CN103275889A - 短短芽孢杆菌菌株产羟苯乙酯的发酵培养基及发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种短短芽孢杆菌菌株产羟苯乙酯的发酵培养基，并揭露了简单且易于操作的发酵方法，其中，短短芽孢杆菌菌株为短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX；发酵培养基的组分：豆饼粉25.18g/L，DL-苹果酸29.68g/L，NaCl 13.18g/L，蛋白胨2g/L，超纯水配制，pH7.0。本发明对短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX的发酵条件进行优化，从而提高短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX产羟苯乙酯的能力，为羟苯乙酯的分离纯化、大批量生产及工业发酵生产的开发奠定了基础；进而能够避免现有化工合成制备羟苯乙酯时对环境所造成的污染。
Description
【技术领域】
本发明涉及微生物工程技术领域，尤其涉及一种短短芽孢杆菌菌株产羟苯乙酯的发酵培养基及发酵方法。
【背景技术】
世界上已报道的微生物产生的生物活性物质已超过万余种，其中约有二百余种已在医药、工业、农业、畜牧、养殖、食品保藏与科学研究等领域广泛应用，发挥着重要的社会效益。微生物生物活性物质包括抗生素和非抗生素生物活性物质，每年发现近百个新微生物活性物质，其中新的非抗生素生物活性物质逐年增多，并在数量上超过抗生素。
短短芽孢杆菌是一类革兰氏染色阳性或可变、菌体杆状、以周生鞭毛运动、产芽孢的一类细菌。据报道，短短芽孢杆菌产生的短杆菌素一般由九种核糖体产生的线状短杆菌肽和二十八种以上非核糖体产生的短杆菌酪肽和tryptocidines组成，这些蛋白往往具有不同的生物活性（Rautenbach等）；但目前却未见短短芽孢杆菌产羟苯乙酯的相关报道。羟苯乙酯（CAS120-47-8）为白色结晶性粉末、无臭或有轻微的特殊香气、味微苦、灼麻；其对真菌的抑菌效果较强，但对细菌的抑菌效果较弱，用作抑菌防腐剂，广泛用于液体制剂、半固体制剂以及食品和化妆品的防腐，也用于饲料防腐剂。目前，羟苯乙酯的生产和制备均大多采用化学合成的方式进行工业化生产，造成污染严重。
因此，若能够采用短短芽孢杆菌生产羟苯乙酯，有望避免现有化工合成制备羟苯乙酯时对环境所造成的污染。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题之一在于提供一种短短芽孢杆菌菌株产羟苯乙酯的发酵培养基。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题之一的：
一种短短芽孢杆菌菌株产羟苯乙酯的发酵培养基，该发酵培养基的组分：豆饼粉25.18g/L，DL-苹果酸29.68g/L，NaCl13.18g/L，蛋白胨2g/L，超纯水配制，pH7.0。
本发明所要解决的技术问题之二在于提供一种短短芽孢杆菌菌株产羟苯乙酯的发酵方法。
本发明所要解决的技术问题之二在于提供一种短短芽孢杆菌菌株产羟苯乙酯的发酵方法，其操作如下：将短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX的种子液按2%接种量接种至250mL锥形瓶中，且该锥形瓶内装有100mL已消毒灭菌的权利要求1中所述的发酵培养基；之后将所述锥形瓶置于恒温摇床上进行发酵培养即可，培养温度35℃、摇床转速170r/min、培养时间24h。
进一步地，发酵培养基是置于120℃下消毒灭菌30min。
本发明的有益效果在于：对短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX的发酵条件进行优化，从而提高短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX产羟苯乙酯的能力，不仅增添了新的产高效抑菌活性物质羟苯乙酯菌种研究资料，而且为羟苯乙酯的分离纯化、大批量生产及工业发酵生产的开发奠定了基础；进而能够避免现有化工合成制备羟苯乙酯时对环境所造成的污染。
