CN103269714A - 以新城疫病毒为载体的疱疹病毒疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明包括重组新城疫病毒-疱疹病毒疫苗或组合物。本发明包括重组NDV载体，其编码或表达疱疹病毒病原体、抗原、蛋白质、表位或免疫原。所述疫苗或组合物可用于保护动物使之不受疾病的侵害。

Description

以新城疫病毒为载体的疱疹病毒疫苗

相关申请的交叉引用

本申请要求于2010年8月31日提交的美国临时申请序列号61/378,575的权益。

发明领域

本发明包括以NDV为载体的疱疹病毒疫苗或组合物。

发明背景

近年来，有一些研究聚焦于开发新城疫病毒（NDV）用作疫苗载体用于禽类疾病的潜力(Krishnamurthy等人，Virology278,168-182,2000;Huang等人,J.Gen.Virol.82,1729-1736,2001;Nakaya等人,J.Virol.75,11868-11873,2001;Park等人PNAS103,8203-8208,2006;Veits et al PNAS103,8197-8202,2006;Ge等人J.Virol.81,150-158,2007;

等人Vaccine26,2307-2313,2008)。

NDV属于副黏液病毒亚科（Paramyxovirinae），禽腮腺病毒（Avulavirus）属。NDV在呼吸道及胃肠道、在输卵管中复制，有一些分离株会在神经***中复制。其通过口、***物途径进行空气传染。NDV引起高感染性的致命疾病，影响到所有鸟种属，也可感染一些哺乳动物种属。该疾病可分为临床不明显形式及高毒性形式，这取决于病毒株和宿主种属。根据NDV显示的毒力连续谱可将其分成三种不同的病理型：弱毒型、中毒型（mesogenic）以及强毒型（Alexander,D.J.,Diseases of Poultry,Iowa State Uni.Press,Ames IA,541-569,1997)。弱毒型株通常不会在成年鸡中引发疾病，并在美国和其他国家被广泛用作肉禽工业中的活体疫苗。中等毒力的病毒被称为中毒型，而引起高死亡率的病毒被称为高毒型。该疾病在世界范围都有分布，仍然是商业肉禽生产的长期主要威胁。

NDV基因组具有大约15kb的不分节段的负链RNA。所述基因组RNA含有六个基因，按顺序分别编码以下蛋白质：核壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白（F）、血凝素-神经氨酸酶（HN）和大聚合酶蛋白（L）。P基因转录过程中的RNA编辑会产生功能未知的两个其他的蛋白质V和W(Steward等人,1993,Journal ofGeneral Virology74:2539-2547)。

近年来建立的从克隆的cDNA中完整回收不分节段负链RNA病毒的方法的发展开拓了对此种病毒组群进行遗传操作的可能性，包括NDV(Conzelmann,K.K.,Ann.Rev.Genet.32,123-162,1998;Robertsand Rose,Virology247,1-6,1998)。所述独特的分子遗传方法学，称为“反向遗传学”，不仅提供了研究多种编码病毒的基因功能的方式(Palese等人,PNAS93,11354-11358,1996;Nagai,Y.,Rev.Med.Virol.9,83-99,1999)，还提供了将这些病毒用于表达异源基因的方式(Bukreyev等人,J.Virol.70,6634-6641,1996;Mebatsion等人,PNAS93,7310-7314,1996;Schnell等人,PNAS93,11359-11365,1996;Hasan等人,J.Gen.Virol.78,2813-2820,1997;He等人,Virology237,249-260,1997;Sakai等人,FEBS Lett.45,221-226,1999)。这提供了一种生成改善的疫苗和疫苗载体的新方法。近期，NDV被用作载体用于表达禽流感抗原(US2010/0255029,Merial Limited)。

疱疹病毒糖蛋白D(gD)对FHV-1(猫疱疹病毒–1)的进入至关重要，并且参与与宿主细胞的相互作用（结合至受体）。gD蛋白质具有对猫血红细胞的凝血活性(Maeda等人,Virology202,1034-8,1994;Maeda等人,Virus Res.46,75-80,1996)。疱疹病毒糖蛋白B（gB）对FHV进入至关重要，并参与融合过程(Spatz and Maes,Virology197,125-36,1993;Maeda等人,Virus Res39,55-61,1995)。两种糖蛋白都可诱导中和抗体的产生(Horimoto等人,Arch Virol111,127-32,1990)。

由于动物，包括人类对疱疹病毒的易感性，因此防止疱疹病毒感染并保护动物的方式变得至关重要。因此，需要开发针对疱疹病毒的有效疫苗。

本申请中任何文档的引用或识别并不承认该文档是作为本发明的在先技术可用的。

发明简述

本发明涉及以NDV为载体的疫苗或包含一种或多种工程改造的重组NDV载体和可选地药学或兽医学可接受载体、佐剂、辅料或媒介物的组合物，所述重组NDV载体包括并表达特定疱疹病毒抗原，如猫疱疹病毒抗原。所述NDV可为

NDV株，其为MerialLimited的商业化改良活体疫苗。

疱疹病毒抗原可为糖蛋白。所述疱疹病毒抗原可为来自猫疱疹病毒的糖蛋白B（gB）或糖蛋白D（gD）抗原。

本发明还涉及免疫动物的方法，其包括对动物施用有效量的一种或多种疫苗或组合物，所述疫苗或组合物可包含有效量的重组NDV载体和可选地药学或兽医学可接受载体、佐剂、辅料或媒介物。所述的施用可以为通过卵内、口鼻、滴眼、喷雾、饮用水或非肠道方式(皮下、肌内、透皮、皮内)的施用。

本发明进一步涉及使用初免-增强免疫（prime-boost）操作流程施用所述疫苗或组合物。本发明进一步包括用于实施诱发或诱导免疫应答的方法的试剂盒，其可包含重组疱疹病毒免疫组合物或疫苗、或灭活免疫组合物或疫苗中任意一种，以及用于进行所述方法的说明书。

因此，本发明的一个目标是不在本发明内包括任何先前已知的产品、制造所述产品的过程或使用该产品的方法，这样使得本申请人保留权利并由此公开对任何先前已知产品、过程或方法的免责声明。进一步应当注意，本发明不意欲在本发明的范围内包括不满足USPTO(35U.S.C.§112,第一段)或EPO(EPC第83条)的书面描述及实施要求的任何产品、过程或产品的制造或使用所述产品的方法，这样本申请人保留权利并由此公开对任何先前描述的产品、制造所述产品的过程或使用所述产品的方法的免责声明。

公开了这些以及其他实施方式，其由下文的详述变得清楚并包括于详述中。

附图简述

下文的详述是以实施例的方式给出的，但不意欲将本发明限制为所描述的特定实施方式，其在结合附随的附图时可得到最好的理解，其中：

图1为表格，显示了为DNA和蛋白质序列指定的SEQ ID NO。

图2A描绘了全长NDV基因组的遗传图谱；图2B描绘了图谱，阐明了两个有疱疹病毒gB或gD***全长NDV基因组上两个代表性的基因间***位点的工程改造NDV载体的遗传图谱；图2C为NDV反向遗传***的流程图的一个实例。

图3描述了含有猫疱疹病毒(FHV)gB基因(pFR14质粒)或gD基因(pFR16质粒)的NDV转录质粒的生成。

图4描述了pFR14和pFR16质粒的图谱。

图5显示了疫苗攻击后猫的平均直肠温度。组A为ON接种NDV-HV，组B为SC接种NDV-HV，组C为阳性对照（接种含有减毒猫疱疹病毒F2株的疫苗，Merial Limited)，组D为阴性对照（未进行免疫）。

图6显示了疫苗攻击后猫的平均体重。组A为ON接种NDV-HV，组B为SC接种NDV-HV，组C为阳性对照（接种含有减毒猫疱疹病毒F2株的疫苗，Merial Limited)，组D为阴性对照（未进行免疫）。

图7显示了疫苗攻击后对猫的临床表征收集的数据。组A为ON接种NDV-HV，组B为SC接种NDV-HV，组C为阳性对照（接种含有减毒猫疱疹病毒F2株的疫苗，Merial Limited)，组D为阴性对照（未进行免疫）。

图8显示了疫苗攻击后对猫的临床表征的统计分析。组A为ON接种NDV-HV，组B为SC接种NDV-HV，组C为阳性对照（接种含有减毒猫疱疹病毒F2株的疫苗，Merial Limited)，组D为阴性对照（未进行免疫）。

图9描述了疫苗攻击后猫的病毒披发（shedding）。组A为ON接种NDV-HV，组B为SC接种NDV-HV，组C为阳性对照（接种含有减毒猫疱疹病毒F2株的疫苗，Merial Limited)，组D为阴性对照（未进行免疫）。

图10为疫苗攻击后猫的病毒披发的统计学分析。组A为ON接种NDV-HV，组B为SC接种NDV-HV，组C为阳性对照（接种含有减毒猫疱疹病毒F2株的疫苗，Merial Limited)，组D为阴性对照。

图11显示了每组的平均FHV Ab（抗-gB）滴度变化。组A为ON接种NDV-HV，组B为SC接种NDV-HV，组C为阳性对照（接种含有减毒猫疱疹病毒F2株的疫苗，Merial Limited)，组D为阴性对照（未进行免疫）。

