CN103267811A - 短短芽孢杆菌菌株发酵液中羟苯乙酯的高效液相色谱检测方法 - Google Patents
短短芽孢杆菌菌株发酵液中羟苯乙酯的高效液相色谱检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种短短芽孢杆菌菌株发酵液中羟苯乙酯的高效液相色谱检测方法,先配制标准溶液与待测液,然后分别取制备获得的标准溶液及待测液,并采用高效液相色谱仪进行进样检测,记录色谱图,经过色谱仪器自带软件积分得到峰面积;之后采用外标法定量分析待测液中羟苯乙酯的含量。本发明填补了现有技术中短短芽孢杆菌菌株发酵液中羟苯乙酯检测方法的空白;另外,该方法还具有灵敏度高、稳定性良好,且样品预处理简单的优点。
Description
【技术领域】
本发明涉及一种菌株发酵液中活性物质的检测方法,尤其涉及一种短短芽孢杆菌菌株发酵液中羟苯乙酯的高效液相色谱检测方法。
【背景技术】
微生物是产生天然活性化合物的天然宝库。据估计,现在已知的细菌不到总数的1%,已知的真菌不到总数的5%,表明还有成千上万的微生物种类有待进一步开发。由于不同生态环境下微生物的种类各不相同,因而产生的次级代谢物的种类和功能也各不相同。据报道,短短芽孢杆菌产生的短杆菌素一般由九种核糖体产生的线状短杆菌肽(Gramicidins)和二十八种以上非核糖体产生的短杆菌酪肽(Tyrocidines)和Tryptocidines组成,这些蛋白往往具有不同的生物活性。
羟苯乙酯化学名为4-对羟基苯甲酸乙酯,为尼泊金酯类防腐剂,具有广谱抑菌作用,常用作抑菌剂用于食品药品和化妆品中。对羟苯乙酯的检测,目前主要采用高效液相色谱法,如武利芬等建立了HPLC测定盐酸左氧氟沙星滴眼液中防腐剂羟苯乙酯含量的方法。简炎林等建立了以反相高效液相色谱法测定医院制剂中防腐剂羟苯乙酯含量的方法。但目前未见关于从微生物发酵液中检测羟苯乙酯的相关方法报道。
本申请人已于2010年09月29日申请的中国发明申请号为CN201010296437.6、名称为“一种新的短短芽孢杆菌菌株及其应用”中揭露了“短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX”;且在车建美等发表于“福建农业学报,2012,27(10):1106-1111”、名称为“龙眼保鲜功能微生物FJAT-0809-GLX(Brevibacillus brevis FJAT-0809-GLX)功能成分的分析”的文献中报道了短短芽孢杆菌FJAT-0809-GLX具有广谱抑菌性,经分离与鉴定,其主要功能成分是羟苯乙酯。而短短芽孢杆菌菌株发酵液中的成分复杂,对羟苯乙酯的检测容易造成干扰,为了精确测定羟苯乙酯在短短芽孢杆菌菌株 FJAT-0809-GLX发酵液中的含量,需建立一种快速、简单、有效的检测方法。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题在于提供一种短短芽孢杆菌菌株发酵液中羟苯乙酯的高效液相色谱检测方法,该发明具有灵敏度高、稳定性良好,且样品预处理简单的优点。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的:一种短短芽孢杆菌菌株发酵液中羟苯乙酯的高效液相色谱检测方法,该方法具体包括如下步骤:
(1)待测液的制备
取短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX的发酵液5mL,置于50mL具塞离心管中,并加入20mL体积比为70:29.5:0.5乙醇-水-冰醋酸的混合液,之后水浴超声波辅助提取15min,接着将提取获得的提取液置于4000r/min下离心10min,离心结束后采用所述混合液将提取液定容至50.0mL,过滤,取25mL滤液上样于已预先用10mL甲醇、10mL蒸馏水活化处理过的固相萃取柱,保持自然流速过柱,用10mL蒸馏水冲洗柱子,抽干,再以3.0mL甲醇洗脱固相萃取柱,控制液体流速不超过1mL/min,收集洗脱液,用甲醇将洗脱液定容至5.0mL,然后经0.22μm细菌过滤器过滤并将所得滤液作为待测液;
(2)标准溶液的制备
精密称量羟苯乙酯标准品12.5mg并置于100mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀作为对照品贮备液;取所述对照品贮备液2.0mL、2.5mL、3.0mL、3.5mL、4.0mL分别置于25mL容量瓶中,并加甲醇稀释至刻度,摇匀以获得不同浓度梯度的标准溶液;
