CN103275888A

CN103275888A - 一株草木犀剑菌及其在降解烟碱类杀虫剂噻虫啉中的应用

Info

Publication number: CN103275888A
Application number: CN2013101207993A
Authority: CN
Inventors: 葛峰; 周玲艳; 王颖; 戴亦军; 袁生
Original assignee: Nanjing Normal University
Current assignee: Nanjing Normal University
Priority date: 2013-04-09
Filing date: 2013-04-09
Publication date: 2013-09-04
Anticipated expiration: 2033-04-09
Also published as: CN103275888B

Abstract

本发明公开了具有固氮能力的草木犀剑菌Ensifer melilotiCGMCC7333及其应用。该菌株可降解烟碱类杀虫剂噻虫啉，降解途径为水解噻虫啉生成酰胺噻虫啉。

Description

一株草木犀剑菌及其在降解烟碱类杀虫剂噻虫啉中的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及草木犀剑菌CGMCC7333及其应用于烟碱类杀虫剂噻虫啉的降解。

背景技术

新烟碱类杀虫剂是是继有机磷类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类杀虫剂之后***杀虫剂，主要用于防治刺吸口器和一些咀嚼口器害虫。噻虫啉（分子结构见图1）是一种对刺吸口器害虫高效广谱杀虫剂，对梨果类水果、棉花、蔬菜和马铃薯上的重要害虫有优异的生物活性。目前，噻虫啉在全球50多种农作物上使用，近几年来在我国开始推广和使用。

近几年来，随着害虫对烟碱类杀虫剂的交互耐药性的急剧增加，噻虫啉的施用量和施用频率不断增加，其对生态环境的影响也日益突出。微生物降解法是有机污染物降解的最有效的方法之一。申请人曾报道了红酵母Rhodotorula mucilaginosa IM-2和贪噬菌Variovorax boronicumulans CGMCC4969可降解噻虫啉，这两种菌降解噻虫啉的途径均为水解噻虫啉生成产物酰胺噻虫啉（Dai YJ,Ji WW,Chen T,Zhang WJ,Liu ZH,Ge F,Yuan S(2010)Metabolism of the neonicotinoid insecticides acetamiprid and thiacloprid by the yeast Rhodotorula mucilaginosa Strain IM-2.J Agric Food Chem58:2419–2425；Zhang HJ,Zhou QW,Zhou GC,Cao YM,Dai YJ,Ji WW,Shang GD,Yuan S(2012)Biotransformation of the neonicotinoid insecticide thiacloprid by bacterium Variovorax boronicumulans strain J1and mediation of the major metabolic pathway by nitrile hydratase.J Agric Food Chem60:153–159）。

发明内容

本发明的目的是提供一种可降解烟碱类杀虫剂噻虫啉的细菌菌株及其在噻虫啉微生物降解中的应用，本发明示意图如图1所示。

本发明所提供的菌株为一种草木犀剑菌，命名为SCL3-10菌株，菌种保藏号为CGMCC7333。草木犀剑菌CGMCC7333降解噻虫啉的主要途径为水解噻虫啉生成酰胺噻虫啉。

本发明所提供的草木犀剑菌CGMCC7333是一种固氮菌，在标准固氮培养基上，草木犀剑菌CGMCC7333可生长（如图2所示）。

本发明所提供的草木犀剑菌CGMCC7333具有降解烟碱类杀虫剂噻虫啉的能力；可应用于噻虫啉的微生物降解；其降解噻虫啉过程中，产生主要代谢产物酰胺噻虫啉；噻虫啉降解的高效液相色谱（HPLC）分析和产物的液相色谱质谱联用分析结果分别如图3和图4所示。

本发明所提供的草木犀剑菌CGMCC7333降解噻虫啉的方法为：将草木犀剑菌CGMCC7333在营养培养液中振荡培养24h，离心收集和洗涤菌体；将菌体悬浮于含200mg/L噻虫啉的0.2mol/L,pH7.0的磷酸盐缓冲液中；上述悬浮液于220rpm的摇床中30℃振荡培养。培养12-60h，草木犀剑菌CGMCC7333可降解噻虫啉，生成酰胺噻虫啉。

