥保护剂（见附注4）作为稀释液，将经检验纯度合格的单抗按测定的效价，进行稀释至效价为1∶5。稀释后的单克隆抗体按每瓶1mL剂量进行分装，冻干。
附图说明
图1猪布鲁氏菌S1330的PCR鉴定图中，1:DNAMarker；2:大肠杆菌阴性对照；3:S2菌株的PCR扩增。
本发明涉及的微生物资源信息
猪种布鲁氏菌S2株（B.suis S2），该菌株为动物布鲁氏菌活疫苗的生产菌株，中国兽医药品监察所保藏，编号为：CVCC70502（中国兽医药品监察所，中国兽医微生物菌种保藏管理中心，中国兽医菌种目录第二版，中国农业科学技术出版社，2002，p35）;一株只与布鲁氏菌有凝集反应，而与耶尔森氏菌O9和大肠杆菌O157（H7型）无凝集反应的单克隆抗体细胞株，命名为3E4株，该布鲁氏菌单克隆抗体细胞株已于2013年05月31日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所内中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.7706。
本发明的优点
本发明利用我国独有的、且对猪、牛、羊均具有良好的抗原性猪种布鲁氏菌S2株提取脂多糖(LPS)作为包被抗原，利用本发明筛选的布鲁氏菌特异性单克隆抗体3E4株（该单克隆抗体与耶尔森氏菌O9和大肠杆菌O157无反应），建立了布鲁氏菌病竞争ELISA检测方法。该试剂盒能同时对猪、牛、羊布病进行高通量检测，且克服了现有布病cELISA诊断方法不能有效区分耶尔森氏菌O9和大肠杆菌O157感染的技术弱点，是目前动物布病检测中特异性和敏感性均非常理想的检测试剂盒，为我国布鲁氏菌病病防控提供了新的技术手段。
实施例
实施例1
——试剂盒的组装
抗原包被板的制备用0.05mo1/L碳酸盐缓冲液（pH9.6，含体积比0.01%的硫柳汞）将LPS抗原稀释成1μg/ml，按100/μl孔包被酶标板（Corning），2～8°C包被18h以上。弃去孔中的抗原包被液，再用5%明胶（含0.01%的硫柳汞）封闭（溶于PBS，pH7.4），100μL/孔，37°C作用2h。
干燥弃去封闭液后37°C干燥2h，加干燥剂一起放入锡伯袋中，抽真空密封。
保存2～8°C保存，有效期暂定为12个月。
抗原包被板的检验包装袋封闭良好，孔底清洁透明，无异物。
试剂盒组份的分装
将强阳性对照血清、弱阳性对照血清、阴性对照血清（中国兽医药品监察所提供），布鲁氏菌单克隆抗体3E4（中国兽医药品监察所提供），HRP标记山羊抗鼠IgG（Sigma,Lot：A4416-1），PBS-Tween洗涤液（20×），底物显色液和终止液分装成试剂盒所用剂量。
将试剂盒组装将上述组份按每个试剂盒数量装载瓶数放入试剂盒塑料支架。将封板膜、冷冻干燥的单克隆抗体和说明书放入试剂盒，贴好外标签和侧标签。
将检验合格的各试剂盒组份按下表1组装成试剂盒。
表1本发明所涉及试剂盒的组分
| （1）抗原包被板 | 2块（96孔/块） |
| （2）强阳性对照血清 | 1管（100μL/管） |
| （3）弱阳性对照血清 | 1管（100μL/管） |
| （4）阴性对照血清 | 1管（100μL/管） |
| （5）布鲁氏菌单克隆抗体3E4 | 2瓶（1mL/瓶） |
| （6）HRP标记山羊抗鼠IgG | 1瓶（30mL/瓶） |
| （7）底物显色液 | 1瓶（20mL/瓶） |
| （8）终止液 | 1瓶（20mL/瓶） |
| （9）PBS-Tween洗涤液（20×） | 1瓶（100mL/瓶） |
| （10）封板膜 | 4张 |
| （11）说明书 | 1份 |
实施例2
————试剂盒敏感性试验
将阳性参考血清1:2连续倍比稀释到1:32后，每稀释度分别取50μL加到抗原包被孔中，再加入50μL按试剂盒要求稀释的单克隆抗体。阳性参考血清1:32倍稀释后其抑制率（PI）均≥30%。同时设强阳性血清对照、弱阳性血清对照、阴性血清对照和血清空白对照。每个样品均作2个平行孔。强阳性对照血清PI均在80%～110%；弱阳性对照血清PI均在30%～70%；阴性对照血清PI均在10%～15%，空白对照OD450nm在0.75～2.0之间。
将10份布鲁氏菌阳性参考血清倍比稀释后，分别对实验室试制的布鲁氏菌抗体cELISA检测试剂盒进行敏感性试验，结果本发明所制备的cELISA试剂盒对阳性参考血清检出阳性的最大稀释倍数均为640～1280倍（表2），表明试制的试剂盒具有良好的敏感性，符合临床诊断试剂盒要求。
表2cELISA试剂盒对不同稀释度阳性参考血清的检测结果
实施例3
————试剂盒特异性试验