(3)样品的测定
分别取制备获得的标准溶液及待测液,并采用高效液相色谱仪进行进样检测,记录色谱图,经过色谱仪器自带软件积分得到峰面积;之后采用外标法定量分析待测液中羟苯乙酯的含量。
进一步地,所述高效液相色谱仪的色谱条件如下:
色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充的C18柱;
流动相:甲醇-水;且甲醇与水的体积比为65:35;
流速为:1.0mL/min;
检测器:紫外检测器或二极管阵列检测器;
检测波长:254nm;
柱温:25℃;
进样量:10μL;
洗脱方式:等梯度洗脱。
本发明的有益效果在于:提供了一种短短芽孢杆菌菌株发酵液中羟苯乙酯的高效液相色谱检测方法,填补了现有技术中这方面检测方法的空白;另外,该方法还具有灵敏度高、稳定性良好,且样品预处理简单的优点。
【附图说明】
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。
图1是本发明中羟苯乙酯标准溶液的高效液相色谱图。
图2本发明中羟苯乙酯待测液的高效液相色谱图。
图3是本发明中羟苯乙酯的标准曲线图。
图4是本发明中灵敏度试验的高效液相色谱图。
【具体实施方式】
本发明短短芽孢杆菌菌株发酵液中羟苯乙酯的高效液相色谱检测方法,能够精确测定羟苯乙酯在短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX发酵液中的含量。结合如下实施例对本发明方法进行详细说明。
实施例
(1)菌株的培养:将短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX进行活化,之后按1%接种量将活化后的短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX接种至100mL发酵培养基中,30℃、170rpm/min下培养48h;且发酵培养基的组分为:可溶性淀粉8g/L,豆饼粉30.0g/L,蛋白胨2.0g/L,蔗糖20.0g/L,Cacl2 5g/L,蒸馏水配制,pH7.2。
(2)待测液的制备:取5mL步骤(1)培养所得的短短芽孢杆菌菌株 FJAT-0809-GLX发酵液,置于50mL具塞离心管中,并加入20mL体积比为70:29.5:0.5乙醇-水-冰醋酸的混合液,之后水浴超声波辅助提取15min,接着将提取获得的提取液置于4000r/min下离心10min,离心结束后采用所述混合液将提取液定容至50.0mL,过滤,取25mL滤液上样于已预先用10mL甲醇、10mL蒸馏水活化处理过的固相萃取柱,保持自然流速过柱,用10mL蒸馏水冲洗柱子,抽干,再以3.0mL甲醇洗脱固相萃取柱,控制液体流速不超过1mL/min,收集洗脱液,用甲醇将洗脱液定容至5.0mL,然后经0.22μm细菌过滤器过滤并将所得滤液作为待测液。
(3)标准溶液的制备
精密称量羟苯乙酯标准品12.5mg并置于100mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀作为对照品贮备液;取所述对照品贮备液2.0mL、2.5mL、3.0mL、3.5mL、4.0mL分别置于25mL容量瓶中,并加甲醇稀释至刻度,摇匀以获得不同浓度梯度的标准溶液。
(4)高效液相色谱检测:色谱条件如下:
色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充的C18柱;
流动相:甲醇-水;且甲醇与水的体积比为65:35;
流速为:1.0mL/min;
检测器:紫外检测器或二极管阵列检测器;
检测波长:254nm;
柱温:25℃;
进样量:10μL;
洗脱方式:等梯度洗脱。
(5)样品的测定
a、标准曲线测定:取所制备的标准溶液注入上述色谱条件的高效液相色谱仪中进行分析测定,记录色谱图(如图1所示),经过色谱仪器自带软件积分得到峰面积;并以以质量浓度Cmg/mL(x)对峰面积(y)进行线性回归,得线性回归方程y=83.031x-55.929,相关系数R2=0.9998,则绘制标准曲线如图3所示。