图12显示了gB蛋白质的序列比对及序列同一性百分比。

图13显示了gD蛋白质的序列比对及序列同一性百分比。

发明详述

要注意到，本公开，尤其是在权利要求和/或段落中，术语如“包含”、“包含的”、“包含有”等等具有美国专利法赋予其的意义；例如，其可意指“包括”、“包括的”、“包括有”，等等。而术语如“基本上由……组成”及“基本上包括”具有美国专利法中赋予其的意义，例如，其允许有未专门提到的元素，但排除在先技术中可见的或影响本发明的基本或新颖特征的元素。

除非另有解释，本文使用的所有技术和科学术语具有本公开针对的本领域普通技术人员通常理解的意义。单数术语“一”、“一个”以及“这个”包括复数指代物，除非上下文中清楚地指代其他意义。类似地，词语“或”意欲包括“和”，除非上下文中清楚地指代其他意义。

本发明中，将

株用作NDV载体(US2010/0255029)。

本发明涉及疫苗或组合物，其可包含有效量的一种或多种工程改造的NDV载体，和可选地药学或兽医学可接受载体、佐剂、辅料或媒介物。

本发明包括工程改造的NDV载体，其表达在动物中引发免疫原性应答的疱疹病毒蛋白质、多肽、抗原、表位或免疫原。所述疱疹病毒蛋白质、多肽、抗原、表位或免疫原可为猫疱疹病毒蛋白质、多肽、抗原、表位或免疫原。

如本文所使用的，术语“疱疹病毒多肽、抗原、表位或免疫原”指代疱疹病毒的任何多肽、抗原、表位或免疫原。所述疱疹病毒可为猫疱疹病毒、犬疱疹病毒、海豹疱疹病毒。所述疱疹病毒多肽可为疱疹病毒糖蛋白，包括但不限于疱疹病毒gB或gD蛋白质。

通过“动物”，意指哺乳动物、人、鸟，等等。所述动物可选自马科（例如马）、犬科（例如，狗、狼、狐狸、土狼、豺）、猫科（如狮、虎、家猫、野猫、其他大型猫科动物，及其他猫科动物，包括猎豹、猞猁）、绵羊（例如，羊）、牛科（如牛、奶牛、水牛）、猪科（猪）、鸟类（如鸡、鸭、鹅、火鸡、鹌鹑、野鸡、鹦鹉、雀、鹰、乌鸦、鸵鸟、鸸鹋和食火鸡）、灵长类（例如，原猴、眼镜猴、猴、长臂猿、猿），和鱼类。术语“动物”还包括发育所有阶段的个体动物，包括胚胎及胎儿期动物。

在一个实施方式中，所述疱疹病毒免疫组合物或疫苗包含一种或多种工程改造的NDV载体和优选地药学或兽医学可接受辅料、佐剂、载体或媒介物。所述工程改造的NDV载体可为包含编码疱疹病毒蛋白质、多肽、抗原、表位或免疫原的多核苷酸的NDV表达载体。所述疱疹病毒蛋白质、多肽、抗原、表位或免疫原可为糖蛋白或其任意片段。疱疹病毒蛋白质、多肽、抗原、表位或免疫原可为gB或gD蛋白质或其任意片段。

如本文所使用的，术语“抗原”或“免疫原”意指在宿主动物中诱导特异免疫应答的物质。抗原可包含整个生物体，可以是灭活的、减毒的或活体的；生物体的亚单元或部分；重组载体，其含有表达表位、多肽、肽、蛋白质或其具有免疫原特性的片段的***片段；核酸块或片段，其能够在呈递至宿主动物时诱导免疫应答；蛋白质、多肽、肽、表位、半抗原或其任意组合。备选地，所述免疫原或抗原可包含毒素或抗毒素。

如本文所使用的，术语“免疫原性蛋白质或肽”还包括这样的肽和多肽，其在这样的意义上是免疫活性的——一旦将其施用于宿主，其能够引发针对该蛋白质的体液和/或细胞型免疫应答。优选地，所述蛋白质片段具有与总蛋白基本相同的免疫活性。因此，根据本发明的蛋白质包含至少一种表位或抗原决定簇或由其组成，或基本上由其组成。术语表位，也称为抗原决定簇，其为由免疫***识别并能诱导体液型（B细胞）和/或细胞型（T细胞）免疫应答的大分子的一部分。

术语“免疫原性蛋白质或肽”进一步包含对序列的删除、添加和置换，只要该多肽的功能是产生本文限定的免疫应答。就这一点而言，尤其优选的置换通常在本质上是保守的，即，是那些发生于一个氨基酸家族之内的置换。例如，氨基酸通常被划分为四大家族：(1)酸性氨基酸——天冬氨酸和谷氨酸；（2）碱性氨基酸——赖氨酸、精氨酸和组氨酸；（3）非极性氨基酸——丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸及（4）无电荷极性氨基酸——甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被分类为芳香氨基酸。合理地，可以预测异亮氨酸或缬氨酸对亮氨酸的分开的取代，或反之；谷氨酸对天冬氨酸的取代，或反之；丝氨酸对苏氨酸的取代，或反之；或结构相关的氨基酸对某个氨基酸的类似的保守取代对生物学活性不会有大的影响。因此，与参考分子具有基本上相同氨基酸序列但具有基本上不会影响所述蛋白质的免疫原性的少量氨基酸置换的蛋白质在参考多肽的定义之内。

术语表位是由免疫***识别并能诱导体液型（B细胞）和/或细胞型（T细胞）免疫应答的大分子的一部分。该术语还与“抗原决定簇”或“抗原决定位点”交换使用。可在一项简单的免疫测定法中识别相同表位的抗体，该测定显示了一种抗体阻断另一种抗体对靶标抗原结合的能力。

对组合物或疫苗的“免疫应答”是宿主中逐渐形成目的组合物或疫苗的细胞和/或抗体介导的免疫应答。通常，“免疫应答”包括但不限于一种或多种以下效应：产生特异性针对目的组合物或疫苗中包括的抗原或多种抗原的抗体、B细胞、辅助T细胞和/或细胞毒性T细胞。优选地，宿主会表现出治疗性或保护性的免疫应答，以增强对新感染的抵抗和/或减少疾病的临床严重度。这样的保护可通过受感染的宿主通常表现的症状的减少或缺失而表现，也可通过恢复时间加快和/或受感染宿主中病毒滴度降低而表现。

如本文所使用的，术语“免疫原性”蛋白质或多肽指代引发上文描述的免疫应答的氨基酸序列。如本文所使用的，“免疫原性”蛋白质或多肽包括蛋白质的全场序列，其类似物或其免疫原性片段。通过“免疫原性片段”，意指包括一个或多个表位并因此引发上文描述的免疫应答的蛋白质的片段。这样的片段可使用任何表位作图技术鉴定，这些在本领域是熟知的。见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods inMolecular Biology,Vol.66(Glenn E.Morris,Ed.,1996)。例如，线性表位可通过例如在固体支持物上同时合成大量对应于蛋白质分子部分的肽并在肽仍然连接于支持物时将所述肽与抗体反应而确定。这些技术在本领域已知，且在例如美国专利号4,708,871;Geysen等人,1984;Geysen等人,1986中有所描述。类似地，构象表位也可通过确定氨基酸的空间构象容易地鉴定出来，例如通过X光晶体成像及2维核磁共振。见，例如，Epitope Mapping Protocols,见上文。

合成抗原也包括在定义内，例如多表位、包围表位（flankingepitope）以及其他重组或合成来源的抗原。用于本发明的目的，免疫原性片段通常包括该分子的至少大约3个氨基酸、大约10-15个氨基酸、大约15-25个氨基酸或更多氨基酸。对于片段长度没有严格的上限，可以包含几乎蛋白质序列的全长，或甚至为包含该蛋白质至少一个表位的融合蛋白质。

因此，表达一个表位的多核苷酸的最小结构为包含编码疱疹蛋白质或多肽的表位或抗原决定簇的核苷酸或基本上由其组成或由其组成。编码总蛋白质或肽的片段的多核苷酸包含编码总蛋白质或多肽序列中最少15个核苷酸、有利地为大约30-45个核苷酸、优选地大约45-75、至少57、87或150个连续的或相邻的核苷酸，或由这些核苷酸组成，或基本上由其组成。表位确定步骤，如生成重叠肽文库(Hemmer等人,1998),Pepscan(Geysen等人,1984;Geysen等人,1985;Van der Zee R.等人,1989;Geysen,1990;Multipin.RTM.PeptideSynthesis Kits de Chiron)and algorithms(De Groot等人,1999),可用于本发明的实践，无需过度实验。

“多核苷酸”是核苷酸的多聚形式，可以为任何长度，包含任意组合的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及类似物。多核苷酸可具有三维结构，可进行任何已知或未知的功能。术语“多核苷酸”包括双链、单链及三链的螺旋分子。除非另有指定或要求，本文描述的本发明的任何多核苷酸的实施方式包括双链形式以及已知或预测为构成DNA、RNA或杂交分子双链形式的两种互补形式的每种形式。

