CN103269720A

CN103269720A - 生长激素缀合物

Info

Publication number: CN103269720A
Application number: CN2011800458584A
Authority: CN
Inventors: H.S.安德森; K.马德森; H.德姆思; C.B.席奥特; L.诺斯科夫-劳里森; P.蒂格森; C.贝伦斯; M.古尔布兰特
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk Health Care AG; Novo Nordisk AS
Priority date: 2010-07-22
Filing date: 2011-07-15
Publication date: 2013-08-28
Also published as: US20130143815A1; WO2012010516A1; JP2013533264A; EP2595661A1

Abstract

本发明涉及包含胆汁酸残基的生长激素缀合物，所述缀合可通过野生型或突变型氨基酸残基而发生。生长激素多肽可以是野生型人生长激素或生长激素变体。

Description

生长激素缀合物

发明领域

本发明涉及包含胆汁酸衍生物的生长激素缀合物。所述缀合物可用于生长激素缺乏的治疗或其中通常应用人生长激素的其它治疗。

发明背景

生长激素(GH)是一种由哺乳动物垂体前叶分泌的多肽激素。依物种而定，GH是一种由大约190个氨基酸残基组成的蛋白质，相当于约22kDa的分子量。GH与细胞表面受体即GH受体(GHR)结合，并通过GH受体发出信号。GH在促进生长、保持正常身体组成、合成代谢和脂质代谢中起关键作用。它还对中间代谢具有直接作用，例如葡萄糖摄取降低、脂解作用增加、氨基酸摄取和蛋白质合成增加。该激素还对其它组织发挥作用，包括脂肪组织、肝、肠、肾、骨骼、***和肌肉。重组hGH已有生产且可市售获得，例如：Genotropin^TM(PharmaciaUpjohn)、Nutropin^TM和Protropin^TM(Genentech)、Humatrope^TM(EliLilly)、Serostim^TM(Serono)、诺地托品(Norditropin)(NovoNordisk)、Omnitrope(Sandoz)、NutropinDepot(Genentech和Alkermes)。另外，在N末端具有额外甲硫氨酸残基的类似物还以例如Somatonorm^TM(PharmaciaUpjohn/Pfizer)销售。

GH与蛋白质GH家族的其它成员催乳素(PRL)和胎盘催乳激素(PL)有共同的拓扑结构。GH被归类为4螺旋束蛋白质(图1)，显示具有两个保守二硫键的“上-上-下-下(up-up-down-down)”拓扑结构。具体而言，野生型人GH(hGH)由191个氨基酸残基组成，并在53、165、182和189位上具有4个半胱氨酸残基，其通过形成分别连接C53与C165和C182与C189的2个分子内二硫键而稳定蛋白质的三维结构(图1)。通过X射线晶体学实验性地测定了以下的hGH结构：游离形式(Chantalet L.等,Protein and Peptide Letters(1995)3，333-340)和与其结合蛋白(人GHR(hGHR)的胞外结构域)的复合物(Devos，A.M.等，Science(1992)255，306-312)。这些结构已保藏在蛋白质数据库(PDB)中，并且可公开获取(PDB登录代码分别为1HGU和1HWG)。因此，根据已发表的hGH结构，可鉴定出对hGH与hGHR结合是重要的残基。此外，通过核磁共振(NMR)光谱法研究了hGH的动力学特性(Kasimova M.R.等.J.Mol.Biol.(2002)318，679-695)。将X射线与NMR数据结合可将结构化良好和界线明确的hGH的区域与结构化较少并且是动态的区域区分开来。预期hGH的较少结构化的动态区特别易遭蛋白酶剪切，该区域的适当稳定可导致蛋白水解稳定性改进。

已对hGH进行大量诱变以试图产生具有所需化学或生物性质的hGH类似物。具体而言，已描述了用于若干目的的半胱氨酸突变体。

US2003/0162949公开了GH超基因家族成员的半胱氨酸变体。提供了用于产生这些蛋白质的位点特异性的生物活性缀合物的通用方法。所述方法包括将半胱氨酸残基加到蛋白质的非必需区或采用定点诱变用半胱氨酸残基取代蛋白质中的非必需氨基酸，然后通过所加入的半胱氨酸残基，将半胱氨酸反应性聚合物或其它类型的半胱氨酸反应性部分与蛋白质共价偶联。

WO02/055532描述了遗传工程改造的具有至少一个共价连接的非多肽部分的hGH突变体，特别是其中所引入的半胱氨酸残基被用于聚乙二醇化的hGH突变体。

US5,951,972描述了有生理活性的衍生化天然和重组的哺乳动物及人蛋白质和多肽，其中蛋白质内的至少一个天然存在的或掺入的半胱氨酸残基用各种取代基衍生化。

详细研究了hGH的蛋白酶剪切。由残基128-154组成的长环具有例如以下几种蛋白酶的推定的切割位点：凝血酶、纤维蛋白溶酶、胶原酶、枯草杆菌蛋白酶和胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。因此，hGH的这个部分显示特别易受蛋白酶剪切影响(Lewis，U.J.Ann.Rev.Physiol.(1984)46，33-42)。已报道的降解hGH的酶包括凝血酶、纤维蛋白溶酶、枯草杆菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶和激肽释放酶。

已对大鼠组织中hGH的降解进行了研究(Garcia-Barros等,J.Endocrinol.Invest.(2000)23，748-754)。

发现在大鼠甲状腺中，有利于在大型和亲脂性氨基酸残基处切割的胰凝乳蛋白酶样蛋白酶首先切割Y143和S144之间的肽键，产生2链分子，接着在Y42和S43之间切割，释放N端肽F1-Y42。再通过胰凝乳蛋白酶样蛋白酶在F146和D147之间切割并再通过羧肽酶的作用，加工2链分子中的裂环(split loop)。

已报道了产生对蛋白水解性降解稳定的hGH类似物的几种方法。

Alam等人(J.Biotech.(1998)65，183-190)通过特异性点突变，设计了抗凝血酶和纤维蛋白溶酶的hGH突变体。凝血酶特别在R134和T135之间切割hGH，双重突变体R134D,T135P产生抗凝血酶切割的hGH变体，而三重突变体R134D,T135P,K140A产生纤维蛋白溶酶抗性。此外，后一种hGH突变体具有在7天时间内抗人血浆蛋白酶解的抗性。

EP534568描述了通过使R134突变成丙氨酸、亮氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸或组氨酸而对蛋白水解性降解稳定的hGH突变体。

WO2004/022593/Nautilus描述了通用的高通量定向进化方法，以产生蛋白水解稳定性提高的修饰细胞因子(包括GH变体)。

WO2006/048777/Nautilus特别描述了蛋白水解稳定性改进的修饰的hGH类似物。该类似物在1-55、57、58、60-63、67-87、89-91、93、95-100、102-128、131-132、135-139、141、142、144、148-182、184、185和187-191位含有1-5个突变。半胱氨酸残基的引入可能导致形成不需要的二硫键连接的二聚体，在WO2006/048777中，该范围明确不包括氨基酸残基被半胱氨酸取代；在WO2006/048777(第65页)中阐述：“明确避免氨基酸被半胱氨酸残基置换，因为这种改变可能导致形成分子间二硫键”。

显然需要开发抗蛋白水解性降解的hGH化合物。这种稳定化合物对蛋白酶剪切应显示出稳定性提高，同时保持所需的hGH的生物学性质。这种GH分子应提高稳定性、降低清除率和/或延长体内半寿期。

此外，蛋白质治疗剂通常需要静脉内或皮下给予，因为其通常不能通过口服而充分利用。蛋白质口服生物利用度低部分是由于胃肠道中的蛋白水解性降解所致。因此，还需要开发可以口服给予以治疗hGH相关病症的hGH化合物。

天然存在的胆汁酸通过一系列转运蛋白的作用而在肝肠环路内受严格限制(Carey,M.C.;Cahalane,M.J.Enterohepatic Circulation.载于The Liver:Biologyand Pathobiology,第2版;Raven Press:Ltd,New York,1988;第33章,第573-616页)。这种肠与肝摄取机制确保分泌到肠中的约90%的胆汁酸在回肠中再吸收，在所谓的肝肠循环中再循环，将胆汁盐从肠***转移回到肝和胆囊中。

具有类似于天然存在的胆汁酸性质的生长激素化合物或缀合物可具有口服生物利用度以及药理学上相关的肝水平和高肝-血浆(或肝-组织)比率，因此是极有吸引力的化合物。

发明概述

本发明描述了具有共价结合的胆汁酸共价的生长激素缀合物。如本文所述，胆汁酸可与各种生长激素化合物连接，例如蛋白酶稳定性生长激素变体。

一方面，本发明涉及包括与生长激素化合物连接的胆汁酸残基的生长激素缀合物。可通过式(I)描述这类生长激素缀合物及其药学上可接受的盐

A-W-B-GH(I)

其中

GH表示生长激素化合物，

A表示胆汁酸残基，

B表示与GH共价连接的亲水间隔物，

W是连接A和B的化学基团。

在本发明进一步的实施方案中，生长激素化合物(GH)是人生长激素(SEQ IDNO1)或其具有一个或多个氨基酸取代的变体。

又一方面，本发明涉及这类生长激素缀合物的任何用途，例如其在治疗生长激素缺乏的方法中的用途。

又一方面，本发明涉及制备包括与生长激素化合物连接的胆汁酸残基的生长激素缀合物的方法，其中所述胆汁酸残基与生长激素化合物共价连接。

附图描述

图1

与2个拷贝hGH结合蛋白结合的hGH的结构(PDB1HWG)。hGH中4个主要螺旋以暗灰色显示，标为H1-H4。用箭头标示方向(N→C端)。hGH的N端和C端分别标为N和C。分别连接C53与C165和C182与C189的2个二硫键用黑色棒与球表示。还标记了L128和D154，分别表示连接H3和H4的长的柔性环中的第一个和最后一个残基。

图2

具有突出显示并标记的4个主要螺旋(H1-H4)的hGH的野生型氨基酸序列。还标记了连接主要螺旋的3个环(L1-L3)。螺旋定义涉及与其结合蛋白复合的hGH(PDB1HWG)。

定义

在本文中，术语“肽”和“多肽”可互换使用，欲表示相同含义。术语“肽”或“多肽”欲表示由肽键连接的两个或更多个氨基酸的序列，其中所述氨基酸可以是天然的或非天然的。组分氨基酸可来自由遗传密码编码的氨基酸的组别，而且它们可以是非由遗传密码编码的天然氨基酸和合成氨基酸。非遗传密码编码的天然氨基酸例如Hyp(羟脯氨酸)、γ-羧基谷氨酸(y-carboxyglutamate)、Orn(鸟氨酸)、磷酸丝氨酸、D-丙氨酸和D-谷氨酰胺。合成氨基酸包括化学合成法制备的氨基酸，例如由遗传密码编码的氨基酸的D-异构体，例如D-丙氨酸和D-亮氨酸、Aad(α-氨基己二酸)、Aib(α-氨基异丁酸)、Abu(α-氨基丁酸)、Agl(α-氨基甘氨酸)、Asu(α-氨基辛二酸)、Cha(β-环戊基-丙氨酸)、Chg(环己基甘氨酸)、Dab(α,γ-二氨基丁酸)、Dap(α,β-二氨基丙酸)、Hcy(高半胱氨酸)、Hpr(高脯氨酸)、Nle(正亮氨酸)、Phg(苯甘氨酸)、Hph(高苯丙氨酸)、1Nal(β-(1-萘基-丙氨酸)、2Nal(β-(2-萘基-丙氨酸)、2Pal(-(2-吡啶基)-丙氨酸、3Pal(β-(3-吡啶基)-丙氨酸)、Pip(4-氨基-哌啶-4-羧酸)、Pra(炔丙基-甘氨酸)、Pyr(焦谷氨酸)、Gla(γ-羧基-谷氨酸)、Hci(高瓜氨酸)、Nva(正缬氨酸)、Tle(叔丁基甘氨酸)、β-丙氨酸、3-氨基甲基苯甲酸和邻氨基苯甲酸。

该术语还包括术语“蛋白质”，其可由一条多肽链组成，或者由通过非共价或共价相互作用(例如半胱氨酸二硫桥)保持在一起的两条或更多条多肽链组成。

要理解的是，该术语还欲包括这样的肽，除包含额外的二硫键以外，例如还通过例如但不限于以下部分与肽的侧链或主链连接而被衍生化：PEG、糖、脂肪酸、白蛋白结合剂、烷基链、亲脂基团、维生素、胆汁酸或间隔物(spacer)。术语肽包括任何合适的肽，并且可与术语多肽和蛋白质作为同义词使用，除非另有说明或与上下文抵触，只要读者认识到，含有各种氨基酸聚合物的分子的各个类型可能与显著差异有关，从而构成本发明的各个实施方案(例如由多个多肽链组成的肽(例如抗体)显著不同于例如单链抗体、肽免疫黏附素或单链免疫原性肽)。因此，本文的术语肽一般应理解为是指任何合适大小和组成(就氨基酸的数目和蛋白质分子中相关链的数目而言)的任何合适的肽。此外，本文所述肽可包含非天然存在的和/或非L氨基酸残基，除非另有说明或与上下文抵触。

除非另有说明或与上下文抵触(且如果作为术语多肽和/或蛋白质的各个实施方案论述时)，否则术语肽还包括衍生化肽分子。衍生化肽分子是这样的肽分子，其中肽的一个或多个氨基酸残基被化学修饰(例如通过烷基化、酰化、酯形成或酰胺形成)或与一个或多个非氨基酸有机和/或无机原子或分子取代基(例如聚乙二醇(PEG)基团、亲脂性取代基(其任选可通过间隔残基或基团例如β-丙氨酸、γ-氨基丁酸(GABA)、L/D-谷氨酸、琥珀酸等与肽的氨基酸序列连接)、荧光团、生物素、放射性核素等)缔合，并且衍生化肽分子可另外或备选地包含非必需的、非天然存在的和/或非L氨基酸残基，除非另有说明或与上下文抵触(然而，还应认识到，这种衍生物本身且自动被视为本发明的独立特征，肽的含义中包括这类分子是为了便于描述本发明，并非意味着裸肽和这种衍生物之间有任何等同性)。

这类氨基酸残基的非限制性实例包括例如2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、β-氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、2,4-二氨基丁酸、锁链素、2,2'-二氨基庚二酸、2,3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、羟赖氨酸、别羟赖氨酸、3-羟脯氨酸、4-羟脯氨酸、异锁链素、别异亮氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、6-N-甲基赖氨酸、N-甲基缬氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸、炔丙基-甘氨酸和抑制素(statine)卤化的氨基酸。

本发明所述“化合物”可以是“蛋白质”或“肽”或“多肽”，不论其修饰方式，其均可以是保持所需要的类似于wthGH的生物活性的“类似物”或“变体”。

本文所用术语“类似物”或“变体”当指多肽时，意指所述肽的修饰形式，其中肽的一个或多个氨基酸残基被其它氨基酸残基取代和/或其中一个或多个氨基酸残基从肽中缺失，和/或其中一个或多个氨基酸残基被添加至肽中。氨基酸残基的这类取代或添加或缺失可发生在肽的N端和/或肽的C端和/或肽的N端或C端之间。未规定旋光异构体的所有氨基酸要理解为意指L-异构体。

术语“二硫键”或“二硫桥”可互换使用，意欲表示相同含义。在半胱氨酸残基的巯基之间形成蛋白质中的“二硫键”或“二硫桥”。

术语“额外的半胱氨酸”或“引入的半胱氨酸”可互换使用，欲表示相同含义。该术语欲包括不存在于野生型hGH中的半胱氨酸残基。为了使结构变化降到最小，通常通过一个或多个氨基酸残基的取代引入一个或多个半胱氨酸残基，以此保持hGH的长度。在环部分中或在螺旋的边界(boarder)可容许额外cys残基的***，但在螺旋内引入cys残基不太有吸引力。

术语“额外的二硫键”或“引入的二硫键”可互换使用，欲表示相同含义。该术语欲包括在两个半胱氨酸残基之间形成的二硫键，其中至少一个半胱氨酸残基不存在于野生型hGH中。

本文所用术语“单点突变”表示突变(与SEQ ID NO1限定的hGH相比)。术语“额外的单点突变”可用来指与引入生长激素化合物中形成任何二硫桥的额外半胱氨酸突变无关的单点突变。术语“额外的单个cys突变”可用来指引入半胱氨酸残基的点突变。这类突变可以是“额外的单点突变”或甚至是hGH中的更多突变。

本文用来定义本发明的术语“缀合物”是指肽或多肽，其中肽的一个或多个氨基酸残基与胆汁酸残基共价连接。因此，本发明的术语“缀合物”用作将胆汁酸缀合物与备选衍生物区分开的术语。但是注意到其它文献使用可互换使用的术语“缀合物”和“衍生物”，因此当涉及其它文献时，该术语可互换使用。作为动词，该术语欲表示使一部分(在此为胆汁酸残基或连接基)与蛋白质或多肽键合的过程。

本文所用术语“衍生物”是指肽或多肽，其中肽的一个或多个氨基酸残基通过将聚合物(例如PEG)、糖部分、白蛋白结合剂、脂肪酸、亲脂基团、维生素或间隔物引入生长激素化合物的侧链或主链而被化学修饰。化学修饰在性质上也可以是暂时的，即其可容易地在体内除去。例如可通过细胞本身或通过在表达后在肽上进行化学修饰，而在翻译后引入化学修饰。

在本文中，措词“人生长激素(hGH)’、“hGH wt”和“野生型hGH(wthGH)”可互换使用，均指具有SEQ ID No.1的氨基酸序列的蛋白质。

本领域所知术语“同一性”是指两个或更多个肽序列间的关系，这通过比较序列来确定。本领域中，“同一性”还指肽之间序列相关性的程度，这通过两个或更多个氨基酸残基的串(string)之间的匹配数目确定。“同一性”测量两个或更多个序列之间相同匹配的百分比，这用由具体的数学模型或计算机程序(即“算法”)得出的空位比对(如果有的话)来进行。可以通过已知方法容易地计算出相关肽的同一性。这类方法包括但不限于描述于以下文献的方法：Computational MolecularBiology,Lesk,A.M.,主编,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,主编,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,第1部分,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.,主编,Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,vonHeinje,G.,Academic Press,1987；Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.,主编,M.Stockton Press,New York,1991；以及Carillo等,SIAM J.Applied Math.(1988)48,1073。

设计了测定同一性的优选方法以得到所测试序列之间的最大匹配。测定同一性的方法描述于可公开获取的计算机程序中。测定2个序列之间同一性的优选计算机程序方法包括GCG程序包，包括GAP(Devereux等,Nucl.Acid.Res.(1984)12，387；Genetics Computer Group，University of Wisconsin，Madison，Wis.)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等,J.Mol.Biol.(1990)215，403-410)。BLASTX程序可公开获自美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information,NCBI)和其它来源(BLAST手册，Altschul等.NCB/NLM/NIH Bethesda，Md.20894；Altschul等，同上)。众所周知的SmithWaterman算法也可用于测定同一性。

例如，运用计算机算法GAP(Genetics Computer Group,University ofWisconsin,Madison,Wis.)，针对其相应氨基酸的最佳匹配，对待测定序列同一性百分比的两个肽进行比对(“匹配跨度(matched span)”，由该算法确定)。空位开放罚分(gap opening penalty)(经计算为平均对角线(average diagonal)的三倍；“平均对角线”是所用比较矩阵对角线的平均值；“对角线”是通过具体比较矩阵赋予每个完全匹配氨基酸的分值或数目)、空位延伸罚分(其通常为{分数(1/10)}乘以空位开放罚分)以及比较矩阵(例如PAM250或BLOSUM62)与算法结合使用。该算法还利用了标准比较矩阵(对于PAM250比较矩阵参见Dayhoff等，Atlas of ProteinSequence and Structure,(1978)5，；对于BLOSUM62比较矩阵参见Henikoff等，PNAS USA(1992)89，10915-10919)。

肽序列比较的优选参数包括下列参数：算法：Needleman等,J.Mol.Biol.(1970)48，443-453；比较矩阵：Henikoff等，PNAS US(1992)89，10915-10919的BLOSUM62；空位罚分：12，空位长度罚分(Gap Length Penalty)：4，相似性阈值(Threshold of Similarity)：

具有上述参数的GAP程序是有益的。上述参数对于运用GAP算法的肽比较(连同末端缺口无罚分)是默认参数。

术语“蛋白酶”欲包括具有催化肽键水解切割的能力的所有酶。蛋白酶可以是胞内、胞外或膜结合的蛋白酶、蛋白水解酶或肽酶，并包括哺乳动物肠腔中的蛋白酶和哺乳动物血浆中存在的蛋白酶。蛋白酶可以是内切蛋白酶和外切蛋白酶两种类型。蛋白酶可为下列类型，但不限于下列类型：丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。蛋白酶的具体实例为胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、弹性蛋白酶、因子VIIa、因子Xa、蛋白酶K、羧基肽酶、DPPIV、中性内肽酶、粒酶B、脯氨酸-内肽酶、嗜热菌蛋白酶、凝血酶、Arg-C蛋白酶、Asp-N内肽酶、胱天蛋白酶1-10、梭菌蛋白酶、肠激酶、谷氨酰基内肽酶、LysC、LysN和葡萄球菌肽酶I。

术语“抗蛋白水解性降解”或“对蛋白水解性降解的稳定性提高”或“对蛋白酶剪切的稳定性提高”或“蛋白水解稳定性改进”或“蛋白水解稳定性”可互换使用，欲表示相同含义。如果与本发明的hGH化合物联用，则该术语欲表示与野生型hGH相比，所述hGH化合物的多肽链在特定情况下以较慢的速度被蛋白酶切割。

蛋白质的蛋白酶剪切速度可通过本领域技术人员已知的几种技术测定。测量hGH或hGH化合物降解速率的测定法的实例描述于实施例5。

术语“功能性体内半寿期”以其标准意义使用，即达到肽(例如生长激素化合物)的50%生物活性的时间，其中生长激素化合物仍然存在于机体/靶器官中，或肽(例如生长激素化合物)的活性是其起始值的50%时的时间。作为测定功能性体内半寿期的备选方法，可测定“体内血浆半寿期”和延长作用，即在被清除前50%的肽在血流中循环的时间。血浆半寿期的测定通常比测定功能性半寿期更简单，血浆半寿期的长短常常是功能性体内半寿期长短的良好指示物。

术语“烷烃”或“烷基”欲表示饱和的直链、支链和/或环状烃。除非标明其它碳原子数，否则该术语欲表示具有1-30(包括1和30两者)个碳原子、例如1-20(包括1和20两者)、例如1-10(包括1和10两者)、例如1-5(包括1和5两者)个碳原子的烃。术语烷基和亚烷基分别是指相应的基团和双基。

术语“C_1-6烷基”是指具有1-6(包括1和6)个碳原子的直链或支链饱和烃。这类基团的实例包括但不限于甲基、2-丙基、1-丁基、2-丁基、2-甲基-2-丙基、2-甲基-1-丁基和正己基。

术语“C_3-10环烷基”通常是指环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基和环癸基(cyclodecanyl)。

术语“烯烃”欲表示包含至少一个碳-碳双键的直链、支链和/或环状烃。除非标明其它的碳原子数，否则该术语欲表示具有2-30(包括2和30两者)个原子、例如2-20(包括2和20两者)、例如2-10(包括2和10两者)、例如2-5(包括2和5两者)个碳原子的烃。术语烯基和亚烯基分别是指相应的基团和双基。

术语“炔烃(alkyne)”欲表示包含至少一个碳-碳三键的直链、支链和/或环状烃，且可任选包含一个或多个碳-碳双键。除非标明其它的碳原子数，否则该术语欲表示具有2-30(包括两者)个碳原子、例如2-20(包括两者)、例如2-10(包括两者)、例如2-5(包括两者)个原子的烃。术语炔基和亚炔基分别是指相应的基团和双基。

术语“碳环芳族化合物”欲表示芳族烃，例如苯和萘。

术语“杂环化合物”欲表示包含5、6或7个环原子的环状化合物，其中的1、2、3或4个是选自N、O和/或S的杂原子。实例包括杂环芳族化合物，例如噻吩、呋喃、吡喃、吡咯、咪唑、吡唑、异噻唑、异噁唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪及其部分或完全氢化的等同物，例如哌啶、吡唑烷(pirazolidine)、吡咯烷、吡咯啉(pyroline)、咪唑烷、咪唑啉、哌嗪和吗啉。

术语“杂烷烃”、“杂烯烃”和“杂炔烃”欲表示上文定义的烷烃、烯烃和炔烃，其中一个或多个杂原子或基团***所述部分的结构中。杂基团和杂原子的实例包括-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)₂-、-C(O)-、-C(S)-和-N(R*)-，其中R*表示氢或C₁-C₆-烷基。杂烷烃的实例包括：

