CN103275874B - 一种高密度分布式立体电极装置 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高密度分布式立体电极装置，包括电极阵列和电极固定组件，电极阵列固定在电极固定组件上，所述电极阵列包括多个电极，所述多个电极上按时间周期分别施加第一极性的电脉冲和第二极性的电脉冲，其中，所述第一极性的电脉冲对应的电极的周围分布的都是第二极性的电脉冲对应的电极。通过上述方式，本发明提供的一种高密度分布式立体电极装置，所述装置采用分组复用的电极，能够最大程度的弥补立体电极造成的电场不均，能够单次处理毫升级的细胞，在孔板和流式装置中均能使用，能避免了高电压对细胞的伤害，成本低，是一种高通量、高效率的细胞电穿孔装置。

Description

一种高密度分布式立体电极装置
技术领域
本发明涉及细胞电穿孔技术，特别是涉及一种高密度分布式立体电极装置。
背景技术
自从1970年代电穿孔技术就被用于将分子***到动物细胞或植物细胞内，研究者证实，细胞暴露于短暂持续的高压电场中能使胞膜上形成通道，大分子如蛋白质和DNA可通过该通道进入细胞内。这些通道被称为电孔洞，是由高压电场造成的细胞膜局部破裂引起的通透性升高区。这些孔洞的存在时间虽然短暂，但足以满足大分子如质粒DNA分子进入细胞的需要。细胞虽然能够耐受这些孔洞的形成，但如果形成的孔洞过多过大，其产生的过程以及由此导入的分子也可能会杀死细胞。
最早是用最简单的带平行板电容器进行电穿孔，彼此相对的电极之间可产生基本均匀的电场。将准备进行电穿孔的细胞悬液与操作者希望将其导入到细胞内的分子混合置于两个电极之间，在电极上通以一次或多次短时间的高压电场脉冲，从而达到分子通过电穿孔导入到细胞内的效果。但平行板电极之间的间距较大，所需要的电压通常都高达数千伏，无可避免的会产生阴极效应，对细胞产生巨大伤害。
之后出现的平面电极虽然解决了电压过高带来的负面作用，但是每次能够处理的细胞量很小，不适合于高通量的实验操作。立体式电极容易刺入组织和活体，多用于肿瘤或活体组织等临床方向的电穿孔，其电穿孔效率并不高，对于体外的细胞电穿孔如悬浮细胞或贴壁细胞都没有过相关的报道。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种结构简单、易于加工制造的高密度分布式立体电极装置。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种高密度分布式立体电极装置，包括电极阵列和电极固定组件，所述电极阵列固定在所述电极固定组件上，所述电极阵列包括多个电极，所述多个电极上按时间周期分别施加第一极性的电脉冲和第二极性的电脉冲，其中，所述第一极性的电脉冲对应的电极的周围分布的都是第二极性的电脉冲对应的电极。
在本发明一个较佳实施例中，所述电极阵列中的多个电极按正多边形排列，所述电极阵列中相邻的两个电极之间的距离相等。
在本发明一个较佳实施例中，所述电极阵列的形状为由若干等边三角形组成的正六边形，所述电极位于所述等边三角形的顶点上。
在本发明一个较佳实施例中，所述第一极性为正极，所述第二极性为负极。
在本发明一个较佳实施例中，所述第一极性为负极，所述第二极性为正极。
在本发明一个较佳实施例中，所述电极的直径为0.01-1.2mm，所述两个相邻电极中心点之间的距离为0.1-2.4mm，所述电极的个数为大于19根，所述电极的材料为不锈钢。
在本发明一个较佳实施例中，所述电极的直径为0.1-0.4mm，所述两个相邻电极中心点之间的距离为0.2-1.5mm，所述电极的个数为大于36根。