以小肠结肠炎耶尔森菌O:9（Y.E.O:9）、沙门氏菌（S.E.）045-2（D群）、C500（C1群）、AE616（B群）、乙型副伤寒杆菌（S.paratyphiB）及大肠杆菌O:157（933株）阳性血清，以及阴性参考血清30份，作为检测样品进行cELISA，验证其特异性。其中小肠结肠炎耶尔森菌O:9（Y.E.O:9）、沙门氏菌（S.E.）045-2（D群）、C500（C1群）、AE616（B群）、乙型副伤寒杆菌（S.paratyphi B）及阴性参考血清30份由中国兽用药品监察所细菌制品检测室提供，大肠杆菌O:157（933株）阳性血清由扬州大学兽医学院高菘教授提供。
结果本发明所制备的试剂盒检测小肠结肠炎耶尔森菌O:9的阳性血清，及大肠杆菌O:157阳性血清，其PI均小于6%；检测沙门氏菌（S.E.）045-2（D群）、C500（C1群）、AE616（B群）及乙型副伤寒杆菌（S.paratyphi B）PI均小于10%；检测牛布鲁氏菌阳性血清时PI均大于80%，全部为阳性（表3）；检测牛阴性血清的PI均小于3%，全部为阴性（表4）。同时比对的2个不同厂家生产的布病cELISA试剂盒却不能有效区分耶尔森菌O:9的阳性血清，及大肠杆菌O:157阳性血清（结果见表5、表6）。本研究结果表明，基于布病特异性单克隆抗体3E4所建立的cELISA抗体检测试剂盒能够有效的排除由小肠结肠炎耶尔森O:9，大肠杆菌O157及其它革兰氏阴性细菌导致的假阳性反应，说明试制的抗体cELISA检测试剂盒具有良好的特异性，可以用于布鲁氏菌抗体的临床检测。
表3本申请研发的cELISA检测试剂盒特异性试验检测结果
注：PI=100—（检测样品或对照样品平均OD450nm×100）／空白照OD450nm
表4cELISA检测试剂盒对30份阴性参考血清检测结果
| 血清编号 | 测定结果 | 血清编号 | 测定结果 | 血清编号 | 测定结果 |
| 1 | － | 11 | － | 21 | － |
| 2 | － | 12 | － | 22 | － |
| 3 | － | 13 | － | 23 | － |
| 4 | － | 14 | － | 24 | － |
| 5 | － | 15 | － | 25 | － |
| 6 | － | 16 | － | 26 | － |
| 7 | － | 17 | － | 27 | － |
| 8 | － | 18 | － | 28 | － |
| 9 | － | 19 | － | 29 | － |
| 10 | － | 20 | － | 30 | － |
| 阳性对照 | 0.112 | 阴性对照 | 1.363 | —— | —— |
表5商品化cELISA检测试剂盒（1）特异性试验检测结果
注：PI=100—（检测样品或对照样品平均OD450nm×100）／空白照OD450nm
表6商品化cELISA检测试剂盒（2）特异性试验检测结果
注：PI=100—（检测样品或对照样品平均OD450nm×100）／空白照OD450nm
附注
1.iELISA方法
将纯化的LPS抗原用0.05M的碳酸盐缓冲液稀释成1μg/mL，按100μL/孔包被96孔酶标板（Corning，2592），4℃作用18h以上。按100μL/孔加入5%明胶37°C封闭2h。弃去包被液，加入200μL1×PBS-Tween洗涤液洗板4次。取1:3200稀释的ELISA强阳性参考血清、1:3200稀释的弱阳性参考血清和1:100稀释的阴性血清各100μL加入孔中，做一个平行孔，室温作用45min。弃去液体，加入200μL1×PBS-Tween洗涤液洗板4次，每次3min。加HRP标记抗牛二抗（A9425，Sigma）1:10000稀释，每孔100μL。室温孵育45min。弃去液体，加入200μL1×PBS-Tween洗涤液洗板4次，每次3min。加底物显色液（860336，Sigma），每孔50μL，室温避光反应5～10min。
2.细胞计数
将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。静置3min。镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：细胞数/ml＝4大格细胞总数/4×10000。注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。
3.cELISA方法及步骤