术语“基团”或“双基”欲表示从中分别脱去一个或两个氢原子的化合物。当具体阐明时，基团也可表示通过从化合物中正式脱去较大的原子基团(例如羟基)所形成的部分。

术语“卤素”欲表示周期表第七主族的成员，例如F、Cl、Br和I。

本文中，术语“芳基”欲表示其中至少一个环是芳族的碳环芳族环基团或稠合芳族环系基团。典型的芳基包括苯基、联苯基、萘基等。

本文所用术语“杂芳基(heteroaryl/hetaryl)”单独地或组合地是指具有例如5-7个原子成员的芳族环基团，或者是具有例如7-18个原子成员的稠合芳族环系基团，其中至少一个环是芳族的，含有一个或多个选自氮、氧或硫杂原子的杂原子作为环原子，其中N-氧化物及一氧化硫和二氧化硫允许杂芳族取代。实例包括呋喃基、噻吩基、苯硫基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、***基、四唑基、噻唑基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、噻二唑基、异噻唑基、吡啶基、哒嗪基、吡嗪基、嘧啶基、喹啉基、异喹啉基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基和吲唑基等。

术语“基序”用来描述较大实体(例如间隔物(B))内的小化学实体，其中这类基序可由一个或多个化学基团构成。

术语“残基”用于化学单位，等于有关氨基酸的通常用法，例如由共价连接的氨基酸残基组成的蛋白质或肽。具体地讲，涉及胆汁酸残基使用术语残基，表示通过化学连接基团与间隔物共价结合的胆汁酸。

本文中，术语“药学上可接受的盐”欲表示对患者无害的盐。这类盐包括药学上可接受的酸加成盐、药学上可接受的金属盐、铵盐和烷基化铵盐。酸加成盐包括无机酸以及有机酸的盐。合适无机酸的代表性实例包括盐酸、氢溴酸、氢碘酸、磷酸、硫酸、硝酸等。合适有机酸的代表性实例包括甲酸、乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸、丙酸、苯甲酸、肉桂酸、柠檬酸、富马酸、乙醇酸、乳酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、草酸、苦味酸、丙酮酸、水杨酸、琥珀酸、甲磺酸、乙磺酸、酒石酸、抗坏血酸、双羟萘酸、双亚甲基水杨酸、乙二磺酸、葡萄糖酸、柠康酸、天冬氨酸、硬脂酸、棕榈酸、EDTA、乙醇酸、对氨基苯甲酸、谷氨酸、苯磺酸、对甲苯磺酸等。药学上可接受的无机酸或有机酸加成盐的其它实例包括列于以下文献中的药学上可接受的盐：J.Pharm.Sci.66，2，(1977)，其通过引用结合到本文中。金属盐的实例包括锂盐、钠盐、钾盐、镁盐等。铵盐和烷基化铵盐的实例包括铵、甲基铵、二甲铵、三甲铵、乙基铵、羟基乙基铵、二乙基铵、丁基铵、四甲基铵盐等。

发明描述

生长激素缀合物

本发明的一个方面涉及包含与生长激素化合物共价连接的胆汁酸残基的生长激素缀合物。在一个实施方案中，可用式(I)描述缀合物及其药学上可接受的盐

A-W-B-GH(I)

其中

GH表示生长激素化合物，

A表示胆汁酸残基，

B表示与GH共价连接的亲水间隔物，

W是连接A和B的化学基团。

如本文下文中所述，这类缀合物的组分可通过包括不同的生长激素变体或衍生物、提供其它官能团同时保持对生长激素受体的刺激作用而改变。

此外，通常在生长激素缀合物中保留人生长激素的主要官能团。可以任何生长激素化合物测试人生长激素缀合物的体外和体内活性。

生长激素化合物

按照本发明，生长激素化合物保留人生长激素的主要官能团，而在一个实施方案中，可与人生长激素(SEQ ID NO1)相同。

在本发明的一个实施方案中，生长激素化合物是包含与SEQ ID No.1具有以下同一性的氨基酸序列的多肽：至少20%，例如至少30%、例如至少40%、例如至少50%、例如至少60%、例如至少70%、例如至少80%、例如至少90%同一性、例如至少95%、例如至少96%、例如至少97%、例如至少98%。

在一个实施方案中，生长激素化合物具有与SEQ ID NO1限定的hGH的体外活性相当的体外活性。生长激素化合物的体外活性优选按本文方法5中描述的BAF测定法测量。

在下文所述进一步的实施方案中，生长激素化合物具有至少1%的生长激素活性，例如至少5%、例如至少10%、例如至少25%的hGH活性，按BAF测定法测定(方法5中描述的和/或在垂体切除大鼠中测定(方法6中描述的)。

在一个实施方案中，化合物可具有不同于hGH的体外活性的体外活性。如上所述，较低的体外活性可通过其它功能性补偿。

在一个实施方案中，体外活性可为hGH活性的例如至少1%、例如至少5%、例如至少10%、例如至少25%。在进一步的实施方案中，化合物相对于由SEQ IDNo.1限定的野生型hGH的EC₅₀比率不超过10、不超过8、不超过6、不超过4、不超过2。在一个实施方案中，所述化合物较之于由SEQ ID No.1限定的野生型hGH的EC₅₀比率为5-0.01或例如3-0.01或例如为2-0.01。在本发明的备选实施方案中，EC₅₀可通过方法7中描述的表面等离振子共振分析(SPR)测量。在相应的实施方案中，通过SPR测定的体外活性可为hGH活性的例如至少1%、例如至少5%、例如至少10%、例如至少25%。在进一步的实施方案中，通过SPR测定的化合物相对于由SEQ ID No.1限定的野生型hGH的EC₅₀比率不超过10、不超过8、不超过6、不超过4、不超过2。在一个实施方案中，所述化合物较之于由SEQ ID No.1限定的野生型hGH的EC₅₀比率为5-0.01或例如3-0.01或例如2-0.01。

为了避免疑惑，生长激素化合物还可具有比这些测定法中的hGH高的活性。

在一个实施方案中，其中生长激素化合物以某种方式衍生化(除胆汁酸缀合之外)，可测量未衍生化生长激素化合物的生长激素相对于hGH的活性，因为衍生化可显著改变活性。例如在生长激素化合物用延长生长激素化合物的功能性体内半寿期的改性基团衍生化的情况下，衍生化生长激素化合物的活性可比hGH的活性低得多，这种降低被停留时间延长而抵消。

在一个备选的实施方案中，可测量衍生化生长激素化合物的生长激素活化。在进一步的实施方案中，测定生长激素缀合物(包括胆汁酸缀合)和任何其它改性化学修饰的生长激素活性，确保这类缀合和/或修饰不干扰受体相互作用。应注意的是，试验将在摩尔浓度基础上或基于相对蛋白质/肽含量(例如不应包括任何衍化或缀合的重量)与hGH进行比较。

在一个实施方案中，生长激素化合物是这类多肽的片段，所述片段保留大量的上述生长激素活性。

在一个实施方案中，生长激素化合物是hGH的截短形式，即一个或多个氨基酸残基从对应于SEQ No.1的N端和/或C端缺失，其中所述化合物保留所需的野生型hGH的生物学性质。

在一个实施方案中，生长激素化合物的体内半寿期延长。

在一个实施方案中，生长激素化合物的保存期限延长。

在一个实施方案中，生长激素化合物可以是融合蛋白。

在本发明的一个实施方案中，生长激素化合物通过使例如但不限于以下部分与生长激素化合物的侧链或主链连接而化学修饰(除胆汁酸缀合外)：PEG、碳水化合物、白蛋白结合剂、脂肪酸、烷基链、亲脂基团、维生素或间隔物。

在一个实施方案中，当与未经化学修饰的hGH或hGH变体相比时，生长激素化合物经化学修饰以利于跨上皮转运。化学修饰可以是例如本文所述胆酸残基的缀合。不同测定法例如Caco-2细胞测定法或MDCK细胞测定法可用来估算生长激素化合物跨细胞层的转运。

在一个实施方案中，本发明的生长激素化合物经化学修饰以获得长时间的体内作用。

在本发明的一个实施方案中，生长激素化合物经化学修饰以获得长时间的功能性体内半寿期。

在一个实施方案中，生长激素化合物的化学修饰的性质可以是短暂的，即其可容易地体内除去。

在一个实施方案中，生长激素化合物修饰可发生在不干扰生长激素化合物与人生长激素受体(hGHR)结合的任何氨基酸残基上。

在下文所述的进一步的实施方案中，缀合可发生在选自wthGH残基和突变体残基的不同位置上。

在一个实施方案中，缀合通过N端或C端连接。

在一个实施方案中，缀合通过Gln残基(例如Gln40或Gln141)连接。

在其中胆汁酸接头(或备选衍生物)通过突变体残基与GH连接的这类进一步的实施方案中，缀合物的GH可具有单个Cys突变，其选自GH的N端、H1、L1、H2、L2或H3区中的单个Cys突变的任一个。

在进一步的这类实施方案中，单个Cys突变位于hGH(SEQ ID NO:1)的N端，突变为例如T3C、P5C、S7C的任一个；或位于H1(对应于AA9-35)，突变为例如D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C的任一个；或位于相当于AA36-71的L1，突变为例如Q40C、K41C、Y42C、S55C、S57C、S62C的任一个或位于H2、L2或H3(对应于AA72-98、AA99-106和AA107-127)，突变为例如E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C和G126C的任一个。如果单个Cys突变存在于hGH变体中，则突变位于相应的氨基酸残基上。

进一步的实施方案包括这样的GH缀合物，其中GH中的单个Cys突变选自以下的任一个：hGH(SEQ ID NO:1)的T3C、P5C、S7C、D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C、Q40C、S55C、S57C、S62C、E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C和G126C，例如Q40C、S62C和L101C的任一个。

在更进一步的实施方案中，单个Cys突变位于hGH的AA93-106或hGH变体的相应残基内。

在更具体的实施方案中，单个Cys突变位于L2内，例如位于AA99-106或AA99-103或相应的残基内。

为了获得体内停留时间延长的生长激素缀合物，使生长激素化合物的稳定性最优化，尤其应用对蛋白质降解较不敏感的生长激素化合物是有吸引力的。

在一个实施方案中，生长激素化合物的蛋白酶稳定性提高。

在一个实施方案中，生长激素化合物对蛋白酶剪切的稳定性提高。

在一个实施方案中，生长激素化合物对因胰蛋白酶所致的蛋白水解性降解的稳定性提高。

在一个实施方案中，生长激素化合物对因胃肠道中存在的蛋白酶所致的蛋白水解性降解的稳定性提高。

在一个实施方案中，生长激素化合物对因哺乳动物血浆中存在的蛋白酶所致的蛋白水解性降解的稳定性提高。

在一个实施方案中，生长激素化合物具有一个或多个额外的二硫键。在通过点突变引入野生型hGH序列中的一个或两个半胱氨酸对之间形成二硫键。选择突变位点，使得所引入的半胱氨酸残基适当置于折叠蛋白质的三维结构中以供形成二硫键。如果只引入一个半胱氨酸，则其形成二硫键的配偶体可包括野生型hGH中存在的4个半胱氨酸残基之一。具有额外二硫键的折叠蛋白质可通过合适的宿主生物表达可溶形式的合适的hGH半胱氨酸突变体获得，或利用本领域技术人员熟知的生长激素化合物的标准再折叠条件从包含体中回收(Cabrita和Bottomley，Biotechnology Annual Review(2004)10，31-50)。引入额外二硫键的候选位置的鉴定可辅以计算方法，例如利用根据经验确定的与其两个拷贝的结合蛋白复合的hGH(PDB登录代码1HWG)的三维结构。引入二硫键的合适位置的选择可根据以下文献所述的二硫键距离和几何标准：Dombkowski A.,A.,Bioinformatics(2003)19,1852-1853及Petersen等,Protein Eng.(1999)12,535-548。

选择半胱氨酸突变体，使得引入的二硫键不会破坏蛋白质的天然结构，并且对与hGH有关的所需要生物活性具有最小的负面影响。因此，构建这样的化合物，使得引入的二硫键不会削弱与hGHR的相互作用。已从1HWG中鉴定出对受体相互作用重要的hGH区。因此，可通过分析1HWG结构，指导引入二硫键的合适位置(其对生物活性而言是中性的)的选择。

可选择半胱氨酸突变体，使得引入的二硫键提供对蛋白酶剪切的稳定性提高。蛋白质对蛋白酶切割的敏感性部分由所述蛋白质的一级氨基酸序列确定。蛋白酶可以是相对无特异性的，或者可以可变的选择性程度识别一级氨基酸序列中的特定基序。然而，用作底物的蛋白质分子的三维结构和动力学强烈地影响蛋白水解稳定性。高柔性和动态环结构特别易受蛋白酶催化切割的影响，而结构化良好的区域一般不太如此。因此，可通过引入二硫键稳定蛋白质的动态区，来获得保护免于蛋白酶剪切。

对于两个半胱氨酸残基间的二硫桥，可在本文所述任何区域或位置上引入或取代为半胱氨酸残基，以利于形成一个或多个额外的二硫键。氨基酸残基的取代和***可通过本领域技术人员已知的标准技术进行。

在一个实施方案中，与SEQ ID NO1限定的hGH相比，所述生长激素化合物包含一个或多个额外的二硫键。如上文所述，本发明的生长激素化合物多肽优选与由SEQ ID NO1鉴定的人生长激素具有高水平的同一性。

因此，将通过在由SEQ ID No.1限定的hGH中引入一个或多个额外的二硫键而对蛋白水解性降解有抗性的稳定的GH化合物与本文所述的胆汁酸残基缀合。在一个实施方案中，生长激素化合物对于蛋白酶解是稳定的。

在一个实施方案中，通过在环区段和螺旋结构间引入二硫键以实现生长激素化合物的蛋白水解稳定性提高。

在一个实施方案中，通过在环区段内引入二硫键实现生长激素化合物的蛋白水解稳定性提高。

在一个实施方案中，通过在环区段间引入二硫键实现生长激素化合物的蛋白水解稳定性提高。

在一个实施方案中，通过在螺旋间引入二硫键实现生长激素化合物的蛋白水解稳定性提高。

在一个实施方案中，至少一个引入的二硫键连接生长激素化合物的两个半胱氨酸残基，其中至少一个所述半胱氨酸残基不存在于野生型hGH中。

在一个实施方案中，生长激素化合物所引入的二硫键稳定连接H3和H4的环(L3，残基128-154)，即在引入的二硫键中至少一个半胱氨酸位于包含残基128-154的区段(图1和图2)。

在一个实施方案中，生长激素化合物所引入的二硫键位于采用以下文献描述的距离和几何标准选择的半胱氨酸残基之间：Dombkowski A.,A.,Bioinformatics(2003)19,1852-1853及Petersen等,Protein Eng.(1999)12,535-548。

如上所述，生长激素化合物包含额外的二硫键，其连接多肽的环区段和螺旋区段或在多肽的环区段内或连接多肽的环区段或连接多肽的螺旋区段。任何这类额外的二硫键的位置均是为了参照SEQ ID NO1限定的hGH多肽描述的本申请的目的。提供连接螺旋、环和环与螺旋的键的cys突变的非限制性实例列举在下表中。

a)H1-H4是指螺旋1-4，L1-L3是指环1-3，Ct是指C端区段。

在一个实施方案中，生长激素化合物包含至少一对突变，所述突变对应于SEQ ID NO1中的R16C/L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、D26/V102C、D26/Y103C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C和/或V185C/S188C。

在一个实施方案中，生长激素化合物包含至少一对突变，所述突变对应于SEQ ID NO1中的A17C/E174C、H21C/M170C、D26/V102C、D26/Y103C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C、F92C/T148C和/或R94C/D107C。

按照本发明的一个实施方案，缀合物的生长激素化合物包含额外的二硫键，其中至少一个半胱氨酸存在于L3(SEQ ID NO1中的AA128-154)中，或存在于例如由AA135-148限定的环的中区或相应的氨基酸残基中。

在一个实施方案中，生长激素化合物具有存在于L3中的额外二硫键的至少一个半胱氨酸，其位置对应于SEQ ID NO1中的AA141、AA142、AA143、AA144、AA145或AA146，优选AA143或AA144。

在一个实施方案中，生长激素化合物包含至少一对突变，所述突变对应于SEQ ID NO1中的F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C和/或F92C/T148C。

在一个实施方案中，生长激素化合物包含至少一对突变，所述突变对应于SEQ ID NO1中的F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C和/或F92C/T148C。

本发明的一个实施方案涉及其中生长激素化合物包含连接L3与L1的额外二硫键的缀合物。

在一个实施方案中，生长激素化合物包含使对应于L3中的AA54、AA55、AA56、AA57、AA58或AA59的氨基酸残基与对应于SEQ ID NO1中的L1的AA143或AA144的氨基酸连接的额外二硫键。

在一个实施方案中，本发明的生长激素化合物包含至少一对突变，所述突变对应于SEQ ID NO1中的F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C和/或S71C/S132C。

本发明的一个实施方案涉及包含额外二硫键的生长激素化合物，所述二硫键连接L3与螺旋区段例如螺旋2(H2)。

在一个实施方案中，生长激素化合物包含使对应于H2中的AA84或AA85的氨基酸残基与对应于SEQ ID NO1L3中的AA143或AA144的氨基酸连接的额外二硫键。

在一个实施方案中，生长激素化合物包含至少一对突变，所述突变对应于SEQ ID No中的L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C和F92C/T148C。

在一个实施方案中，生长激素化合物包含至少一对突变，所述突变对应于SEQ ID NO1中的L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C和/或F92C/T148C。

本发明的一个实施方案涉及包含连接L2与螺旋1的额外二硫键的生长激素化合物。

在一个实施方案中，生长激素化合物包含至少一对突变，所述突变对应于D26C/V102C或D26C/Y103C。

在一个实施方案中，包含一个或多个额外的二硫键的生长激素化合物对因以下一种或多种蛋白酶所致降解是稳定的：例如消化蛋白酶，例如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶和/或弹性蛋白酶。

在本发明的一个实施方案中，生长激素化合物对因胰蛋白酶、凝乳蛋白酶和/或弹性蛋白酶所致的蛋白水解性降解的稳定性提高。

在一个实施方案中，生长激素化合物对胰凝乳蛋白酶和/或弹性蛋白酶的降解是稳定的。

在一个实施方案中，生长激素化合物包含至少一对突变，所述突变对应于SEQ ID NO1中的H21/M170、D26/V102C、D26/Y103C、F54C/Y143C、F54C/S144C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C和/或S85C/S144C。

在一个实施方案中，生长激素化合物包含至少一对突变，所述突变对应于SEQ ID NO1中的D26/V102C、D26/Y103C、S57C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C、F92C/T148C和/或R94C/D107C。

在一个实施方案中，生长激素化合物包含至少一对突变，所述突变对应于SEQ ID NO1中的S57C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C和/或S85C/S144C。

在进一步的实施方案中，本发明涉及式I的生长激素缀合物，其中与人生长激素相比，该生长激素化合物包含一个或多个额外的二硫键和至少一个额外的单点突变。出于与生长激素化合物的功能性有关的多种原因，生长激素化合物中可包括至少一个额外的单点突变。所述至少一个额外的单点突变的目的可在于例如通过引入包含适于化学修饰的化学实体的氨基酸残基，而进一步提高蛋白酶稳定性和/或提供适于化学修饰的“位点”。

因此，本发明涉及任何生长激素缀合物，其中与由SEQ ID NO1限定的人生长激素相比，生长激素化合物包含上文所述一个或多个额外的二硫键和至少一个额外的单点突变。

在一个实施方案中，生长激素化合物的至少一个额外的单点突变位于已知的蛋白酶位点。

在一个实施方案中，至少一个额外的单点突变位于对应于SEQ ID NO1的1-55、57、58、60-63、67-87、89-91、93、95-100、101、102-128、131-132、135-139、141、142、144、148-182、184、185和/或187-191位的位置。

在一个实施方案中，至少一个额外的单点突变位于对应于hGH的T3、P5、S7、D11、H18、Q29、E30、E33、A34、Y35、E88、Q91、S95、A98、N99、S100、L101、V102、Y103、D107、S108、D112、Q122和G126位的位置。

在一个实施方案中，至少一个额外的单点突变位于对应于SEQ ID NO1的10、40、41、42、55、57、62、101、134、136、139、142和/或144位的位置。

在一个实施方案中，至少一个额外的单点突变位于对应于SEQ ID NO1的55、57、62、101、134、136、142和/或144位的位置。

在一个实施方案中，至少一个额外的单点突变位于对应于SEQ ID NO1的62、101、134、136、142和/或144位的位置。

在一个实施方案中，至少一个单点突变存在于L1(对应于SEQ ID NO1的AA36-71)和/或L3(对应于SEQ ID NO1的AA128-154)中，而在进一步的实施方案中，至少一个单点突变存在于L1中。在一个实施方案中，至少一个单点突变存在于L1的中区(对应于SEQ ID NO1的AA40-65)。在一个实施方案中，至少一个单点突变存在于对应于SEQ ID NO1的40、41、42、55、57和/或62位的位置上。在一个实施方案中，至少一个单点突变存在于L3中，而在进一步的实施方案中，至少一个单点突变存在于L3的中区(对应于SEQ ID NO1的AA134-148)。

在一个实施方案中，至少一个单点突变位于对应于SEQ ID NO1的134、136、139、142和/或144位的位置。

在一个实施方案中，至少一个单点突变位于对应于SEQ ID NO1限定的hGH的62位的位置上。

在一个实施方案中，至少一个额外的单点突变位于对应于SEQ ID NO1限定的hGH的62位的位置上。在一个这类的实施方案中，丝氨酸(S62)被选自以下的氨基酸残基取代：苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)、半胱氨酸(C)、组氨酸(H)、谷氨酰胺(Q)和谷氨酸(E)。

在一个实施方案中，至少一个额外的单点突变位于对应于SEQ ID NO1限定的hGH的55位的位置上。在一个这类的实施方案中，丝氨酸(S55)被选自以下的氨基酸残基取代：苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)、半胱氨酸(C)、组氨酸(H)、谷氨酰胺(Q)和谷氨酸(E)。

在一个实施方案中，至少一个额外的单点突变位于对应于SEQ ID NO1限定的hGH的57位的位置上。在一个这类的实施方案中，丝氨酸(S57)被选自以下的氨基酸残基取代：苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)、半胱氨酸(C)、组氨酸(H)、谷氨酰胺(Q)和谷氨酸(E)。

按照本发明，与SEQ ID NO1相比，一个或多个额外的二硫键通过至少两个氨基酸的氨基酸取代来获得。

在进一步的实施方案中，与SEQ ID NO1相比，所述化合物包含正好一个额外的二硫键。

在一个实施方案中，与SEQ ID NO1限定的人生长激素相比，本发明的生长激素化合物的多肽包含至少两个额外的半胱氨酸。

在进一步的实施方案中，与SEQ ID NO1限定的人生长激素相比，所述多肽包含正好两个额外的半胱氨酸。

在进一步的实施方案中，与SEQ ID NO1限定的人生长激素相比，所述生长激素化合物包含至少两个额外的半胱氨酸。

在一个实施方案中，与SEQ ID NO1相比，所述生长激素化合物包含正好3个氨基酸取代。

在一个实施方案中，与SEQ ID NO1限定的人生长激素相比，所述生长激素化合物包含正好两个额外的半胱氨酸和正好一个额外的单点突变。

在一个实施方案中，与SEQ ID NO1相比，本发明的生长激素化合物的多肽包含总共至多10个氨基酸取代。在一个实施方案中，所述生长激素化合物包含总共至多8个、例如至多7个、例如至多6个、例如至多5个、例如至多4个氨基酸取代。在一个实施方案中，与SEQ ID NO1限定的人生长激素相比，所述生长激素化合物包含正好3个额外的半胱氨酸。

在一个实施方案中，与SEQ ID NO1限定的人生长激素相比，所述生长激素化合物包含一个额外的二硫键和单个Cys突变。

在一个实施方案中，单个Cys突变选自GH的N端、H1、H2、L2或H3区中的任一个单个Cys突变。

在一个实施方案中，生长激素化合物具有选自对应于以下的突变的单个Cys突变：hGH(SEQ ID NO:1)的T3C、P5C、S7C、D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C、Q40C、S55C、S57C、S62C、E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C和G126C。

在一个实施方案中，生长激素化合物具有位于对应于hGH的AA93-106、例如AA99-106或AA99-103的位置的单个Cys突变。

在一个实施方案中，额外的单个cys突变为N99C、S100C或L101C。在一个实施方案中，额外的单个cys突变位于对应于hGH的AA55-62的位置上。在一个实施方案中，额外的单个cys突变是S55C、S57C或S62C。

在一个实施方案中，与SEQ ID NO1相比，本发明的生长激素化合物的多肽包含总共至多10个氨基酸取代。在一个实施方案中，所述生长激素化合物包含总共至多8个、例如至多7个、例如至多6个、例如至多5个、例如至多4个氨基酸取代。