本发明的新菌株，不仅具有固氮能力，还能生物降解噻虫啉，实验表明该菌株可降解45-87%的噻虫啉，生成0.32-0.60mmol/L酰胺噻虫啉。该菌株既可用作农药降解菌剂，又可用作微生物肥料，因而具有很好的应用前景。

附图说明

图1草木犀剑菌CGMCC7333降解噻虫啉的代谢途径。

图2草木犀剑菌CGMCC7333在固氮培养基上生长图。

图3草木犀剑菌CGMCC7333降解噻虫啉的HPLC图。

图4草木犀剑菌CGMCC7333降解噻虫啉的产物质谱图。

具体实施方式

实施例一：可生物降解噻虫啉的菌株分离筛选、鉴定和生物学特性

1、菌株分离

从江苏南京、苏州和山东荷泽等地采集土壤，取2g土壤加入含5颗玻璃珠的18mL无菌水中，振荡5min，静置5min后，取1ml悬液加入到19ml含200mg/L噻虫啉的矿物盐培养基的100ml三角瓶中。矿物盐培养基的组成为：1.36g/L KH₂PO₄，2.13g/L Na₂HPO₄，0.5g/L MgSO₄·7H₂O和10ml/L金属离子液，pH7.5。金属离子液组成为：0.40g/L CaCl₂·2H₂O,0.30g/L H₃BO₃,0.04g/L CuSO₄·5H₂O,0.10g/L KI,0.20g/LFeSO₄·7H₂O，0.40g/L MnSO₄·7H₂O，0.20g/L NaMoO₄·2H₂O和10.0mL/L浓盐酸。样品于30℃、转速为220rpm的摇床中培养三周。取100μl样品稀释至10^-3和10^-4后，涂布LB平板。LB培养基组成为（g/L）：蛋白胨10.0、酵母膏5.0、NaCl10.0，pH7.2。从LB平板挑取形态不同的菌落划线至新的LB平板上，30℃培养3-5天后，再次进行菌种平板划线纯化。共获得30株形态各异的细菌。

2、菌株降解噻虫啉能力的测定

接种上述纯化菌种至含20mL LB液体培养基的100mL三角瓶中，30℃培养24h后，取5mL菌液装于50mL离心管中，6000g离心10min。倾去上清液，细胞沉淀加入5mL含200mg/L噻虫啉的0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0），220rpm振荡培养24h。安捷伦1200型HPLC仪分析检测噻虫啉含量变化。HPLC条件为：流动相为35%乙腈和65%的含0.01%乙酸的去离子水，流速为1ml/min；HPLC柱为安捷伦HC-C18反相柱（4.6×250mm，5μm），柱温为30℃；检测波长为242nm。在上述HPLC条件下，命名为SCL3-10的菌株具有可将噻虫啉转化为一种极性更大的产物（图3），该产物的HPLC保留时间与酰胺噻虫啉相同，液相色谱质谱联用分析仪检测该产物的分子量为270（图4），与酰胺噻虫啉分子量一致。上述结果表明 SCL03-10菌株可水解噻虫啉生成产物酰胺噻虫啉。

3、SCL3-10菌株的鉴定及生物学特性

在LB固体培养基上，SCL3-10菌落呈白色、光滑、不透明、有粘液、边缘规整。革兰氏阴性。显微镜观察SCL3-10菌体呈杆状，无芽孢；该菌株属化能异养，好氧菌。

采用菌落PCR扩增16S rRNA基因序列并进行SCL3-10菌株的分类学鉴定。从含LB固体培养基上用无菌牙签挑取SCL3-10单菌落，加入20μL无菌水，100℃加热10min。轻微离心后，取5μL作为模板。引物为16S rRNA基因扩增通用引物K1和K2。K1引物序列为：5′-AACTGAAGAGTTTGATCC-3′（SEQ ID No：1），K2引物序列为：5′-TAGGTTACCTTGTTGTTACGACTT-3′（SEQ ID No：2）。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。反应体系：Taq缓冲液(10×)2.5μL、MgCl₂(25mmol/L)1μL、dNTP(2.5mmol/L)2.5μL、K1(50mmol/L)1μL、K2(50mmol/L)1μL、去离子水16.5μL、rTaq酶(2U/μL)0.5μL，共25μL总反应体积。PCR反应条件：95℃预变性5min后，95℃变性1min，59℃退火1min，72℃延伸1min，共25个循环，72℃延伸10min。所得序列由生工生物工程（上海）有限公司测序后，得到的部分16S rRNA基因序列（SEQ ID No：3）在美国国家生物技术信息中心的Genbank数据库中进行blast搜索。比对结果表明SCL3-10菌株与草木犀剑菌Ensifer meliloti亲缘关系最近，相似性达到100%。