取包被并经检验合格的LPS抗原稀释成1μg/ml，包被96孔酶标ELISA板（Corning），100μl/孔。18h后，用5%明胶（Sigma）封闭（溶于PBS，pH7.4），100μL/孔，37°C作用2h。洗涤4次。将腹水/上清/单抗连续倍比稀释后，每个稀释度取100μL（作2孔重复）加入孔中。然后每孔立即加入1:10稀释的布鲁氏菌OIE强阳性标准血清50μL，室温孵育45min。清洗（方法同上）4次后，将HRP标记山羊抗鼠IgG（Sigma）1:10000稀释，每孔加入每孔100μL，37°C孵育45min，再洗涤4次。加入底物显色液（TMB860336，Sigma）50μL，显色5～10min后，加入终止液（0.5M H2SO4）50μL。同时设布鲁氏菌OIE弱阳性标准血清、OIE阴性标准血清对照。另设不加腹水/上清/单抗的空白对照。酶标仪测定OD450nm，按公式计算抑制率，确定腹水的效价。抑制率（%）（PI）=（未抑制空白照OD450nm－检测样品OD450nm）/未抑制空白照OD450nm×100%。当腹水/上清/单抗的PI≥30%时的最大稀释倍数即为腹水/上清/单抗效价。
4.冷冻干燥保护剂配方：单克隆抗体溶于PBS（pH=7.4），每ml其中含有10%甘露醇，1.5%甘氨酸，1%葡萄糖，1%BSA。
Claims (2)
1.一种动物布鲁氏菌病的竞争ELISA诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒主要含有：猪种布鲁氏菌S2株LPS抗原包被板，特异性布鲁氏菌单克隆抗体3E4，其中：
(1)该试剂盒中使用的包被抗原为猪种布鲁氏菌S2株提取的LPS，该LPS对猪、牛、羊布鲁氏菌病的病原菌具有良好的敏感性，提高了试剂盒检测的敏感性；
(2)该试剂盒中使用了特异性布鲁氏菌株单克隆抗体3E4，该单克隆抗体能够能特异性识别布鲁氏菌脂多糖，能有效排除小肠结肠炎耶尔森氏菌O9和大肠杆菌O157对布鲁氏菌病检测的干扰；制备布鲁氏菌株单克隆抗体3E4的布鲁氏菌单克隆抗体3E4细胞株已于2013年05月31日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所内中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.7706。
2.权利要求1所述动物布鲁氏菌病的竞争ELISA诊断试剂盒的应用，其特征在于使用该试剂盒能对猪、牛和羊布布鲁氏菌病进行高通量检测。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310213811.5A CN103278635B (zh) | 2013-05-31 | 2013-05-31 | 动物布鲁氏菌病竞争elisa 抗体检测试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310213811.5A CN103278635B (zh) | 2013-05-31 | 2013-05-31 | 动物布鲁氏菌病竞争elisa 抗体检测试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103278635A CN103278635A (zh) | 2013-09-04 |
| CN103278635B true CN103278635B (zh) | 2014-10-22 |
Family
ID=49061214
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310213811.5A Expired - Fee Related CN103278635B (zh) | 2013-05-31 | 2013-05-31 | 动物布鲁氏菌病竞争elisa 抗体检测试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103278635B (zh) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103995123B (zh) * | 2014-06-16 | 2016-08-17 | 扬州大学 | 检测布氏杆菌抗体的一种elisa试剂盒的制备方法与应用 |
| CN105067812A (zh) * | 2015-08-06 | 2015-11-18 | 中国兽医药品监察所 | 牛布鲁氏菌间接elisa抗体检测试剂盒 |
| CN105137073A (zh) * | 2015-08-06 | 2015-12-09 | 中国兽医药品监察所 | 牛布鲁氏菌胶体金抗体检测试纸条 |
| CN105445473B (zh) * | 2015-11-13 | 2017-11-03 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种牛布鲁氏菌elisa检测试剂盒 |
| CN106771208A (zh) * | 2016-11-10 | 2017-05-31 | 中国兽医药品监察所 | 布鲁氏菌抗体检测试纸条 |
| CN112300254B (zh) * | 2020-11-05 | 2022-08-19 | 中国动物卫生与流行病学中心 | 一种布鲁氏菌病诊断用多肽及其应用 |
