CN103266075B - 人苍白杆菌及其在脱除含硫恶臭物质中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公布了一株人苍白杆菌及其在生脱除含硫恶臭物质中的应用。本发明所涉及的人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)SL1，为从中国科学院生态环境研究中心水污染控制实验室处理含H2S等恶臭物质的反应器中得到分离菌，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7400。该菌株可制备成微生物活性填料，用于净化含硫恶臭物质的气体，解决污水、污泥处理、垃圾处理和堆肥等过程产生的恶臭污染问题，对硫化氢、甲硫醇、甲硫醚等含硫恶臭物质降解效率可以达到90％以上。
Description
技术领域：
本发明属于环境治理领域，具体涉及一种脱除含硫恶臭物质的微生物及其应用。
背景技术：
在污水、污泥处理、垃圾处理和堆肥等过程中会产生大量的臭味气体，硫化氢、硫醇、硫醚、二硫化碳等含硫物质为臭味气体中常见的发臭物质。恶臭物质逸散到大气中，随着空气的流动扩散到各处，对周围环境造成污染，对人体健康产生危害。目前，空气污染和臭气的治理引起人们越来越多的关注，许多国家都制定了严格的排放标准。严格控制废气中污染物的排放，并要求企业在排放污染物前，采取相应的治理措施。我国于1993年开始实施的国家《恶臭污染物排放标准》(GB14554-93)中对挥发性有机污染物及恶臭物质的排放做出了严格的规定。
与其它物理化学废气处理方法相比，生物处理方法因其具有成本低、操作简便、技术清洁、无二次污染等优点，九十年代以后成为研究的热点。生物法的原理是利用微生物的生物氧化作用将含硫的恶臭物质转化为硫酸盐或硫单质的过程。
但是，微生物通常附着生长在载体表面，在运行生物反应器时需要定期向载体喷淋营养液以维持微生物的生长所需的养分与水分。在喷淋的过程中，微生物极易从载体表面脱落，随多余的营养液从净化废气的生物反应器中流出，造成流失，引起含硫恶臭物质的处理效果降低的问题。并且，载体通常采用堆肥材料、木片、树皮，拉西环，陶粒等。堆肥材料、木片、树皮等载体的比表面积小，填充密度大，压力损失大，易腐烂，使用寿命短；拉西环、陶粒表面光滑，微生物不易附着，更易流失。净化含硫恶臭物质的生物反应器的接种物多为污水处理厂的活性污泥，微生物适应期长，生物反应器启动慢。
发明内容：
本发明的目的是提供一株人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)SL1及其在脱除含硫恶臭物质中的应用。
本发明所涉及的人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)SL1，为从中国科学院生态环境研究中心水污染控制实验室处理含H2S等恶臭物质的反应器中得到分离菌。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7400，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。保藏日期2013年4月02日。
该菌株特点如下：
该菌株在LB固体平板上菌落颜色为无色，圆形，表面光滑，边缘整齐，湿润。菌体呈杆状，大小为0.5-0.8×3.0-3.5μm，周生鞭毛，革兰氏染色阴性，接触酶和氧化酶阳性。吲哚阴性。葡萄糖发酵产酸，可以利用硝酸盐，不水解七叶灵和明胶。可以广泛利用碳水化合物、氨基酸、有机酸为碳源。最适生长温度为20-37℃。
采用全自动磁珠核酸提取仪Smart LabAssist-16及相应环境样品DNA提取纯化试剂盒分别对目的菌株DNA进行提取和纯化，选用细菌通用引物F16S-27和R16S-1492进行PCR扩增，引物序列分别为：
F16S-27(5`-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3`)
R16S-1492(5`-CGGTTACCTTGTTACGACTTC-3`)
PCR反应条件设定为：94℃预变性5min；随后94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，循环25个周期；然后72℃延伸10min；最后4℃保持10min。然后将PCR产物连接到PMD-19T载体上，随后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。将转化后的感受态细胞50μl涂布于含有半乳糖苷、异丙基-β-d-硫代半乳糖苷和氨苄青霉素的LB培养基上。培养12小时后，从每个平板挑取25个白色单菌斑进行液体LB培养基培养。培养2小时后，将培养液进行测序分析。测得的序列首先采用DNAMAN软件进行相似性归并，将相似性大于97％的序列归并为一个操作单元，选取每个操作单元中的代表序列利用BLAST与GenBank数据库中的16SrDNA基因序列进行同源性分析，选取1400bp以上长度进行比对(Clustelx1.83)，采用邻位连接(Neighbour Joining)法进行***学分析(MEGA3.1)。***发育树如图1所示。
该菌剂可通过试管斜面种-摇瓶种-种子罐-生产罐-产品(包装剂型为液体菌剂或固体吸附菌剂)的生产工艺制备得到。
本发明提供了一株降解含硫恶臭物质的人苍白杆菌(Ochrobactrumanthropi)SL1(CGMCC No.7400)，由该细菌制备的菌剂，在气体流量为1.0-90m3/h，停留时间1-3min，温度20-37℃，硫化氢浓度为0.1-80mg/m3，甲硫醇0.1-10mg/m3，甲硫醚0.1-10mg/m3，对硫化氢、甲硫醇、甲硫醚等含硫恶臭物质降解效率可以达到90％以上。可用于净化含硫恶臭物质的气体，解决污水、污泥处理、垃圾处理和堆肥等过程产生的恶臭污染问题。