术语“密码子优化”指代为编码蛋白质、多肽、抗原、表位、结构域或片段在选定宿主中表达/翻译的核酸序列进行优化配置的过程。通常，基因表达水平取决于许多因素，如启动子序列和调控元件。最重要的因素之一是将转录基因使用的密码子转换为宿主的典型密码子使用(Lithwich,G.and Margalit,H.,Genome Res.13,2665-2673,2003)。因此，翻译选择下在原核基因组高度表达的基因具有显著的密码子使用偏好。这是因为其使用了由最广泛的tRNA物种识别的一小部分密码子(Ikemura,T.,J.Mol.Biol.151,389-409,1981)。调制此种密码子转换的驱动力被称为翻译选择，翻译选择强度在生长快的细菌中很重要(Rocha,E.P.,Genome Res.14,2279-2286,2004;Sharp,P.M.等人,Nucleic Acids Res.33,1141-1153)。如果基因包含宿主极少使用的密码子，其表达水平不会最大化。这可能为异源蛋白质表达(Gustafsson,C.等人,Trends Biotechnol.22,346-353,2004)及DNA疫苗开发(Ivory,C.and Chadee,K.,Genet.Vaccines Ther.2,17,2004)的限制之一。大量合成基因都已经过重新设计以增加表达水平。合成基因数据库（Synthetic Gene Database，SGDB)(Wu,G.等人,Nucleic Acids Res.35,D76-D79,2007)包含来自200多项对合成基因进行的已发表实验的信息。在设计要***新宿主并以优化的量表达特定蛋白质的核酸序列的过程中，密码子使用优化通常是第一阶段中的一步(Gustafsson,C.,Trends Biotechnol.22,346-353,2004)。密码子使用优化基本上涉及对靶标基因中稀有密码子的改变，以使其更接近地反映出宿主的密码子使用，而不修饰所编码的蛋白质的氨基酸序列(Gustafsson,C.,TrendsBiotechnol.22,346-353,2004)。因此这些通常用于优化过程的信息是待优化的DNA或蛋白质序列及宿主的密码子使用表（参考组）。

有数个公共网络服务器及独立应用程序以使本领域任何技术人员能够进行一定的密码子优化。‘GeneDesign’(Richardson,S.M.等人,Genome Res.16,550-556,2006),‘Synthetic Gene Designer’(Wu,G.等人,Protein Expr.Purif.47,441-445,2006)以及‘Gene Designer’(Villalobos,A.等人,BMC Bioinformatics7,285,2006)为程序包，其提供了包括密码子优化步骤的合成基因设计平台。关于每个服务器或程序中可用的密码子使用优化的方法，第一种开发程序只使用了“一个氨基酸-一个密码子”的方法。更近期的程序和服务器现在包括了其他方法以创造一些密码子使用的多样性。此多样性反映了天然高表达基因的密码子使用的多样性并使优化过程中能引入另外的标准（如避免限制性位点）。本文描述的最多的应用程序和网络服务器提供了三种密码子优化的方法：所有密码子的完全优化、基于参考组中密码子使用相对频率的优化（使用了Monte Carlo方法），以及一种新方法，其设计为使优化得到最大化而查询和优化序列间变动最小。

在一个实施方式中，编码重组蛋白质、抗原、肽、多肽、片段、结构域或表位的氨基酸序列为针对动物中表达而优化的密码子。在另一个实施方式中，密码子优化的序列编码猫疱疹病毒蛋白质、抗原、肽、多肽、片段、结构域或表位用于动物表达。在另一个实施方式中，密码子优化的序列编码疱疹病毒gB或gD蛋白质、抗原、肽、多肽、片段、结构域或表位用于动物表达。

以下为多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段、外显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、siRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任意序列的分离DNA、任意序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸及核苷酸类似物、尿嘧啶、其他糖类及连接基团如氟代核糖和巯基核苷酸，以及核苷酸分支。核苷酸序列可在多聚化后发生进一步修饰，如缀合标记组分。此定义中包括的其他类型的修饰为加帽、用类似物对一种或多种天然发生的核苷酸的置换，以及引入将多核苷酸连接于蛋白质、金属离子、标记组分、其他多核苷酸或固相支持物的方式。所述多核苷酸可通过化学合成或来源于微生物而获得。

术语“基因”广泛用于指代多核苷酸的与生物学功能相关的任意区段。因此，基因包括内含子和外显子（基因组序列中），或只包括编码序列（cDNA）和/或用于其表达的调控序列。例如，基因还指代表达mRNA或功能RNA，或编码特定蛋白质的核酸片段，其包括调控序列。

本发明进一步包含编码疱疹蛋白质、抗原、表位或免疫原的多核苷酸的互补链。互补链可为任何长度的多聚体，并可以任意组合包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及类似物。

术语“蛋白质”、“肽”、“多肽”和“多肽片段”在本文交换使用，指代任意长度的氨基酸残基的多聚体。所述多聚体可为线性或分支的，其可包含修饰的氨基酸或氨基酸类似物，其可由除了氨基酸以外的化学部分隔断。该术语还包括天然修饰或经过干预修饰的氨基酸多聚体；例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他的操作或修饰，如缀合标记或生物活性组分。

“分离的”多核苷酸或多肽是基本不含其在原生环境中结合的材料的那些。通过基本上不含，指的是其中至少50%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%不含这些物质。

杂交反应可在不同严格度条件下进行。增加杂交反应的严格度的条件是熟知的。例如，见“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,second edition(Sambrook等人,1989)。相关条件的实例（以严格度增加的顺序）包括：孵育温度为25°C、37°C、50°C和68°C;缓冲液浓度为10x SSC、6x SSC、1x SSC、0.1x SSC(其中SSC为0.15M NaCl和15mM柠檬酸盐缓冲液)及其等价物（用其他缓冲液***时）；甲酰胺浓度为0%、25%、50%和75%;孵育时间为5分钟-24小时；1、2或更多的洗涤步骤；洗涤孵育时间为1、2或15分钟；洗涤溶液为6x SSC、1x SSC、0.1x SSC或去离子水。

本发明进一步包括编码所述疱疹病毒多肽的功能等价变体或衍生物的多核苷酸及其功能等价片段，其可增强、降低或不显著影响由其编码的多肽的内在特性。这些功能等价变体、衍生物和片段表现出保留所述活性的能力。例如，DNA序列中不改变所编码氨基酸序列的改变，以及导致氨基酸残基发生保守性置换、一个或少量氨基酸删除或添加，以及由氨基酸类似物置换氨基酸残基的改变不会显著影响所编码的多肽的特性。在一个实施方式中，变体与目的疱疹病毒多核苷酸或多肽具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同源性或同一性。

在一方面，本发明提供了疱疹病毒多肽，具体而言为疱疹病毒gB多肽。在另一方面，本发明提供了具有如SEQ ID NO:1、7、8、9、11、13或15所示序列的多肽，以及其变体或片段。

在另一方面，本发明提供了与本发明的疱疹病毒gB多肽，具体而言是与具有如SEQ ID NO:1、7、8、9、11、13或15所示序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的多肽。

在另一方面，本发明提供了如上文识别(SEQ ID NO:1、7、8、9、11、13或15)的疱疹病毒gB多肽的片段和变体，其可容易地由本领域技术人员使用熟知的分子生物学技术制备。

所述变体为与本发明的抗原性多肽，具体而言为与如SEQ ID NO:1、7、8、9、11、13或15所示序列具有至少大约75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的氨基酸序列的同源多肽。

疱疹病毒gB多肽的免疫原性片段包括具有如SEQ ID NO:1、7、8、9、11、13或15所示序列的疱疹病毒gB多肽或其变体中至少8、10、15或20个连续的氨基酸、至少21个氨基酸、至少23个氨基酸、至少25个氨基酸或至少30个氨基酸。在另一个实施方式中，疱疹病毒gB多肽的片段包括可见于全长疱疹病毒gB多肽上的特异抗原表位。

在另一方面，本发明提供了编码疱疹病毒gB多肽的多核苷酸，如编码具有如SEQ ID NO:1、7、8、9、11、13或15所示序列的多肽的多核苷酸。在另一方面，本发明提供了多核苷酸，，其编码与如下序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的多肽：具有如SEQ ID NO:1、7、8、9、11、13或15所示序列的多肽或其保守变体、等位变体、同源物或包含这些多肽中至少八个或至少十个连续氨基酸的免疫原性片段、或这些多肽的组合。编码疱疹病毒gB多肽的多核苷酸可为密码子优化的，以在特定动物种属中表达。

在另一方面，本发明提供了具有如SEQ ID NO:2、3、10、12、14或16所示的核苷酸序列的多核苷酸或其变体。在另一方面，本发明提供了与如SEQ ID NO:2、3、10、12、14或16所示核苷酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的多核苷酸，或其变体。

在一方面，本发明提供了疱疹病毒多肽，具体而言为疱疹病毒gD多肽。在另一方面，本发明提供了具有如SEQ ID NO:4、17、19、21或23所示序列的多肽，及其变体或片段。

在另一方面，本发明提供了多肽，其与本发明的疱疹病毒gD多肽，具体而言是与具有如SEQ ID NO:4、17、19、21或23所示序列的多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。

在另一方面，本发明提供了如上文识别(SEQ ID NO:4、17、19、21或23)的疱疹病毒gD多肽的片段和变体，其可容易地由本领域技术人员使用熟知的分子生物学技术制备。

变体为与本发明的抗原性多肽，具体而言为与如SEQ ID NO:4、17、19、21或23所示序列具有至少大约75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的氨基酸序列的同源多肽。

疱疹病毒gD多肽的免疫原性片段包括具有如SEQ ID NO:4、17、19、21或23所示序列的疱疹病毒gD多肽或其变体中至少8、10、15或20个连续的氨基酸、至少21个氨基酸、至少23个氨基酸、至少25个氨基酸或至少30个氨基酸。在另一个实施方式中，疱疹病毒gD多肽的片段包括可见于全长疱疹病毒gD多肽上的特异抗原表位。