| CN113092755A (zh) * | 2021-05-18 | 2021-07-09 | 中国兽医药品监察所 | 一种夹心法检测布鲁氏菌抗原的胶体金检测试纸条 |
| CN115541887A (zh) * | 2022-08-02 | 2022-12-30 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 一种检测牛布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法及应用 |
| CN115267203A (zh) * | 2022-08-02 | 2022-11-01 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 一种检测羊布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法及应用 |
| CN116083502A (zh) * | 2022-12-19 | 2023-05-09 | 岭南现代农业科学与技术广东省实验室肇庆分中心 | 用于布鲁氏菌检测的抗原及其制备方法、应用 |
| CN116121199B (zh) * | 2022-12-27 | 2024-06-21 | 岭南现代农业科学与技术广东省实验室肇庆分中心 | 布鲁氏菌单克隆抗体6a5及其应用、试剂盒 |
| CN117405884B (zh) * | 2023-08-14 | 2024-05-17 | 珠海朗泰生物科技有限公司 | 一种羊全血布鲁氏菌检测试剂盒 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101037663A (zh) * | 2006-09-08 | 2007-09-19 | 中国兽医药品监察所 | 一种利用基因重组技术获得粗糙型布氏杆菌及其疫苗的生产方法 |
| CN101581726A (zh) * | 2009-03-26 | 2009-11-18 | 张晓艳 | 新一代布鲁氏菌病抗体竞争酶联免疫吸附试验检测试剂盒 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2646944A1 (en) * | 2007-11-30 | 2009-05-30 | Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Minister Of National Defence | Serum components that bind to threat agents |
| KR101024365B1 (ko) * | 2009-03-31 | 2011-03-23 | 와토스코리아 주식회사 | 양변기 필밸브의 림측급수관 물량조절밸브 |
-
2013
- 2013-05-31 CN CN201310213811.5A patent/CN103278635B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101037663A (zh) * | 2006-09-08 | 2007-09-19 | 中国兽医药品监察所 | 一种利用基因重组技术获得粗糙型布氏杆菌及其疫苗的生产方法 |
| CN101581726A (zh) * | 2009-03-26 | 2009-11-18 | 张晓艳 | 新一代布鲁氏菌病抗体竞争酶联免疫吸附试验检测试剂盒 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| 光滑型布鲁氏菌LPS单克隆抗体的制备及竞争ELISA方法的建立;王加兰;《中国硕士论文数据库》;20091231;全文 * |
| 光滑型布鲁氏菌LPS单克隆抗体的制备及鉴定;王加兰等;《中国预防兽医学报》;20090831;第31卷(第8期);642-649 * |
| 布鲁氏菌特异性单克隆抗体的研制和抗原捕捉ELISA方法的建立;梅建军;《农业科技辑》;20060930;D050-44 * |
| 梅建军.布鲁氏菌特异性单克隆抗体的研制和抗原捕捉ELISA方法的建立.《农业科技辑》.2006,D050-44. |
| 王加兰.光滑型布鲁氏菌LPS单克隆抗体的制备及竞争ELISA方法的建立.《中国硕士论文数据库》.2009,全文. |