所述人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)SL1可以制备吸附于填料上成为微生物活性填料，更好的处理含硫恶臭物质。
所述填料为轻质多孔聚氨酯泡沫块、颗粒活性炭、火山岩、珍珠岩中的一种或多种材料；
所述填料密度为0.7-1.0kg/m3，孔隙率为50-96％，粒径为5-50mm；
所述的微生物菌悬液与轻质多孔材料的质量比为50-300∶10；
所述的微生物活性填料中人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)SL1菌体浓度大于106CFU/g(活性填料)。
所述的微生物活性填料制备步骤如下：
(1)斜面培养：培养制备人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)SL1斜面菌种；
所述的人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)SL1斜面培养基组成为：葡萄糖0.5g，KH2PO42.0g，K2HPO42.0g，KNO32.0g，NH4Cl0.5g，MgCl2·6H2O0.2g，FeSO4·7H2O0.01g，Na2S2O3·5H2O5.0g，琼脂20g，水1000ml，pH值6.8-7.2，121℃灭菌20min；
(2)菌悬液的制备：将步骤(1)制备的人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)SL1斜面菌体按5-20％接种量逐级发酵培养，分离获得菌体浓度为0.4-0.8g/L人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)SL1菌悬液；
人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)SL1菌悬液制备方法如下；
人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)SL1斜面菌体按5-20％接种量逐级发酵培养，培养温度36℃，培养时间48h，通风量5-200L/min，溶解氧＞2.0mg/L，罐压0.03-0.10Mpa，发酵液置于冷冻离心机中于4℃，2000-8000rpm，离心浓缩5-20min，弃去上清液，沉淀用无菌营养液稀释，获得菌体浓度为0.4-0.8g/L人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)SL1菌悬液；
所述的人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)SL1液体发酵培养基的组成为：葡萄糖0.5g，KH2PO42.0g，K2HPO42.0g，KNO32.0g，NH4Cl0.5g，MgCl2·6H2O0.2g，FeSO4·7H2O0.01g，Na2S2O3·5H2O5.0g，水1000ml，pH值6.8-7.2，121℃灭菌20min；
所述的人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)SL1无菌营养液的组成为：葡萄糖0.5g，KH2PO43.0g，K2HPO43.0g，NH4H2PO40.5g，MgCl2·6H2O0.2g，FeCl30.01g，水1000ml，pH值6.8-7.2；121℃灭菌20min；
(3)微生物活性填料的制备：
(a)将步骤(3)制备的微生物菌悬液喷淋到方块体或颗粒形状的轻质多孔材料的表面；(b)将带有人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)SL1的多孔材料块(或颗粒)放入旋转混合器中旋转混合；(c)再次向轻质多孔材料表面喷淋微生物菌悬液，获得微生物活性填料，4℃保存备用；
优选的重复步骤(a)-(c)2-3次，使材料表面以及微孔中均附载有菌细胞，获得微生物活性填料；
本发明的另一目的是利用微生物活性填料进行臭味气体处理，特别是在降解H2S气体中的应用，具体步骤如下：
(1)将附载有人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)SL1的微生物活性填料置于一容器中，通入H2S气体，以H2S气体为硫源，活化微生物活性填料；活化时间为1-14天；
所述的H2S的浓度为50-200ppm；
(2)将活化后的微生物活性填料置于生物反应器中，通入含硫恶臭物质的气体，用人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)SL1净化废气中的含硫恶臭物质，微生物活性填料体积为0.001-200m3，硫化物的总浓度为50-200ppm，气体流速为0.05-10000m3/h，净化温度为10-35℃；定期向微生物活性填料表面喷淋营养液维持微生物活性填料的活性，喷淋频率为1-7天喷淋1次，每次喷淋速度为1.0-200L/min，每次喷淋时间为20-120min；
所述的营养液的组成为：葡萄糖0.5g，KH2PO42.0g，K2HPO42.0g，KNO32.0g，NH4Cl0.5g，MgCl2·6H2O0.2g，FeCl30.01g，水1000ml，pH6.8-7.2；跟踪检测含硫恶臭物质的降解能力。