在一个实施方案中，与SEQ ID NO1相比，本发明的生长激素化合物的多肽包含正好3个氨基酸取代。

可将额外的二硫桥引入其中的GH化合物的其它实例包括以下文献公开的GH化合物：WO92/09690(Genentech)、US6,004931(Genentech)、US6,143,523(Genentech)、US6,136,536(Genentech)、US6,057,292(Genentech)、US5,849,535(Genentech)、WO97/11178(Genentech)、WO90/04788(Genentech)、WO02/055532(Maxygen APS and Maxygen Holdings)、US5,951,972(American CynanamidCorporation)、US2003/0162949(Bolder Biotechnologies，Inc.)，所述文献通过引用结合到本文中。还包括hGH的天然变体，例如描述于Masuda,N等,Biochim.Biophys.Acta949(1988)(1),125-131的20kDa天然变体。

在本文所述所有实施方案中，还任选生长激素化合物在对应于SEQ ID NO1的120位的位置上具有Gly残基。

本领域技术人员可按照方法1和2及下文中的描述，制备本文所述生长激素多肽。

多肽的产生是本领域众所周知的。例如，多肽可通过经典肽合成产生，例如采用tert-Boc或Fmoc化学法的固相肽合成或其它已十分确定的技术，参见例如Greene和Wuts，“Protective Groups in Organic Synthesis”,John Wiley&Sons,2006。

多肽还可通过这样的方法产生，所述方法包括在允许肽表达的条件下，将含有编码该多肽的DNA序列和能够表达该多肽的宿主细胞培养在合适的营养培养基中。对于包含非天然氨基酸残基的多肽，应对重组细胞进行修饰，使得例如通过使用tRNA突变体将非天然氨基酸掺入多肽中。

还可采用无细胞的体外转录/翻译***制备多肽。含有新的非天然氨基酸的多肽还可采用例如描述于以下文献的移码或无义抑制***(nonsense suppressionsystem)制备：J.Am.Chem.Soc.(2003)125,11782-11783；Science(2003)301,964-967；Science(2001)292,498-500,Science(2004)303,371-373及本文的参考文献。

用于培养细胞的培养基可以是适于宿主细胞生长的任何常规培养基，例如含有适当补充剂的极限培养基或复合培养基。合适的培养基可获自供应商或可按照已发表的配方制备(例如美国典型培养物保藏中心的目录)。然后用常规方法，从培养基中回收细胞产生的肽，包括通过离心或过滤将宿主细胞从培养基中分离出来。对于胞外产物，根据所述多肽的类型，通过以下方法分离上清液的蛋白质性组分：过滤、柱层析法或沉淀例如微过滤、超滤、等电沉淀、各种层析方法的纯化例如离子交换层析法、疏水作用层析法、凝胶过滤层析法、亲和层析法等。对于胞内或胞质产物，使自培养基分离的细胞破裂或透化，提取以回收产物多肽或其前体。

编码多肽的DNA序列可适宜是基因组或cDNA来源，例如按照标准技术，通过制备基因组或cDNA文库，并使用特异性DNA或RNA探针通过杂交，筛选编码全部或部分肽的DNA序列而获得(参见例如Sambrook,J,Fritsch,EF和Maniatis,T,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratoryPress,New York,1989)。编码多肽的DNA序列还可通过以下已确立的标准方法合成制备：例如Beaucage和Caruthers，Tetrahedron Letters(1981)22，1859-1869描述的亚磷酸酰胺(phosphoamidite)方法或Matthes等，EMBO Journal(1984)3，801-805描述的方法。还可按例如US4,683,202或Saiki等，Science(1988)239，487-491所述，使用特异性引物，通过聚合酶链式反应来制备DNA序列。

可将编码待表达的肽的DNA序列***适宜进行重组DNA方法的任何载体中，载体的选择常常取决于其将导入其中的宿主细胞。因此，载体可为自发复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒。或者，载体可以是当导入宿主细胞时整合至宿主细胞基因组并与其整合到其中的染色体一起复制的载体。

载体可以是其中编码多肽的DNA序列与DNA转录所需的其它区段(例如启动子)有效连接的表达载体。启动子可以是任何DNA序列，其在所选宿主细胞中具有转录活性，可来源于编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。用于指导编码待表达的肽的DNA在各种宿主细胞中转录的合适启动子的实例是本领域众所周知的，参见例如Sambrook等，同上。

必要时，编码待表达的肽的DNA序列还可与合适的终止子、多腺苷酸化信号、转录增强子序列和翻译增强子序列有效连接。本发明的重组载体还可包含使载体能够在所述宿主细胞中复制的DNA序列。

载体还可包含选择标记，例如其产物补偿宿主细胞缺陷或者赋予氨苄西林、卡那霉素、四环素、氯霉素、新霉素、潮霉素或甲氨蝶呤等药物抗性的基因。对于大批生产，选择标记可以不是例如抗生素抗性的，例如当载体用于大批生产时，载体中的抗生素抗性基因可被切离。用于从载体中消除抗生素抗性基因的方法是本领域已知的，参见例如US6,358,705，其通过引用结合到本文中。

为了将待表达的肽引入宿主细胞的分泌途径，在重组载体中可提供分泌信号序列(亦称前导序列、前序列原(prepro-sequence)或前序列)。将分泌信号序列在正确读框中与编码肽的DNA序列连接。分泌信号序列通常位于编码肽的DNA序列的5’。分泌信号序列可为与肽正常结合的序列或可以来自编码另一分泌蛋白的基因。

分别连接编码待表达的肽的DNA序列、启动子和任选终止子和/或分泌信号序列，并将其***含有复制必需的信息的合适载体中所使用的方法为本领域技术人员所熟知(参见例如Sambrook等，同上)。

向其中导入DNA序列或重组载体的宿主细胞可以是能够产生本发明肽的任何细胞，包括细菌、酵母、真菌和高等真核细胞。众所周知并用于本领域的合适宿主细胞的实例为大肠杆菌(E.coli)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或者哺乳动物BHK或CHO细胞系，但并不限于此。待表达的肽还可通过使用本领域普遍已知的体外转录/翻译***产生。

胆汁酸接头

一方面，本发明涉及胆汁酸接头。可按下文化学法部分中所述制备本发明的生长激素缀合物。缀合方法包括胆汁酸接头的共价连接，胆汁酸接头取决于所采用的方法，可用下式描述：

A-W-B1-NH₂、A-W-B1-CHO、A-W-B1-LG、A-W-B1-C(O)NHCH₂-CH=CH₂和

其中A表示胆汁酸残基，B1表示亲水间隔物，W是连接A和B1的化学基团。下文提供有关与胆汁酸残基、间隔物和连接基团W有关的A、W和B1的更多详情。

B1可视为下文描述的B的部分：

A-W-B1-NH₂->A-W-B1-NH-GH->A-W-B-GH(B=B1-NH)

A-W-B1-CHO->A-W-B1-CH₂-GH->A-W-B-GH(B=B1-CH₂-)

A-W-B1-LG->A-W-B1-GH->A-W-B-GH(B1=B)

A-W-B1-C(O)NHCH₂-CH=CH₂->A-W-B1-C(O)NHCH₂-CH₂-CH₂-GH->A-W-B-GH

(B=B1-C(O)NHCH₂-CH₂-CH₂-)和

胆汁酸残基

胆汁酸在自然界中以各种形式存在，还可在与生长激素化合物缀合前对其进行修饰。

按照本发明，生长激素缀合物包含选自以下的胆汁酸残基(A)：胆烷酸、胆酸、鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、乌索脱氧胆酸、石胆酸、甘胆酸盐、甘氨脱氧胆酸盐、甘氨鹅脱氧胆酸盐、牛磺胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐和牛磺鹅脱氧胆酸盐。

在一个实施方案中，胆汁酸接头和/或生长激素缀合物包含选自以下的胆汁酸残基(A)：

其中(*)表示亲水间隔物(B)通过W的连接点。

在一个实施方案中，胆汁酸残基(A)为胆酸残基，这类胆酸残基选自：

且其中(*)表示亲水间隔物(B)通过W的连接点。

由上可见，在一个实施方案中，胆酸残基可经由胆酸残基的“3”、“7”、“12”或“24”位通过W与亲水间隔物(B)连接。

在一个实施方案中，胆酸残基经由“3”、“7”或“12”位通过W与亲水间隔物(B)连接。

在一个实施方案中，胆酸残基经由“3”位通过W与亲水间隔物(B)连接。

在一个实施方案中，胆酸残基经由“7”位通过W与亲水间隔物(B)连接。

在一个实施方案中，胆酸残基经由“12”位通过W与亲水间隔物(B)连接。

亲水间隔物

胆汁酸接头和/或生长激素缀合物的进一步的特征在于存在亲水间隔物。亲水间隔物旨在提供自生长激素化合物与胆汁酸残基的合适距离，以使胆汁酸接头的功能性最优化。其它功能性可与间隔物的基团以及各个接头相关，例如缀合物的优良合成或优良的次级作用。

亲水间隔物(B)的溶解性可通过其logP值来描述。LogP，亦称为分配系数，是在平衡时两种不混溶溶剂的混合物的两相中化合物的浓度之比的对数。通常一种溶剂是水，而第二种选自辛-1-醇、氯仿、环己烷和丙二醇二壬酸酯(PGDP)。在这些不同溶剂中测量的LogP值显示主要由氢键结合效应引起的差异。辛醇可捐出和接受氢键，而环己烷是惰性的。氯仿可捐出氢键，而PGDP只可接受氢键。

在本发明的一个实施方案中，亲水间隔物在辛-1-醇、氯仿、环己烷和丙二醇二壬酸酯(PGDP)中的LogP低于-0.5。

在进一步的实施方案中，亲水间隔物在辛-1-醇、氯仿、环己烷和丙二醇二壬酸酯(PGDP)中的logP低于-1。

或者，可应用已发表的算法，计算亲水间隔物部分的LogP值为mLogP和/或cLogP(J.Am.Chem.Soc.(1964),865175-5180"A New Substituent Constant,Pi,Derived from Partition Coefficients(从分配系数推导的新的取代基常数π)",C.A.Lipinski等.Advanced Drug Delivery Reviews,(1997)233-25,"Experimental andComputational Approaches to Estimate Solubility and Permeability in Drug Discoveryand Development Settings(在药物研发和发展背景下估算溶解性和渗透性的实验和计算方法)"和I.Moriguchi,S.Hirono,I.Nakagome,H.Hirano,Chem.Pharm.Bull.(1994)42976-978"Comparison of Reliability of logP Values for Drugs Calculated bySeveral Methods(通过几种方法计算的药物logP值的可靠度的比较)")。

在本发明的一个实施方案中，亲水间隔物的mLogP<0。在进一步的实施方案中，亲水间隔物(hydrophilic space)的mLogP低于-0.50，例如低于-1.00。例如低于-1.50、-2.00、-2.50、-3.00、-3.50、-4.00或4.50。

在本发明的一个实施方案中，亲水间隔物的cLogP<0。在进一步的实施方案中，亲水间隔物的cLogP低于-0.50，例如低于-1.00。例如低于-1.50、-2.00、-2.50、-3.00、-3.50、-4.00或4.50或例如低于-5.00、-5.50或-6.00。

当使改性基团(例如胆酸残基)与多肽和蛋白质缀合时，蛋白质和胆酸残基间的距离可影响最终化合物的功能性，因此使用亲水间隔物可能是有利的。使用亲水间隔物可提高最终化合物的水溶性以及提高这类化合物的收率和合成简易性，因为接头(包括亲水间隔物)和蛋白质间的缀合反应常常在缓冲水溶液环境中进行。如下文所见，用于本发明的亲水间隔物提供呈COOH基团形式的多个负电荷和/或呈(-CH2-CH2-O-)n重复的额外极性，这两者无疑可分别影响溶解性。

在一个实施方案中，亲水间隔物是利用包含至少5个非氢原子(其中其30-50%为N或O)的化学部分将生长激素化合物与胆汁酸残基分隔开的间隔物。

在一个实施方案中，亲水间隔物是利用包含0-5个COOH基团的化学部分将生长激素化合物与胆汁酸残基分隔开的间隔物。

在一个实施方案中，亲水间隔物是利用包含0-100个-CH₂-CH₂-O-基团的化学部分将生长激素化合物与胆汁酸残基分隔开的间隔物。

在一个实施方案中，亲水间隔物(B)包含至少一个OEG基序，基团8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(dioxaoctanic acid)即-NH-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-O-CH₂-CO-。在进一步的实施方案中，亲水间隔物包含至少两个OEG基序。在一个实施方案中，这类OEG基序的取向使得-CO-最接近生长激素化合物，-NH-最接近白蛋白结合残基。

在包含两个OEG基序的其它实施方案中，两个基序具有相同的方向或不同的方向。在一个实施方案中，两个这类OEG基序彼此邻接定位，而在备选的实施方案中，这类OEG基序被共价连接的一个或多个原子分隔开。

在一个实施方案中，亲水间隔物包含至少一个谷氨酸残基。谷氨酸包含两个羧酸基团。其可使用γ-羧基与赖氨酸的ε-氨基，或与OEG分子的氨基(如存在的话)，或与另一个Glu残基的氨基(如果存在的话)形成酰胺键。或者可使用α-羧基与赖氨酸的ε-氨基，或与OEG分子的氨基(如存在的话)，或与另一个Glu残基的氨基(如果存在的话)形成类似的酰胺键。Glu的氨基进而可与白蛋白结合残基的羧基，或与OEG基序的羧基(如果存在的话)，或与另一个Glu的γ-羧基或α羧基(如果存在的话)形成酰胺键。

在一个实施方案中，亲水间隔物(B)可包含两个或更多个谷氨酸残基。一个Glu的氨基与第二个Glu的γ-羧基的连接可称为“γ-Glu”基序。

在一个实施方案中，亲水间隔物包含至少一个组合的OEG-Glu基序(-NH-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-O-CH₂-CO-NH-CH(-COOH)-(CH₂)₂-CO-)或至少一个组合的Glu-OEG基序(-NH-CH(-COOH)-(CH₂)₂-CO-NH-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-O-CH₂-CO-)或其组合，其中这类Glu-OEG和OEG-Glu基序可被一个或多个共价连接的原子分隔开，或通过Glu形成γl-Glu的酰胺键彼此直接键合。

在一个实施方案中，亲水间隔物(B)具有下式

-X₁-X₂-X₃-X₄-

其中

X₁为-W₁-[(CHR³)_I1-W₂]_m1-{[(CH₂)_n1E1]_m2-[(CHR⁴)_I2-W₃]_m3}_n2-，

X₂为-[(CHR⁵)_I3-W₄]_m4-{[(CH₂)_n3E2]_m5-[(CHR⁶)_I4-W₅]_m6}_n4-，

X₃为-[(CHR⁷)_I5-W₆]_m7-，

X₄为F-D1-(CH₂)_I6-D2-，

I1、I2、I3、I4、I5和I6独立选自0-10，

m1、m3、m4、m6和m7独立选自0-6，

m2和m5独立选自0-6，

n1、n2、n3和n4独立选自0-6，

F为芳基、杂芳基、吡咯烷-2,5-二酮或价键，

其中芳基和杂芳基被卤素、-CN、-OH、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)₂OH或C_1-6-烷基任选取代，

R³、R⁴、R⁵、R⁶和R⁷独立选自氢、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)OH、-S(O)₂OH、-NH-C(=NH)-NH₂、C_1-6-烷基、芳基或杂芳基；

其中烷基、芳基和杂芳基被卤素、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)OH、-S(O)₂OH、-CN或-OH任选取代，

D1、D2、E1和E2独立选自-O-、-N(R⁸)-、-N(C(O)R⁹)-或价键；其中R⁸和R⁹独立表示氢或C_1-6-烷基，

W₁-W₆独立选自-NH-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-NHC(O)C_1-6-烷基、-C(O)NHC_1-6-烷基、-CH₂C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH₂)_s2-、-C(O)-或价键；其中s2为0或1。

在更具体的实施方案中，间隔物如上定义，其中

I1、I2、I3、I4、I5和I6独立地为0-6，

m1、m3、m4、m6和m7独立地为0-6，

m2和m5独立地为0-6，和

n1、n2、n3和n4独立地为0-6。

在更具体的实施方案中，间隔物如上定义，其中D1和D2独立选自-O-或价键。

在更具体的实施方案中，间隔物如上定义，其中E1和E2独立选自-O-或价键。

在更具体的实施方案中，间隔物如上定义，其中W₁-W₆独立选自：-NH-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-NHC(O)C_1-6-烷基或-C(O)NHC_1-6-烷基和价键。

在更具体的实施方案中，间隔物如上定义，其中R³、R⁴、R⁵、R⁶和R⁷独立选自氢、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)₂OH或C_1-6-烷基；其中烷基被-C(O)OH、-C(O)NH₂或-S(O)₂OH任选取代。

在本发明的另一个实施方案中，生长激素缀合物包含选自以下的亲水间隔物(B)：

化学连接基团

胆汁酸接头和/或生长激素缀合物的进一步特征在于由胆酸接头的合成方法而定的化学连接基团(w)。化学连接基团是胆汁酸残基(A)和亲水间隔物(B)连接的结果，确切地说，作为化学活性基团的用于合成接头的中间体在胆汁酸接头合成期间可以改变(A-W-B1-X)，其中X为离去基团(LG)例如卤素或可参与形成B1和被缀合的化合物(例如hGH或备选化合物)间的共价化学键的化学活性基团。

在一个实施方案中，化学基团(W)选自：-NR¹-、-NHC(O)[CH₂]_n1C(O)-、-NHC(O)CH=CHC(O)-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、或-C(O)-；

其中R¹选自氢或-[CH₂]_n2R²，n2为1-4，R²选自-C(O)OH、-S(O)₂OH或四唑-1-基，其中n1为2-8。

在一个实施方案中，化学基团(X)选自：-NH₂、-CHO、-LG、-C(O)NHCH₂-CH=CH₂，或

其中LG为卤素。

生长激素缀合物

如本文所述，通过本文所述生长激素化合物和胆汁酸接头共价连接形成生长激素缀合物。

胆汁酸接头可与生长激素化合物的任何残基共价结合，只要如之前部分所述保持GH的活性。在一个实施方案中，GH在野生型氨基酸残基上缀合。

在一个实施方案中，GH在选自以下的野生型氨基酸残基上缀合：N端、C端、Gln40和Gln141。

在一个实施方案中，GH在突变体残基上缀合。

在一个实施方案中，GH在突变体残基上缀合，所述突变体残基是作为单点突变引入生长激素化合物中的cys残基。

在一个实施方案中，生长激素缀合物选自：

和

制备生长激素缀合物的方法

以下本文提供的化学法部分描述了适于制备本发明的生长激素缀合物的方法。本领域技术人员可了解制备这类缀合物的备选方法。

本发明的一个方面涉及用于制备生长激素缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：

a)使胆汁酸接头与生长激素化合物(GH)缀合，和

b)得到生长激素缀合物。

在一个实施方案中，所得到的生长激素缀合物用本文所述的式I限定，其中A表示胆汁酸残基，B表示亲水间隔物，W是连接A和B的化学基团。

在一个实施方案中，用于所述方法的胆汁酸接头选自：

A-W-B1-NH₂、A-W-B1-CHO、A-W-B1-LG、A-W-B1-C(O)NHCH₂-CH=CH₂和

其中A表示胆汁酸残基，B1表示亲水间隔物，W是连接A和B1的化学基团。

根据本文的描述，显然，B1与有关所得到的生长激素缀合物的亲水间隔物中定义的B有关。

在一个实施方案中，亲水间隔物B1包含亲水间隔物B的任一个特征。在一个实施方案中，所得到的生长激素缀合物的亲水间隔物B包含亲水间隔物B1。

在一个实施方案中，亲水间隔物B1具有下式：-X₁-X₂-X₃-X₄-

其中

X₂为-[(CHR⁵)_I3-W₄]_m4-{[(CH₂)_n3E2]_m5-[(CHR⁶)_I4-W₅]_m6}_n4-，

X₃为-[(CHR⁷)_I5]_m7-，

X₄为价键，

I1、I2、I3、I4和I5独立选自0-10，

m1、m3、m4、m6和m7独立选自0-6，

m2和m5独立选自0-6，

n1、n2、n3和n4独立选自0-6，

E1和E2独立选自-O-、-NR⁸-、-N(COR⁹)-或价键；

其中R⁸和R⁹独立表示氢或C_1-6-烷基，

W₁-W₆独立选自-NH-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH₂)_s2-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)-或价键；其中s2为0或1。

药物组合物

本发明还涉及包含本文定义和描述的生长激素缀合物的药物组合物。

在一个实施方案中，可以若干剂型给予本发明的药物组合物，例如作为溶液剂、混悬剂、乳剂、微乳剂、复合型乳剂、泡沫剂、药膏剂、糊剂、硬膏剂(plaster)、软膏剂、片剂、包衣片剂、用吸收促进化合物共配制的片剂、冲洗剂、胶囊剂(例如硬明胶胶囊剂和软明胶胶囊剂)、包衣胶囊剂、栓剂、滴剂、凝胶剂、喷雾剂、散剂、微粒剂、纳米粒剂、气雾剂、吸入剂、注射用溶液剂、原位转化溶液剂(insitu transforming solution)(例如原位胶凝剂、原位沉降剂、原位沉淀剂、原位结晶剂)、输液剂和植入剂。

在本发明的一个实施方案中，可通过口服、皮下、肌内、经鼻和静脉内给药给予药物组合物。

在本发明的一个实施方案中，可以通过若干给药途径给予药物组合物，例如舌、舌下、含服、口内、直肠、胃或肠内。

在一个实施方案中，使用全部为本领域技术人员熟知的装置，例如定量吸入器、干粉吸入器和喷雾器，将本发明的药物组合物用于固体剂、半固体剂、散剂和溶液剂的组合物中以用于经肺给予肽缀合物，例如GH缀合物。

在一个实施方案中，本发明的药物组合物还可以例如通过共价、疏水或静电相互作用与药物载体、药物递送***或高级药物递送***混配或连接，以进一步提高GH缀合物的稳定性、提高生物利用度、提高溶解度、降低不良反应、实现本领域技术人员熟知的计时治疗和提高患者顺应性或其任何组合。载体、药物递送***和高级药物递送***的实例包括但不限于聚合物，例如纤维素及衍生物、多糖(例如葡聚糖及衍生物、淀粉及衍生物、脱乙酰壳多糖及衍生物)、聚乙烯醇、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯聚合物、聚乳酸和聚乙醇酸及其嵌段共聚物、聚乙二醇、载体蛋白(例如白蛋白)、凝胶(例如热凝胶***，例如本领域技术人员熟知的嵌段共聚物***)、微团、脂质体、微球、纳米颗粒、液晶及其分散体、脂质-水***的相特征领域技术人员熟知的L2相及其分散体、聚合物微团、复乳(自乳化和自微乳化)、环糊精及其衍生物和树枝状大分子。

通过引入结合到本文的用于口服制剂的递送***的多个实例包括表面活性剂，已知其增加亲水化合物的渗透。表面活性剂的实例为癸酸钠、酒石酸、Brij56、Brij58、Brij35、Brij30、脂肪酸糖、牛磺脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠、对叔辛基酚聚氧乙烯-9.5(Triton X-100)(参见Takatsuka等,Eur.J.Pharm.Biopharm.(2006)62，52-58(2006))。口服递送***还可包括蛋白酶抑制剂和粘液溶解物质。蛋白酶抑制剂的实例为大豆胰蛋白酶抑制剂、抑肽酶和胰凝乳蛋白酶抑制剂。粘液溶解物质的实例为二硫苏糖醇(dithiotreitol)和N-乙酰基半胱氨酸。通过同时使用溶真菌剂和表面活性剂来增强较不被吸收的亲水化合物的肠吸收。还有Emisphere开发的5-CNAC和类似化合物(WO2008/101240、WO2008/11283687、WO2008/027854、WO2008/014430、US2008/0095837)。

口服制剂递送***还可以包括紧密连接调节剂，其起上皮细胞的特异性紧密连接开具(opener)的功能。这些紧密连接调节剂暂时地或非暂时地起作用，并且干扰将上皮细胞紧密保持在一起的蛋白质复合体(Kondoh等，Mol Pharmacology(2005)67，749-756)。口服制剂递送***的其它实例包括粘膜粘着剂，例如含有硫醇的添加剂(共制剂)或共价连接的侧链可以增加与粘膜层、脱乙酰壳多糖和卡波姆分子、聚丙烯酸酯、PEG及其衍生物的粘附(Palmberger等,Eur.J.Pharm.Biopharm.(2007)66，405-412；Leitner，V.M等,Eur.J.Pharm.Biopharm.(2003)56，207-214；H.L.Leuβen等,Parm.Res.(1996)13,1668-1672；H.L.Leuβen等,Int.J.Pharmaceuticals(1996)141,39-52；Takatsuka等,Eur.J.Pharm.Biopharm.(2006)62，52-58。口服制剂递送***的其它实例包括胞膜窖/脂质筏、SMVT(钠依赖性的多种维生素运载蛋白)。口服递送制剂的另一个实例包括受体介导的转胞吞作用(trancytosis)，例如使用维生素B12(钴胺素)作为底物的IRF(内因子受体)、FcRn(新生Fc受体)和运铁蛋白(M.Gumbleton,Adv.Drug.Del.Rev.(2001)49,281-300；K.C.Partlow等,Biomaterials(2008)29,3367-3375；Lee等,Biotechnol.Appl.Biochem.(2007)46,211-217；S.Y.Chae等,Bioconjugate Chem.(2008)19,334-341；Russell-JonesG.:载于Membrane Transporters as Drug Targets中的第17章(1999)；Said和Mohammed Curr.Opin.Gastroent.(2006)22,140-146；Chalasani等,J.Con.Release(2007)117,421-429；H.Li和Z.M.Qian Med.Res.Rev.(2002)22,225-250；Liang和Yang Biochem.Biophys.Res.Comm.(2005)225,734-738)。