在另一方面，本发明提供了编码疱疹病毒gD多肽的多核苷酸，如编码具有如SEQ ID NO:4、17、19、21或23所示序列的多肽的多核苷酸。在另一方面，本发明提供了多核苷酸，其编码与如下序列有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的多肽：具有如SEQ ID NO:4、17、19、21或23所示序列的多肽或其保守变体、等位变体、同源物或包含这些多肽中至少八个或至少十个连续氨基酸的免疫原性片段、或这些多肽的组合。编码疱疹病毒gD多肽的多核苷酸可为密码子优化的，以在特定动物种属中表达。

在另一方面，本发明提供了具有如SEQ ID NO:5、6、18、20、22或24所示核苷酸序列的多核苷酸或其变体。在另一方面，本发明提供了与如SEQ ID NO:5、6、18、20、22或24所示序列的多核苷酸序列之一具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的多核苷酸，或其变体。

通常，氨基酸序列的比较是通过将结构已知的多肽的氨基酸序列与结构未知的多肽的氨基酸序列进行比对而完成的。然后，将序列中的氨基酸进行比较，并将同源的氨基酸群聚集成组。该方法检测到多肽的保守区域并考虑到氨基酸的***和删除。氨基酸序列之间的同源性可通过使用商业可得的算法进行确定（也见上文同源性的描述）。除了本文提到的其他方法，还提到了由国家生物技术信息中心提供的程序BLAST、缺口BLAST（gapped BLAST）、BLASTN、BLASTP和PSI-BLAST。出于此项目的，这些程序广泛用于本领域并能比对两条氨基酸序列的同源区域。

备选地或此外地，术语“同源性”或“同一性”例如在有关核苷酸或氨基酸序列时可表示对两条序列之间同源性的定量测量。序列同一性的百分比可以以(N_ref-N_dif)*100/N_ref计算，其中N_dif为两条序列在比对时其中非相同残基的总数，而其中N_ref为这些序列之一的残基数。因此，DNA序列AGTCAGTC与序列AATCAATC(N_ref=8;N_dif=2)有75%的序列同一性。

备选地或此外地，“同源性”或“同一性”在有关序列时可指代具有相同核苷酸或氨基酸的位置数除以两条序列中较短序列的核苷酸或氨基酸数，其中对两条序列的比对可根据Wilbur和Lipman的算法确定(Wilbur等人,1983)，例如，使用20个核苷酸的窗口大小、4个核苷酸的词长、以及4的缺口罚值可使用商业可用的程序（例如，VectorNTI Software^TM,Invitrogen Inc.CA,USA)方便地计算机辅助分析，并对包括比对的序列数据进行解释。当描述RNA序列为与DNA序列类似、或具有序列同一度或同源性时，DNA序列中的胸腺嘧啶(T)被视为等价于RNA序列中的尿嘧啶（U）。因此，RNA序列在本发明的范围内，可来源于DNA序列，其中DNA序列的胸腺嘧啶(T)被视为等价于RNA序列中的尿嘧啶（U）。并且，不需要过度实验，本领域技术人员可参考很多用于确定同源性百分比的其他程序或参考文献。

本发明进一步包括包含在载体分子或表达载体中并可操作地连接于启动子元件和可选地连接于增强子的疱疹病毒多核苷酸。

“载体”指代重组DNA或RNA质粒、噬菌体或病毒，其包含要在体外或体内递送至靶标细胞的异源多核苷酸。异源多核苷酸可包含目的序列以用于预防或治疗的目的，可选地，其为表达盒的形式。如本文所使用的，载体不需要能够在最终的靶标细胞或受试者中复制。术语“载体”包括用于克隆的载体，也包括病毒载体。

术语“工程改造的”或“重组的”意指半合成或合成来源的多核苷酸，其不会天然发生，或者是以自然界中不可见的排列方式连接于另一种多核苷酸。

“异源的”意指来源于与其比较的实体的其他部分有遗传差异的实体。例如，多核苷酸可通过遗传工程改造技术并入来源于不同来源的质粒或载体，因此为异源多核苷酸。从原生编码序列移除并可操作地连接于除原生序列的其他编码序列的启动子为异源启动子。

本发明的多核苷酸可包含其他的序列，如相同转录单元中的其他编码序列，控制元件如启动子、核糖体结合位点、5’UTR、3’UTR、转录终止子、多腺苷酸化位点，受相同或不同启动子控制的其他转录单元，允许克隆、表达、异源重组和对宿主细胞进行转化的序列，任意这类构建体可能提供本发明的实施方式。

有利地，用于表达疱疹病毒多肽、抗原、表位或免疫原的元件存在于本发明的载体中。以最小化的方式，其包含起始密码子（ATG）、终止密码子和启动子以及可选地特定载体如质粒及特定病毒载体的多聚腺苷酸化序列，基本上由其组成或由其组成。当所述多核苷酸编码多肽片段例如疱疹病毒肽时，有利的是在载体中ATG置于阅读框的5’，终止密码子置于3’。用于控制表达的其他元件也可存在，如增强子序列、稳定序列如内含子或不翻译5’或3’序列，以及允许蛋白质的分泌的信号序列。

用于体内或体外制造和/或施用表达本发明的基因产物的载体或重组体或质粒的方法可为任何期望的方法，例如，通过或类似于公开于以下文献引用的文档中的方法：美国专利号4,603,112;4,769,330;4,394,448;4,722,848;4,745,051;4,769,331;4,945,050;5,494,807;5,514,375;5,744,140;5,744,141;5,756,103;5,762,938;5,766,599;5,990,091;5,174,993;5,505,941;5,338,683;5,494,807;5,591,639;5,589,466;5,677,178;5,591,439;5,552,143;5,580,859;6,130,066;6,004,777;6,130,066;6,497,883;6,464,984;6,451,770;6,391,314;6,387,376;6,376,473;6,368,603;6,348,196;6,306,400;6,228,846;6,221,362;6,217,883;6,207,166;6,207,165;6,159,477;6,153,199;6,090,393;6,074,649;6,045,803;6,033,670;6,485,729;6,103,526;6,224,882;6,312,682;6,348,450;6,312,683及6,596,279;美国专利申请序列号12/753,597;WO90/01543;W091/11525;WO94/16716;WO96/39491;WO98/33510;EP265785;EP0370573。

本发明还涉及组合物或疫苗，其包含载体，如表达载体。所述组合物或疫苗包含一种或多种载体，例如表达载体，如体内表达载体，基本上由其组成，或由其组成，其中所述载体包含一种或多种疱疹病毒多肽、抗原、表位或免疫原，基本上由其组成，或由其组成，或表达这些成分。所述载体包含或表达多肽，所述多肽包含疱疹病毒抗原、表位或免疫原，基本上由其组成，或由其组成，表达这些成分，在药学或兽医学可接受载体、佐剂、辅料或媒介物中。

根据另一个实施方式，所述组合物或疫苗中的一种或多种载体包含编码疱疹病毒多肽、抗原、表位或免疫原的一种或多种蛋白质或其一种或多种片段的一种或多种多核苷酸，或由所述多核苷酸组成，或基本上由其组成。本发明的组合物或疫苗包含一种或多种载体，或由所述载体组成，或基本上由其组成，其中所述载体包含来自不同疱疹病毒分离株的编码相同蛋白质和/或不同蛋白质的多核苷酸，或由所述多核苷酸组成，或基本由其组成,其有利地还在恰当条件或合适条件下在体内或在合适宿主细胞中表达所述多核苷酸。本发明还针对载体混合物，其含有不同疱疹病毒蛋白质、多肽、抗原、表位或免疫原，或基本上由这些成分组成，或由其组成，并编码表达这些成分，这些疱疹病毒蛋白质、多肽、抗原、表位或免疫原为例如来自不同种属的疱疹病毒多肽、抗原、表位或免疫原，例如但不限于猫科、人类、犬科、马、牛科（如牛）、猪，或禽类。

术语质粒涵盖任何DNA转录单元，其包含根据本发明的多核苷酸及用于其在期望的宿主或靶标的细胞或多种细胞内进行体内表达的元件；并且，就这一点而言，注意到超螺旋质粒及其全部拓扑异构体、开环质粒以及质粒的线性形式都在本发明的范围内。

除了编码重组蛋白质、抗原、表位或免疫原的异源多核苷酸，每种质粒包含或含有或由如下组成：可选地与编码异源肽序列、变体、类似物或片段的多核苷酸融合，与启动子可操作地相连或受启动子控制，或依赖于启动子。通常，有利地是采用在真核细胞中功能性的强启动子。优选的强启动子为人或小鼠来源或具有其他来源如大鼠或豚鼠的立即早期巨细胞病毒启动子(CMV-IE)。CMV-IE启动子可包含实际的启动子片段，其可连接于或不连接于增强子区段。可参考EP-A-260148、EP-A-323597、美国专利号5,168,062、5,385,839,和4,968,615,以及PCT申请号WO87/03905。有利地，CMV-IE启动子为人CMV-IE(Boshart等人,1985)或小鼠CMV-IE。

在更通用的术语中，启动子为病毒或细胞来源的。除了CMV-IE之外可在本发明的实践中采用的强病毒启动子为SV40病毒的早期/晚期启动子或鲁斯氏肉瘤病毒的LTR启动子。可在本发明的实践中采用的强细胞启动子为细胞骨架基因启动子，如肌间线蛋白启动子(Kwissa等人,2000),或肌动蛋白启动子(Miyazaki等人,1989)。