在本发明一个较佳实施例中，所述电极的直径为0.3mm，所述两个相邻电极中心点之间的距离为1mm，所述电极的个数为37根。
在本发明一个较佳实施例中，所述电极固定组件包括固定支撑柱、电极连接板和电极定位板，所述固定支撑柱垂直固定于所述电极定位板上，所述电极连接板将只施加同一极性的电脉冲对应的电极连接到一起，所述电极***到所述电极定位板中。
在本发明一个较佳实施例中，所述电极阵列中的电极分为若干组，所述同一组的电极只施加同一极性的电脉冲，以所述电极阵列的其中一组为正极施加电脉冲，其余组为负极施加电脉冲，再以另一组为正极施加电脉冲，其余组为负极施加电脉冲，如此交替，将得到的电场叠加得到均匀的电场。
本发明的有益效果是：本发明的高密度分布式立体电极装置，所述装置采用分组复用的电极，能够最大程度的弥补立体电极造成的电场不均，能够单次处理毫升级的细胞，在孔板和流式装置中均能使用，电极间距小，所需电穿孔电压就很小，避免了高电压对细胞的伤害，成本低，是一种高通量、高效率的细胞电穿孔装置。
附图说明
图1是本发明高密度分布式立体电极装置一较佳实施例的结构示意图；
图2是图1所述高密度分布式立体电极装置的正视图；
图3是图1所述高密度分布式立体电极装置的俯视图；
图4是图1所述高密度分布式立体电极装置中电极阵列的拓扑结构图；
图5是所述高密度分布式立体电极装置施加电脉冲时的电极分布图；
图6是HEK-293A、Hela、MCF-7、A-375、Neuro-2A、U251、C2C12、3T3-L1、CHO、MDCK、HL-60、HUVEC用所述高密度分布式立体电极装置施加不同电脉冲情况下的电穿孔亮场图和荧光图；
附图中各部件的标记如下：1、电极阵列，2、固定支撑柱，3、螺栓，4、螺母，5、电极连接板，6、电极定位板。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
实施例一：
请参阅图1、图2、图3和图4，本发明提供一种高密度分布式电极装置，包括电极阵列1和电极固定组件，所述电极阵列1固定在所述电极固定组件上。
所述电极阵列1由实心的37根圆柱体电极组成，排列规则为所有的电极排列成正六边形结构，相邻的两个电极之间的间距都相等，以相邻两个电极之间的间距为边长，将正六边形内部分成若干小的等边三角形单元，每个等边三角形的顶点放置一个电极，即所有的电极分为I、II、III 3组，每个等边三角形单元的顶点分别属于I、II、III。
所述电极阵列1的正六边形的内径与多孔板的板孔相匹配，两个相邻电极中心点之间的距离为1mm。两个电极之间的间距影响电穿孔时的电压，可以根据需要调整。在电极***孔板中，离孔板底部的距离为0.1mm-1mm。
所述电极的直径为0.3mm，直径过大或者过小都会影响电穿孔效果。直径过大时，电穿孔的有效电场面积会减少，使能够电穿孔的细胞量减少，不利于高通量的细胞电穿孔。直径过小，电极容易弯曲，使制作成本大大增加。
所述电极的材料可选择任意导电金属和其他导电材料，其中不锈钢电极是作为电极的极好的材料。所述不锈钢材料具有良好的生物兼容性，容易清洗，不易氧化，容易做成较长的电极，能够大批量生产并多次重复使用而不影响其导电特性。
所述电极固定组件包括固定支撑柱2、电极连接板5和电极定位板6，两个电极连接板5分别位于所述电极定位板6的上下部位，再用螺栓3和螺母4将所述固定支撑柱2、所述电极连接板5和所述电极定位板6紧固在一起。
所述固定支撑柱2位于所述高密度分布式立体电极阵列1的四个角，能够与多孔板的板孔之间的间隙相咬合以达到固定所述电极阵列1的作用。所述固定支撑柱2垂直固定于所述电极定位板6上，并能够锁定所述多孔板上特定的孔，使所述电极连接板5和所述多孔板相对固定。