在一个实施方案中，本发明的GH化合物发挥生长激素活性，可用于治疗可获益于循环生长激素的量增加的疾病或状态。这类疾病或状态包括生长激素缺乏(GHD)；特纳综合征；普-韦综合征(Prader-Willi syndrome,PWS)；努南综合征；唐氏综合征；慢性肾病、幼年型类风湿性关节炎、囊性纤维化；接受HAART治疗的儿童HIV感染(HIV/HALS儿童)；小于胎龄(SGA)出生的矮小儿童(shortchildren)；非SGA的以极低出生体重(VLBW)出生的儿童的身材矮小症；骨骼发育不良；软骨发育不良；软骨发育不全；特发性身材矮小症(ISS)；成人GHD；长骨骨折，所述长骨为例如胫骨、腓骨、股骨、肱骨、桡骨、尺骨、锁骨、掌骨(matacarpea)、跖骨(matatarsea)和指骨(digit)；海绵骨例如头骨(scull)、手腕骨(baseof hand)和脚底骨(base of food)的骨折；例如手、膝或肩中的腱或韧带手术后的患者；经历或进行牵引成骨作用(distraction oteogenesis)的患者；髋关节置换或关节盘置换(discus replacement)、半月板修复、脊柱融合或例如在膝、髋、肩、肘、腕或颚中的假体固定后的患者；其中已固定骨接合材料(例如钉、螺钉和板)的患者；骨折不愈合或畸形愈合的患者；例如胫骨或第一脚趾骨解剖(osteatomsia)后的患者；移植物植入后的患者；创伤或关节炎引起的膝关节软骨退化；特纳综合征患者中的骨质疏松症；男性骨质疏松症；长期透析的成年患者(APCD)；APCD中营养不良相关的心血管疾病；APCD中的恶病质逆转；APCD中的癌症；APCD中的慢性阻塞性肺病(chronic abstractive pulmonal disease)；APCD中的HIV；APCD老年人；APCD中的慢性肝病、APCD中的疲劳综合征；克罗恩病(Chron’sdisease)；肝功能受损；患有HIV感染的男性；短肠综合征；向心性肥胖；HIV相关脂肪营养不良综合征(HALS)；***；重大选择性手术、酒精/药物解毒或神经创伤后的患者；衰老；虚弱的老年人；骨关节炎；创伤性损伤的软骨；***功能障碍；纤维肌痛；记忆障碍；抑郁；创伤性脑损伤；蛛网膜下腔出血；极低出生体重；代谢综合征；糖皮质激素性肌病或糖皮质激素治疗导致的儿童身材矮小症。生长激素还可用于加快肌肉组织、神经组织或创伤的愈合；加快或改善血液流到受损组织；或降低受损组织的感染率。

在一个实施方案中，本发明涉及治疗疾病的方法，其中生长激素化合物活性可用于治疗可获益于循环生长激素化合物的量增加的疾病或状态，所述方法包括给予患者有效量的SEQ ID No.1的生长激素化合物或其缀合物的药物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种方法，所述方法包括给予有需要的患者治疗有效量的本发明的生长激素化合物。本发明因此提供用于治疗这些疾病或状态的方法，所述方法包括给予有需要的患者治疗有效量的本发明的生长激素化合物。

本文使用的本发明化合物的“治疗有效量”意指足以治愈、减轻或部分抑制给定疾病及其并发症的临床表现的量。将足以实现这一目的的量定义为“治疗有效量”。对每一目的而言，有效量将取决于例如疾病或损伤的严重性以及受试者的体重、性别、年龄和总体状态。应当理解，使用常规实验可以确定合适的剂量，这完全属于受过训练的医师或兽医的普通技术范围。

在一个实施方案中，本发明提供生长激素化合物或其缀合物在制备用于治疗上述疾病或状态的药物中的用途。

在本文中定义和描述的本发明的生长激素化合物欲用作治疗性蛋白质。

本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利均通过引用以其整体结合到本文中，其程度与分别具体指明每一参考文献通过引用结合以及在本文中以其整体提供相同(至法律允许的最大程度)。

在本文中使用的所有标题与副标题仅为了方便，而不应解释成以任何方式限制本发明。

本文提供的任何和全部实施例或示例性用语(例如“例如”)的使用，只是欲更好地阐明本发明，并不对本发明的范围进行限制，除非另有说明。说明书中任何用语都不应解释为表明任何非要求保护的要素是实施本发明所必需的。

本文中专利文献的引用和结合只是为了方便，并不反映对这些专利文献的有效性、专利性和/或可实施性有任何观点。

根据适用法律的许可，本发明包括随附权利要求书中所述主题的所有的修改和等同内容。

下面通过本文提供的实施方案的非限制性列表，对本发明作进一步地描述。

实施方案1.一种下式(I)的生长激素缀合物和药学上可接受的盐

A-W-B-GH(I)

其中

GH表示生长激素化合物，

A表示胆汁酸残基，

B表示与GH共价连接的亲水间隔物，

W是连接A和B的化学基团。

实施方案2.实施方案1的生长激素缀合物，其中与SEQ ID NO1限定的人生长激素(hGH)相比，所述生长激素化合物GH包含一个或多个额外的二硫键。

实施方案3.实施方案2的生长激素缀合物，其中所述生长激素化合物GH包含连接环区段和螺旋区段的一个或多个额外的二硫键。

实施方案4.前述实施方案中任一个的生长激素缀合物，其中所述生长激素化合物包含至少一对突变，所述突变对应于SEQ ID NO1中的R16C/L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、D26/V102C、D26/Y103C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C和/或V185C/S188C。

实施方案5.实施方案4的生长激素缀合物，其中所述生长激素化合物包含至少一对突变，所述突变对应于SEQ ID NO1中的A17C/E174C、H21C/M170C、D26/V102C、D26/Y103C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C、F92C/T148C和/或R94C/D107C。

实施方案6.前述实施方案中任一个的生长激素缀合物，其中所述生长激素化合物包含额外的二硫键，其中至少一个半胱氨酸存在于对应于SEQ ID NO1中的AA128-154的L3中或存在于例如对应于SEQ ID NO1中的AA135-148的区域中。

实施方案7.实施方案6的生长激素缀合物，其中额外的二硫键的至少一个半胱氨酸存在于L3中对应于SEQ ID NO1中的AA141、AA142、AA143、AA144、AA145或AA146、优选AA143或AA144的位置上。

实施方案8.实施方案6的生长激素缀合物，其中所述生长激素化合物包含至少一对突变，所述突变对应于SEQ ID NO1中的F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C和/或F92C/T148C。

实施方案9.实施方案8的生长激素缀合物，其中所述生长激素化合物包含至少一对突变，所述突变对应于SEQ ID NO1中的F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C和/或F92C/T148C。

实施方案10.前述权利要求中任一项的生长激素缀合物，其中所述生长激素化合物包含连接L3与L1的额外二硫键。

实施方案11.实施方案10的生长激素缀合物，其中所述化合物包含将对应于SEQ ID NO1中的L3中的AA54、AA55、AA56、AA57、AA58或AA59的氨基酸残基与对应于L1中的AA143或AA144的氨基酸连接的额外二硫键。

实施方案12.实施方案11的生长激素缀合物，其中所述化合物包含至少一对突变，所述突变对应于SEQ ID NO1中的F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C和/或S71C/S132C。

实施方案13.实施方案2-9中任一个的生长激素缀合物，其中所述生长激素化合物包含连接L3与螺旋区段的额外二硫键。

实施方案14.实施方案13的生长激素缀合物，其中所述生长激素化合物包含连接L3与螺旋2的额外二硫键。

实施方案15.实施方案14的生长激素缀合物，其中所述化合物包含将对应于SEQ ID NO1的H2中的AA84或AA85的氨基酸残基与对应于L3中的AA143或AA144的氨基酸连接的额外二硫键。

实施方案16.实施方案14的生长激素缀合物，其中所述化合物包含至少一对突变，所述突变对应于SEQ ID No.1的L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C和F92C/T148C。

实施方案17.实施方案16的生长激素缀合物，其中所述化合物包含至少一对突变，所述突变对应于SEQ ID NO1中的L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C和/或F92C/T148C。

实施方案18.实施方案1-9中任一个的生长激素缀合物，其中所述生长激素化合物包含连接L2与螺旋1的额外二硫键。

实施方案19.实施方案18的生长激素缀合物，其中所述化合物包含至少一对突变，所述突变对应于D26C/V102C或D26C/Y103C。

实施方案20.前述实施方案中任一个的生长激素缀合物，其中所述多肽序列与SEQ ID NO1限定的hGH有至少80%、例如90%、例如95%、例如96%、例如97%、例如98%或例如99%同一性。

实施方案21.前述实施方案中任一个的生长激素缀合物，其中所述生长激素化合物包含至少一个单点突变位于蛋白酶位点。

实施方案22.前述实施方案中任一个的生长激素缀合物，其中所述生长激素化合物包含至少一个单点突变，其位于对应于SEQ ID NO1的1-55、57、58、60-63、67-87、89-91、93、95-100、102-128、131-132、135-139、141、142、144、148-182、184、185和/或187-191位的位置上。

实施方案23.前述实施方案中任一个的生长激素缀合物，其中所述生长激素化合物包含至少一个单点突变，其位于对应于SEQ ID NO1的55、57、62、101、134、136、142和/或144位的位置上。

实施方案24.前述实施方案中任一个的生长激素缀合物，其中至少一个单点突变存在于L1(对应于SEQ ID NO1的AA36-71)和/或L3(对应于SEQ ID NO1的AA128-154)中。

实施方案25.实施方案24的生长激素缀合物，其中至少一个单点突变存在于L1中。

实施方案26.实施方案25的生长激素缀合物，其中至少一个单点突变存在于L1的中区(对应于SEQ ID NO1的AA40-65)。

实施方案27.实施方案26的生长激素缀合物，其中至少一个单点突变存在于对应于SEQ ID NO1的40、41、42和/或62位的位置上。

实施方案28.实施方案24的生长激素缀合物，其中至少一个单点突变存在于L3中。

实施方案29.实施方案28的生长激素缀合物，其中至少一个单点突变存在于L3的中区(对应于SEQ ID NO1的AA135-148)。

实施方案30.实施方案29的生长激素缀合物，其中至少一个单点突变存在于对应于SEQ ID NO1的134、136、139、142和/或144位的位置上。

实施方案31.前述实施方案中任一个的生长激素缀合物，其中所述化合物的体外活性是SEQ ID NO1限定的野生型hGH的活性的至少5%。

实施方案32.前述实施方案中任一个的生长激素缀合物，其中所述多肽的功能性体内半寿期是人生长激素的2倍或更多倍。

实施方案33.前述实施方案中任一个的生长激素缀合物，其中所述多肽的功能性体内半寿期是人生长激素的2倍至10倍。

实施方案34.前述实施方案中任一个的生长激素缀合物，其中所述生长激素缀合物对以下一种或多种蛋白酶的降解是稳定的：例如消化蛋白酶，例如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶和/或弹性蛋白酶。

实施方案35.实施方案34的生长激素缀合物，其中所述化合物对胰凝乳蛋白酶和/或弹性蛋白酶的降解是稳定的。

实施方案36.实施方案35的生长激素缀合物，其中所述生长激素化合物包含至少一对突变，所述突变对应于SEQ ID NO1中的H21C/M170C、D26C/V102C、D26C/Y103C、F54C/Y143C、F54C/S144C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C和/或S85C/S144C。

实施方案37.实施方案36的生长激素缀合物，其中所述生长激素化合物包含至少一对突变，所述突变对应于SEQ ID NO1中的D26C/V102C、D26C/Y103C、S57C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C、F92C/T148C和/或R94C/D107C。

实施方案38.实施方案35的生长激素缀合物，其中所述生长激素化合物包含至少一对突变，所述突变对应于SEQ ID NO1中的S57C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C和/或S85C/S144C。

实施方案39.前述实施方案中任一个的生长激素缀合物，其中与SEQ ID NO1相比，一个或多个额外的二硫键通过至少两个氨基酸的氨基酸取代来获得。

实施方案42.前述实施方案中任一个的生长激素缀合物，其中与SEQ ID NO1相比，所述生长激素化合物包含正好一个额外的二硫键。

实施方案41.前述实施方案中任一个的生长激素缀合物，其中与SEQ ID NO1限定的人生长激素相比，所述生长激素化合物包含至少两个额外的半胱氨酸。

实施方案42.前述实施方案中任一个的生长激素缀合物，其中与SEQ ID NO1相比，所述化合物包含正好3个氨基酸取代。

实施方案43.前述实施方案中任一个的生长激素缀合物，与SEQ ID NO1限定的人生长激素相比，其包含正好两个额外的半胱氨酸和正好一个单点突变。

实施方案44.前述实施方案中任一个的生长激素缀合物，其中与SEQ ID NO1限定的人生长激素相比，所述生长激素化合物包含正好两个额外的半胱氨酸。

实施方案45.实施方案1-43中任一个的生长激素缀合物，其中与SEQ IDNO1限定的人生长激素相比，所述生长激素化合物包含正好3个额外的半胱氨酸。

实施方案46.实施方案45的生长激素缀合物，其中与SEQ ID NO1限定的人生长激素相比，所述生长激素化合物包含一个额外的二硫键和单个Cys突变。

实施方案47.实施方案46的生长激素缀合物，其中单个Cys突变选自GH的N端、H1、H2、L2或H3区中的任一个单个Cys突变。

实施方案48.实施方案46的生长激素缀合物，其中单个Cys突变选自对应于以下的突变：hGH(SEQ ID NO:1)中的T3C、P5C、S7C、D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C、Q40C、S55C、S57C、S62C、E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C和G126C。

实施方案49.实施方案47的生长激素缀合物，其中单个Cys突变位于对应于hGH的AA93-106、例如AA99-106或AA99-103的位置上。

实施方案50.前述实施方案中任一个的生长激素缀合物，其中GH在野生型氨基酸残基上缀合。

实施方案51.前述实施方案中任一个的生长激素缀合物，其中GH在选自以下的野生型氨基酸残基上缀合：N端、C端、Gln40和Gln141。

实施方案52.前述实施方案1-50中任一个的生长激素缀合物，其中GH在突变体残基上缀合。

实施方案53.实施方案52的生长激素缀合物，其中所述突变体残基是cys突变。

实施方案54.实施方案53的生长激素缀合物，其中所述cys突变选自对应于以下的突变：hGH(SEQ ID NO:1)中的T3C、P5C、S7C、D11C、H18C、Q29C、E30C、E33C、A34C、Y35C、Q40C、S55C、S57C、S62C、E88C、Q91C、S95C、A98C、N99C、S100C、L101C、V102C、Y103C、D107C、S108C、D112C、Q122C和G126C。

实施方案55.实施方案54的生长激素缀合物，其中所述cys突变体对应于人生长激素的L101C突变。

实施方案56.实施方案1-55中任一个的生长激素缀合物，其中与人生长激素相比，所述生长激素缀合物对以下一种或多种蛋白酶的蛋白水解性降解是稳定的：例如消化蛋白酶，例如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶和/或弹性蛋白酶。

实施方案57.实施方案1-56中任一个的生长激素缀合物，其中所述生长激素化合物经化学修饰以促进跨上皮的转运。

实施方案58.实施方案1-58中任一个的生长激素缀合物，其中当与wt hGH相比时，所述生长激素化合物经化学修饰以促进跨上皮的转运。

实施方案59.实施方案1-58中任一个的生长激素缀合物，其中当与wt hGH相比时，所述生长激素化合物经化学修饰以获得延长的功能性体内半寿期。

实施方案60.实施方案59的生长激素缀合物，其中所述生长激素化合物的功能性体内半寿期是hGH的2倍或更多倍。

实施方案61.实施方案60的生长激素缀合物，其中与hGH相比，功能性体内半寿期为2倍至10倍。

实施方案62.实施方案57-61中任一个的生长激素缀合物，其中化学修饰发生在不干扰生长激素化合物与hGHR结合的氨基酸残基上。

实施方案63.前述实施方案中任一个的生长激素缀合物，其中所述胆汁酸残基(A)选自：胆烷酸、胆酸、鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、乌索脱氧胆酸、石胆酸、甘胆酸盐、甘氨脱氧胆酸盐、甘氨鹅脱氧胆酸盐、牛磺胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐和牛磺鹅脱氧胆酸盐。

实施方案64.前述实施方案中任一个的生长激素缀合物，其中所述胆汁酸残基(A)选自：

其中(*)表示亲水间隔物(B)通过W的连接点。

实施方案65.前述实施方案中任一个的生长激素缀合物，其中所述胆汁酸残基(A)是胆酸残基。

实施方案66.实施方案65的生长激素缀合物，其中胆酸残基选自

其中(*)表示亲水间隔物(B)通过W的连接点。

实施方案67.实施方案63的生长激素缀合物，其中胆酸残基经由“3”、“7”、“12”或“24”位通过W与亲水间隔物(B)连接。

实施方案68.前述实施方案中任一个的生长激素缀合物，其中所述化学基团(W)选自：-NR¹-、-NHC(O)[CH₂]_n1C(O)-、-NHC(O)CH=CHC(O)-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-或-C(O)-；

其中R¹选自氢或-[CH₂]_n2R²，n2为1-4，R²选自-C(O)OH、-S(O)₂OH或四唑-1-基，且其中n1为2-8。

实施方案69.前述实施方案中任一个的缀合物，其中所述亲水间隔物(B)具有下式

-X₁-X₂-X₃-X₄-

其中

X₂为-[(CHR⁵)_I3-W₄]_m4-{[(CH₂)_n3E2]_m5-[(CHR⁶)_I4-W₅]_m6}_n4-，

X₃为-[(CHR⁷)_I5-W₆]_m7-，

X₄为F-D1-(CH₂)_I6-D2-，

I1、I2、I3、I4、I5和I6独立选自0-10，

m1、m3、m4、m6和m7独立选自0-6，

m2和m5独立选自0-6，

n1、n2、n3和n4独立选自0-6，

F为芳基、杂芳基、吡咯烷-2,5-二酮或价键，其中芳基和杂芳基被卤素、-CN、-OH、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)₂OH或C_1-6-烷基任选取代，

其中

烷基、芳基和杂芳基被卤素、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)OH、-S(O)₂OH、-CN或-OH任选取代，

实施方案70.实施方案69的缀合物，其中

I1、I2、I3、I4、I5和I6独立地为0-6，

m1、m3、m4、m6和m7独立地为0-6，

m2和m5独立地为0-6，和

n1、n2、n3和n4独立地为0-6。

实施方案71.实施方案69或70的缀合物，其中D1和D2独立选自-O-或价键。

实施方案72.实施方案69-71中任一个的缀合物，其中E1和E2独立选自-O-或价键。

实施方案73.实施方案69-72中任一个的缀合物，其中W₁-W₆独立选自：-NH-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-NHC(O)C_1-6-烷基或-C(O)NHC_1-6-烷基和价键。

实施方案74.实施方案69-73中任一个的缀合物，其中R³、R⁴、R⁵、R⁶和R⁷独立选自氢、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)₂OH或C_1-6-烷基；其中烷基被-C(O)OH、-C(O)NH₂或-S(O)₂OH任选取代。

实施方案75.前述实施方案中任一个的生长激素缀合物，其中所述亲水间隔物(B)的溶解度(mLogP)低于1。

实施方案76.前述实施方案中任一个的生长激素缀合物，其中所述亲水间隔物(B)包含至少一个OEG基序(-NH-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-O-CH₂-CO-)。

实施方案77.前述实施方案中任一个的生长激素缀合物，其中所述亲水间隔物(B)包含至少两个OEG基序(-NH-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-O-CH₂-CO-)。

实施方案78.前述实施方案中任一个的生长激素缀合物，其中所述亲水间隔物(B)包含至少一个谷氨酸残基。

实施方案79.前述实施方案中任一个的生长激素缀合物，其中所述亲水间隔物(B)包含至少一个谷氨酸残基。

实施方案80.前述实施方案中任一个的生长激素缀合物，其中所述亲水间隔物(B)包含至少一个赖氨酸残基。

实施方案81.前述实施方案中任一个的生长激素缀合物，其中所述亲水间隔物(B)包含至少一个谷氨酸残基，其通过α羧基或羧基与赖氨酸、OEG基序或另一个Glu残基的胺基形成酰胺键。

实施方案81.前述实施方案中任一个的生长激素缀合物，其中所述亲水间隔物(B)包含至少一个谷氨酸残基，其通过氨基与白蛋白结合残基的羧基(A)、OEG基序的羧基或另一个Glu的γ-羧基或α-羧基形成酰胺键。

实施方案82.前述实施方案中任一个的生长激素缀合物，其中所述亲水间隔物(B)选自：

实施方案83.前述实施方案中任一个的生长激素缀合物，其中所述缀合物选自：

实施方案84.一种用于制备实施方案1的生长激素缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：

a)使胆汁酸接头与生长激素化合物(GH)缀合，和

b)得到前述实施方案中任一个的生长激素缀合物。

实施方案85.实施方案84的方法，其中所述胆汁酸接头选自：

A-W-B1-NH₂、A-W-B1-CHO、A-W-B1-LG、A-W-B1-C(O)NHCH₂-CH=CH₂和

其中A表示胆汁酸残基，B1表示亲水间隔物，W是连接A和B的化学基团。

实施方案86.实施方案85的方法，其中所述亲水间隔物B1包含实施方案70-82中限定的亲水间隔物B的任一个特征，或者其中所述亲水间隔物B1为实施方案70-82限定的亲水间隔物B所包含。

实施方案87.实施方案85的方法，其中所述亲水间隔物B1具有下式：-X₁-X₂-X₃-X₄-

其中

X₂为-[(CHR⁵)_I3-W₄]_m4-{[(CH₂)_n3E2]_m5-[(CHR⁶)_I4-W₅]_m6}_n4-，

X₃为-[(CHR⁷)_I5]_m7-，

X₄为价键，

I1、I2、I3、I4和I5独立选自0-10，

m1、m3、m4、m6和m7独立选自0-6，

m2和m5独立选自0-6，

n1、n2、n3和n4独立选自0-6，

E1和E2独立选自-O-、-NR⁸-、-N(COR⁹)-或价键；其中R⁸和R⁹独立表示氢或C_1-6-烷基，

实施方案87.一种药物组合物，其包含实施方案1-83中任一个的生长激素缀合物和药学上可接受的载体。

实施方案88.实施方案87的药物组合物，其中可通过舌、舌下、含服、口内、口服、胃和肠内、经鼻、经肺、表皮、真皮、透皮和胃肠外将所述组合物给予患者。

实施方案89.实施方案87或88的药物组合物，其中所述组合物用于口服给药。

实施方案90.一种制备药物组合物的方法，其中所述组合物包含实施方案1-83中任一个的生长激素缀合物和药学上可接受的载体。

实施方案91.一种用于治疗疾病的方法，其中所述生长激素活性可用于治疗其中患者可获益于循环生长激素的量增加的疾病或状态，所述方法包括给予患者有效量的实施方案1-83中任一个的生长激素缀合物或实施方案87-89中任一个的药物组合物。

实施方案92.一种治疗其中患者可获益于生长激素活性提高的疾病或状态的方法，所述方法包括给予患者有效量的实施方案1-83中任一个的生长激素缀合物或实施方案87-89中任一个的药物组合物。