【附图说明】
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。
图1是本发明中不同碳源对菌株FJAT-0809-GLX产羟苯乙酯的影响图。
图2是本发明中不同氮源对菌株FJAT-0809-GLX产羟苯乙酯的影响图。
图3是本发明中不同无机盐对菌株FJAT-0809-GLX产羟苯乙酯的影响图。
图4是本发明中回归模型响应面的立体分析图。
【具体实施方式】
本发明中“短短芽孢杆菌菌株”指的是本申请人于2010年09月29日申请的中国发明申请号为CN201010296437.6、名称为“一种新的短短芽孢杆菌菌株及其应用”中所揭露的“短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX”，其于2010年08月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，且保藏编号为CGMCC No.4115。另外，车建美等发表的文章“龙眼保鲜功能微生物FJAT-0809-GLX（Brevibacillus brevis FJAT-0809-GLX）功能成分的分析”（福建农业学报，2012，27（10）：1106-1111）中报道了短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX具有广谱抑菌性，经分离与鉴定，其主要功能成分是羟苯乙酯；从而说明了菌株能产羟苯乙酯。且为了方便阐述，以下将该短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX简称为菌株FJAT-0809-GLX。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌株：短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX。
1.1.2 主要试剂及仪器：安捷伦自动进样高效液相色谱***；恒温培养振荡器ZHWY-2102C；羟苯乙酯标准品购于美国sigma公司，纯度≥99%；超纯水由Miliipore-system制取。
1.1.3 培养基：
种子培养基：牛肉膏3.0g/L，蛋白胨10.0g/L，葡萄糖10.0g/L，pH7.2-7.4；
发酵培养基：可溶性淀粉8.0g/L，豆饼粉30.0g/L，蛋白胨2.0g/L，蔗糖2.0g/L，CaCl25.0g/L，超纯水配置，pH7.1-7.2。
以上培养基在配制完成后，均需在120℃高压灭菌30min。
1.2 方法
1.2.1 菌株FJAT-0809-GLX发酵液羟苯乙酯待测溶液的制备
（1）制备菌株FJAT-0809-GLX的发酵液：将菌株FJAT-0809-GLX进行活化以获得菌株FJAT-0809-GLX的单菌落，之后将该菌株FJAT-0809-GLX的单菌落接种于100mL的种子培养基中，并将其置于恒温振荡摇床中培养24h，温度30℃，转速180rpm/min；将获得的菌株FJAT-0809-GLX的种子液按2%接种量接种至250mL锥形瓶中，且该锥形瓶内装有100mL已消毒灭菌的发酵培养基；之后将该锥形瓶置于恒温摇床上进行发酵培养即可，培养温度30-35℃、摇床转速160-170r/min、培养时间24h。
（2）羟苯乙酯待测溶液的制备：取菌株FJAT-0809-GLX的发酵液5mL置于50mL具塞离心管中，并加入20mL乙醇-水-冰醋酸（体积比为70:29.5:0.5）混合液，之后水浴超声波辅助提取15min，接着将提取获得的提取液置于4000r/min下离心10min，离心结束后采用所述混合液将提取液定容至50.0mL，过滤，取25mL上清液上样于已预先用10mL甲醇、10mL蒸馏水活化处理过的固相萃取柱，保持自然流速过柱，用10mL蒸馏水冲洗柱子，抽干，再以3.0mL甲醇洗脱小柱，控制液体流速不超过1mL/min，收集洗脱液，用甲醇定容至5.0mL，经0.22μm细菌过滤器过滤作为待测溶液，供高效液相色谱仪测定。
1.2.2 菌株FJAT-0809-GLX发酵液羟苯乙酯的高效液相色谱检测