所述固定支撑柱2能够控制电极到所述多孔板底部的间距。由于所述电极比较长，而电穿孔技术对于电极间距精度要求很高，因此在进行电穿孔实验时采用了双层电极连接板5和电极定位板6对所述电极进行定位。由于所述双层电极连接板5和所述电极定位板6的厚度约1cm，能够对所述电极进行长距离的约束和定位，因此能够很准确的控制电极到达孔板底部的位置。所述高密度分布式立体电极装置的支撑结构能够轻松的扩展，可以组成2*2、1*4、12*8等任意组合阵列的电极网络，这样灵活多样的组合能够最大程度的兼容多孔板结构，方便用户使用。
所述电极连接板5将同一组的电极通过焊接方式、导电胶或其他电学连接方式连在一起。可以采用PCB线路板，也可以是任何能够完成规定线路连接的器件。所述电极定位板6用于电极定位，电极细长容易弯曲，使用所述电极定位板6能降低电极间距的不一致性，从而提高电场均匀性。
所述高密度分布式立体电极装置可以为单孔的器件，可以组合成4个一组，也可以96个一组以配合生物常用的多孔板结构，甚至更多来使用。
所述高密度分布式立体电极装置的电穿孔方法为：在电穿孔时先以I作为正极，II、III作为负极施加电脉冲，得到的电场模拟分布如图4中的t1所示，再以II作为正极，I、III作为负极施加电脉冲，得到的电场模拟分布如图4中的t2所示，然后以III作为正极，I、II作为负极施加电脉冲，得到的电场模拟分布如图4中的t3所示。
对于某种特定的细胞，所加电场高于某一阈值的时候，细胞膜会出现开孔。当电场逐渐增加，细胞的死亡率会出现上升。为了保证细胞的高电穿孔率和低死亡率，需要将电场精确控制在电穿孔阈值电场。
图5中的t1、t2、t3三个电场分布图都显示电场不均匀，因而当施加单一组合的脉冲时，必然会有部分细胞所受到的电场高于多数细胞或者低于多数细胞，电穿孔效率不会很高。但当三个不均匀的电场最大场强叠加在一起时，情况却发生了变化。叠加后的电场如图5中Max，可以看出电场在超过90%以上的区域中的电场都是均匀的，这说明在全部区域内的细胞接受到的最高电场是均匀的。因此只要控制所述均匀电场强度为电穿孔的最佳电穿孔电压，整个有效区域内的细胞都能最大程度的进行电穿孔。由此可见，分组复用弥补了单一分组造成的电场不均，提高了电穿孔效率，可以判断这种组合电场的电穿孔效率会比传统电穿孔效率高很多。
所述高密度分布式立体电极装置能够对很多细胞系进行悬浮或者贴壁的电穿孔。我们选用了HEK-293A、Hela、MCF-7、A-375、Neuro-2A、U251、C2C12、3T3-L1、CHO、MDCK、HL-60、HUVEC 12种细胞进行电穿孔，使用GFP分子作为标志物。如果细胞被电穿孔，GFP分子会进入细胞，并且在细胞内合成荧光物质，合成的荧光物质在荧光场下会发出绿色荧光，因此用荧光场中细胞的数量除以整个细胞数量可以得出细胞的电穿孔率，即同等密度细胞的荧光强度越大，电穿孔效率越高。
图6为所述高密度分布式立体电极装置进行生物实验的结果。这12组电穿孔实验结果的图片中，左边为细胞亮场图，表示进行电穿孔的细胞数量。右图为荧光场图，反映细胞电穿孔的情况。通过亮场图和荧光图进行对比，可以得出细胞的存活率和电穿孔效率都可以高达80%以上。
所述高密度分布式立体电极装置能应用在流式装置中。将所述高密度分布式立体电极装置置于流式的环境中，随流动液体均匀分布流动的细胞经过所述电极阵列时，经流速和脉冲刺激的控制，使之接收最佳的电穿孔刺激条件，所述电穿孔刺激条件包括脉冲的电压幅值、脉冲宽度、脉冲间隔、脉冲个数和电极交换控制。在持续流动***中，除了在电极上施加脉冲的时间与细胞在电极之间开始流动的时间需要协调之外，脉冲与细胞流动之间不需要“期间处理”的协调。