实施方案93.一种治疗实施方案90或91的疾病的方法，其中所述疾病选自生长激素缺乏(GHD)；特纳综合征；普-韦综合征(PWS)；努南综合征；唐氏综合征；慢性肾病、幼年型类风湿性关节炎；囊性纤维化；接受HAART治疗的儿童HIV感染(HIV/HALS儿童)；小于胎龄(SGA)出生的矮小儿童；非SGA的以极低出生体重(VLBW)出生的儿童的身材矮小症；骨骼发育不良；软骨发育不良；软骨发育不全；特发性身材矮小症(ISS)；成人GHD(GHDA)；长骨骨折，所述长骨为例如胫骨、腓骨、股骨、肱骨、桡骨、尺骨、锁骨、掌骨、跖骨和指骨；海绵骨例如头骨、手腕骨和脚底骨的骨折；例如手、膝或肩中的腱或韧带手术后的患者；经历或进行牵引成骨作用的患者；髋关节置换或关节盘置换、半月板修复、脊柱融合或例如在膝、髋、肩、肘、腕或颚中的假体固定后的患者；其中已固定骨接合材料例如钉、螺钉和板的患者；骨折不愈合或畸形愈合的患者；例如胫骨或第一脚趾骨解剖后的患者；移植物植入后的患者；创伤或关节炎引起的膝关节软骨退化；特纳综合征患者中的骨质疏松症；男性骨质疏松症；长期透析的成年患者(APCD)；APCD中营养不良相关的心血管疾病；APCD中的恶病质逆转；APCD中的癌症；APCD中的慢性阻塞性肺病；APCD中的HIV；APCD老年人；APCD中的慢性肝病，APCD中的疲劳综合征；克罗恩病；肝功能受损；患有HIV感染的男性；短肠综合征；向心性肥胖；HIV相关脂肪营养不良综合征(HALS)；***；重大选择性手术、酒精/药物解毒或神经创伤后的患者；衰老；虚弱的老年人；骨关节炎；创伤性损伤的软骨；***功能障碍；纤维肌痛；记忆障碍；抑郁；创伤性脑损伤；蛛网膜下腔出血；极低出生体重；代谢综合征；糖皮质激素性肌病或糖皮质激素治疗导致的儿童身材矮小症。

实施方案94.用作药物的实施方案1-83中任一个的生长激素缀合物。

实施方案95.实施方案1-83中任一个的生长激素缀合物用作用于治疗选自以下的疾病的药物：生长激素缺乏(GHD)；特纳综合征；普-韦综合征(PWS)；努南综合征；唐氏综合征；慢性肾病、幼年型类风湿性关节炎；囊性纤维化；接受HAART治疗的儿童HIV感染(HIV/HALS儿童)；小于胎龄(SGA)出生的矮小儿童；非SGA的以极低出生体重(VLBW)出生的儿童的身材矮小症；骨骼发育不良；软骨发育不良；软骨发育不全；特发性身材矮小症(ISS)；成人GHD(GHDA)；长骨骨折，所述长骨为例如胫骨、腓骨、股骨、肱骨、桡骨、尺骨、锁骨、掌骨、跖骨和指骨；海绵骨例如头骨、手腕骨和脚底骨的骨折；例如手、膝或肩中的腱或韧带手术后的患者；经历或进行牵引成骨作用的患者；髋关节置换或关节盘置换、半月板修复、脊柱融合或例如在膝、髋、肩、肘、腕或颚中的假体固定后的患者；其中已固定骨接合材料例如钉、螺钉和板的患者；骨折不愈合或畸形愈合的患者；例如胫骨或第一脚趾骨解剖后的患者；移植物植入后的患者；创伤或关节炎引起的膝关节软骨退化；特纳综合征患者中的骨质疏松症；男性骨质疏松症；长期透析的成年患者(APCD)；APCD中营养不良相关的心血管疾病；APCD中的恶病质逆转；APCD中的癌症；APCD中的慢性阻塞性肺病；APCD中的HIV；APCD老年人；APCD中的慢性肝病，APCD中的疲劳综合征；克罗恩病；肝功能受损；患有HIV感染的男性；短肠综合征；向心性肥胖；HIV相关脂肪营养不良综合征(HALS)；***；重大选择性手术、酒精/药物解毒或神经创伤后的患者；衰老；虚弱的老年人；骨关节炎；创伤性损伤的软骨；***功能障碍；纤维肌痛；记忆障碍；抑郁；创伤性脑损伤；蛛网膜下腔出血；极低出生体重；代谢综合征；糖皮质激素性肌病和糖皮质激素治疗导致的儿童身材矮小症。

实施方案96.实施方案1-83中任一个的生长激素作为药物的用途。

实施方案97.实施方案1-83中任一个的生长激素化合物在治疗疾病的方法中的用途。

实施方案98.实施方案69或实施方案70的用途，其中所述疾病选自生长激素缺乏(GHD)；特纳综合征；普-韦综合征(PWS)；努南综合征；唐氏综合征；慢性肾病、幼年型类风湿性关节炎；囊性纤维化；接受HAART治疗的儿童HIV感染(HIV/HALS儿童)；小于胎龄(SGA)出生的矮小儿童；非SGA的以极低出生体重(VLBW)出生的儿童的身材矮小症；骨骼发育不良；软骨发育不良；软骨发育不全；特发性身材矮小症(ISS)；成人GHD；长骨骨折，所述长骨为例如胫骨、腓骨、股骨、肱骨、桡骨、尺骨、锁骨、掌骨、跖骨和指骨；海绵骨例如头骨、手腕骨和脚底骨的骨折；例如手、膝或肩中的腱或韧带手术后的患者；经历或进行牵引成骨作用的患者；髋关节置换或关节盘置换、半月板修复、脊柱融合或例如在膝、髋、肩、肘、腕或颚中的假体固定后的患者；其中已固定骨接合材料例如钉、螺钉和板的患者；骨折不愈合或畸形愈合的患者；例如胫骨或第一脚趾骨解剖后的患者；移植物植入后的患者；创伤或关节炎引起的膝关节软骨退化；特纳综合征患者中的骨质疏松症；男性骨质疏松症；长期透析的成年患者(APCD)；APCD中营养不良相关的心血管疾病；APCD中的恶病质逆转；APCD中的癌症；APCD中的慢性阻塞性肺病；APCD中的HIV；APCD老年人；APCD中的慢性肝病，APCD中的疲劳综合征；克罗恩病；肝功能受损；患有HIV感染的男性；短肠综合征；向心性肥胖；HIV相关脂肪营养不良综合征(HALS)；***；重大选择性手术、酒精/药物解毒或神经创伤后的患者；衰老；虚弱的老年人；骨关节炎；创伤性损伤的软骨；***功能障碍；纤维肌痛；记忆障碍；抑郁；创伤性脑损伤；蛛网膜下腔出血；极低出生体重；代谢综合征；糖皮质激素性肌病或糖皮质激素治疗导致的儿童身材矮小症。

实施方案99.一种选自以下的胆汁酸接头：A-W-B1-NH₂、A-W-B1-CHO、A-W-B1-LG、A-W-B1-C(O)NHCH₂-CH=CH₂和

实施方案100.实施方案99的胆汁酸接头，

其中A如实施方案64-67中一个或多个中定义，

其中B1为如实施方案69-82中一个或多个中定义的B所包含和/或

其中W如实施方案68中定义。

实施方案101.实施方案99的胆汁酸接头，其中所述胆汁酸接头选自：本文所述接头1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13。

化学法

化学法7361化学法I

一方面，本发明涉及式(I)的生长激素缀合物的制备，其中采用TGase催化的化学法将GH化合物用改性基团处理。最初，使用氨基醇通过两步反应引入醛或酮官能团，随后用过碘酸盐处理以产生被氧化裂解的醛或酮官能团。仅用于说明的氨基醇的非限制性实例包括1,3-二氨基-2-丙醇和1-氨基-2,3-二羟基丙烷。

又一方面，本发明涉及式(I)的生长激素缀合物的制备，其包括将来源于GH化合物的醛或酮用改性基团来源的苯胺或杂芳基胺处理得到胺(III→IV)。

在一个实施方案中，来源于GH化合物的醛用改性基团来源的苯胺或杂芳基胺处理。

术语“GH化合物来源的醛(或酮)”或“来源于GH化合物的醛或酮”欲表示醛或酮官能团与之共价连接的GH化合物，或在其上产生了醛或酮官能团的GH化合物。下述GH化合物来源的醛(例如化合物(III))的制备为本领域技术人员所熟知，这些已知方法的任一种均可用于制备实施本文公开的本发明所需要的GH化合物来源的醛(III)。

在一个实施方案中，如下所示制备缀合物A-W-B-GH(IV)：

TGase介导的酶促反应导致141和/或40位的Gln的修饰(II)。修饰的GH(II)用过碘酸盐处理，裂解氨基-醇，得到GH来源的醛(III)。GH与A-W-B1-NH₂的缀合通过还原烷基化(III→IV)而发生。本文所例示还原烷基化是本领域技术人员公知的。

化学法I7361化学法I

一方面，本发明涉及式(I)的生长激素缀合物的制备，其中采用TGase催化的化学法，将GH化合物用改性基团来源的胺、苯胺或杂芳基胺直接处理，得到生长激素缀合物(I→III)。

在一个实施方案中，GH化合物用改性基团来源的胺、苯胺或杂芳基胺处理。

在一个实施方案中，如下所示制备缀合物A-W-B-GH(III)：

GH(I)与A-W-B1-NH₂(II)的TGase介导的酶促反应导致141和/或40位的Gln的修饰，得到缀合物A-W-B-GH(III)。

化学法II7361化学法I

在一个实施方案中，如下所示，GH缀合物A-W-B-GH(V)通过与GH的N端缀合来制备：

GH与A-W-B1-CHO(IV)的缀合通过还原烷基化(GH→V)而发生。对于修饰蛋白质(例如GH)的N端，如上所例示的还原烷基化是本领域公知的。

其中亲水间隔物B1具有下式

-X₁-X₂-X₃-X₄-

其中

X₂为-[(CHR⁵)_I3-W₄]_m4-{[(CH₂)_n3E2]_m5-[(CHR⁶)_I4-W₅]_m6}_n4-，

X₃为-[(CHR⁷)_I5]_m7-，

X₄为价键，

I1、I2、I3、I4和I5独立选自0-10，

m1、m3、m4、m6和m7独立选自0-6，

m2和m5独立选自0-6，

n1、n2、n3和n4独立选自0-6，

R³、R⁴、R⁵、R⁶和R⁷独立选自氢、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)OH、-S(O)₂OH、-NH-C(=NH)-NH₂、C_1-6-烷基、芳基或杂芳基；其中烷基、芳基和杂芳基被卤素、-C(O)OH、-C(O)NH₂、-S(O)OH、-S(O)₂OH、-CN或-OH任选取代，

W₁-W₆独立选自-NH-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH₂-、-CH₂NHC(O)-、-C(O)NHS(O)₂-、-S(O)₂NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)CH₂-、-CH₂C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH₂)_s2-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-或价键；其中s2为0或1。

化学法IV

在一个实施方案中，如下所示制备缀合物A-W-B-GH(IX)：

其中GH化合物含有单个半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基任选作为混合二硫化物(mixeddisulfide)(GH-S-S-R¹⁰(VI))被保护起来，其中R¹⁰为小的有机部分。混合二硫化物的非限制性实例可包括以下间的二硫化物

胱胺(R¹⁰=-CH₂CH₂NH₂)；半胱氨酸(R¹⁰=-CH₂CH(C(O)OH)NH₂)；

高半胱氨酸(R¹⁰=-CH₂CH₂CH(C(O)OH)NH₂)；和

谷胱甘肽(gluthatione)(R¹⁰=-CH₂CH(C(O)NH-CH₂C(O)OH)NH-C(O)CH₂CH₂CH(C(O)OH)NH₂)。

衍生化过程利用接头A-W-B1-LG(VIII)，其中LG表示无机离去基团例如-Cl、-Br、-I或有机离去基团例如甲磺酸酯基或甲苯磺酸酯基。GH(VI)与A-W-B1-LG(VIII)的缀合通过亲核取代(VII→IX)而发生。对于修饰蛋白质(例如GH)中的游离半胱氨酸，如上所例示的亲核取代是本领域公知的。

化学法V

在一个实施方案中，如下所示制备缀合物A-W-B-GH(XI)：

可使获自上文(VI)的脱保护CysGH化合物(VII)与马来酰亚胺(malimide)取代的接头(X)反应，得到GH缀合物A-W-B1-NHC(O)CH₂CH₂-吡咯烷-2,5-二酮-3-GH(XI)

其中亲水间隔物B1具有下式

-X₁-X₂-X₃-X₄-

其中

X₂为-[(CHR⁵)_I3-W₄]_m4-{[(CH₂)_n3E2]_m5-[(CHR⁶)_I4-W₅]_m6}_n4-，

X₃为-[(CHR⁷)_I5]_m7-，

X₄为价键，

I1、I2、I3、I4和I5独立选自0-10，

m1、m3、m4、m6和m7独立选自0-6，

m2和m5独立选自0-6，

n1、n2、n3和n4独立选自0-6，

化学法VI

在一个实施方案中，如下所示制备缀合物A-W-B-GH：

可按照WO2009/024791中所述，采用S-亚硝酰基化学法，使胆汁酸接头与单个cysGH衍生物连接。

通过加入NO供体例如DEA NOnate(Sigma Aldrich)，对脱保护的Cys GH化合物(VII)进行S-亚硝基化。然后使亚硝基化单个cys GH(XII)与烯丙基胺取代的胆汁酸接头(XIII)反应，得到肟(XIV)，肟水解后，得到GH缀合物A-W-B1-C(O)NHCH₂C(O)CH₂-Cys GH(XV)

其中亲水间隔物B1具有下式

-X₁-X₂-X₃-X₄-

其中

X₂为-[(CHR⁵)_I3-W₄]_m4-{[(CH₂)_n3E2]_m5-[(CHR⁶)_I4-W₅]_m6}_n4-，

X₃为-[(CHR⁷)_I5]_m7-，

X₄为价键，

I1、I2、I3、I4和I5独立选自0-10，

m1、m3、m4、m6和m7独立选自0-6，

m2和m5独立选自0-6，

n1、n2、n3和n4独立选自0-6，

其中

E1和E2独立选自-O-、-N(R⁸)-、-N(C(O)R⁹)-或价键；其中R⁸和R⁹独立表示氢或C_1-6-烷基，

实施例

可通过参照下列实施例，对本发明作进一步的定义，所述实施例描述了本文所述各种化合物的制备和表征及用于测定其生物活性的方法。对本领域技术人员显而易见的是，可对材料与方法两者实施许多修改而又不偏离本发明的范围。缩略语：

amu=原子质量单位

CV=柱体积

hr=小时

Hz=赫兹

L=升

M=摩尔浓度

mbar=毫巴

mg=毫克

min.=分钟

mL=毫升

mM=毫摩尔浓度

mm=毫米

mmol=毫摩尔

nmol=纳摩尔

mol=摩尔

μL=微升

N=当量

nm=纳米

sec=秒钟

ppm=百万分率

ESI=电喷雾电离

i.v.=静脉内

m/z=质荷比

MS=质谱法

HPLC=高压液相层析法

RP=反相

HPLC-MS=高压液相层析法-质谱法

NMR=核磁共振波谱法

p.o.=经口服

rt或RT=室温

s.c.=皮下

R_t=保留时间

Boc=叔丁氧羰基

O-t-Bu=叔丁酯

t-Bu=叔丁基

Boc-4-ABZ-OH=4-叔丁氧羰基氨基-苯甲酸

DCM=二氯甲烷，CH₂Cl₂

DIC=二异丙基碳二亚胺

DIPEA=N,N-二异丙基乙胺

DMF=N,N-二甲基甲酰胺

DMSO=二甲亚砜

DTT=二硫苏糖醇

EDAC=1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐

Et₂O=***

EtOAc=乙酸乙酯

Fmoc=9H-芴-9-基甲氧基羰基

Fmoc-Glu-O-t-Bu=N-Fmoc-谷氨酸-1-叔丁酯

Fmoc-Lys(Mtt)-OH=(S)-6-[(二苯基-对甲苯基-甲基)-氨基]-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)己酸

Fmoc-OEG-OH=(2[2-(Fmoc-氨基)乙氧基]乙氧基)乙酸

OEG=(2[2-(氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基

Fmoc-Thx-OH=N-Fmoc-反式-4-氨基甲基环己烷甲酸

H₂O=水

HOBt=1-羟基苯并***

MeCN=乙腈

MeOH=甲醇

MSNT=1-(1,3,5-三甲基苯-2-磺酰基)-3-硝基-1,2,4-***

MTP=3-甲基-硫基-1-丙醇

NaCl=氯化钠

NaOH=氢氧化钠

NMP=N-甲基吡咯烷-2-酮

OEG=(2[2-(氨基)乙氧基]乙氧基)乙酸

TFA=三氟乙酸

THF=四氢呋喃

TIS=三异丙基甲硅烷

TSPP：三(3-磺苯基)膦三钠盐

CDCl₃=氘氯仿

CD₃OD=四氘代甲醇

DMSO-d₆=六氘代二甲亚砜

TNBS=三硝基苯磺酸

TSTU=四氟硼酸O-(N-琥珀酰亚胺基)-1,1,3,3-四甲基铀

TFAA=三氟乙酸酐

TEA=三乙醇胺

方法1.制备hGH化合物的通用方法。

将编码生长激素化合物的基因重组***质粒载体中。通过使用Quik Change定点诱变试剂盒(Stratagene)引入突变。随后使用质粒载体，转化合适的大肠杆菌(E.coli)菌株。蛋白质被表达为具有富含N端组氨酸的肽标签的可溶蛋白，所述肽标签适合于固定化金属亲和色谱纯化。可表达具有N端甲硫氨酸的hGH或GH变体，或hGH或GH变体可作为MEAE融合物表达，随后MEAE序列从中切割下来。

在50%甘油中制备细胞原液，并保存在-80℃下。将甘油原液菌株接种至LBA板中，随后在37℃下孵育过夜。各板的内容物用LB培养基洗涤，并稀释到500mlLB+AMP培养基中进行表达。在220rpm振荡下，在37℃下孵育培养物直到达到OD₆₀₀0.6。使用0.2mMIPTG在30℃下进行随后的诱导达6小时，得到最终的OD₆₀₀为2.0。最后通过离心收获细胞。

随后将细胞悬浮于20mM Tris-HCl(pH8.5)中，并使用细胞破碎仪在30kPSI下破碎。通过离心收集上清液，随后进行层析法纯化。

采用固定化金属亲和层析法作为俘获步骤进行纯化，接着使用来自Unizyme的二氨基-肽酶除去肽标签。最后的纯化通过离子交换层析法实现。还可通过使用本领域技术人员已知的以下技术(但不限于这些技术)来实现纯化：离子交换层析法、疏水作用层析法、亲和层析法、大小排阻层析法和基于膜的分离技术。

方法2.Cys突变的GH蛋白的分离和纯化：

该方法使用MEAE-hGH[Q84C,Y143C,L101C]为例。可对基于本领域公知常识的分离和纯化方案略加改动，以可能的类似方式进行备选突变体的分离和纯化。

通过离心(6056xG持续30分钟)收获细胞，并可保存在-80℃下。匀浆化：将细胞沉淀(2580g)溶于约20kg缓冲液(20mM Tris、0.1%吐温-20、5mM EDTA，pH=8.5)中，调整pH至8.5，接着用二次压降1000和200巴匀浆化。将细胞匀浆(约20kg)以1:1稀释于8M脲中，得到4M脲浓度。向该溶液中加入胱胺2HCl(18g)(0.9g/L)，在轻轻搅拌下，将所得混合物在5℃下孵育过夜。

过滤：通过死端过滤1.0和0.5μm将匀浆物过滤，得到约42kg透过物。MEAE-hGH[Q84C,Y143C,L101C]的纯化包括3个层析步骤，并且酶消化除去N端MEAE-序列。使用Q Sepharose XL (GE Healthcare)俘获MEAE-hGH[Q84C,Y143C,L101C]，通过线性梯度洗脱，在Tris-NaCl缓冲液(pH8.5)中洗脱。向所收集的合并物中加入1.0MNaCl，然后加载到Phenyl Sepharose 6FF(high sub)(GEHealthcare)中。WFI中的分步洗脱用来洗脱蛋白质，并降低电导率用于酶消化。

使用酶DAPI(二肽基氨基肽酶1)除去MEAE-序列。DAPI一次切割2个N端氨基酸，并在AE后停止，因为hGH的第二个氨基酸是脯氨酸残基，其是DAPI消化的天然终止信号。以2mg/mL(pH4.3)的蛋白质浓度于40℃进行消化。该反应后是LC-MS，约60分钟后当消化完成时终止反应。冷却至5℃后，加入39%v/v冷乙醇(99%)，将蛋白质等电沉淀(iso-precipitate)后，调节pH至4.9。将反应混合物保存在5℃下持续至少2小时以沉淀蛋白质。

将沉淀的hGH[Q84C,Y143C,L101C]重新溶于7M脲-三乙醇胺缓冲液(pH7.5)中，在Source30Q(GE Healthcare)上纯化，将靶蛋白与少量未切割的物质和其它杂质分离开来。最终的产物通过线性梯度洗脱，在三乙醇胺缓冲液(pH7.5)中洗脱。经RP-HPLC分析(UV214nm)，产物纯度>97%。

方法3.制备胆酸缀合的化合物的方法。

1.通式A-W-B1-CHO的胆汁酸接头与GH化合物(I)的N端苯丙氨酸的偶联：

目标胆汁酸接头通常作为二烷基缩醛(即A-W-B1-CH(OR)₂)合成，在缀合前需要转化成游离醛。这可如下进行：胆汁酸接头二烷基缩醛用酸(例如TFA)处理，蒸发至干。所得游离醛无需进一步纯化便能使用。

然后分批加入GH的缓冲液(例如HEPES，pH7.0)溶液，同时加入1N NaOH保持pH为7.0。然后以5分钟的间隔分批加入溶于水的NaCNBH₃。通常搅拌1小时后得到澄清溶液。反应烧瓶用锡纸包裹，将反应混合物在室温下轻轻搅拌过夜。反应样品用LC/MS分析以证实产物形成。

然后，将IEX和HIC层析法、大小排阻柱和超滤联用，对hGH缀合物进行纯化。通常得到纯度为95%或更高的缀合物。

2.通式A-W-B1-NH2的胆汁酸接头与转氨基化和氧化GH化合物(I)的偶联

之前WO2005/070468中描述了使用转谷氨酰胺酶以使醛手柄(aldehydehandle)在谷氨酰胺残基上与GH连接。可根据本发明将该方法用于式A-W-B1-NH2的基于胆汁酸的接头的连接。按照US5156956，所用TGase是来自茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)的微生物转谷氨酰胺酶。

如下进行该反应：如WO2005/070468中所述，GH(I)最初用1,3-二氨基-2-丙醇(II)转氨基化：

下一步，向转氨基化GH(III)中加入过碘酸盐。氧化通常在低温(例如4-10℃)下在30分钟内任选避光进行。过碘酸盐可将GH中的甲硫氨酸残基氧化成其相应的甲硫氨酸亚砜残基。为了使这种氧化风险降到最小，可在过碘酸盐氧化期间加入小分子有机硫醚。合适的有机硫醚为3-甲基硫基丙-1-醇，但技术人员能够提出其它有机硫醚。

转氨基化GH化合物(III)的氧化：

可进行缓冲液更换以得到有效氰基硼氢化钠还原所需要的酸溶液。通常使用过量的A-W-B1-NH2胺，并可随时间推移加入较少量的氰基硼氢化钠。

(IV)用胆汁酸接头(V)的还原胺化：

后一反应可如下进行：

将氧化转氨基化GH(IV)溶液加入胆汁酸接头(V)在AcOH(1.5mL)和50mM MES(0.5mL)的混合物中的溶液(pH6.00)中。将所得反应混合物在室温下轻轻振荡30分钟，届时加入NaCNBH₃溶液(15μL，(22mg NaCNBH₃，溶于500μLMilli-Q水+AcOH(15μL))。将样品用锡纸包覆，在室温下搅拌过夜。

可如下通过阴离子交换层析法分离缀合物：

使用Amicon Ultra15装置(Ultracel10K管)，通过以4000rpm/分钟离心3x8分钟，用纯水(3X)进行缓冲液更换除去乙酸。然后使用Amicon Filter装置，将混合物更换缓冲液为20mM TEA(pH：8.50)，用20mM TEA稀释至50mL的最终体积，然后加载到HiLoad Q Sepharose，26/10柱中。柱先用20mM TEA，pH8.50(缓冲液A)洗涤，然后用20mM TEA，500mM NaCl，pH8.50(缓冲液B)洗脱，采用0-100%(B)梯度，20CV内，流速为2mL/分钟。使用Amicon Ultra15装置(Ultracel10K管)，通过4000rpm/分钟离心3x8分钟，对合并的流分进行缓冲液更换5次至10mM碳酸氢铵缓冲液/纯水。

3.通式A-W-B1-LG(VIII)的胆汁酸接头与具有内部游离单一cys的GH化合物(VII)的偶联。

1)通过用合适的选择性还原剂[H]还原二硫化物(VI)释放游离Cys GH(VII)：

2)游离Cys GH(VII)用离去基团(LG)活化的胆汁酸接头(VIII)烷基化，得到Cys缀合的GH化合物(IX)

半胱氨酸残基任选作为混合二硫化物(GH-S-S-R(VI))被保护起来，其中Ｒ为小的有机部分。混合二硫化物的非限制性实例可包括以下之间的二硫化物：胱胺(R=-CH₂CH₂NH₂)；半胱氨酸(R=-CH₂CH(C(O)OH)NH₂)；高半胱氨酸(R=-CH₂CH₂CH(C(O)OH)NH₂);和谷胱甘肽(R=-CH₂CH(C(O)NH-CH₂C(O)OH)NH-C(O)CH₂CH₂CH(C(O)OH)NH₂)。