这些启动子的功能性亚片段，即这些启动子中维持充分的启动活性的部分包括在本发明内，例如，根据PCT申请号WO98/00166或美国专利号6,156,567的截短CMV-IE启动子。因此，本发明的实践中的启动子包括全长启动子中维持充分的启动活性的衍生物或亚片段，其因此起启动子功能，优选地与所述衍生物或亚片段来源的实际或全长启动子基本类似地具有启动活性，例如近似于美国专利号6,156,567中的截短CMV-IE启动子活性对全长CMV-IE启动子活性的类似程度。因此，本发明实践中的CMV-IE启动子可包含全长启动子的启动子部分和/或全长启动子的增强子部分，以及其衍生物和亚片段，或由这些部分组成，或基本上由其组成。

优选地，质粒包含其他表达控制元件或基本上由这些元件组成。优选地，并入一种或多种稳定序列，例如一种或多种内含子序列、优选地为hCMV-IE的第一内含子(PCT申请号WO89/01036)、兔β-球蛋白基因II号内含子(van Ooyen等人,1979)是有利的。

对于用于质粒和除痘病毒之外的病毒载体的多腺苷酸化信号（polyA），更多地可利用牛生长激素（bGH）基因的poly（A）信号（见美国专利号5,122,458）或兔β球蛋白基因的poly(A)或SV40病毒的poly(A)信号。

根据本发明的另一个实施方式，表达载体为用于在恰当细胞***中体外表达蛋白质的表达载体。可在分泌后或不在分泌后（如没有分泌，则通常发生或进行细胞裂解）从培养物或培养物上清中收获表达的蛋白质，可选地已经通过浓缩方法如超滤进行浓缩和/或通过纯化方式如亲和、离子交换或凝胶过滤型色谱方法进行纯化。

“宿主细胞”代表通过施用外源多核苷酸如重组质粒或载体已经进行遗传改变或能够进行遗传改变的原核或真核细胞。在提到遗传改变的细胞时，该术语指代原始的经改变的细胞，也指代其子代细胞。宿主细胞包括但不限于，幼仓鼠肾(BHK)细胞、结肠癌(Caco-2)细胞、COS7细胞、MCF-7细胞、MCF-10A细胞、小猎犬肾上皮细胞系（Madin-Darby canine kidney，MDCK)、貂肺(Mv1Lu)细胞、MRC-5细胞、U937细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、猴Vero细胞（来源于非洲绿猴肾的细胞系）、鹌鹑（鹌鹑肌细胞系QM7）、鸡细胞系DF1及VERO细胞。包含期望序列的多核苷酸可***合适的克隆或表达载体中，所述载体转而可被引入合适的宿主细胞进行复制和扩增。可通过任何本领域已知的方式将多核苷酸引入宿主细胞。可通过大量恰当方式中的任意方式将含有目的多肽的载体引入宿主细胞，包括直接摄取、内吞作用、转染、f-交配、电穿孔、采用氯化钙、氯化铯、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其他物质进行的转染；基因枪法（microprojectilebombardment）;脂质体转染;以及感染（其中载体为感染性的，如，为逆转录病毒载体）。对引入的载体或多核苷酸的选择常常会取决于宿主细胞的特征。

在本发明的一个实施方式中，所述载体为如US2010/0255029（通过引用以其全文并入本文）中描述的新城疫病毒（NDV）。记为禽副黏液病毒1（APMV1，副黏液病毒科，副黏液病毒亚科、禽腮腺病毒属）的新城疫病毒是一种禽病原体，其天然发生株显示广泛产生疾病严重度。NDV作为用于兽医用途的疫苗载体尤其有利，因为该载体自身就起需要的肉禽疫苗的作用。NDV株病原型有无症状肠型(例如Ulster2C,Queensland V4)、弱毒型(例如Hitchner B1、F(例如Asplin),La Sota)、中毒型(例如strain H,Mukteswar,Roakin,Beaudette C)或强毒型(例如Texas GB,NY parrot70181,Italien,Milano,Herts33/56)。基于NDV载体的疱疹病毒疫苗的优点包括但不限于，（1）诱导广泛的免疫，包括体液、细胞和粘膜应答，（2）不表达NP和M蛋白质，因此与DIVA（区别受感染动物与接受免疫的动物）策略相兼容,(3)诱导免疫快速发生，（4）其为二价的，以及（5）其生产比灭活疫苗在事故性排放上对环境造成的风险较低。

NDV的特定特征提示表达外源蛋白质的重组NDV（rNDV）或工程改造NDV会成为极为良好的疫苗候选物。NDV在很多细胞系和卵中都生长达到极高的低度，其在体内引发强的体液及细胞免疫应答。天然地，NDV经由呼吸道及食道的粘膜表面感染，因此对于递送呼吸疾病病原体如FHV的保护性抗原尤其有用。此外，商业可得的活体NDV疫苗在美国和多数其他国家都有广泛使用。基于活体NDV重组体的疫苗还可具有超出其他活体重组疫苗载体的优势。首先，外源蛋白质只会与少量NDV蛋白质一同表达。相反，痘病毒和疱疹病毒载体从其大型基因组中表达大量的其他蛋白质。为在应用疫苗时生成特异的免疫应答，只表达有限量的蛋白质时有利的。第二，NDV在感染细胞的细胞质中进行复制，没有DNA阶段，这排除了病毒基因组整合入宿主细胞DNA的问题。所述病毒没有经过可检测的遗传重组。

在一个实施方式中，NDV载体为NDV

如US2010/0255029中所描述的。所述NDV载体还可为美国专利号5,118,502的载体，具体而言是以ATCC号VR2239保藏的病毒株。

在一方面，本发明涉及药用组合物或疫苗，用于在以所述疫苗或组合物接种的宿主动物中诱导免疫应答，所述疫苗或组合物包括一种或多种修饰的AVINEW重组病毒载体。在本发明的另一方面，工程改造或重组的AVINEW病毒载体在病毒基因组的非必需区域内包括疱疹病毒DNA序列，其编码来源于病原体的疱疹病毒抗原性蛋白质，其中当将组合物或疫苗施用于宿主时，其能诱导特异针对所述病原体编码的蛋白质的免疫应答。所述组合物可选地包含药学或兽医学可接受载体或媒介物或佐剂或辅料。

术语“非必需区域”指代病毒基因组区域，其对于病毒在组织培养物中的复制和繁殖不是必需的，且其的删除或失活可减少多种动物***中的毒力。可从AVINEW基因组中删除任何非必需区域或部分，或可将外来序列***其中，由所述删除或***获得的工程改造AVINEW的活力和稳定性可用于确定其的删除区域或部分是否确实非必需。在另一个实施方式中，AVINEW基因组的非必需区域是P基因和M基因之间的区域，或为AVINEW基因组的M基因和F基因之间的区域。在一个实施方式中，非必需区域位于AVINEW基因组上的NP基因的上游。在另一个实施方式中，非必需区域位于AVINEW基因组上的L基因的下游。在另一个实施方式中，非必需区域为不编码区域或基因间区域。在这一点上，不编码区域或基因间区域可为AVINEW基因组上NP和P基因之间、P和M基因之间、M和F基因之间或F和HN基因之间的区域。在另一个实施方式中，非必需区域可以为SEQ ID NO:27的1nt-121nt、1591nt-1886nt、3074nt-3289nt、4384nt-4543nt、6205nt-6411nt、8262nt-8380nt或14995nt-15186nt的区域。

本发明的一个方面涉及表达疱疹病毒抗原的工程改造或重组的NDV载体。所述抗原可为疱疹病毒糖蛋白，如前文所述的蛋白质gB或gD。所述工程改造NDV载体可包含编码一种或多种疱疹病毒抗原的一种或多种多核苷酸。在另一方面，工程改造的NDV-疱疹病毒载体包含一种或多种编码疱疹病毒gB抗原或其变体、疱疹病毒gD抗原或其变体的多核苷酸，或其组合。

在一个实施方式中，本发明提供了施用治疗有效量的制剂而在靶标细胞中递送和表达蛋白质、抗原、表位或免疫原。对预防或治疗有效量的确定对本领域普通技术人员是常规实验。在另一个实施方式中，制剂包含表达载体，其包含表达疱疹病毒抗原、表位或免疫原的多核苷酸以及药学或兽医学可接受载体、媒介物、佐剂或辅料。在另一个实施方式中，所述药学或兽医学可接受载体、媒介物、佐剂或辅料促进所述载体或蛋白质的转染及/或改善其保存。

药学或兽医学可接受载体、媒介物、佐剂或辅料对本领域技术人员是已知。例如，所述药学或兽医学可接受载体、媒介物、佐剂或辅料可为无菌水、0.9%NaCl(例如生理盐水)溶液或磷酸缓冲液。其他可用于本发明的方法的药学或兽医学可接受载体、媒介物、佐剂或辅料包括但不限于,多聚-(L-谷氨酸盐)或聚乙烯吡咯烷酮。所述药学或兽医学可接受载体、媒介物、佐剂或辅料可为促进载体（或由本发明载体体外表达的蛋白质）施用的任意化合物或化合物组合；有利地，所述载体、媒介物、佐剂或辅料可促进转染所述载体（或蛋白质）的转染及/或改善其保存。剂量和剂量体积在本文是以一般描述的形式讨论的，也可由本领域技术人员根据本公开的阅读结合本领域的知识进行确定，无需过度实验。

不仅仅适合于载体（的含有季铵盐的阳离子脂质具有以下化学式:

其中R1为饱和或不饱和的直链脂肪根基团，具有12-18个碳原子，R2为另一种脂肪根基团，含有2或3个碳原子，而X为氨基或羟基基团，例如DMRIE。在另一个实施方式中，所述阳离子脂质可与中性脂质例如DOPE相结合。