SCL3-10菌株于2013年3月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），分类命名为草木犀剑菌Ensifer meliloti，保藏编号为CGMCC7333。

实施例二：草木犀剑菌CGMCC7333固氮测定

将草木犀剑菌CGMCC7333接种到LB平板上，待其长出单菌落后，挑单菌落划线至固氮培养基（Nfb）上，30℃培养。Nfb培养基组成为：KH₂PO₄1.2g/L、K₂PO₄0.8g/L、Glucose5g/L、MgSO₄·7H₂O0.2g/L、NaCl0.2g/L、CaCl₂·2H₂O0.02g/L、FeSO₄·7H₂O0.002g/L、金属离子液2mL。金属离子液组成为：NaMoO₄·2H₂O1.0g/L、MnSO₄·H₂O1.75g/L、H₃BO₃1.4g/L、CuSO₄·5H₂O0.04g/L、ZnSO₄·7H₂O0.12g/L，琼脂20g/L。培养一周后，草木犀剑菌CGMCC7333和阳性对照粘着箭菌Ensifer adhaerens CGMCC6315在固氮培养基上出现非常明显的菌落生长，而阴性对照大肠杆菌DH10B则不生长。上述结果（如图2所示）表明草木犀剑菌CGMCC7333具有固氮能力，是一种固氮菌。

实施例三：草木犀剑菌CGMCC7333降解噻虫啉

取保藏的草木犀剑菌CGMCC7333划线于LB固体培养基上，于30°C培养箱中培养至长出单菌落。挑取单菌落，接种于含25mL LB液体培养基的100mL锥形瓶中，30℃，220rpm下振荡培养24h。以1%的接种量接入含100mL LB液体培养基的500mL锥形瓶中，30℃，220rpm下振荡培养，当OD₆₀₀值达到5时，取5mL菌液于4℃，8000rpm离心5min，收集菌体。菌体用磷酸盐缓冲液（0.2mol/L Na₂HPO₄/KH₂PO₄， pH7.0）洗涤两次后，悬浮于含5mL上述磷酸盐缓冲液50ml的离心管中，加入终浓度为200mg/L的噻虫啉。上述悬浮液于30℃，220rpm摇床振荡培养12h。HPLC分析噻虫啉的降解量和酰胺噻虫啉的生成量，结果显示噻虫啉减少了0.34mmol/L，同时生成0.32mmol/L的酰胺噻虫啉，噻虫啉的降解率为45.0%。

实施例四：

与实例二基本相同，只是降解时间为24h。结果显示，噻虫啉减少了0.49mmol/L，同时生成0.46mmol/L的酰胺噻虫啉，噻虫啉的降解率为64.9%。

实施例五：

与实例二基本相同，只是降解时间为48h。结果显示，噻虫啉减少了0.63mmol/L，同时生成0.59mmol/L的酰胺噻虫啉，噻虫啉的降解率为82.1%。

实施例六：

与实例二基本相同，只是降解时间为60h，结果显示，噻虫啉减少了0.66mmol/L，同时生成0.60mmol/L的酰胺噻虫啉，噻虫啉的降解率为87.0%。

本发明并不仅仅限于上述的实施例。

Claims

1. 一种草木犀剑菌（Ensifer meliloti）SCL3-10，其保藏号为：CGMCC 7333。

2.权利要求1所述的草木犀剑菌CGMCC 7333作为固氮菌的用途。

3.权利要求1所述的草木犀剑菌CGMCC 7333在降解烟碱类杀虫剂噻虫啉中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将草木犀剑菌CGMCC 7333在营养培养液中振荡培养24 h，离心收集和洗涤菌体；将菌体悬浮于含200 mg/L噻虫啉磷酸盐缓冲溶液中，于220 rpm的摇床中30 ℃振荡培养，草木犀剑菌CGMCC 7333可降解噻虫啉，并生成产物酰胺噻虫啉。