采用C18色谱柱进行测定上述制备的羟苯乙酯待测溶液；流动相为甲醇-水（体积比为65:35），流速1.0mL/min，检测波长为254nm，测定温度为25℃，进样量10μL。根据样品的保留时间和色谱峰图进行定性分析，根据其峰面积进行定量分析。
1.2.3 短短芽孢杆菌FJAT-0809-GLX发酵条件的优化
（1）单因素试验
在发酵培养基基础上，分别改变碳源、氮源和无机盐的类型测定发酵液中羟苯乙酯的含量，每组设置3个重复。
（2）响应面优化确定最优发酵条件
Plackeet-Burman试验：将初始发酵条件：温度（A）、pH（B）、转速（C）、通气量（D）、DL-苹果酸（E）、蛋白胨（F）、Nacl（G）、接种量（H）。分别作为试验设计的8个因素，每个因素取2水平，低水平（-1）为初始发酵培养基的各因素取值，测定羟苯乙酯的含量。
最陡爬坡试验：根据Plackett-Burman试验筛选出的对短杆菌素产量影响显著的因素，以各显著因素的正负效应及效应大小来确定最陡爬坡试验的路径（包括变化方向和变化步长），快速的逼近最大响应区域。
中心组合设计与响应面分析：以Plackett-Burman试验筛选得到的对产物含量影响显著的因素作为设计因素，以最陡爬坡试验得出的因素取值作为中心点，使用Minitab15．0软件进行试验设计，并对试验结果进行响应面分析。即采用多元二次回归方程来拟合表达因素与响应值之间函数关系的回归方程，并通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，确定关键因素的最佳水平。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
固定氮源为蛋白胨，分别对8种（葡萄糖、可溶性淀粉、乳糖、麦芽糖、甘油、DL-苹果酸、蔗糖、甘露醇）不同的碳源进行尝试，测算出羟苯乙酯含量如图1所示。由图1可知，对8种不同的碳源进行单因素测定发酵液中羟苯乙酯含量，发现DL-苹果酸作为碳源时发酵液中羟苯乙酯含量最高，达到4.58mg/mL，因而选用DL-苹果酸作为碳源。
固定碳源为DL-苹果酸，分别对8种（酵母浸膏、蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、草酸铵、硫酸铵、营养肉汤）不同的氮源进行尝试，测算出羟苯乙酯含量如图2所示。由图2可知，对8种不同的氮源进行单因素测定发酵液中羟苯乙酯含量，发现蛋白胨作为氮源时发酵液中羟苯乙酯的含量最高，达到4.58mg/mL，因而选用蛋白胨作为氮源。
固定碳源为DL-苹果酸、氮源为蛋白胨，分别对8种（Cacl2、MgSO4、Nacl、K2HPO4、KH2PO4、Mncl2、NaCO3、FePO4)不同的无机盐进行尝试，测算出羟苯乙酯含量如图3所示。由图3所示，对8种不同的无机盐进行单因素测定发酵液中羟苯乙酯含量，发现Nacl作为无机盐时羟苯乙酯含量最高，达到3.61mg/mL，因此选择Nacl作为无机盐进行下一步的研究。
2.2 响应面优化确定最优发酵条件
2.2.1 影响因素的筛选
用Minitab软件设计8因素2水平的Plackett—Burman试验方案。按照试验设计，在发酵结束时，制备羟苯乙酯待测溶液并取样进高效液相色谱测定样品的峰面积。测算出羟苯乙酯含量。Plackett—Burman试验设计方案及相应羟苯乙酯含量见下表1，且Plackett—Burman试验因素水平及效应值见表2。
表1Plackett-Burman试验设计及结果
注：表1中，A：温度（0C）、B：转速（rmp）、C：豆饼粉（g/L）、D:通气量（mL）、E：DL-苹果酸（g/L）、F：蛋白胨（g/L）、G：Nacl（g/L）、H：接种量（%）。
由表1可以看出，不同的因素组合，发酵所产生的羟苯乙酯含量是不同的。
表2Placekett-Burman试验因素水平及效应值
由表2可知，豆饼粉、DL-苹果酸和Nacl作为重要影响因子的可信度大于90%，对发酵液中羟苯乙酯的含量影响显著；其中DL-苹果酸、Nacl的浓度对羟苯乙酯的含量是正效应，而豆饼粉浓度的影响是负效应。
2.2.2中心试验点的确立