在这些阳离子脂质中，偏向于使用DMRIE(N-(2-羟乙基)-N,N-二乙基-2,3双（十四烷氧基)-1-丙基铵;WO96/34109),有利地，其与中性脂质相结合，有利地所结合的中性脂质为DOPE(dioleoyl-phosphatidyl-ethanol amine;Behr,1994)，形成了DMRIE-DOPE。

具有佐剂的质粒混合物是在施用制备物时或在施用制备物之前短期内临时即刻形成和/或同时形成的；例如，在施用前短期内或先于施用形成质粒-佐剂混合物，这样有利地在先于施用前给混合物足够的时间形成复合物，例如在施用前大约10-大约60分钟形成混合物，如在施用前大约30分钟形成混合物。

当存在DOPE时，DMRIE:DOPE的摩尔比可为大约95:大约5-大约5:大约95之间，或为大约1:大约1,例如1:1。

DMRIE或DMRIE-DOPE佐剂:质粒的重量比可在大约50:大约1-大约1:大约10之间，如在大约10:大约1-大约1:大约5之间，有利地在大约1:大约1-大约1:大约2之间,例如1:1和1:2。

在另一个实施方式中，药学或兽医学可接受载体、佐剂、辅料或媒介物可为油包水乳液。合适的油包水乳液的实例包括油基的油包水疫苗乳液，在4°C下是稳定的流体，其含有：6-50v/v%的含抗原的水相，且优选地含有12-25v/v%、50-94v/v%的油相，其全部或部分含有不可代谢的油类（例如矿物油如石蜡油）及/或可代谢油类(例如蔬菜油或脂肪酸、多元醇或醇酯)、含有0.2-20p/v%，优选地3-8p/v%的表面活性剂，后者全部或部分地与聚丙三醇酯（优选地为聚甘油蓖麻醇酯或聚氧乙烯蓖麻油）或与氢化聚氧乙烯蓖麻油混合。可用于水包油乳液中的表面活性剂的实例包括乙氧基化山梨糖醇酯(例如聚氧化乙烯(20)去水山梨糖醇单油酸酯可获自AppliChem,Inc.,Cheshire,CT)以及山梨糖醇酯(例如去水山梨糖醇单油酸酯

可获自Sigma Aldrich,St.Louis,MO)。此外，关于油包水乳液，见美国专利号6,919,084。在一些实施方式中，含有抗原的水相包含生理盐水溶液，其包含一种或多种缓冲试剂。合适的缓冲溶液的一个实例为磷酸盐缓冲液。在一个实施方式中，油包水乳液可为水/油/水(W/O/W)三重乳液(见，例如美国专利号6,358,500)。其他合适的乳液的实例在美国专利号7,371,395中有所描述。

根据本发明的免疫组合物和疫苗可包含一种或多种佐剂，或基本上由其组成。适合用于本发明的实践的佐剂为（1）丙烯酸或甲基丙烯酸多聚体、顺丁烯二酸酐及链烯基衍生物多聚体，（2）免疫刺激序列（ISS）如具有一个或多个非甲基化CpG单元的寡脱氧核糖核苷酸序列(Klinman等人,1996;WO98/16247),(3)水包油乳液，如SPT乳液，描述于“Vaccine Design,The Subunit and Adjuvant Approach”，p147，M.Powell,M.Newman,Plenum Press1995出版，以及乳液MF59，描述于相同作品的p183，(4)含有季铵盐的阳离子脂质，例如DDA，(5)细胞因子,(6)氢氧化铝或磷酸铝，(7)皂素或(8)本文提到或作为参考并入本文的任意文档中讨论的其他佐剂，或(9)其的任意组合或混合物。

对病毒载体尤其适当的水包油乳液（3）可基于：轻质液体石蜡油（欧洲药典型）、类异戊二烯油如角鲨烷、角鲨烯、由链烯烃寡聚化所得的油类如异丁烯或癸烯、具有直链烷基基团的酸酯或醇酯，如蔬菜油、油酸乙酯、丙二醇、二（辛酸酯/癸酸酯）、甘油三（辛酸酯/癸酸酯），丙二醇二油酸酯，或支链的，脂肪醇或酸的酯，尤其是异硬脂酸酯。

所述油类与乳化剂组合使用以形成乳液。乳化剂可为非离子表面活性剂如：一方面山梨糖醇、二缩甘露醇（例如油酸无水甘露醇酯）、甘油、聚丙二醇或丙烯乙二醇，另一方面为油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟基硬脂酸的酯，优选地，所述酯类为任选地乙氧基化的，或为聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物块，如普朗尼克（Pluronic）例如L121。

在(1)型佐剂聚合物中，偏向使用交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是通过糖类或多元醇的聚稀酯交联的。这些化合物以卡波姆（Carbomer）的名称为人所知(Pharmeuropa,vol.8,no.2,June1996)。本领域技术人员还可参考美国专利号2,909,462，其提供了这样的丙烯酸聚合物，其通过具有至少三个羟基基团，优选地不超过八个所述基团的多羟基化合物交联，该化合物的至少三个羟基基团上的氢原子由具有至少两个碳原子的不饱和脂肪根基团取代。优选的基团为含有2-4个碳原子的那些，如乙烯基，烯丙基和其它烯属不饱和基团。所述不饱和基团还可含有其他置换物如甲基。以卡波普（Carbopol）的名称出售的产品(BF Goodrich,Ohio,USA)是非常合适的。其通过丙烯基蔗糖或通过丙烯基季戊四醇进行交联。其中，参考了卡波普974P、934P和971P。

对于顺丁烯二酸酐-链烯基衍生物共聚物，偏向于使用EMA(Monsanto),其为直链或交联的乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物，而且，其可为例如通过二乙烯醚进行交联的。仍然参考J.Fields等人,1960。

丙烯酸或甲基丙烯酸多聚体和EMA在结构上优选地是由具有以下化学式的碱性单元形成的：

其中：

-R1和R2可以为相同或不同的，其代表H或CH3

-x=0或1,优选地x=1

-y=1或2,其中x+y=2.

对于EMA,x=0、y=2，对于卡波姆x=y=1。

这些多聚体可溶于水或生理盐溶液(20g/l NaCl)，其pH可例如通过苏打（NaOH）调整至7.3-7.4，这样可以提供其中可并入一种或多种表达载体的佐剂溶液。最终的免疫或疫苗组合物中的多聚体浓度范围为0.01-1.5%w/v、0.05-1%w/v或0.1-0.4%w/v之间。

一种或多种细胞因子（5）可为蛋白质形式存在于免疫或疫苗组合物中，或可在宿主中与一种或多种免疫原或其一种或多种表位共表达。偏向于将一种或多种细胞因子进行共表达，或者通过与表达所述一种或多种免疫原或其一种或多种表位的载体相同的载体或通过与其分离的载体进行共表达。

本发明包括对这类组合组合物的制备；例如，通过混合活性物质，有利地是与佐剂、载体、细胞因子和/或稀释剂一同混合而制备。

可用于本发明的细胞因子包括但不限于，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素α(IFNα)、干扰素β(IFNβ)、干扰素γ(IFNγ)、白介素-1α(IL-1α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-2(IL-2)、白介素-3(IL-3)、白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)、白介素-6(IL-6)、白介素-7(IL-7)、白介素-8(IL-8)、白介素-9(IL-9)、白介素-10(IL-10)、白介素-11(IL-11)、白介素-12(IL-12)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、肿瘤坏死因子β(TNFβ)以及转化生长因子β(TGFβ)。可以理解，细胞因子能与本发明的免疫或疫苗组合物共施用和/或顺序施用。因此，本发明的疫苗还可含有例如在体内表达适合细胞因子的外源核酸，例如与要进行免疫或要在其中引发免疫应答的宿主匹配的细胞因子（例如，施用猫生长因子用于制备物施用于猫）。

在另一个实施方式中，可使用如Stauffer等人描述的化学或物理步骤制备本发明的组合物(Recent Patents on Anti-Infective DrugDiscovery,1,291-296,2006)。一些失活技术总结于下表：

化学方法	物理方法	联合方法
			抗坏血酸		抗坏血酸+UV
b-丙内酯	加热	β-丙内酯+UV
			b-氨基苯甲酮	加压	***+加热
焦炭酸二乙酯	UV	***+UV
			乙烯亚胺	非离子去垢剂	加热+低压
***/甲醛		加压+加热或降温
			苯酚		补骨脂素+UV

根据本发明的免疫组合物和/或疫苗包含引发对如本文描述的一种或多种表达载体和/或多肽产生保护性或治疗性应答的有效量，或由所述的有效量组成;并且，有效量可根据本公开，包括并入本文的文档以及本领域的知识而确定，无需过度实验。

本发明的组合物或疫苗可通过卵内、经由饮用水、口鼻、喷雾、气雾剂、鼻内滴注、滴眼、喙倾、翅蹼针刺、透皮、皮下或肌内注射施用于动物。有利地，所述疫苗是通过口鼻、皮下、滴眼、喷雾或饮用水的方式施用的。

本发明至少包括以有效量的根据本发明制造的治疗组合物对动物进行至少一次施用。根据本发明的治疗组合物可通过无针头装置进行施用（例如使用Pigjet,Dermojet,Biojector,Vetjet或Vitajet装置进行施用(Bioject,Oregon,USA))。

在本发明的一个实施方式中，可采用初免-增强免疫的方案，其包括至少一次初免施用和至少一次增强免疫的施用，这两次施用使用了至少一种共同的蛋白质、多肽、抗原、表位或免疫原。用于初免施用的免疫组合物或疫苗与用作增强免疫物的那些在本质上是不同的。然而，可以注意到相同的组合物可用作初免施用以及增强免疫施用。这种施用操作流程被称为“初免-增强免疫”。