本发明采用气相色谱法跟踪检测含硫化合物；所述的气相色谱法为：采用安捷伦GC-6890N气相色谱仪分析测定硫化物浓度，色谱柱为DB-1701毛细管柱(30m×0.32mm×0.25μm)，汽化室、FPD检测器、柱温分别设置为100℃、250℃、220℃，进样量50μL，N2流速为0.3mL/min，总流量为12mL/min。
有益效果：
1.本发明的人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)SL1具有较高的降解硫化氢的效率；并且优势菌的适应期短，可以快速开始降解反应，应用在净化含硫恶臭物质的废气生物反应器中，能够缩短启动期。
2.利用沉降、附着和离心等多种力学的作用，将降解优势菌人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)SL1附载在轻质多孔材料上，形成微生物活性填料，菌细胞不仅能够均匀地附着在填料表面，而且能够进入填料内部的孔中，使微生物活性填料的菌细胞附载量高，不易从生物反应器中流失。
3.微生物活性填料使用前经过活化，可以使生物反应器快速启动。附载的菌细胞酶活稳定，能够维持长期稳定的含硫恶臭物质的净化效果。
4.用于微生物活性填料的载体材料的表面粗糙、多孔，适于菌细胞附着；比表面积大，透气性好，阻力小，有利于菌细胞与废气中的含硫恶臭物质接触，提高传质效率。
5.用于微生物活性填料的载体材料质轻，应用在净化含硫恶臭物质的废气生物反应器中，填充密度低，压力损失小。
6.微生物活性填料不易腐烂变形，可以长期使用和适应多种复杂的实际条件。
附图说明：
图1人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)SL1***发育树
具体实施方式：
例1：一种脱除含硫恶臭物质的微生物活性填料及其制备方法。
一种脱除含硫恶臭物质的微生物活性填料，所述填料附载有人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)SL1，所述人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)SL1保藏编号为CGMCC No.7400，所述填料为聚氨酯泡沫块；
所述填料密度为0.9kg/m3，孔隙率为86％，粒径为30mm；
所述的微生物以菌悬液的形式附载在填料上；
所述的微生物菌悬液与轻质多孔材料的质量比为100∶10；
所述的微生物活性填料中人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)SL1菌体浓度大于106CFU/g
所述的微生物活性填料制备步骤如下：
(1)斜面培养：制备人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)SL1斜面菌种；
所述的人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)SL1斜面培养基组成为：葡萄糖0.5g，KH2PO42.0g，K2HPO42.0g，KNO32.0g，NH4Cl0.5g，MgCl2·6H2O0.2g，FeSO4·7H2O0.01g，Na2S2O3·5H2O5.0g，琼脂20g，水1000ml，pH值6.8-7.2，121℃灭菌20min；
(2)菌悬液的制备：人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)SL1斜面菌体10％接种量逐级发酵培养，分离获得菌体浓度为0.6g/L人苍白杆菌(Ochrobactrumanthropi)SL1菌悬液；
人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)SL1菌悬液制备方法如下；
人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)SL1斜面菌体按10％接种量逐级发酵培养，培养温度36℃培养时间48h，通风量100L/min，溶解氧＞2.0mg/L，罐压0.06Mpa，发酵液置于冷冻离心机中于4℃，5000rpm，离心浓缩10min，弃去上清液，沉淀分别用无菌营养液稀释，分别获得菌体浓度为0.5g/L人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)SL1菌悬液；
所述的人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)SL1液体发酵培养基的组成为：葡萄糖0.5g，KH2PO42.0g，K2HPO42.0g，KNO32.0g，NH4Cl0.5g，MgCl2·6H2O0.2g，FeSO4·7H2O0.01g，Na2S2O3·5H2O5.0g，水1000ml，pH值6.8-7.2，121℃灭菌20min；
所述的人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi).SL1无菌营养液的组成为：葡萄糖0.5g，KH2PO43.0g，K2HPO43.0g，NH4 H2PO40.5g，MgCl2·6H2O0.2g，FeCl30.01g，水1000ml，pH值6.8-7.2；121℃灭菌20min；
(3)微生物菌悬液的制备：人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)SL1菌悬液中菌体总浓度为0.5g/L；