所述高密度分布式立体电极装置既有持续流式电穿孔的优点，特别是能在无菌封闭***内对细胞进行高通量电穿孔，又能保证每个细胞都受到最佳次数的脉冲和最均匀的电场，以提高电穿孔的效率，并减少死亡率。
实施例二：
本发明提供一种高密度分布式电极装置，其他结构与实施例一相同，所述电极阵列的排列规则为所有的电极排列成正四边形结构，相邻的两个电极之间的间距都相等，以相邻两个电极之间的间距为边长，将正四边形内部分成若干小的正方形单元，每个正方形的顶点放置一个电极，即所有的电极分为I、II、III、IV 4组，每个正方形单元的顶点分别属于I、II、III、IV，以其中一组的电极作为正极，其余组的电极作为负极，轮流施加电脉冲。
实施例三：
本发明提供一种高密度分布式电极装置，其他结构与实施例一相同，所述电极阵列的排列规则为所有的电极排列成正六边形结构，相邻的两个电极之间的间距都相等，以相邻两个电极之间的间距为边长，将平面成若干小的正六边形单元，每个正六边形单元的顶点放置一个电极，即所有的电极分为I、II、III、IV、V、VI 6组，每个正六边形单元的顶点分别属于I、II、III、IV、V和VI，以其中一组的电极作为正极，其余组的电极作为负极，轮流施加电脉冲。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种高密度分布式立体电极装置， 其特征在于， 包括电极阵列和电极固定组件， 所述电极阵列固定在所述电极固定组件上， 所述电极阵列包括多个电极， 所述多个电极上按时间周期分别施加第一极性的电脉冲和第二极性的电脉冲， 其中， 所述第一极性的电脉冲对应的电极的周围分布的都是第二极性的电脉冲对应的电极，所述电极的直径为0.01-1.2mm， 所述两个相邻电极中心点之间的距离为 0.1-2.4mm。
2.根据权利要求 1 所述的装置， 其特征在于， 所述电极阵列中的多个电极按正多边形排列， 所述电极阵列中相邻的两个电极之间的距离相等。
3.根据权利要求 2 所述的装置， 其特征在于， 所述电极阵列的形状为由若干等边三角形组成的正六边形， 所述电极位于所述等边三角形的顶点上。
4.根据权利要求1所述的装置， 其特征在于， 所述第一极性为正极， 所述第二极性为负极。
5.根据权利要求1所述的装置， 其特征在于， 所述第一极性为负极， 所述第二极性为正极。
6.根据权利要求1-3任一所述的装置， 其特征在于，所述电极的个数为大于 19 根， 所述电极的材料为不锈钢。
7.根据权利要求 6 所述的装置， 其特征在于， 所述电极的直径为 0.1-0.4mm， 所述两个相邻电极中心点之间的距离为 0.2-1.5mm， 所述电极的个数为大于 36 根。
8.根据权利要求 7 所述的装置， 其特征在于， 所述电极的直径为 0.3mm， 所述两个相邻电极中心点之间的距离为 1mm， 所述电极的个数为 37 根。
9.根据权利要求 1-3 任一所述的装置， 其特征在于， 所述电极固定组件包括固定支撑柱、 电极连接板和电极定位板， 所述固定支撑柱垂直固定于所述电极定位板上， 所述电极连接板将只施加同一极性的电脉冲对应的电极连接到一起， 所述电极***到所述电极定位板中。
10.根据权利要求1-3任一所述的装置， 其特征在于， 所述电极阵列中的电极分为若干组， 所述同一组的电极只施加同一极性的电脉冲， 以所述电极阵列的其中一组为正极施加电脉冲， 其余组为负极施加电脉冲， 再以另一组为正极施加电脉冲， 其余组为负极施加电脉冲， 如此交替， 将得到的电场叠加得到均匀的电场。
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