衍生化过程利用胆汁酸接头A-W-B1-LG，其中LG表示无机离去基团例如-Cl、-Br、-I或有机离去基团例如甲磺酸酯基或甲苯磺酸酯基。GH与A-W-B1-LG的缀合通过亲核取代(VII→IX)而发生。如果衍生化过程利用丙烯酰基官能团的马来酰亚胺作为反应基团，则缀合通过硫化物加入马来酰亚胺或丙烯酸酯官能团的双键而产生。

按本发明所述制备的GH缀合物可通过HPLC、大小排阻层析法和离子交换层析法等标准方法纯化。

应注意，上述通用偶联方法只用作说明目的，本领域技术人员可选择用于制备缀合物的其它缓冲溶液、纯化方法和反应条件。

方法4.纯化的生长激素化合物的蛋白质化学表征。

Maldi-Tof质谱法

采用Autoflex Maldi-Tof仪器(Bruker)测定分子量。使用α-氰基-4-羟基-肉桂酸作为基质制备样品。

采用MALDI-MS分析完整的纯化蛋白质。实测质量等于自氨基酸序列推导的理论质量。

在二硫键用DTT还原之前和之后，通过采用胰蛋白酶和AspN消化，接着对消化物进行MALDI-MS分析对肽作图，来表明各化合物中二硫键的连接。

毛细管电泳

毛细管电泳采用Agilent Technologies3DCE***(Agilent Technologies)进行。数据采集和信号处理采用Agilent Technologies3DCE ChemStation进行。毛细管为得自Agilent的64.5cm(56.0cm有效长度)、内径50μm的“延长光程毛细管(Extended Light Path Capillary)”。UV检测在200nm(16nm Bw，参比380nm和50nm Bw)处进行。电泳电解质为磷酸盐缓冲液50mM pH7(方法A)。毛细管用0.1M NaOH调节3分钟，然后用Milli-Q水调节2分钟并用电解质调节3分钟。每次电泳后，毛细管依次用milli-Q水冲洗2分钟、用磷酸冲洗2分钟、用milli-Q水冲洗2分钟。在50mbar下进行流体动力学注射4.0秒钟。电压为+25kV。毛细管温度为30℃，运行时间为10.5分钟。

RP-HPLC

使用Vydac218TP544.6mmx250mm5μmC-18硅胶柱(The SeparationsGroup，Hesperia)，在Agilent1100***上进行RP-HPLC分析。在214nm、254nm、280nm和301nm处通过UV检测。柱用0.1%三氟乙酸/H₂O平衡，样品通过0-90%乙腈针对0.1%三氟乙酸/H₂O的合适梯度洗脱。

LC-MS

在配备了2个Perkin Elmer200系列微型泵、Perkin Elmer200系列自动进样器、Applied Biosystems785AUV检测器和Sedex75蒸发光散射(Evaporative Light)检测器的PE-Sciex API100或150质谱仪上进行LC-MS分析。Waters Xterra3.0mmx50mm5μC-18硅胶柱在室温下以1.5ml/分钟洗脱。柱用5%MeCN/0.1%TFA/H₂O平衡，用5%MeCN/0.1%TFA/H₂O洗脱1.0分钟，然后在7分钟内用至90%MeCN/0.1%TFA/H₂O的线性梯度洗脱。检测在214nm和蒸发光散射下通过UV检测进行。将柱洗脱物的流分引入PE-SciexAPI100质谱仪的离子喷雾界面。在运行期间每2秒钟扫描质量范围300-2000amu。

蛋白质的定量测定

采用NanoDrop ND-1000UV-分光光度计，通过在280nm处测量吸光度，来估算蛋白质浓度。

用于测定衍生化部位的酶促肽作图：

使用还原和烷基化的蛋白质的Asp-N消化进行肽作图。首先，按照标准方法，用DTT和碘乙酰胺处理蛋白质。烷基化产物采用HPLC纯化。随后烷基化的纯化产物按1:100的酶:底物之比用内切蛋白酶Asp-N(Boehringer)消化过夜。使用C-18柱和标准TFA/MeCN缓冲体系，对消化物进行HPLC分离。将所得肽图谱与未衍生化hGH的肽图谱作比较，随不同的保留时间收集流分，并采用Maldi-tof质谱法进一步分析。

SDSpage

使用NuPAGE4%-12%Bis-Tris凝胶(Invitrogen NP0321BOX)，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。对凝胶进行银染(Invitrogen LC6100)或考马斯染色(InvitrogenLC6065)。

蛋白质层析法

蛋白质层析法在

Explorer层析***和得自GE Health Care的柱上进行。阴离子交换采用Q-Sepharose HP26/10柱进行。起始缓冲液为20mM三乙醇胺缓冲液(pH8.5)，洗脱缓冲液为起始缓冲液+0.2MNaCl。化合物通常用超过15倍柱体积的0-75%洗脱缓冲液的梯度洗脱。脱盐和缓冲液交换使用HiPrep26/10柱进行。

TNBS试验

制备10%DIPEA/DMF溶液(溶液1)和1M TNBS水溶液(溶液2)。将少数树脂珠粒置于小试管中，加入各溶液(1和2)1-3滴。在短暂混合后，将混合物置于室温下10分钟，接着检查珠粒。强烈的橙色或红色珠粒表示阳性结果(即存在游离胺)；黄色或略微橙色的珠粒表示轻微阳性，无色珠粒为阴性。

方法5.纯化生长激素化合物的生物活性分析。

在基于细胞的受体效价增殖测定(即BAF测定)中，测量hGH化合物的生物活性。该方法是hGH化合物通用的。

BAF-3细胞(源自骨髓的鼠前-B淋巴样细胞系)的生长和存活是IL-3依赖性的。IL-3激活JAK-2和STAT，它们是GH在刺激时活化的相同介体。

可用含有hGH受体的质粒转染BAF-3细胞。在hGH刺激时能增殖的克隆可变成hGH依赖性的细胞系，下文称作BAF3-GHR。所述细胞系以剂量相关生长模式对GH做出响应，因此可在增殖测定中用来评价不同的hGH化合物的作用。

在饥饿培养基(不含GH的培养基)中在37℃、5%CO₂下培养BAF-3GHR细胞24小时。将细胞离心，去除培养基，并将细胞重新悬浮于饥饿培养基中至2.22x10⁵个细胞/ml。将多份90μL细胞上清液接种到微量滴定板(96孔NUNC-clone)中。将不同浓度的生长激素化合物加入细胞中，将板于37℃、5%CO₂下孵育72小时。

AlamarBlue是一种氧化还原指示剂，因此被细胞代谢固有反应还原的(BioSource目录号Dal1025)提供活细胞数目的间接量度。将

稀释6倍(5μL饥饿培养基)，并将30μL稀释的

加到每个孔中。然后再将细胞孵育4小时。最后，使用544nM的激发滤光片和590nM的发射滤光片，在荧光读板仪中，测量细胞的代谢活性。

给定化合物的结果表示为所述化合物的EC₅₀和平行运行的wthGH的EC₅₀之比。

方法6.3A之前的切除垂体的Sprague Dawley大鼠中的体内剂量反应研究

可在切除垂体的雄性Sprague Dawley大鼠中，研究体内剂量反应关系。切除垂体的大鼠是众所周知和公认的生长激素缺乏动物模型，其中在手术切除脑垂体后，不产生生长激素。这还导致低的***-1(IGF-1)循环水平，这是人生长激素缺乏的另一个重要临床特征。

对重为90-100g的4周龄雄性大鼠进行垂体切除术。手术后3-4周重为100-110g的动物进入该研究。手术后3-4周期间体重增加大于10%的动物不允许进入该研究。

通常将70只切除垂体的Sprague Dawley大鼠随机分配到7个给药组，每组10只动物。1个组只接受溶媒，用作未治疗对照组。3个组分别接受试验化合物(例如hGH变体)33、3.3和0.33nmol，3个组分别接受作为比较物(comparator)的50、5.0和0.5nmol hGH。将化合物和溶媒均作为单次皮下剂量给予颈部。每日在8-10am之间测量体重持续一周。

可通过将第0天的体重与第7天的相比，获得对体重剂量依赖性增加的评价。

通过非线性回归分析，将S形剂量反应方程式与实验数据拟合(第0-7天间的体重增加)，以计算E_max、E₀和ED₅₀的参数估计值。所述方程式是用于Windows的GraphPad Prism4.00版S形剂量反应内置方程式(GraphPad SoftwareInc.，SanDiego，USA)。通常提供包括参数估计值和95%置信区间的数据。

对于hGH[Q84C,Y143C]和hGH，未观察到E₀和E_max的参数估计值的差异。然而，与hGH相比，hGH[Q84C,Y143C]的ED₅₀显著较低，这就表明了hGH[Q84C,Y143C]的体内效价增加。

方法7.通过表面等离振子共振分析的受体相互作用研究。

采用表面等离振子共振分析，对hGH化合物的受体相互作用进行了分析。该方法对hGH化合物是通用的。采用Biacore T100(GE Health Care，Sweden)，通过表面等离振子共振对hGH和类似物与hGH结合蛋白(hGHBP)的相互作用进行了研究。按照生产商说明书，以通常5000RU的水平将抗hGH mAb(FitzgeraldIndustries International，USA，#10G05B)固定在CM-5芯片上。在运行缓冲液(10mMHEPES、0.15M NaCl、30mM EDTA、0.05%表面活性剂P20，pH7.4)中以10-25μg/mL俘获wthGH或类似物，这得到250-400RU俘获配体。随后将0-800nM浓度的hGHBP以30μL/分钟注射在表面上。具有固定化抗hGH mAb但没有俘获hGH的表面用作参考。

用带有1:1Langmuir结合模型的Biacore^TM评价软件2.0对动力学数据进行了分析。

方法8.测量野生型hGH和GH化合物蛋白酶降解速率的测定法

在适当的缓冲液(例如PBS或碳酸氢铵)中，在37℃下用有关的蛋白酶(胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、弹性蛋白酶、因子VIIa、因子Xa、蛋白酶K、羧肽酶、DPPIV、中性内肽酶、粒酶B、脯氨酸-内肽酶、葡萄球菌肽酶I、嗜热菌蛋白酶、凝血酶、Arg-C蛋白酶、Asp-N内肽酶、胱天蛋白酶1-10、梭菌蛋白酶、肠激酶、谷氨酰内肽酶、粒酶B、LysC、LysN、脯氨酸-内肽酶和葡萄球菌肽酶I或组织提取物)消化目标化合物，直到24小时。通过HPLC测定，评估蛋白水解性降解。

蛋白水解消化：

1mg/mL溶于碳酸氢铵缓冲液的100μL试验化合物溶液用酶在37℃下降解，直到24小时。在不同时间点取出子样品，通过10倍稀释于1%TFA中使样品酸化，来终止蛋白水解反应。通过反相HPLC分析这些稀释样品，以估算蛋白水解消化的程度。

HPLC方法：

将10μL上述溶液注入反相VydacC42×150mm柱中，在30分钟时间内以0.2mL/分钟的流速，用0.1%TFA/水至含有0.1%TFA的100%MeCN线性梯度洗脱。在214nm UV吸收处进行峰检测。由时间点t=T的峰面积(A_T)和t=0的峰面积(A₀)计算时间点t=T的%完整化合物，为(A_T/A₀)×100%。

4小时(在上述方程式中T=4)后，得到以下实施例提供的结果。应用GraphPadPrims软件5.01版，将%完整化合物对时间作图。另通过GraphPad Prism软件，

计算为单相衰减(one phase decay)。用于实施例中的酶是弹性蛋白酶(Sigma，得自猪胰)和胰凝乳蛋白酶(Roche测序级)。缓冲液为50mM碳酸氢铵(pH8.5)。

方法9.通过肠内和i.v.给予

迷你猪的生长激素化合物的药代动力学性质

通常在研究中使用获自Ellegaard

Minipigs A/S重约为30kg的8只

雄性迷你猪。在2周适应期后，对动物进行手术，将2个中心静脉导管***每只动物中。手术后，将动物关养在其正常的各个围栏内。给药前给动物称重。对于接受肠内给药的动物，在给药前2天从围栏中撤除稻草和垫料，以确保GI道中没有外来物质。

对于i.v.给药，通过短的中心导管给予20nmol/kg，导管在给药后用2mL盐水冲洗。

对于肠内给药，通过内窥镜(Pentax胃镜)给予800nmol/kg。将胃镜经口***，穿过食道和胃室经由幽门直到空肠。在空肠中释放试验制剂，抽出胃镜。在给药过程中，用Sedator和异丙酚使迷你猪镇静，该过程后，肌内给予Antisedan。

通常在下列时间点采集血样：

i.v.给药：给药前，给药后5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1、1.5、2、3、4、6、8、24、48和72小时。

肠内给药：给药前、给药后15分钟、30分钟、45分钟、1、1.5、2、3、4、6、8、24、48和72小时。

在每个采样时间，从每只动物抽取2mL血液。血样通过中心导管采集。在每次抽取血样后，导管用5mL含肝素(10U/mL)的盐水冲洗。采样期间，弃去第一ml血。在血液采样期间需要无菌技术，以避免细菌污染和凝血风险。

将血样收集在装有EDTA8mM的试管中。在离心(4000rpm，4℃，10分钟)前，将血样置于冰上最多20分钟。立即收集血浆，并保存在-20℃下直到测定。针对试验化合物对血浆样品进行分析。

使用豚鼠抗hGH多克隆抗体作为收集器，生物素化hGH结合蛋白(人GH受体的可溶部分)作为检测器，通过夹心ELISA测定试验化合物浓度。该测定法的检测限为0.2nM。

对于i.v.给药，将化合物在甘氨酸20mg/ml、甘露醇2mg/mL、NaHCO₃2.4mg/mL中溶解成0.6mM，调节pH至8.2。

对于肠内给药，将化合物在甘氨酸20mg/mL、甘露醇2mg/mL、NaHCO₃2.4mg/mL中溶解成6mM，调节pH至8.2。

方法10.通过肠内给予Sprague Dawley大鼠的生长激素化合物的药代动力学性质

通常约250-300g的24只Sprague Dawley大鼠，获自Taconic M&B(Rekv.No.2010 0824)。将动物关养在IV型笼中，每个笼4-5只动物。研究期间大鼠任意接近饮用水(自来水)，但给药前18小时禁食。禁食期间，将动物放入没有垫料或窝料的笼的网格上，给药前一天2pm撤出食物，以确保至少18小时的禁食时间。在禁食期间，动物任意接近饮用水。

在手术当天，在麻醉前给大鼠称重，以计算镇痛药的准确剂量。恰在称重后，动物接受麻醉前剂量的稀释于盐水(1+9)的兽用卡洛芬50mg/mL，0.1mL/100g s.c。

虽然该研究不是无菌研究，但是尽可能无菌地进行手术方法。手术部位用70%乙醇消毒，采取预防措施使手术部位的污染减到最低。

初始阶段，将大鼠用异氟烷(Isofluran)3%麻醉直到动物进入睡眠，然后在手术其余时间减少异氟烷至2-2.5%。术前给腹部剃毛，用70%乙醇消毒。

恰在手术前，每只大鼠接受0.3mg/mL稀释于盐水(1+9)的Temgesic s.c.剂量0.125mL/100g。如果使动物过夜，则给药后1小时和给药后6-8小时，再次给予相同剂量。

在麻醉期间，连续监测大鼠，重点特别放在肤色和呼吸上。因为使用阿片样物质可能引起丧失体热(低温)，因此在研究期间，将大鼠放入37℃的加热柜中。

使麻醉的大鼠躺在其电热毯或绝缘板上。在皮肤上开一中线切口。在剑状软骨(剑突)下约1cm处开始，沿腹白线切一2cm切口进入腹腔。在腹部脂肪层下找出形成显著弯曲的距幽门约50-60cm的一段空肠。使用G27注射器，通过肠内注射将试验化合物(0.2mL/动物)递送到空肠。给药后，小心地抽出针，注射孔用一小滴

封住。30秒钟后，将肠放回腹部，用手术缝线(Vicryl4-0)缝合腹壁，确保伤口端紧密匹配在一起。皮肤使用创缘夹闭合。在伤口闭合后，在腹胁处s.c.给予大鼠2mL盐水以免脱水，并放入加热灯下的特殊的恢复笼中。

当动物从麻醉中完全恢复后，将其放入加热柜中的正常笼中。

按以下时间点，从全部动物的尾静脉中采集200μL血样：给药前、注射后0.5、1、2、3、4和6小时。将血样收集到装有EDTA8mM的试管中。离心(4000rpm，4℃，10分钟)前将血样保持在冰上最多20分钟。立即收集血浆样品，并保存在-20℃下直到测定。针对试验化合物对血浆样品进行分析。使用豚鼠抗hGH多克隆抗体作为收集器，生物素化hGH结合蛋白(人GH受体的可溶部分)作为检测器，通过夹心ELISA测定试验化合物浓度。该测定法的检测限为0.2nM。

对于肠内给药，将化合物在甘氨酸20mg/mL、甘露醇2mg/mL、NaHCO₃2.4mg/mL中溶解至1.5mM，调节pH至8.2。

方法11—Caco-2透性测定

使用Caco-2细胞测量试验化合物跨细胞单层的转运。Caco-2细胞系来源于人结肠直肠癌，广泛用于预测跨人肠的药物吸收。分化Caco-2细胞的细胞层类似于(resemple)小肠柱状上皮，因此可用于测试化合物的转运性质。获自Caco-2细胞转运研究的表观透性系数(P_app)表明与人小肠吸收有关(J.D Irvine等.J.Pharm.Sci.(1999)88和P.Artursson.J.Pharm.Sci.(1990)79)。将细胞培养在半透膜上来进行测定。将试验化合物加到细胞层的顶面，随时间推移测量其在底外侧上的出现，所计算出的P_app表示肠吸收。

材料

Caco-2细胞获自美国典型培养物保藏中心ATCC(Manassas，VA，USA)。所有细胞培养试剂购自LONZA BioWhittaker，除非另有说明。胰蛋白酶-EDTA0.25%来自Invitrogen，Gibco(Denmark)。MEM(非必需氨基酸)来自Invitrogen，Gibco(Denmark)；FBS HI来自Invitrogen，Gibco(Denmark)和Hank平衡盐溶液(HBSS)目录号14025和HEPES目录号15630购自Invitrogen，Gibco(Denmark)。甘露醇D-[1-³H(N)]-购自Perkin Elmer Danmark A-S。Microscint40闪烁液购自Packard BioScience(Groningen，The Netherlands)。

细胞培养物

将Caco-2细胞接种到的培养瓶中的含Ultraglutamine的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中，并传代(使用DPBS和胰蛋白酶0.25%-EDTA)，该培养基中补充了10%胎牛血清、青霉素-链霉素(分别为100U/mL和100μg/mL)和1%非必需氨基酸。以10⁵个细胞/cm²的密度，将细胞(介于传代23-40之间)接种到组织培养物处理的Transwells^TM(Costar，NY，USA)。随后在接种后第22-24天进行转运实验。使Caco-2细胞单层培养物在5%CO₂-95%O₂的气氛和90%湿度、37℃下生长。每隔一天更换生长培养基。使用上皮欧姆计Millipore，Denmark)，在37℃下测量TEER，单位Ωcm²，转运实验中在使用前，成熟Caco-2细胞单层的TEER.>600Ωcm²。

透性测定

通过测量甘露醇D-[1-³H(N)]-，(0.8μCi/mL)P_app并监测2小时实验期间TEER的变化，来评价Caco-2的完整性。实验前，从成熟Caco-2细胞中去除生长培养基，细胞单层物用37℃HBSS漂洗一次。所有化合物转运实验均使用试验化合物的200μM溶液进行，顶部体积为400μL，底外侧体积为1000μL。在转运实验中，将pH7.4的试验化合物加入顶室中，在15、30、45、60和120分钟时从底外侧室取出200μL，然后用200μL新鲜的预热缓冲液补充底外侧室。在120分钟时，从供体室取出2x10μL样品，以确定实验结束时化合物的浓度。所有实验在37℃下进行2小时。使用来自Packard的TopCount NXT，对含有放射性对照甘露醇D-[1-³H(N)]的样品进行分析，同时采用冷光氧通道形成免疫测定法(Luminescence Oxygen Channeling Immunoassay，LOCI)，对含有试验化合物的样品进行分析，该方法是基于均质珠粒的测定法。LOCI试剂包括2种乳胶珠粒试剂和生物素化抗体，所述抗体是夹心法中的抗体之一。珠粒试剂之一是用链霉抗生物素涂覆并含有光敏染料的通用试剂(供体珠粒)。第二珠粒试剂(接纳体珠粒)用构成夹心法的另一种抗体涂覆。在测定期间，3种反应物与分析物结合形成珠粒-聚集体-免疫复合物。照射复合物从形成通往接纳体珠粒的通道的供体珠粒上释放单线态氧，并引发化学发光，在EnVision读板仪中测量该光。所产生的光的量与试验化合物浓度成比例。将样品/校准物/对照在测定缓冲液中稀释10x。将1μL稀释的样品/校准物/对照加至384孔LOCI板上。将15μL生物素化mAb HGH-7(ES7)和mAb HGH-3A7(ES3)-缀合的接纳体-珠粒的混合物加入各孔(21-22℃)中。将板在21-22℃下温育1小时。将30μL链霉抗生物素涂覆的供体-珠粒(67μg/mL)加至各孔中，将全部在21-22℃下温育30分钟。用680nm激光激发后，在21-22℃下，在具有带宽为520-645nm的滤光片的Envision读板仪中读板。每孔的总测量时间为210ms，包括70ms激发时间。

透性的计算

运用下列方程式，使用随时间推移而出现在底外侧室的试验化合物的累积量dQ/dt，来计算P_app：P_app=dQ/dt×1/(AC₀)，其中A为滤光片的面积(1cm²)，C₀为供体室的起始浓度。

胆汁酸接头的制备

接头1：-NN-AU-0087

材料

固相支持体：PAM树脂0.7-1.3mmol/g，100-200目，Sigma。

Fmoc-8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(dioxaoctonic acid)、MSNT(1-(1,3,5-三甲基苯-2-磺酰基)-3-硝基-1,2,4-***)(得自Chemimpex)、Fmoc-Glu-O^tBu(Novabiochem)、Fmoc-Gly-OH(GLBiochem)、胆酸(Sigma)。

Fmoc-Gly-OH与PAM树脂的连接

使PAM树脂(3g，3.3mmol)在无水DCM(经P₂O₅蒸馏)中溶胀1小时。将Fmoc-Gly-OH(4.9g，5eq，16.5mmol)、MSNT(4.9g，5eq，16.5mmol)、N-甲基咪唑(0.75mL，3.75eq，12.4mmol)溶于含有2-3滴THF的无水DCM(20mL)中。然后将该溶液加入预先溶胀的树脂中。使树脂在Robbins scientific旋转器中在室温下旋转。反应2小时后，将树脂过滤，用DCM(6x10mL)和DMF(6x10mL)洗涤。在相同条件下再次重复该过程。

脱去Fmoc-Gly-PAM的Fmoc基团：

通过用20%(v/v)哌啶/DMF(15mL)的溶液处理两次分别5和15分钟，使Fmoc-Gly-PAM的Fmoc基团脱保护。然后将树脂过滤，用DMF(10x5mL)、DCM(6x10mL)和DMF(6x10mL)洗涤。通过阳性茚三酮试验证实Fmoc基团脱保护。

Fmoc-氨基酸/接头/胆酸序贯偶联的通用方法。

使Fmoc-脱保护的胺树脂在DMF中溶胀。将Fmoc保护的氨基酸(5当量，相对于树脂负载)、HOBt(5当量)和DIC(5当量)在无水DMF中的预活化溶液加入预先溶胀的树脂中，使反应混合物在室温下旋转3小时。将树脂过滤后，用DMF(6x5mL)、DCM(6x5mL)和DMF(6x5mL)洗涤。通过阴性茚三酮试验证实偶联反应完成。

胆酸-琥珀酸偶联的通用方法。

使Fmoc-脱保护的胺树脂在DMF中溶胀。将胆酸-琥珀酸(3当量，相对于树脂负载)、HOBt(3当量)和DIC(3当量)在无水DMF中的预活化溶液加入预先溶胀的树脂中，使反应混合物在室温下旋转16小时。将树脂过滤后，用DMF(6x5mL)、DCM(6x5mL)和DMF(6x5mL)洗涤。通过阴性茚三酮试验证实偶联反应完成。

从肽基树脂上切割叔丁基

在靶分子与固相序贯连接后，将树脂用***(6x10mL)洗涤，并在真空干燥器中干燥过夜。通过用由95%TFA、2.5%TIS、2.5%水(25mL)组成的切割混合物在室温下处理肽-树脂1小时，来实现将肽从固相支持体上切割。树脂然后用DCM(2x5mL)、DMF(2x5mL)、DCM(2x5mL)洗涤。经干燥的切割了叔丁基侧链的肽树脂用CHCl₃/氨基乙醛二甲基缩醛(54:36)mL的混合物在45℃下处理26小时。切割后，将树脂滤干，用DCM、MeOH、H₂O、0.1%TFA、HFIP、DCM、MeOH和DCM洗涤。合并滤液，真空蒸发，将所得油状物溶于规定体积的蒸馏水中。用TFA调节pH至7，将溶液冷冻并冻干，得到粗产物。粗产物用制备型HPLC纯化，得到263mg化合物，通过LC-MS证实其特征。