| 王加兰等.光滑型布鲁氏菌LPS单克隆抗体的制备及鉴定.《中国预防兽医学报》.2009,第31卷(第8期),642-649. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103278635A (zh) | 2013-09-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103278635B (zh) | 动物布鲁氏菌病竞争elisa 抗体检测试剂盒 | |
| FORGIE et al. | Etiology of acute lower respiratory tract infections in Gambian children: II. Acute lower respiratory tract infection in children ages one to nine years presenting at the hospital | |
| Barnes et al. | Etiology of acute gastroenteritis in hospitalized children in Melbourne, Australia, from April 1980 to March 1993 | |
| Bonfini et al. | Cross-reactivity in serological tests for brucellosis: a comparison of immune response of Escherichia coli O157: H7 and Yersinia enterocolitica O: 9 vs Brucella spp. | |
| CN105067812A (zh) | 牛布鲁氏菌间接elisa抗体检测试剂盒 | |
| Escobar et al. | Etiology of respiratory tract infections in children in Cali, Colombia | |
| CN106556701B (zh) | 羊布鲁氏菌间接elisa抗体检测试剂盒 | |
| CN104007269A (zh) | 一种鸭疫里默氏杆菌间接血凝抗体检测试剂盒及其应用 | |
| CN105137073A (zh) | 牛布鲁氏菌胶体金抗体检测试纸条 | |
| CN106771182A (zh) | 牛布鲁氏菌IgM亚型抗体间接ELISA检测试剂盒 | |
| CN104789500A (zh) | 一种鸡白痢染色凝集抗原及其制备方法和应用 | |
| CN106596958B (zh) | 布鲁氏菌病cf-elisa抗体检测试剂盒 | |
| CN107446851A (zh) | 一种鸡白痢凝集抗原及其制备方法 | |
| CN106771208A (zh) | 布鲁氏菌抗体检测试纸条 | |
| CN105784999A (zh) | 结核菌群的免疫学检测方法和试剂盒 | |
| CN105158463A (zh) | 羊布鲁氏菌胶体金抗体检测试纸条 | |
| CN103837684A (zh) | 快速检测沙门氏菌的抗体试剂及检测方法 | |
| KhoSrAvi et al. | Prevalence of Escherichia coli O157: H7 in children with bloody diarrhea referring to Abuzar teaching hospital, Ahvaz, Iran | |
| CN102304585A (zh) | 金黄色葡萄球菌免疫捕捉pcr的检测试剂盒和试剂盒使用方法 | |
| Safiulah et al. | Laboratory methods for diagnosing leptospirosis: a review | |
| Miao et al. | The development and application of a blocking ELISA kit for the diagnosis of infectious coryza | |
| CN103869084A (zh) | 抗牛γ干扰素双抗体夹心ELISA试剂盒及其制备方法 | |
| CN106353496A (zh) | 布鲁氏菌荧光偏振（fpa）检测试剂盒 | |
| Manimaran et al. | Development of a promising agglutination based diagnostic kit for detection of Mycoplasma gallisepticum (MG) infection in chickens | |
| CN101846681A (zh) | 动物布鲁氏菌病荧光偏振检测法-fpa抗体检测试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20141022 |