通过Plackett-Burman试验结果设计最陡爬坡试验路径。根据3个因素效应大小的比例，设定它们的变化方向及步长设计试验，按一定的梯度增加DL-苹果酸Nacl和在发酵液中的浓度，同时再按一定的梯度减少豆饼粉在发酵液中的浓度，其余5个因素均取初始值，检测最终发酵液羟苯乙酯含量的变化，从而确定此3因素的最适浓度范围。最陡爬坡试验路径的设计及结果如表3所示。
表3最陡爬坡试验设计及结果
从表3可以看出，随着豆饼粉、DL-苹果酸和Nacl浓度的变化，发酵液中羟苯乙酯的含量先上升后下降，当豆饼粉、DL-苹果酸和Nacl的浓度分别为23.5g/L、28g/L、11.5g/L时，所对应的发酵液中的羟苯乙酯含量达到最大即7.16mgm/L，因此以该浓度为中心点，进行下一步优化试验。
2.2.3最佳发酵培养基的确定
以豆饼粉、DL-苹果酸和Nacl3个重要因素为自变量，进行中心组合试验设计各因素编码水平、真实值及结果。中心组合试验设计及结果见表4。对回归结果进行方差分析（其结果见表6），对于二次多项式各项对响应值的影响大小用t检验评价，且回归系数见表5。从表5可以看到，在模型各参数中，除NaCl一次项以及酪蛋白胨，NaCl及酵母浸粉两两之间的交互项，其他各项对产物含量均有较显著的影响（可信度>90％）。需要说明的是，表4中的“C、E、G”及表5中的“A、B、C”与上述表2中相应字母所代表的是一样的。
表4中心组合试验设计及结果
表5回归系数表
表6回归模型的方差分析
结合表4至表6，尤其是表5、表6的分析，建立回归方程，回归方程为：
Y=8.3408+0.09898A-0.01395B+0.1385C-0.07031A*A-0.19583B*B-0.12865C*C+0.05250A*B+0.09250A*C+0.10250B*C。
高模型决定系数R2=0.9659，表明该模型能解释96.59%产物的含量的变化，回归拟合程度较好，可以用此模型对发酵液中羟苯乙酯的含量进行预测。利用minitab软件对回归模型进行响应面分析，得到个响应面的立体分析图，如图4所示。
由图4响应面图分析可知，响应面呈现凸面状，证明存在最佳的培养条件。通过对岭脊分析当豆饼粉、DL-苹果酸和Nacl的质量浓度分别为25.18g/L、29.68g/L、13.18g/L时，响应面值达到最大值，即发酵液中羟苯乙酯质量浓度为8.34mg/mL。
微生物发酵是一个复杂的生理生化过程，当菌体处于不同的营养条件时，会直接影响菌体的生理代谢，从而影响活性物质的产量。要提高菌株FJAT-0809-GLX发酵液中羟苯乙酯的产量，对发酵条件进行优化是必不可少的。本发明对菌株FJAT-0809-GLX的发酵条件进行了优化，通过单因素和响应面法确定了其最佳发酵产羟苯乙酯培养基为：豆饼粉25.18g/L、DL-苹果酸29.68g/L、NaCl13.18g/L、蛋白胨2g/L，超纯水配制，pH7.0；培养条件是：培养温度35℃、摇床转速170r/min、培养时间24h。本发明增添了新的产高效抑菌活性物质羟苯乙酯菌种研究资料，为羟苯乙酯的分离纯化、大批量生产及工业发酵生产的开发奠定了基础；从而能够避免现有化工合成制备羟苯乙酯时对环境所造成的污染。
Claims (3)
1.一种短短芽孢杆菌菌株产羟苯乙酯的发酵培养基，其特征在于：该发酵培养基的组分：豆饼粉25.18g/L，DL-苹果酸29.68g/L，NaCl13.18g/L，蛋白胨2g/L，超纯水配制，pH7.0。
2.一种短短芽孢杆菌菌株产羟苯乙酯的发酵方法，其特征在于：将短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX的种子液按2%接种量接种至250mL锥形瓶中，且该锥形瓶内装有100mL已消毒灭菌的权利要求1中所述的发酵培养基；之后将所述锥形瓶置于恒温摇床上进行发酵培养即可，培养温度35℃、摇床转速170r/min、培养时间24h。
3.根据权利要求2所述的短短芽孢杆菌菌株产羟苯乙酯的发酵方法，其特征在于：所述发酵培养基是置于120℃下消毒灭菌30min。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130904 |