肽的纯化和表征

分析型(Agilent1100系列)

柱：Zorbax Eclipse XDB-C₁₈(4.6X150mm，5μm)。

温度：25℃。

溶剂A：0.1%TFA/H₂O。

溶剂B：9:1:0.1(MeCN/H₂O/TFA)。

流速1mL/分钟

监测波长：220nm(二极管阵列检测器)。

梯度

时间(分钟)	0	2	15	20	25	30	32	35
									%B	2	2	70	95	100	100	2	2

将粗制肽溶于MeCN/H₂O(1:1)的混合物中。

制备型HPLC(Agilent1100系列)

柱：Zorbax-Eclipse XDB-C₁₈，9.4X250mm，5μm。

温度：25℃。

溶剂A：0.005%TFA/H₂O。

溶剂B：MeCN

监测波长：220nm(二极管阵列检测器)。

梯度

时间(分钟)	0	2	50
				%B	25	30	80

胆酸叔丁酯-琥珀酸的合成

步骤-1：自胆酸合成胆酸叔丁酯：

在冰浴温度下，将三氟乙酸酐(200mL，1.43mol)在5分钟内加入胆酸(50g，0.123mol)在无水THF(1L)中的经搅拌溶液中。撤掉冰浴后，搅拌混合物80分钟，届时使之再冷却，加入叔丁醇(300mL，3.16mol)。在室温下搅拌7小时后，在冷却时加入氨水溶液(280mL，25%w/w)，保持温度低于20℃，使溶液在室温下静置12小时。加入另一份氨水溶液(100mL)，在室温下再过4小时后，使混合物在***(2L)和水(1L)之间分配。(通过TLC监测三氟乙酸酯水解过程，用EtOAc作为洗脱液，RF=0.4)。有机相用2N NaOH溶液(6x1L)、水(6x1L)、盐水(1L)洗涤后，经硫酸钠干燥。将有机相过滤，挥发物经减压蒸发，得到胆酸叔丁酯，为固体(54g，95%)，通过TLC和¹H-NMR纯化。

步骤-2：自胆酸叔丁酯合成胆酸-ONH₂：

将胆酸叔丁酯(15g，32.3mmol)溶于THF(150mL)中。在0℃下将三苯膦(16.9g，2eq，64.6mmol)和N-羟基邻苯二甲酰亚胺(10.5g，2eq，64.6mmol)加入反应混合物中。在1小时时间内，滴加DEAD(13mL，2.5eq，80.8mmol)。完成加入后，使反应混合物达到室温，并搅拌过夜。减压除去挥发物。将残余油状物溶于EtOH(100mL)中，加入水合肼(12mL，247.3mmol)，使反应混合物在45℃下加热3小时，届时TLC表明反应完成。减压除去挥发物，得到灰白色固体，将其用DCM(2x500mL)洗涤。减压浓缩滤液，得到黄色固体。粗产物通过使用硅胶(60-120目)的柱层析法纯化。化合物在作为洗脱液的1-2%MeOH/DCM中洗脱。

步骤-3：自胆酸叔丁酯-ONH₂合成胆酸叔丁酯-琥珀酸

将胆酸叔丁酯-ONH₂(20g，41.7mmol)溶于THF(200mL)中。将琥珀酐(4.6g，1.1eq，45.9mmol)、三乙胺(11.5mL，2eq.，83.5mmol)加入反应混合物中，在室温下搅拌3小时。TLC表明反应完成。减压除去THF，得到粘性油状物。将油状物溶于EtOAc(200ml)中，用柠檬酸溶液、水、盐水洗涤，经硫酸钠干燥后，减压浓缩，得到粗制固体(30g)。通过溶于AcOEt/MeOH的助溶剂中，经重结晶纯化粗产物，得到10g(42%)化合物，纯度为95%。

通过LC-MS和NMR证实化合物特性。

接头2：

按上述有关接头1的类似方法，使用4,4-二甲氧基丁基胺代替氨基乙醛二甲基缩醛，制备下列化合物。

TOF-MS：质量970.93

接头3：-NN-AU-0090

按上述有关接头1的类似方法，制备下列化合物。

TOF-MS：质量1087.28

接头4：(NN-AU-0109)

TOF-MS：质量1115.34

接头5：-(NN-AU-0091)

材料

固相支持体：氯三苯甲基氯树脂(CTC)1.01mmol/g，200-400目。

Fmoc-8-氨基-3,6-二氧杂辛酸、Fmoc-Lys(Dde)-OH(Chemimpex)。

Fmoc-Lys(Dde)-OH与聚合物支持体的连接：

使氯三苯甲基氯树脂(CTC)(4g，4mmol)在无水DCM(经P₂O₅蒸馏)中溶胀1小时。将Fmoc-Lys(Dde)-OH(2.6g，1.2eq，4.8mmol)和DIPEA(3.52mL，4.8eq，19.2mmol)溶于无水DCM(25mL)中。将该溶液转移到树脂上。使树脂在Robbinsscientific旋转器中在室温下旋转过夜。将反应物过滤，用DCM(6x10mL)和DMF(6x10mL)洗涤。

除去CTC-Lys(Dde)-Fmoc树脂的Fmoc基团：

通过用20%(v/v)哌啶/DMF溶液(20mL)处理两次各5和15分钟，使CTC-Lys(Dde)-Fmoc的Fmoc基团脱保护。然后将树脂过滤，用DMF(10x5mL)、DCM(6x10mL)和DMF(6x10mL)洗涤。通过阳性茚三酮试验证实Fmoc基团脱保护。

Fmoc-氨基酸/接头序贯偶联的通用方法：

使Fmoc-脱保护的胺树脂在DMF中溶胀。将Fmoc保护的氨基酸(3当量，相对于树脂负载)、HOBt(3当量)和DIC(3当量)在无水DMF中的预活化溶液加入预先溶胀的树脂中，使反应混合物在室温下旋转3小时。将树脂过滤后，用DMF(6x5mL)、DCM(6x5mL)和DMF(6x5mL)洗涤。通过阴性茚三酮试验证实偶联反应完成。以脱保护和偶联循环的类似方式，使氨基酸逐个偶联。

胆酸叔丁酯-琥珀酸的偶联：

使Fmoc-脱保护的胺树脂在DMF中溶胀。将胆酸叔丁基-琥珀酸(3当量，相对于树脂负载)、HOBt(3当量)和DIC(3当量)在无水DMF中的预活化溶液加入预先溶胀的树脂中，使反应混合物在室温下旋转过夜。将树脂过滤后，用DMF(6x5mL)、DCM(6x5mL)和DMF(6x5mL)洗涤。通过阴性茚三酮试验证实偶联反应完成。

Dde自肽基树脂上脱保护：

通过用含3%NH₂-NH₂的DMF(20mL)处理两次各5和15分钟，使肽基树脂的Dde基团脱保护。然后将树脂过滤，用DMF(10x5mL)、DCM(6x10mL)和DMF(6x10mL)洗涤。通过阳性茚三酮试验证实Dde基团脱保护。

溴乙酸的偶联：

使游离胺树脂在DMF中溶胀。将溴乙酸(5当量，相对于树脂负载)、HOBt(5当量)和DIC(5当量)在无水DMF中的预活化溶液加入游离胺树脂中，使反应混合物在室温下旋转3小时。将树脂过滤后，用DMF(6x5mL)、DCM(6x5mL)和DMF(6x5mL)洗涤。通过阴性茚三酮试验证实偶联反应完成。

切割

步骤I：作为受保护肽从固相中切割：

在溴乙酸的最后偶联后，树脂(4g)用***(6x10mL)洗涤，在真空干燥器中干燥过夜。通过用六氟异丙醇:DCM(1:4，40mL)的混合物在室温下处理肽-树脂3小时，来实现将肽从固相支持体上切割。经过滤收集切割混合物后，树脂用DCM(2x5mL)洗涤。将过量试剂在氮气下浓缩至小体积，将少量DCM(5-10mL)加入残余物中，在氮气下蒸发。重复该过程3-4次以除去大部分挥发物。使残余物冷却至0℃后，加入无水***使肽沉淀。将沉淀的肽离心，除去上清液***，向肽中加入新的***后再次离心。重复该过程3x，以除去全部有机物，得到3.0g粗制化合物，纯度为40%。

步骤II：侧链保护基团的切割：

用由25%TFA和2.5%TIPS/DCM组成的切割混合物(20mL)处理粗制化合物，来实现叔丁基最后的脱保护。搅拌溶液30分钟。在氮气下将过量试剂浓缩至小体积，将少量DCM(5-10mL)加入残余物中，在氮气下蒸发。重复该过程3-4次以除去大部分挥发物。使残余物冷却至0℃后，加入无水***使肽沉淀。将沉淀离心，除去上清液***相，向肽中加入新的***后再次离心。重复该过程3x，以除去全部有机物，得到2.7g粗制肽，纯度约为35%。化合物用制备型HPLC纯化，得到纯的化合物。

接头5的纯化和表征

分析型(Agilent1100系列)

柱：Zorbax Eclipse XDB-C₁₈(4.6X150mm，5μm)。

温度：25℃。

溶剂A：0.1%TFA/H₂O。

溶剂B：9:1:0.1(MeCN/H₂O/TFA)。

流速1mL/分钟

监测波长：220nm(二极管阵列检测器)。

梯度

时间(分钟)	0	2	15	20	25	30	32	35
									%B	2	2	70	95	100	100	2	2

将粗制肽溶于MeCN/H₂O(1:1)的混合物中并注射。

R_t=15.45分钟。

制备型HPLC(Agilent1100系列)

柱：Zorbax-Eclipse XDB-C₁₈，9.4X250mm，5μm。

温度：25℃。

溶剂A：0.1%TFA/H₂O。

溶剂B：MeCN

流速7mL/分钟

监测波长：220nm(二极管阵列检测器)

梯度

时间(分钟)	0	5	15	17
					%B	5	25	70	70

接头#	HPLC纯度(%)	LC-MS
			5	95	1064.5(M+1)

接头6：(NN-AU-0078)

材料

固相支持体：PAM树脂0.7-1.3mmol/g，100-200目(Sigma)。

Fmoc-8-氨基-3,6-二氧杂辛酸、MSNT(Chemimpex)、Fmoc-Glu-O^tBu(Novabiochem)、Fmoc-Gly-OH(GLBiochem)。

Fmoc-Gly-OH与PAM树脂先连接：

使PAM树脂(3g，3.3mmol)在无水DCM(经P₂O₅蒸馏)中溶胀1小时。将Fmoc-Gly-OH(4.9g，5eq，16.5mmol)、MSNT(4.9g，5eq，16.5mmol)、N-甲基咪唑(0.75mL，3.75eq，12.4mmol)溶于含有2-3滴THF的无水DCM(20mL)中，加到预先溶胀的树脂中。使树脂在Robbins scientific旋转器中在室温下旋转。反应2小时后，将树脂过滤，用DCM(6x10mL)和DMF(6x10mL)洗涤。在相同条件下再次重复该过程。

除去Fmoc-Gly-PAM的Fmoc基团：

通过用20%(v/v)哌啶/DMF溶液(15mL)处理两次各5和15分钟，使Fmoc-Gly-PAM的Fmoc基团脱保护。然后将树脂过滤，用DMF(10x5mL)、DCM(6x10mL)和DMF(6x10mL)洗涤。通过阳性茚三酮试验证实Fmoc基团脱保护。

Fmoc-氨基酸/接头/胆酸序贯偶联的通用方法：

从肽基树脂上切割叔丁基：

在靶分子与固相序贯连接后，树脂用***(6x10mL)洗涤，在真空干燥器中干燥过夜。通过用由95%TFA、2.5%三异丙基甲硅烷(TIS)、2.5%水(25mL)组成的切割混合物在室温下处理肽-树脂1小时，来实现从固相支持体上切割肽。树脂用DCM(2x5mL)、DMF(2x5mL)和DCM(2x5mL)洗涤。经干燥的切割了叔丁基侧链的肽树脂用CHCl₃(54mL)和氨基乙醛二甲基缩醛(36mL)的混合物在45℃下处理26小时。切割后，将树脂滤干，用DCM、MeOH、H₂O、0.1%TFA、HFIP、DCM、MeOH和DCM洗涤。合并滤液后，真空蒸发。将所得油状物溶于蒸馏水，用TFA调节pH至7。将溶液冷冻并冻干，得到粗制油状物。粗制油状物用制备型HPLC纯化，得到263mg化合物。

肽的纯化和表征

分析型(Agilent1100系列)

柱：Zorbax Eclipse XDB-C₁₈(4.6X150mm，5μm)

温度：25℃。

溶剂A：0.1%TFA/H₂O。

溶剂B：9:1:0.1(MeCN/H₂O/TFA)。

流速1mL/分钟

监测波长：220nm(二极管阵列检测器)。

梯度

时间(分钟)	0	2	15	20	25	30	32	35
									%B	2	2	70	95	100	100	2	2

将粗制肽溶于MeCN/H₂O(1:1)的混合物中并注射。

R_t=14.37分钟。

制备型HPLC(Agilent1100系列)

柱：Zorbax-Eclipse XDB-C₁₈，9.4X250mm，5μm

温度：25℃。

溶剂A：0.005%TFA/H₂O。

溶剂B：MeCN

监测波长：220nm(二极管阵列检测器)。

梯度

时间(分钟)	%B
		0	25
2	30
		50	80

接头7：(NN-AU-0015)

材料

固相支持体：2gTentagelSRAM树脂0.24mmol/g，

Boc-4-氨基苯甲酸、H-Lys(Fmoc)-OH、HATU、NMM、DMF、Fmoc-Glu-OtBu、Fmoc-8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(Chem Impex)、琥珀酐、胆酸、DIC(Sigma))、TFA、哌啶、DMF、DCM(Spectrochem Bombay，India)和HOBt(Chemlabs，Leonidchemicals(Pvt)Ltd，India)。

Boc-氨基苯甲酸-Lys(Fmoc)-OH的合成

将Boc-4-氨基苯甲酸(1.16g，4.8mmol，0.9eq)、HATU(2.05g，5.4mmol，1.0eq)和NMM(1.2mL，10.8mmol，2eq.)溶于DMF(20ml)中，将反应混合物在冰浴温度下搅拌5分钟。在冰浴温度下向该混合物中加入H-Lys(Fmoc)-OH(2g，5.4mmol，1.0eq.)，将混合物在室温下再搅拌3小时。反应完成后(用TLC监测)，反应混合物用冰水猝灭，滤出沉淀。所得沉淀进一步用冰水和己烷洗涤。干燥后得到的化合物(2.1g，65%)无需进一步纯化便可用于下一步。

Boc-氨基苯甲酸-Lys(Fmoc)-OH与聚合物支持体的连接：

使Tentagel S RAM树脂(2g，0.24mmol)在DCM和DMF中各溶胀1小时。将Boc-氨基苯甲酸-Lys(Fmoc)-OH(1.4g，2.4mmol)、HOBt(327.6mg，2.4mmol)、DIC(371.6mg，2.4mmol)溶于DMF(10mL)中，并转移到预先溶胀的树脂中。使树脂在Robbins scientific旋转器中在室温下旋转5小时。将反应物过滤，用DCM(6x10mL)和DMF(6x10mL)洗涤。

Boc-氨基苯甲酸-Lys(Fmoc)-树脂的Fmoc基团的脱去：

通过用20%(v/v)哌啶/DMF溶液(20mL)处理两次各5和15分钟，使上述Boc-氨基苯甲酸-Lys(Fmoc)-树脂的Fmoc基团脱保护。然后将树脂过滤，用DMF(10x5mL)、DCM(6x10mL)和DMF(6x10mL)洗涤。Fmoc基团的脱保护通过阳性茚三酮试验证实。

Fmoc-氨基酸序贯偶联的通用方法：

琥珀酐的偶联：

使Fmoc-脱保护的胺树脂在DMF中溶胀。将琥珀酐(5eq.，相对于树脂负载)与DIPEA(5当量)在NMP中的溶液加入预先溶胀的树脂中，使反应混合物在室温下旋转2小时。将树脂过滤后，用DMF(6x5mL)、DCM(6x5mL)和DMF(6x5mL)洗涤。通过阴性茚三酮试验证实偶联反应完成。

胆酸羟基胺的偶联：

将胆酸叔丁酯-ONH₂(5当量，相对于树脂负载)、HOBt(5当量)和DIC(5当量)在无水DMF中的溶液加入预先溶胀的树脂中，使反应混合物在室温下旋转24小时。将树脂过滤后，用DMF(6x5mL)、DCM(6x5mL)和DMF(6x5mL)洗涤。

树脂上的肽切割：

在靶分子与固相序贯连接后，树脂用***(6x10mL)洗涤，在真空干燥器中干燥过夜。通过用由95%/2.5%/2.5%(TFA/TIS/水)组成的切割混合物(25mL)在室温下处理肽-树脂3小时，来实现从固相支持体上切割肽。经过滤收集切割混合物后，树脂用DCM(2x5mL)洗涤。将过量试剂在氮气下浓缩至小体积，将少量DCM(5-10mL)加入残余物中，在氮气下蒸发。重复该过程3-4次以除去大部分挥发物。使残余物冷却至0℃后，加入无水***使肽沉淀。将沉淀的肽离心，除去上清液***相，向肽中加入新的***后再次离心。重复该过程3x，以除去全部有机物，得到粗制化合物(1.3g，15%纯度)。目标化合物用prep-HPLC纯化，得到化合物。

肽的纯化和表征

分析型(Agilent1100系列)

柱：Zorbax Eclipse XDB-C₁₈(4.6X150mm，5μm)

温度：25℃。

溶剂A：0.1%TFA/H₂O。

溶剂B：9:1:0.1(MeCN/H₂O/TFA)

流速1mL/分钟

监测波长：220nm(二极管阵列检测器)。

梯度

时间(分钟)	0	2	15	20	25	30	32	35
									%B	2	2	70	95	100	100	2	2

将粗制肽溶于MeCN/H₂O(1:1)并注射。

R_t=7.46分钟。

制备型HPLC(Agilent1100系列)

柱：Zorbax-Eclipse XDB-C₁₈，9.4X250mm，5μm。

温度：25℃。

溶剂A：0.005%TFA/H₂O。

溶剂B：MeCN

流速5mL/分钟

监测波长：220nm(二极管阵列检测器)。

梯度

时间(分钟)	%B
		0	5
40	30
		15	40

接头8：(NN-AU-0016)(NN-AU-0016)按以上有关接头7中所述类似方法，使用FMOC-Lys(Mtt)-OH和Wang树脂，制备下列化合物。

TOF-MS：质量916.13。

接头9：(NN-AU-0086)

按以上有关接头7中所述类似方法，使用FMOC-Lys(Mtt)-OH和Wang树脂，制备下列化合物。

TOF-MS：质量1059.4

HPLC：

柱：Zorbax Eclipse XDB-C₁₈(4.6X150mm，5μm)

温度：25℃。

溶剂A：0.1%TFA/H₂O。

溶剂B：9:1:0.1(MeCN/H₂O/TFA)

流速1mL/分钟

监测波长：220nm(二极管阵列检测器)。

R_t=14.02分钟。

接头10：

材料

	名称	密度	Mw	Mol	n	W	V
										[g/ml]	[g/mol]	比率	[mmol]	[mg]	[ul]
A	尸胺		102.18	10	10	1021.81
								B	产物：C₄₆H₈₁N₅O₁₃		912.18
C	2-氯三苯甲基树脂			1,1	1,1	1000
								D	Fmoc-OEG-OH		385.42	4	4	1541.68
F	DIC	0.815	126.2	4	4	504.8	619
								E	HOBt		153.2	4	4	612.8
G	Fmoc-OEG-OH		385.42	4	4	1541.68
								H	DIC	0.815	126.2	4	4	504.8	619
I	HOBt		153.2	4	4	612.8
								J	Fmoc-Glu-OtBu		425.49	4	4	1701.96
K	DIC	0.815	126.2	4	4	504.8	619
								L	HOBt		153.2	4	4	612.8
M	胆酸		408.58	4	4	1634.32
								N	DIC	0.815	126.2	4	4	504.8	619
O	HOBt		153.2	4	4	612.8

方法：

在NMP中制备0.5MHOBt溶液。

使树脂在DCM中溶胀30分钟。

树脂用尸胺:DCM(10mL，1:9)的混合物处理30分钟。

树脂用5%DIPEA；5%MeOH/DCM处理30分钟。

树脂用DCM(3x)洗涤。

Fmoc-OEG-OH的偶联：

在NMP(8mL)中制备Fmoc-OEG-OH/DIC/HOBt的0.5M溶液，混合2分钟后加入三苯甲基树脂(1g)中。将树脂在室温下振荡45分钟，接着用NMP(5x)和DCM(5x)洗涤。少量产物从树脂上切割，并通过LCMS进行分析。

帽化：

加入Ac₂O/DIPEA/NMP(1:1:5)的溶液。将树脂在室温下搅拌10分钟后，用NMP(5x)和DCM(5x)洗涤。

De-Fmoc：

树脂用30%哌啶-NMP处理2x10分钟。

树脂用NMP(5x)和DCM(5x)洗涤。

第二Fmoc-OEG-OH的偶联：

在NMP(8mL)中制备Fmoc-OEG-OH/DIC/HOBt的0.5M溶液，混合2分钟后，加入上述树脂中。将树脂在室温下振荡45分钟，接着用NMP(5x)和DCM(5x)洗涤。少量产物从树脂上切割，并通过LCMS进行分析。

De-Fmoc：

树脂用30%哌啶-NMP处理2x10分钟。

树脂用NMP(5x)和DCM(5x)洗涤。

Fm _oc -Gl _u -tB _u 的偶联：

在NMP(8mL)中制备Fmoc-Glu-tBu/DIC/HOBt的0.5M溶液，混合2分钟后，加入树脂中。将树脂在室温下振荡45分钟，用NMP(5x)和DCM(5x)洗涤。少量产物从树脂上切割，并通过LCMS进行分析。

De-Fmoc：

树脂用30%哌啶-NMP处理2x10分钟。

树脂用NMP(5x)和DCM(5x)洗涤。

胆酸的偶联：

在NMP(8mL)中制备胆酸/DIC/HOBt的0.5M溶液，混合2分钟后，加入树脂中。将树脂在室温下振荡过夜。接着用NMP(5x)和DCM(5x)洗涤。少量产物从树脂上切割，并通过LCMS进行分析。

从树脂上切割：

树脂用TFA/水/Et₃SiH(15mL，90:5:5)的混合物处理10分钟两次。将合并的滤液浓缩后，通过LCMS分析。LCMS表明形成产物(60%)和三氟乙酰化产物(40%)。因此将残余油状物溶于2MNH₃/MeOH(10mL)中，在室温下搅拌1小时。真空除去挥发物，将残余物溶于MeCN和MQ(11mL，1:10)的混合物，过滤，采用Waters通过prepHPLC纯化：

合并流分，真空浓缩，得到194mg无色油状物。

TOF-MS：质量912.13

按上文有关接头5所述类似方法，使用FMOC-L_ys(Mtt)-OH和Wang树脂，制备下列化合物。

接头11：

接头#	HPLC纯度(%)	LC-MS
			11	96	1032.7(M+1)

接头12：

接头#	HPLC纯度(%)	LC-MS
			12	94	1047.6(M+1)

和

接头13：

接头#	HPLC纯度(%)	LC-MS
			13	95	1048.7(M+2)

胆酸缀合的化合物的合成

按照方法3.1在N端Phe处连接接头3。

化合物A-NNC0186-0000-0078

hGH[Q83C,Y143C]在N端处用接头3还原烷基化。

样品：

将冻干的hGH[Q83C,Y143C](150mg)溶于10mM碳酸氢铵缓冲液，采用Amicon Ultra15装置(Ultracel10K管)通过在4000rpm/分钟、10℃下离心3x8分钟，更换缓冲液为25mM HEPES，pH7.0。

方法：

接头3(11mg)用TFA(500μL)处理6分钟，以释放醛，蒸发后，用EtOH(0.5mL)反萃取两次至干。

分批加入上述hGH[Q83C,Y143C]的溶液，同时通过加入1N NaOH保持pH约为7.0。以5分钟的间隔分批加入溶于水(500μL)的NaCNBH₃(53mg)(5x100μL)。

反应烧瓶用锡纸包裹，将反应混合物在室温下轻轻搅拌过夜。搅拌1小时后得到澄清溶液。在搅拌过夜后，用LC/MS分析样品：产物的m/z：23.063，Rt=6分钟，但起始蛋白质仍剩余。