在本发明的初免-增强免疫操作流程中的另一方面，施用了包含工程改造的Avinew NDV疱疹病毒疫苗的组合物，接着施用包含重组病毒载体的疫苗或组合，其中所述病毒载体含有并在体内表达疱疹病毒，或者接着施用包含疱疹病毒抗原的失活疫苗或组合物，或包含疱疹病毒亚基（蛋白质）的失活疫苗或组合物，或为含有或表达疱疹病毒抗原的DNA质粒疫苗或组合物。类似地，初免-增强免疫操作流程可包含施用其包含含有并在体内表达疱疹病毒抗原的重组病毒载体的疫苗或组合物，或包含疱疹病毒抗原的灭活病毒疫苗或组合物，或包含疱疹病毒亚基（蛋白质）的疫苗或组合物，或含有或表达疱疹病毒抗原的DNA质粒疫苗或组合物，接着施用包含工程改造的Avinew NDV疱疹病毒疫苗或组合物的组合物。可以注意到初次和第二次施用均可包含包含有工程改造的Avinew NDV疱疹病毒疫苗或组合物的组合物。进一步可以注意到初次和第二次施用可包含一种或多种包含有本发明的工程改造NDV-HV载体的组合物。

初免-增强免疫操作流程包含至少一次初免施用和至少一次增强免疫施用，二者使用至少一种供体抗原。用于初免施用的疫苗或组合物可与用作后期增强免疫疫苗或组合物的那些在本质上不同。初免施用可包含一次或多次施用。类似地，增强免疫施用可包含一次或多次施用。

优选地，相隔大约1-大约6周，或大约2-大约4周进行所述多次施用。还包括每2-6周进行的重复增强免疫或每年进行的增强免疫。优选地，动物在第一次施用时年龄至少为一天。

所述免疫组合物和/或疫苗每份剂量含有大约10⁴-大约10¹¹个、有利地含有大约10⁵-大约10¹⁰个、更有利地含有大约10⁶-大约10⁹个表达疱疹病毒抗原、表位或免疫原的重组腺病毒病毒颗粒。在免疫组合物和/或疫苗基于痘病毒的情况下，剂量可为大约10²pfu-大约10⁹pfu。所述免疫组合物和/或疫苗每份剂量含有10²-大约10⁷、有利地含有大约10³-大约10⁵pfu的重组表达疱疹病毒抗原、表位或免疫原的痘病毒或腺病毒病毒颗粒。

病毒载体可为减毒禽痘表达载体。在一个实施方式中，禽痘病毒表达载体可为鸡痘病毒载体，例如

在另一个实施方式中，禽痘病毒表达载体可为金丝雀痘病毒，例如所述疱疹病毒抗原、表位或免疫原可以为疱疹病毒糖蛋白如gB或gD。其他可用于本发明的方法的病毒包括但不限于牛痘病毒，如减毒牛痘病毒，例如NYVAC、腺病毒和疱疹病毒。

可在最后一次免疫后大约2-4周，通过以疱疹病毒的毒株攻击动物而测试这些疫苗的效力。同源和异源株都可用于进行攻击以测试疫苗效力。可通过喷雾、鼻内、滴眼、眼鼻、IM、气管内和/或口服途径对动物进行攻击。攻击病毒可为每体积大约10³-大约10⁸个，取决于施用途径。例如，如果通过喷雾进行施用，会对病毒悬液气雾化以生产大约1-100μm的液滴，如果是鼻内、气管内或口服施用，攻击病毒体积为大约0.05-大约5ml。用于靶标种属的组合物剂量体积，例如猫科组合物的剂量体积为卵内施用大约50μl、滴眼施用大约20-50μl、喷雾施用为大约0.25ml-大约1ml。在攻击14天后，可每日观察动物的临床征兆和死亡率。此外，可对这些动物组实施安乐死并评估病理学状态。可从所有攻击后的动物收集口咽部、气管和泄殖腔拭子进行病毒检测。组织中病毒抗原的存在情况可通过免疫组化、病毒分离或滴定、或核酸检测如逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)而评估。可在攻击后收集血液样品并分析抗疱疹病毒gB或gD的病毒特异性抗体的存在情况。

本领域技术人员应当理解，本文的公开是以实施例的方式提供的，本发明并不限于此。根据本文公开及本领域只是，技术人员可确定施用次数、施用途径、用于每次免疫操作流程的剂量，无需过度实验。

本发明的另一个实施方式是试剂盒，用于进行在动物中诱导针对疱疹病毒的免疫或保护性应答的方法，该试剂盒包含重组NDV免疫组合物或疫苗或灭活疱疹病毒免疫组合物或疫苗以及说明书，以用于以在动物中引发免疫应答的有效量进行递送。

通过以下非限制性实施例对本发明进行进一步说明。

实施例

使用本领域已知的标准分子生物学技术例如由J.Sambrook等人描述的方法(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,1989)进行DNA***片段、质粒及重组病毒载体的构建。

实施例1构建含有猫疱疹病毒（FHV）gB基因（pFR14质粒）以及gD基因（pFR16质粒）的NDV转录质粒

对***到NDV基因组的FHV gB基因进行了哺乳动物表达的密码子优化。将合成的FHV gB基因(SEQ ID NO:2)克隆至基于pBR322的载体，获得含有如图3所示的***盒的质粒pFR13。用PacI和FseI消化质粒pFR13，生成大小为3105bp的PacI-FseI片段。用PacI和FseI消化质粒pIV029(US2010/0255029)，生成大小为19140bp的FseI-PacI片段。将这两个片段连接生成质粒pFR14（图4）。

对***到NDV基因组的FHV gD基因进行了哺乳动物表达的密码子优化。将合成的FHV gD基因(SEQ ID NO:5)克隆至基于pBR322的载体，获得含有如图3所示的***盒的质粒pFR15。用PacI和FseI消化质粒pFR15，生成大小为1373bp的PacI-FseI片段。用PacI和FseI消化质粒pIV029，生成大小为19140bp的FseI-PacI片段。将这两个片段连接生成质粒pFR16（图4)。

实施例2表达FHV gB基因的NDV载体(vAVW07)的生成及鉴定

NDV为负链RNA病毒，生成遗传修饰的NDV病毒需要逆向遗传***。全长基因组病毒RNA的转录以及同时发生的NP、P和L蛋白质的表达使得RNP可以进行组装，而正链RNA可转录进入负链RNA基因组。这起始了NDV病毒的正常复制循环，并使得感染性颗粒得以产生（见图2）。

为生成表达FHV gB基因的工程改造的NDV载体，使用了以下反应剂和条件。将质粒pFR14（见实施例1）用作转录质粒。将质粒pIV32、pIV33和pIV34(US2010/0255029)分别用作NP、P和L蛋白质的表达质粒。将pNS151(US2010/0255029)用作T7RNA聚合酶质粒。将这五种质粒一同共转染进入中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，如图2C的示意图所示。72小时后，将CHO上清接种于10天的含胚卵中以扩增病毒。3天后，收获尿囊液并使用鸡血红细胞检查红血球凝聚活性(HA)。成功获得了NDV-FHV gB的感染性颗粒。使用QuiaAMP病毒RNA提取试剂盒(Qiagen)提取RNA。使用一步RT-PCR试剂盒(Qiagen)进行RT-PCR。测序结果显示gB基因与克隆入转录质粒的gB基因原始序列为100%同一。将该重组NDV-HV gB病毒载体记为vAVW07。

实施例3表达FHV gD基因的NDV载体(vAVW08)的生成及鉴定

为生成表达FHV gD基因的工程改造的NDV载体，使用了以下反应剂和条件。将质粒pFR16（见实施例1）用作转录质粒。将质粒pIV32、pIV33和pIV34(US2010/0255029)分别用作NP、P和L蛋白质的表达质粒。将pNS151(US2010/0255029)用作T7RNA聚合酶质粒。将这五种质粒一同共转染进入中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，如图2C的示意图所示。CHO细胞转染72小时后，将CHO上清接种于10天的含胚卵中以扩增病毒。3天后，收获尿囊液并使用鸡血红细胞检查红血球凝聚活性(HA)。成功获得了NDV-FHV gD的感染性颗粒。

使用QuiaAMP病毒RNA提取试剂盒(Qiagen)提取RNA。使用一步RT-PCR试剂盒(Qiagen)进行RT-PCR。用于RT-PCR反应的两条引物为：

FR09:CGCAGCTGCAATCAATTCAG    (SEQ ID NO:25)

FR10:TGGGTGGACAGGGATCTGCT    (SEQ ID NO:26)

测序结果显示gD基因与克隆入转录质粒的gD基因原始序列为100%同一。将该重组NDV-FHV gD病毒载体记为vAVW08。

实施例4对NDV-HV疫苗在猫中的临床评估

研究中包括了32只SPF(无特定病原体)的9-11周龄的猫。根据不同的窝、性别和年龄，使用4元素的随机表格将这些猫随机指派为4组，每组8只（组A-D）。根据当地畜牧业和动物福利步骤对这些猫进行看护和安置。