b、待测液测定:取所制备的待测液注入上述色谱条件的高效液相色谱仪中进行分析测定,记录色谱图(如图2所示),将待测液的色谱图即图3与标准溶液的色谱图即图1进行比较,待测液的色谱图中与标准溶液保留时间相近(误差范围:标准溶液保留时间±0.5分钟)的色谱峰即为相应的羟苯乙酯成分,利用色谱仪器自带软件积分得到峰面积,结果显示,出峰时间为3.12min,峰面积为136;之后采用外标法定量分析待测液中羟苯乙酯的含量,具体地,将所得峰面积带入上述回归方程中计算即可,计算结果可知待测液中羟苯乙酯的含量为2.311mg/mL。
为了选择最佳的检测条件,本申请人对色谱条件及标准曲线的线性范围进行了相应的试验。
1、色谱条件的选择
(1)流动相的选择:
在其他条件一致的情况下,分别对甲醇-水(体积比分别为65:35,70:30,75:25)、甲醇-0.1%冰醋酸(体积比分别为50:50,60:40,70:30)、乙腈-水(体积比分别为25:75,40:60,50:50)、乙腈-0.005mol·L-1醋酸铵溶液(体积比分别为60:40,50:50,40:60)、乙腈-0.05mol·L-1磷酸二氢钾溶液(体积比分别为60:40,50:50,40:60)进行了试验。
试验结果显示:当利用甲醇-水(体积比分别为65:35,70:30,75:25)作为流动相时,待测样品(即羟苯乙酯)与杂质能够较好的分离,在保留时间均有待测样品独立的峰,与杂质区分开来,且其中甲醇-水体积比为65:35时杂蜂最少,而且分离度最好,因此选用此体积比作为下一步研究条件;当利用甲醇-0.1%冰醋酸(体积比分别为50:50,60:40,70:30)作为流动相时,待测样品溶液共跑出15个峰,待测样品的峰面积均很小,待测样品峰与杂质之间的分离度很差,峰都基本连在一起,无法很好的区分,因此不选用甲醇-0.1%冰醋酸作为HPLC方法检测短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX发酵液中羟苯乙酯的流动相;当利用乙腈-水(体积比分别为25:75,40:60,50:50)作为流动相时,随着乙腈量的增加出峰时间明显缩短,第一体积比出峰时间过长, 体积比为40:60时待测样品检测的峰面积为137.2,且与杂质之间的分离效果不太好,体积比为50:50时峰面积小,且待测样品峰与杂质之间的分离度很差。待测样品所需的峰与杂质之间的分离度不明显,峰都基本连在一起不能很好的分开,因此不选用此流动相作为检测发酵液中羟苯乙酯的流动相;当利用乙腈-0.005mol·L-1醋酸铵溶液(体积比分别为60:40,50:50,40:60)作为流动相时,随着乙腈量的增加,出峰的时间也提前,虽然后两个有较好的峰面积,但待测样品峰与杂质之间的分离度很差,峰都基本连在一起,无法很好的区分,因此不选用此流动相作为检测发酵液中高效抑菌活性物质羟苯乙酯的流动相;当利用乙腈-0.05mol·L-1磷酸二氢钾溶液(体积比分别为60:40,50:50,40:60)作为流动相时,此流动相中待测样品峰与杂质之间的分离度很差,峰都基本连在一起,无法很好的区分,而且待测样品的峰面积也小,流动相中还有K离子导致C18柱子平衡的时候很不好不平衡,经常出现不稳定的状态,因此不使用该流动相作为下一步的分析。
(2)检测波长的选择:
在其他条件一致的情况下,分别对波长262nm、260nm、258nm、254nm、252nm进行标准品检测,发现在254nm处有较高的灵敏度,因此选择254nm作为检测波长。
2.标准曲线的线性范围研究
羟苯乙酯对照品贮备液用甲醇稀释定容,配制羟苯乙酯标准溶液浓度为1.0mg/mL、1.0mg/mL、5.0mg/mL、10.0mg/mL、15.0mg/mL、20.0mg/mL,在确定的色谱条件下进行分析,以质量浓度Cmg/mL(x)对峰面积(y)进行线性回归。结果显示,配制羟苯乙酯标准溶液浓度为1.0mg/mL时平均峰面积为69.00、标准溶液浓度为5.0mg/mL时平均峰面积为360.33、标准溶液浓度为10.0mg/mL时平均峰面积为748.88、标准溶液浓度为15.0mg/mL时平均峰面积为1201.36、及标准溶液浓度为20.0mg/mL时平均峰面积为1610.07。因此可知,羟苯乙酯在1.0-20mg/mL的范围内呈良好的线性关系,且其线性关系为Y=81.031C-55.929,相关系数达到0.9998。
另外,为了验证本发明检测方法的***适用性、精密度、灵敏度、及稳定性是否良好,申请人进行了相应的试验。
1、***适应性试验