混合物使用IEX和HIC层析法联合纯化，在G25柱上进行缓冲液交换，超滤，得到4mg，95%纯化合物。

产物的m/z：23.063[M+1]。

化合物B-NNC0186-0000-0036

按照方法3.1，hGH[Q83C,Y143C]在N端用接头6还原烷基化

样品：

化合物	Mw	比率	μmole	mg
					hGH[Q83C,Y143C]	22.038g/摩尔	1	8.67	191
接头6	1.013g/摩尔	4.5	39.0	39.5
					NaCNBH3	62.84g/摩尔	124	1075	67.6

将冻干的hGH[Q83C,Y143C](200mg)溶于10mM碳酸氢铵缓冲液中，使用Amicon Ultra15装置(Ultracel10K管)通过以4000rpm/分钟、10℃离心3x7分钟，更换缓冲液为25mM HEPES，pH7.00。最终体积：40mL。

方法：

接头6(39.6mg)用50%TFA/H₂O(2mL)的混合物处理20分钟，在旋转蒸发仪(rotavapor)中蒸发至干，用EtOH(2x1mL)反萃取。

当加入hGH[Q83C,Y143C]时，将1N NaOH(5μL)加入无水接头中以防止pH下降。

将上述hGH[Q83C,Y143C]的溶液加入接头中，用1N NaOH(90μL)调节pH至7.00。在加入反应混合物期间pH下降至6.55。用1N NaOH(40μL)调节pH至7.00。

将NaCNBH₃(67.6mg)溶于水(600μL)，并以5分钟的间隔分批加入(3x200μL)。将反应混合物用锡纸包裹，轻轻搅拌的同时温育过夜。LCMS分析表明仍有一些起始原料。使反应混合物温育，在室温下轻轻搅拌，并在4℃下静置过夜。在

***上纯化之前，调节反应混合物的pH至7.50，用Milli-Q水稀释至20mS的电导率。

样品体积：110mL

柱：HiLoad26/10Q Sepharose

缓冲液A：20mM HEPES，pH:7.50+10%乙二醇(Ethylenglycol)

缓冲液B：20mM HEPES，pH:7.50+1MNaCl+10%乙二醇

流速：6mL/分钟

梯度：0-5%，1CV，5-40%，12CV，40-100%，1CV

流分大小：7mL。使用样品泵以5mL/分钟的流速加样品。流分E4，实测所需质量：22.989

合并不充分纯的所有流分用于进一步纯化。

在3次运行中，使流分E4更换缓冲液至10mM碳酸氢铵缓冲液：

柱：50/30Sephadex G25Fine

缓冲液A：10mM碳酸氢铵缓冲液。

流速：10mL/分钟

流分大小：45mL

1轮：合并的流分A2-A3；16.6mg纯化合物

2轮：合并的流分A1-A2；12.9mg纯化合物

3轮：合并的流分A7-A8；19.2mg纯化合物

LC-MS(电喷雾)：m/z实测：22.989

化合物C0186-0000-0050

按照方法3.2接头7在Gln残基上的连接。

如上所述产生转氨基化hGH[Q83C,Y143C]，并与接头7缀合。TOF-LC-MS：质量23.253,99

合并物1：产量12.8mg。纯度：100%。

合并物2：产量19.2mg。纯度：100%。

化合物D NNC0186-0000-0061

按上述有关化合物C的类似方式，使用接头8制备下列化合物。

化合物E–NNC0186-0000-0081

按照方法3.3接头5在101位(L101C)上的连接。

按方法2所述得到的[Q84C,L101C,Y143C]的部分游离半胱氨酸被谷胱甘肽和胱胺封闭。使用含TSPP的TEA/EDTA缓冲液，进行选择性解封闭。

向含hGH[Q84C,L101C,Y143C]的20mM TEA-缓冲液(pH7.4)与约0.1MNaCl的溶液(170mL，蛋白质浓度：2.69mg/mL)中加入EDTA(126mg)至2mM的浓度，用6N NaOH调节pH至8.5。加入TSPP(339mg，25eq.)，将所得混合物在室温下轻轻搅拌4小时。

LC-MS TOF：22.028相当于脱保护的蛋白质(-75)

与接头偶联：

试剂	Mw(g/摩尔)	比率	μmole	mg
					hGH[Q84C,L101C,Y143C]	22.028	1	6.35	140
接头5	1.06	5	32	33

向含解封闭的hGH[Q84C,L101C,Y143C](140mg，13.3mL)的TRIS/NaCl溶液中加入溶于NMP(1mL)、NaCl(0.88mg)和曲辛/EDTA-缓冲液(14mL)的混合物的接头5(33mg)的溶液中。将所得混合物在环境温度下轻轻搅拌过夜(16小时)。

LC-MS TOF：在Rt=6.6分钟时实测23.010。

粗产物的HPLC约为92%纯

总量：138mg。

化合物F NNC0186-0000-0087

按有关化合物E所述类似方法，使用接头5和GH化合物hGH[S62C,Q84C,Y143C]，制备下列化合物。

在蛋白质和接头偶联过夜后，使反应混合物更换缓冲液成20mM三乙醇胺(trietheno lamine)+10%乙二醇(Ethylen glycol)(pH8.50)。

缓冲液更换：

柱：HiPrep26/10脱盐

缓冲液A：20mM TEA，pH:8.50+10%乙二醇

流速：8mL/分钟

合并流分A3和A5用于纯化。

纯化:

柱：HiLoad26/10Q Sepharose HP

缓冲液A：20mM三乙醇胺+10%乙二醇，pH8.50

缓冲液B：20mM三乙醇胺+10%乙二醇，pH8.50+1M NaCl

梯度1：0-10%缓冲液B，在1CV内

梯度2：10-40%缓冲液B，在12CV内

梯度3：40-100%缓冲液B，在1CV内

流速：6mL/分钟

温度：RT

流分：7mL

合并流分D11-D8，并更换缓冲液，且

合并流分C12和D12，更换缓冲液：

D11-D8的缓冲液更换：

柱：HiPrep26/10脱盐

缓冲液A：10mM碳酸氢铵缓冲液

流速：8mL/分钟

收集流分A2、A4、A6和B6并合并，得到47.5mg(HPLC定量测定)100%纯的化合物。

C12和D12的缓冲液更换：

柱：HiPrep26/10脱盐

缓冲液A：10mM碳酸氢铵缓冲液

流速：8mL/分钟

收集流分B4，得到11.9mg(HPLC定量测定)90%纯的化合物。

LC-MSTOF：23.036,62[M+1]

化合物G NNC0186-0000-0088

按照方法3.2，接头10在hGH[Q84C，Y143C]的Gln40上连接。

GH化合物(I)用胆汁酸接头A-W-B1-NH₂(II)和mTGase直接转氨基(如方法3(2)所述)。

缓冲液：

反应缓冲液：20mM三乙醇胺，pH8.5

咪唑缓冲液：20mM咪唑缓冲液pH7.4、10mM CaCl₂、10%甘油、0.02%Tween80。

溶液：

A：hGH[Q84C,Y143C](4.4mg)在反应缓冲液中的227uM溶液

B：接头10在反应缓冲液中的2.91mM溶液

D：Ajinomoto TGase(31mg)在20mM咪唑缓冲液(515μL)(pH7.4)、10mMCaCl₂、10%甘油、0.02%Tween80中的溶液；C=60mg/mL=11.4μM。

按照下述方案，在25℃下将溶液A和B混合，加入D。将所得混合物在室温下搅拌42小时。

hGH[Q84C,Y143C]	接头10	mTGase	咪唑-缓冲液	最终体积
					A(μL)	B(μL)	D(μL)	(μL)	(μL)
880	775	400	1945	4000

采用下表描述的操作条件，在100***上对反应混合物进行纯化：

柱	HiTrapQHP，CV=5mL
		缓冲液A1	20mM HEPES，10%乙二醇，pH=7.5
缓冲液B1	20mM HEPES，10%乙二醇，1M NaCl，pH=7.5
		流速	变量(见下文)
波长	214/280nm
		最大压力	0.7MPa(对于背压使用FR-902)
温度	RT
		流分体积	1.5mL，对全部使用96孔微量测定板
注射体积	5mL
		平衡	Predone，100%A1
注射+洗出	2CV，流速=2mL/分钟，100%A1
		体积	50CV
时间	约85分钟。
		CV	梯度；流速
16	0-12%B1；3mL/分钟
		10	12-25%B1；3mL/分钟
10	25-50%B1；3mL/分钟

3个峰用40mL的9-18%缓冲液B1洗脱。收集含有靶分子的流分(LC-MS22.933)。

化合物H

按有关化合物E所述类似方法，使用接头11和GH化合物hGH[Q84C,L101C,Y143C]，制备下列化合物。

在蛋白质和接头偶联过夜后，使反应混合物更换缓冲液成20mM三乙醇胺+10%乙二醇(pH8.50)。

缓冲液更换：

柱：HiPrep26/10脱盐

缓冲液A：20mM TEA，pH:8.50+10%乙二醇

流速：8mL/分钟

合并流分用于纯化。

纯化：

在

***中对反应混合物进行纯化。

用20mM TEA(pH8.50)+10%乙二醇洗脱至0.1M NaCl的盐浓度。

柱：HiLoad26/10Q Sepharose HP

CIP：1M NaOH

缓冲液A：20mM三乙醇胺+10%乙二醇pH8.50

缓冲液B：20mM三乙醇胺+10%乙二醇pH8.50+1M NaCl

梯度1：0-14%缓冲液B，在1CV内

梯度2：14-19%缓冲液B，在10CV内

梯度3：19-100%缓冲液B，在1CV内

流速：5mL/分钟

温度：RT

流分：7mL/流分

使用样品泵以5mL/分钟的流速加载样品：

极宽峰。

用HPLC分析流分E12、E7、F3、F8、G2、G5。

合并流分E7-G7。

体积：190mL

用HPLC脱盐前进行定量和检查。

实测面积：3624836，注射：5μL，ex.coef.:1000000=0.72mg/mLx190mL=137mg，缓冲液更换前

RT.：14.36分钟的产物。

脱盐：

在上使产物进行缓冲液更换成10mM碳酸氢铵缓冲液。

柱：HiPrep G25Fine50/20脱盐

缓冲液A：10mM碳酸氢铵

流速：8mL/分钟

运行：1.5CV

温度：RT

流分：45mL/流分

使用样品泵以5mL/分钟的流速以2次运行加载样品：

将第一次运行的流分A3-A5与第二次运行的流分A2-A4合并在一起。

体积：270mL

采用Amicon Filter装置以10kDa的截止限(cut off)浓缩合并物。

以4000rpm/6分钟离心。

总体积：37.5mL

用HPLC定量：

实测面积：16576155，注射：5μL，ex.coef.：1000000=3.32mg/mLx37.5mL=124.5mg

LC-MS(电喷雾)：m/z：22.978,4，Rt:6分钟。

HPLC：Rt=14.23分钟。

化合物I

按有关化合物E所述类似方法，使用接头12和GH化合物hGH[Q84C,L101C,Y143C]，制备下列化合物。

缓冲液更换：

柱：HiPrep26/10脱盐

缓冲液A：20mM TEA，pH:8.50+10%乙二醇

流速：8mL/分钟

纯化：

在

中对反应混合物进行纯化。

用20mM TEA(pH8.50)+10%乙二醇稀释至0.1M NaCl的盐浓度。

柱：HiLoad26/10Q Sepharose HP

CIP：1M NaOH

缓冲液A：20mM三乙醇胺+10%乙二醇pH8.50

缓冲液B：20mM三乙醇胺+10%乙二醇pH8.50+1M NaCl

梯度1：0-15%缓冲液B，在1CV内

梯度2：15-25%缓冲液B，在10CV内

梯度3：25-100%缓冲液B，在1CV内

流速：5mL/分钟

温度：RT

流分：7mL/流分

使用样品泵以5mL/分钟的流速加载样品：

窄峰的分离良好。

对流分C10、C12、D9和D7进行了分析。全都是纯的，且含有产物。

合并C10-D7的流分。

体积：63mL

脱盐：

在

中使产物更换缓冲液成10mM碳酸氢铵缓冲液。

柱：HiPrep G25Fine50/20脱盐

缓冲液A：10mM碳酸氢铵

流速：8mL/分钟

运行：1.5CV

温度：RT

流分：45mL/流分

使用样品泵以5mL/分钟的流速在一次运行中加载样品：

合并流分A3-A5。

总体积：135mL

采用截止限为10kDa的Amicon Filter装置浓缩合并流分。

以4000rpm/6分钟离心。

体积：21.3mL

用HPLC定量：

实测面积：16991257，注射：5μL，2x FF，ex.coef.：1000000=6.80mg/mLx21.3mL=144.5mg

纯度：100%

HPLC：Rt=13.65分钟。

LC-MS(电喷雾)：Rt：6分钟的m/z：22.994,5。

化合物J

按有关化合物E所述类似方法，使用接头13和GH化合物hGH[Q84C,L101C,Y143C]，制备下列化合物。

缓冲液更换：

柱：HiPrep26/10脱盐

缓冲液A：20mM TEA，pH:8.50+10%乙二醇

流速：8mL/分钟

纯化：

在中对反应混合物进行纯化。

用20mM TEA(pH8.50)+10%乙二醇稀释至0.1M NaCl的盐浓度。

柱：HiLoad26/10Q Sepharose HP

CIP：1M NaOH

缓冲液A：20mM三乙醇胺+10%乙二醇pH8.50

缓冲液B：20mM三乙醇胺+10%乙二醇pH8.50+1M NaCl

梯度1：0-14%缓冲液B，在1CV内

梯度2：14-25%缓冲液B，在10CV内

梯度3：25-100%缓冲液B，在2CV内

流速：5mL/分钟

温度：RT

流分：7mL/流分

使用样品泵以5mL/分钟的流速加载样品：

用TOF检测流分C2、C11和D8，用HPLC检查流分B1、C3、C6、C9、C12、D10。

全部合并流分B1-D5。

脱盐。

在

中使合并的流分更换缓冲液成10mM碳酸氢铵缓冲液。

柱：HiPrep G25Fine50/20脱盐

缓冲液A：10mM碳酸氢铵

流速：8mL/分钟

运行：1.3CV

温度：RT

流分：45mL/流分

使用样品泵以5mL/分钟的流速以两次运行加载样品：

合并第一次运行的流分A4、A5和A6，合并第二次运行的流分A3、A4和A5。

采用Amicon Filter装置以10kDa的截止限浓缩合并物。

以4000rpm/6分钟离心。

体积：30mL

用HPLC定量：

实测面积：17898813，注射：5μL，2x FF，ex.coef.：1000000=3.58mg/mL x29.5mL=105.5mg。

Rt：13.63分钟的纯度：96%。

LC-MS(电喷雾)：m/z：22.994。

化合物K

按有关化合物E所述类似方法，使用接头5和GH化合物hGH[L101C]，制备下列化合物。

缓冲液更换：

柱：HiPrep26/10脱盐

缓冲液A：20mM TEA，pH:8.50+10%乙二醇

流速：8mL/分钟

第1次纯化：

在

中对反应混合物进行纯化。

用20mM TEA(pH8.50)+10%乙二醇稀释至0.1M NaCl的盐浓度

柱：HiLoad26/10Q Sepharose HP

CIP：1M NaOH

缓冲液A：20mM三乙醇胺+10%乙二醇pH8.50

缓冲液B：20mM三乙醇胺+10%乙二醇pH8.50+1M NaCl

梯度1：0-15%缓冲液B，在1CV内

梯度2：15-30%缓冲液B，在10CV内

梯度3：30-100%缓冲液B，在2CV内

流速：5mL/分钟

温度：RT

流分：7mL/流分

使用样品泵以5mL/分钟的流速加载样品：

用HPLC分析流分D5、D4、D1、E3和E4

在所有流分中检测恰在所需产物前的峰。

使用不同梯度合并全部流分用于第二次纯化。

第2次纯化：

在

中对合并的流分进行纯化。

用20mM TEA(pH8.50)+10%乙二醇稀释至0.1M NaCl的盐浓度

柱：HiLoad26/10Q Sepharose HP

缓冲液A：20mM三乙醇胺+10%乙二醇pH8.50

缓冲液B：20mM三乙醇胺+10%乙二醇pH8.50+1M NaCl

梯度1：0-xx%缓冲液B，在1CV内

梯度2：xx%缓冲液B，在10CV内

梯度3：xx-100%缓冲液B，在2CV内

流速：5mL/分钟

温度：RT

流分：7mL/流分

使用样品泵以5mL/分钟的流速加载样品：

脱盐。

在

中使产物更换缓冲液成10mM碳酸氢铵缓冲液。

柱：HiPrep G25Fine50/20脱盐

缓冲液A：10mM碳酸氢铵

流速：8mL/分钟

运行：1.3CV

温度：RT

流分：45mL/流分

使用样品泵以5mL/分钟的流速加载样品：

合并流分A3、A4和A5。

采用截止限为10kDa的Amicon Filter装置浓缩合并流分。

以4000rpm/6分钟离心。

体积：18mL

用HPLC定量：

实测面积：11570188，注射：5μL，2x FF，ex.coef.：1000000=2.31mg/mL x2=4.62mg/mL x17.7mL=82mg

Rt：13.70分钟。

LC-MS TOF：Rt：6分钟的实测质量：23.097。

化合物L

按有关化合物E所述类似方法，使用接头5和GH化合物hGH[Q40C,Q84C,Y143C]，制备下列化合物。

缓冲液更换：

柱：HiPrep26/10脱盐

缓冲液A：20mM TEA，pH:8.50+10%乙二醇

流速：8mL/分钟

纯化：

在

中对反应混合物进行纯化。

用20mM TEA(pH8.50)+10%乙二醇稀释至0.1M NaCl的盐浓度。

柱：HiLoad26/10Q Sepharose HP

CIP：1M NaOH

缓冲液A：20mM三乙醇胺+10%乙二醇pH8.50

缓冲液B：20mM三乙醇胺+10%乙二醇pH8.50+1M NaCl

梯度1：0-15%缓冲液B，在1CV内

梯度2：15-25%缓冲液B，在11CV内

梯度3：25-100%缓冲液B，在2CV内

流速：5mL/分钟

温度：RT

流分：7mL/流分

使用样品泵以5mL/分钟的流速加载样品：

对流分C2、C3、C5、C7、C9、C11、D12、D10、D8和D6进行分析(HPLC)。全部为纯的，但做成两个合并物，并分别脱盐。

合并物I：C2-C10

合并物II：C11-D8

脱盐。

在

中使两份合并物更换缓冲液成10mM碳酸氢铵缓冲液。

合并物I。

柱：HiPrep G25Fine50/20脱盐

缓冲液A：10mM碳酸氢铵

流速：8mL/分钟

运行：1.3CV

温度：RT

流分：45mL/流分

使用样品泵以5mL/分钟的流速加载样品：

合并物II。

柱：HiPrep G25Fine50/20脱盐

缓冲液A：10mM碳酸氢铵

流速：8ml/分钟

运行：1.3CV

温度：RT

流分：45mL/流分

使用样品泵以5mL/分钟的流速加载样品：

对两次运行，均合并流分A3、A4和A5。

采用Amicon Filter装置以10kDa的截止限浓缩合并物。

以4000rpm/6分钟离心。

体积：31mL

用HPLC定量：

合并物1，实测面积：8819533，注射：5μL，ex.coff.：1000000=1.76mg/mL

合并物2，实测面积：8974748，注射：5μL，ex.coff.：1000000=1.79mg/mL

将两种合并物混合，得到31mL总体积。总共：55mg

LC-MS(电喷雾)：Rt：7分钟的m/z：22.995,6。

HPLC：Rt=13.72分钟。实施例1

如上所述通过BAF测定法和蛋白水解消化分析选定的化合物(方法5和8)。

制备包含额外二硫键的生长激素化合物，测定体外活性和蛋白酶稳定性。4小时后获得以下给出的结果(T=4)。

表1.GH化合物的蛋白水解稳定性。

实施例2

按方法5和8中所述通过BAF测定法和蛋白水解消化分析选定的化合物。

按照方法5和8对生长激素化合物进行测试

表2.GH变体化合物的蛋白水解稳定性。

实施例3

采用BAF-3hGH受体测定法(方法5)对胆汁酸缀合物的体外效价进行了分析。

按通用方法中所述，通过使化合物与胰凝乳蛋白酶或弹性蛋白酶温育4小时，来测定本发明化合物的蛋白酶稳定性。测量了完整GH化合物的百分比(%)，结果见下表。

化合物F	0.054	2,.3	85	80
					化合物H	0.016	1.34	80	65
化合物I	0.020	1.18	80	65
					化合物J	0.009	1.17	70	ND
化合物K	0.011	1.03	ND	ND
					化合物L	0.008	0.75	80	70

表3.GH化合物的蛋白水解稳定性。ND(未测定)。

实施例4.CaCo2测定中GH化合物的透性

按上述方法11中所述，对GH化合物跨肠Caco-2细胞单层转运的能力进行了测定。在吸收方向上测量了表观透性(P_app)，系列GH化合物的P_app计算值见下表。

化合物	P_app(x10^-8cm/s)
		hGH(Q84C，Y143C)	0.24±0.07
E	1.2±0.87
		F	9.0±8.40
H	0.8±1.10
		I	0.4±0.22
J	0.34±0.06
		K	0.3±0.03
L	1.0±0.11

所有值为平均值±SD，n=4。

P_app计算值表明，蛋白酶稳定的GH化合物和/或胆酸缀合的GH化合物跨Caco-2细胞单层转运。对于一些化合物获得高的P_app，而其它化合物显示低的转运，其P_app值低于0.5x10^-8cm/s。

实施例5.GH化合物的药代动力学性质

在迷你猪中，在内窥镜和i.v.给药后，对hGH、hGH(Q84C,Y143C)和具有胆酸衍生物的hGH(Q84C,Y143C,L101C)的药代动力学性质进行了研究。按照上述方法(本文的方法9)对hGH、hGH(Q84C,Y143C)和具有胆酸衍生物的hGH(Q84C,Y143C,L101C)(化合物E)进行了分析。计算的药代动力学参数见下表。

表54A.生长激素化合物和缀合物的药代动力学性质。

在另一项研究中，在Sprague Dawley大鼠中，如上所述，在肠内注射后，对hGH、hGH(Q84C,Y143C)和具有胆酸衍生物的hGH(Q84C,Y143C,L101C)的药代动力学性质进行了研究。按照上述方法(本文的方法10)，对hGH(Q84C,Y143C)和具有胆酸衍生物的hGH(Q84C,Y143C,L101C)(化合物E)进行了分析。计算的药代动力学参数见下表。

表5B.生长激素化合物和缀合物的药代动力学性质。

Claims

1. 一种下式(I)的生长激素缀合物和药学上可接受的盐：

A-W-B-GH　　(I)

其中

GH表示生长激素化合物，

A表示胆汁酸残基，

B表示与GH共价连接的亲水间隔物，

W是连接A和B的化学基团。

2. 权利要求1的生长激素缀合物，其中与SEQ ID NO 1限定的人生长激素(hGH)相比，所述生长激素化合物GH包含一个或多个额外的二硫键。

3. 权利要求2的生长激素缀合物，其中所述生长激素化合物包含连接环区段和螺旋区段的一个或多个额外的二硫键。

4. 前述权利要求中任一项的生长激素缀合物，其中所述化合物包含至少一对突变，所述突变对应于SEQ ID NO 1中的R16C/L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、D26/V102C、D26/Y103C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C和/或V185C/S188C。

5. 权利要求2-4中任一项的生长激素缀合物，其中所述生长激素化合物包含一个或多个额外的二硫键，其中所述二硫键的至少一个半胱氨酸存在于对应于SEQ ID NO 1的AA 128-154的环3 (L3)上。

6. 权利要求5的生长激素缀合物，其中所述生长激素化合物包含连接L3与螺旋2 (H2)或环1 (L1)的一个或多个额外的二硫键。

7. 前述权利要求中任一项的生长激素缀合物，其中所述胆汁酸残基(A)是胆酸残基。

8. 7的生长激素缀合物，其中所述胆酸残基选自

Figure 2011800458584100001DEST_PATH_IMAGE002

其中(*)表示亲水间隔物(B)通过W的连接点。

9. 前述权利要求中任一项的生长激素缀合物，其中GH在选自以下的野生型氨基酸残基上缀合：N端、Gln40和Gln141。

10. 前述权利要求1-8中任一项的生长激素缀合物，其中GH在突变型氨基酸残基上缀合。

11. 权利要求10的生长激素缀合物，其中所述突变型氨基酸残基是半胱氨酸(Cys)。

12. 权利要求11的生长激素缀合物，其中所述cys突变体存在于对应于人生长激素101位的位置。

13. 一种用于制备权利要求1的生长激素缀合物的方法，所述方法包括

a) 使胆酸接头与生长激素化合物(GH)缀合

b) 得到所述生长激素缀合物。

14. 一种药物组合物，其包含权利要求1-12中任一项的生长激素缀合物和药学上可接受的载体。

15. 一种治疗疾病的方法，其中所述生长激素活性可用于治疗其中患者可获益于循环生长激素的量增加的疾病或状态，所述方法包括给予患者有效量的权利要求1-12中任一项的生长激素缀合物或权利要求14的药物组合物。