实验设计显示于表1。

表1对猫进行免疫的实验设计

*NDV-HV=NDV-HV gB和NDV-HV gD,均为10^7.8EID₅₀/mL

**ON=口鼻    SC=皮下

***阳性对照=含有减毒猫疱疹病毒F2株的疫苗，Merial Limited。

在D0和D28天，分别将NDV-HV gB和NDV-HV gD疫苗稀释至1/25和1/35，以使两种疫苗都达到10^7.8EID₅₀/mL的滴度。然后，来自组A的每只猫都在全身麻醉下通过口鼻途径（0.25mL通过鼻腔，0.5ml通过口腔）接收1mL的NDV-HV疫苗(NDV-HV gB和NDV-HVgD)。来自组B的猫通过皮下途径在两肩之间接收1ml的NDV-HV疫苗。来自组C的猫通过皮下途径在两肩之间接收一份剂量的对照疫苗。来自组D的猫未受到免疫。

在D45天，在全身麻醉下对每只猫施用1ml的稀释到1/50的攻击病毒株10^5.56CCID50/mL(0.25mL通过鼻腔，0.25ml通过眼睛）。

图5中显示了直肠温度测试。组A是通过ON接种NDV-HV，组B是通过SC接种NDV-HV，组C是阳性对照(含有减毒猫疱疹病毒F2株的疫苗，Merial Limited),组D为对照（未免疫）。结果显示对照组中7/8的猫体温过高。在免疫组中，阳性对照和通过ON接种NDV-HV的组无体温过高，而通过SC接种NDV-HV的猫中有4/8具有体温过高。

体重结果显示于图6和表2。各组之间猫在免疫期的体重增加情况和生长情况是类似的。

攻击后（pc），组D中所有猫都在pc第4天-pc第8天体重减轻。一些猫(8只当中有3只)体重持续减轻直至pc第10天。然后，所有猫都发生体重增加。在攻击后检测期，在一或两个时期记录到8只猫中6只有>5%的体重减轻。在组C中，在pc第4天和pc第6或第8天之间观察到8只猫中6只有体重减轻。所述的体重减轻在4只猫中>5%。在组B中在pc第4天和pc第6或第8天之间所有的猫都有体重减轻。只在2只猫中观察到一次>5%的体重减轻。

表2攻击后监测期观察的体重减轻情况

图7显示了攻击后每组的平均临床得分，表3总结了观察到的临床症状。组A是通过ON接种NDV-HV，组B是通过SC接种NDV-HV，组C是阳性对照(含有减毒猫疱疹病毒F2株的疫苗，Merial Limited),组D为对照（未免疫）。在组D中，所有的猫都在攻击后表现出临床表征。在组A中，有一只猫在攻击后未显示任何临床表征，而有3只猫只有一天表现有轻微的鼻脓或有两天表现出有轻微的眼分泌物。来自组A的其他猫、来自组B的猫以及来自组C的猫比组D的猫表现出的临床表征更轻、更短暂。

表3攻击后每组观察的临床表征总结

图8显示了每组总体临床得分分布。平均总体临床得分为：组A为7.5、组B为18.6、组C为17.4、组D为33.8。组D和三个免疫组之间有显著差异。三个免疫组之间的临床总体得分有显著差异(ANOVA,p=0.018)。来自组A的猫比来自组B和C的猫显示了显著减少的临床总体得分。组B和组C之间的总体临床得分无显著差异。

图9显示了攻击后每组的平均病毒披发，表4总结了每组的平均AUC。组A是通过ON施用NDV-HV，组B是通过SC施用NDV-HV，组C是阳性对照(含有减毒猫疱疹病毒F2株的疫苗，Merial Limited),组D为对照（未免疫）。

表4每组的平均曲线下面积(AUC)

组	平均AUC
		A	47.2
B	48.3
		C	49.9
D	59.6

攻击前猫未披发猫疱疹病毒。攻击后，在所有猫中都分离到FHV。在组D中，病毒分泌迅速增加，在pc第4天达到峰值，然后规律地降低直到pc第14天。在pc第14天,8只猫中有5只仍然披发低量病毒。在免疫组中，组B和组C在pc第4天病毒分泌达到峰值，组A中峰值出现在pc第6天，然后开始降低，比组D的降低更快。在pc第14天，猫停止披发病毒。

图10显示了每组的总体病毒披发得分分布。免疫组中病毒披发相比于组D（未免疫）显著减少。尽管来自组A的猫比其他免疫组的猫披发病毒更晚，但是病毒分泌三个免疫组之间没有统计学显著差异(ANOVA,p=0.464)。

血清学(抗-gB FHV Ab)数据显示于图11。组A是通过ON接种NDV-HV，组B是通过SC接种NDV-HV，组C是阳性对照(含有减毒猫疱疹病毒F2株的疫苗，Merial Limited),组D为对照（未免疫）。所有的猫在D0天对gB-FHV的血清反应都是阴性。组D所有猫保持血清反应阴性直到攻击那天。组D所有猫在D28天后为gB FHV Ab阳性。通过SC或ON注射一次NDV-HV足以在所有猫中诱导血清阳转。所进行的攻击在所有免疫动物中都诱导了增强免疫的效应，并在所有对照猫中诱导了FHV Ab的产生。血清学数据与临床结果有良好的相关性。

＊＊＊

如此详述了本发明的优选实施方式，应当理解，由上文段落限定的本发明不限于上文描述中提出的具体细节，因为其可能有很多明显的变化实施方式，其不偏离本发明的精神或范围。

本申请引用的文档中引用或参考的所有文档，以及本文引用或参考的所有文档（“本文引用的文档”），以及本文引用的文档中引用或参考的所有文档，以及制造商说明书、描述、产品详述以及本文提到的或并入本文作为参考的任何文档中的任何产品的产品单，其都并入本文作为参考，并可在本发明的实践中采用。

Claims (22)

1.组合物或疫苗，其包含（i）一种或多种重组新城疫病毒(NDV)-疱疹病毒载体以及(ii)药学或兽医学可接受载体。

2.权利要求1的组合物或疫苗，其中重组NDV-疱疹病毒载体包含一种或多种异源多核苷酸，其编码一种或多种疱疹病毒抗原、多肽或其变体。

3.权利要求2的组合物或疫苗，其中疱疹病毒抗原或多肽为疱疹病毒糖蛋白B（gB）或糖蛋白D（gD）或其变体。

4.权利要求2或3的组合物或疫苗，其中重组NDV-疱疹病毒载体包含多核苷酸，其编码与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4有至少90%的序列同一性的多肽。

5.权利要求2或3的组合物或疫苗，其中重组NDV-疱疹病毒载体包含与SEQ ID NO:2、3、5或6有至少90%的序列同一性的多核苷酸。

6.权利要求1-5中任何一项的组合物或疫苗，其中所述组合物或疫苗包含一种或两种NDV-疱疹病毒载体。

7.权利要求6的组合物或疫苗，其中所述组合物或疫苗包含第一种NDV-疱疹病毒重组载体，其包含疱疹病毒gB抗原或其变体，并包含第二种NDV-疱疹病毒重组载体，其包含疱疹病毒gD抗原或其变体。

8.权利要求6的组合物或疫苗，其中所述组合物或疫苗包含NDV-疱疹病毒重组载体，其包含疱疹病毒gB抗原或其变体、疱疹病毒gD抗原或其变体，或其组合。

9.权利要求6-8中任何一项的组合物或疫苗，其中NDV-疱疹病毒重组载体包含多核苷酸，其编码与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4有至少90%的序列同一性的多肽。

10.权利要求6-8中任何一项的组合物或疫苗，其中重组NDV-疱疹病毒载体包含与SEQ ID NO:2、3、5或6有至少90%的序列同一性的多核苷酸。

11.重组NDV-疱疹病毒载体，其包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸编码疱疹病毒gB抗原或其变体、疱疹病毒gD抗原或其变体，或其组合。

12.权利要求11的重组NDV-疱疹病毒载体，其中所述一种或多种多核苷酸编码与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4有至少90%的序列同一性的一种或多种多肽。

13.权利要求11的重组NDV-疱疹病毒载体，其中所述一种或多种多核苷酸与SEQ ID NO:2、3、5或6有至少90%的序列同一性。

14.权利要求11-13中任何一项的重组NDV-疱疹病毒载体，其中NDV-疱疹病毒载体包含多核苷酸，所述多核苷酸编码与SEQ IDNO:1有至少90%的序列同一性的多肽。

15.权利要求11-13中任何一项的重组NDV-疱疹病毒载体，其中NDV-疱疹病毒载体包含多核苷酸，所述多核苷酸编码与SEQ IDNO:4有至少90%的序列同一性的多肽。

16.权利要求11-13中任何一项的重组NDV-疱疹病毒载体，其中NDV-疱疹病毒载体包含两种多核苷酸，所述多核苷酸编码与SEQID NO:1或SEQ ID NO:4有至少90%的序列同一性的多肽。

17.权利要求11-16中任何一项的重组NDV-疱疹病毒载体，其中所述一种或多种多核苷酸是***到NDV Avinew基因组的非必需区域中的。

18.在动物中引发对疱疹病毒的保护性应答的方法，其包括对动物施用表达至少一种疱疹病毒抗原的重组NDV-疱疹病毒载体以及药学或兽医学可接受载体、佐剂、辅料或媒介物。

19.权利要求18的方法，其中NDV-疱疹病毒载体包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸编码与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4有至少90%的序列同一性的一种或多种多肽。

20.权利要求18或19的方法，其中是通过口鼻、滴眼、喷雾、饮用水、卵内、肌内或皮下施用、皮内、透皮方式而施用的。

21.权利要求18-20中任何一项的方法，其中施用为初免-增强免疫方式。

22.权利要求18-21中任何一项的方法，其中的动物为猫或犬。

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