分别取标准溶液、待测液各10μL,注入液相色谱仪,按上述色谱条件测定,记录色谱图。结果显示标准溶液的出峰时间为3.316min,峰面积为8121.7;待测液出峰时间为3.317min,峰面积为51.1。从而说明本发明检测方法***适应性良好。
2、精密度试验
精密量取羟苯乙酯标准品贮备液3.0mL并置于25mL容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,配成15μg/mL的标准溶液,按上述色谱条件测定,连续进样5次,记录峰面积。计算得羟苯乙酯的峰面积的RSD为0.2%(n=5),表明仪器精密度良好。
3、灵敏度试验
将标准样品逐渐稀释,按上述色谱条件测定进样,检测羟苯乙酯的最低检测限度,记录色谱图(如图4所示),结果显示,羟苯乙酯的最低检测限度(S/N=6)为1.0×10-15mg/mL,表明本发明检测方法的灵敏度高。
4、稳定性试验
取10μL的待测液,分别在0h、8h、16h、24h、48h时注入高效液相色谱仪,按上述色谱条件测定,结果如图4所示,结果显示,0h时的出峰时间为3.339,峰面积为49.3;8h时出峰时间为3.317,峰面积为51.7;16h时出峰时间为3.309,峰面积为49.3;24h时的出峰时间为3.318,峰面积为51.3;48h时的出峰时间为3.340,峰面积为51.1。峰面积的RSD为0.4%,从而表明待测液在48h内稳定,即稳定性良好。
5、回收率试验
取待测液3份,分别加入标准溶液5.0mg/mL、10.0mg/mL、15.0mg/mL,按上述色谱条件进行回收率实验,每个浓度测定6次,计算平均回收率,按拟定的含量测定方法检测,检测结果见表1。结果表明羟苯乙酯的回收率在96.2-105.3%之间,平均RSD为0.8%,回收率较稳定。
表1回收率试验的检测结果
综上,本发明提供了高效液相色谱检测短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX发酵液中羟苯乙酯的方法,填补了现有技术这方面的空白,而且该方法还具有灵敏度高、稳定性良好,且样品预处理简单等优点。
Claims (2)
1.一种短短芽孢杆菌菌株发酵液中羟苯乙酯的高效液相色谱检测方法,其特征在于:该方法具体包括如下步骤:
(1)待测液的制备
取短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX的发酵液5mL,置于50mL具塞离心管中,并加入20mL体积比为70:29.5:0.5乙醇-水-冰醋酸的混合液,之后水浴超声波辅助提取15min,接着将提取获得的提取液置于4000r/min下离心10min,离心结束后采用所述混合液将提取液定容至50.0mL,过滤,取25mL滤液上样于已预先用10mL甲醇、10mL蒸馏水活化处理过的固相萃取柱,保持自然流速过柱,用10mL蒸馏水冲洗柱子,抽干,再以3.0mL甲醇洗脱固相萃取柱,控制液体流速不超过1mL/min,收集洗脱液,用甲醇将洗脱液定容至5.0mL,然后经0.22μm细菌过滤器过滤并将所得滤液作为待测液;
(2)标准溶液的制备
精密称量羟苯乙酯标准品12.5mg并置于100mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀作为对照品贮备液;取所述对照品贮备液2.0mL、2.5mL、3.0mL、3.5mL、4.0mL分别置于25mL容量瓶中,并加甲醇稀释至刻度,摇匀以获得不同浓度梯度的标准溶液;
(3)样品的测定
分别取制备获得的标准溶液及待测液,并采用高效液相色谱仪进行进样检测,记录色谱图,经过色谱仪器自带软件积分得到峰面积;之后采用外标法定量分析待测液中羟苯乙酯的含量。
2.根据权利要求1所述短短芽孢杆菌菌株发酵液中羟苯乙酯的高效液相色谱检测方法,其特征在于:所述高效液相色谱仪的色谱条件如下:
色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充的C18柱;
流动相:甲醇-水;且甲醇与水的体积比为65:35;
流速为:1.0mL/min;
检测器:紫外检测器或二极管阵列检测器;
检测波长:254nm;
柱温:25℃;
进样量:10μL;
洗脱方式:等梯度洗脱。
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