(4)微生物活性填料的制备：(a)将步骤(3)制备的微生物菌悬液通过泵和喷淋头喷淋到方块体或颗粒形状的轻质多孔材料的表面；喷淋速度为10L/min，喷淋时间为60min；同时进行搅拌，搅拌速度为100rpm，搅拌时间为100min；使菌悬液与轻质多孔材料充分接触；(b)将带有人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)SL1的多孔材料块(或颗粒)放入旋转混合器中，于10rpm转速下旋转混合50min；随着混合器的转动，附着在轻质多孔材料表面的菌细胞由于离心力的作用进入到孔隙内部；(c)再次向轻质多孔材料表面喷淋微生物菌悬液，同时进行搅拌；获得微生物活性填料，4℃保存备用；
优选的重复步骤(a)-(c)3次，使材料表面以及微孔中均附载有菌细胞，获得微生物活性填料；
所述旋转混合机是高效精细容器回转、搅拌型混合设备，用于不同比例的干性或湿性颗粒物的均匀混合，并且在混合过程中不产生物料的熔解、挥发或变质。旋转混合机主体为不锈钢材料制作，容积为0.05-10m3，内外壁抛光，无死角，内置搅拌叶片，外部转动加上内置叶片搅拌，轻质多孔填料和菌悬液在旋转混合器内径向翻滚，同时还会横向以及上下对流，混合效率高。在混合机旋转过程中，一方面使各成分物质充分混合，另一方面，由于离心力的作用，菌细胞可以进入多孔材料内部的孔中，不仅使微生物活性填料的菌细胞附载量高，而且菌细胞不易流失。
例2：一种微生物活性填料在降解H2S气体中的应用。
本发明的另一目的是利用微生物活性填料进行臭味气体处理，特别是在降解H2S气体中的应用，具体步骤如下：
(1)将附载有人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)SL1的微生物活性填料置于一容器中，通入H2S气体，以H2S气体为硫源，活化微生物活性填料；活化时间为7天；
所述的H2S的浓度为35ppm；
(2)将活化后的微生物活性填料置于生物反应器中，通入含硫恶臭物质的气体，用人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)SL1净化废气中的含硫恶臭物质，微生物活性填料体积为100m3，硫化物的总浓度为100ppm，气体流速为1000m3/h，净化温度为25℃；定期向微生物活性填料表面喷淋营养液维持微生物活性填料的活性，喷淋频率为3天喷淋1次，每次喷淋速度为50L/min，每次喷淋时间为60min；
所述的营养液的组成为：葡萄糖0.5g，KH2PO42.0g，K2HPO42.0g，KNO32.0g，NH4Cl0.5g，MgCl2·6H2O0.2g，FeCl30.01g，水1000ml，pH6.8-7.2；跟踪检测含硫恶臭物质的降解能力。
例3：使用效果实验(将例1填料用于下述气体的处理)。
(1)处理污水厂污泥沉淀池逸散的含硫恶臭气体，气体流量为35m3/h，停留时间为1～3mins，室温条件下操作。硫化氢的进气浓度为：14.86mg/m3，出气浓度低于0.03mg/m3，低于国家制定的恶臭污染物排放标准，去除率高于99％。
(2)用于处理污泥堆肥产生的含硫恶臭气体，硫化氢和乙硫醇的浓度分别为21.2mg/m3和3.21mg/m3，气体流量为70m3/h，停留时间为1～3mins，室温条件下操作，硫化氢和乙硫醇的去除率均大于90％。
(3)垃圾填埋场，处理含有162.1mg/m3硫化氢，3.82mg/m3甲硫醇，以及8.2mg/m3甲硫醚的混合废气，气体流量为60m3/h，停留时间为1～3mins，温度18-37℃，硫化氢、甲硫醇、甲硫醚的去除率分别达到90％，86％和88％。
Claims (3)
1.一种脱除含硫恶臭物质的人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)SL1，其特征在于，所述人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)SL1,保藏编号为CGMCC No.7400。
2.根据权利要求1所述的脱除含硫恶臭物质的人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)SL1在处理含硫恶臭物质中的应用，其特征在于，所述含硫恶臭物质为硫化氢、甲硫醇、乙硫醇、甲硫醚。
3.根据权利要求1所述人苍白杆菌所制备的活性填料进行臭味气体处理的方法，步骤如下：
(1)将附载有人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)SL1的人苍白杆菌活性填料置于一容器中，通入H2S气体，以H2S气体为硫源，活化人苍白杆菌活性填料；活化时间为1-14天；
所述的H2S的浓度为50-200ppm；
(2)将活化后的人苍白杆菌活性填料置于生物反应器中，通入含硫恶臭物质的气体，用人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)SL1净化废气中的含硫恶臭物质，人苍白杆菌活性填料体积为0.001-200m3，硫化物的总浓度为50-200ppm，气体流速为0.05-10000m3/h，净化温度为10-35℃；定期向人苍白杆菌活性填料表面喷淋营养液维持活性填料的活性，喷淋频率为1-7天喷淋1次，每次喷淋速度为1.0-200L/min，每次喷淋时间为20-120min；
所述含硫恶臭物质为硫化氢、甲硫醇、乙硫醇、甲硫醚；
所述的营养液的组成为：葡萄糖0.5g，KH2PO4 2.0g，K2HPO4 2.0g，KNO3 2.0g，NH4Cl 0.5g，MgCl2·6H2O 0.2g，FeCl3 0.01g，水1000ml，pH 6.8-7.2。
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