CN103265612A - 一种羊胚胎活性肽的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种羊胚胎活性肽的提取方法，依次包括下列步骤：（1）．取6～16周羊胚胎新鲜组织，切碎后加入生理盐水，经组织匀浆机匀浆；匀浆后在-20℃与40℃下快速冻融；（2）．超声裂解，每间隔30秒启动超声探头，超声持续时间15秒，重复3～5次；（3）．4℃低温高速离心30分钟，取上清液；（4）．将上清液用5k超滤膜离心超滤，澄清，得超滤液，即为羊胚胎活性肽溶液。发明的提取方法无需任何酸碱处理，从而有效的避免了化学方法处理带来环境污染，也避免了对产品的污染。且能最大限度收集了多种生物活性肽成分，活性肽的分子量有效的控制在5000D以下，最大限度地保持了羊胚胎小分子肽的生物活性。

Description

一种羊胚胎活性肽的提取方法
技术领域
本发明涉及生物活性物质的提取方法，具体涉及胚胎活性肽的提取方法。
背景技术
羊胚胎小分子生物活性肽，又名羊胎素，是胚胎细胞分化发育的调控原件，能使受精卵准确无误地分化为各种组织细胞，能促进细胞分化与细胞增殖。小分子活性肽具有高度的保守性，其同源性很高，没有免疫原性，不会出现过敏反应，对人体没有副作用，可以为人类所利用小分子生物活性肽能直接进入细胞内修复受损细胞的DNA，保护与修复受损细胞，恢复受损细胞的结构与功能。因此，羊胚胎小分子生物活性肽能用于激活人体细胞活力、使老化细胞恢复细胞的结构与功能，保持细胞的活力状态；并用于激活免疫细胞，能增强人体免疫细胞活力，使人体抗病能力增强。
目前，生物领域对蛋白质、多肽提取分离常用的方法包括：酸碱制备法、盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法等。这些方法常常组合到一起对特定的物质进行分离纯化，同时上述这些方法也是蛋白、多肽类物质分析中常用的手段，如层析、电泳等。
酸碱法制备生物活性肽工艺简单，但是具有氨基酸受损严重，水解程度难以控制，副产物较多，影响肽的结构及功能，同时可能有酸、碱或其它物质残留等缺点，故而限制了该方法的广泛应用。酶解法使多肽和氨基酸损失较多，降低了活性肽的活性；且工序较为烦琐，成本较高。其它方法提取小分子多肽主要是不能全部回收所需要活性肽，也很难达到规模化生产的目的。
发明内容
针对目前羊胚胎生物活性肽提取技术中存在的各种不足，本发明的目地在于提供一种新的羊胚胎活性肽提取方法，该方法最大限度收集了多种生物活性肽成分，并最大限度的保持了羊胚胎生物活性肽的活性，且工艺又简单环保。
为实现上述发明目的，本发明羊胚胎活性肽提取方法的详细技术方案依次包括下列步骤：（1）．取6～16周羊胚胎新鲜组织，切碎后加入生理盐水，经组织匀浆机匀浆；匀浆后快速冻融，即放入-20℃冰箱快速冷冻，30分钟后取出，放入40℃水浴箱中快速融解；（2）．超声裂解，每间隔30秒启动超声探头，超声持续时间15秒，重复3～5次；（3）．4℃低温高速离心30分钟，取上清液；（4）．将上清液用5k超滤膜离心超滤，澄清，得超滤液，即为羊胚胎活性肽溶液。
在步骤（1）中，匀浆后快速冻融可重复1～2次。
在步骤（2）超声裂解时，超声频段最好设定为3000Hz。
在步骤（4）对上清液离心超滤时，最好控制流速为10～20ml/min。
上述制得的羊胚胎活性肽溶液还可以经进一步低温冷冻干燥，获得羊胚胎活性肽冻干粉。还可以根据需要，以羊胚胎活性肽溶液或冻干粉作为有效成分，用常规药剂制备方法，加入常规的药学载体各药学辅料，如填充剂、粘合剂、崩解剂等，可以制备出各种药学可接受形式的各种口服制剂，如颗粒剂、片剂和胶囊剂等。
 在本发明的工艺中，羊胚胎组织匀浆后在-20℃与40℃之间快速冻融及超声裂解，能使细胞内天然小分子活性肽全部释放出来；低温高速离心能去除组织匀浆液中未能被超声裂解所破碎的的杂质碎片；上清液经超滤后截留大分子蛋白质，millipore离心超滤澄清，截留分子量大于5kD的多肽或蛋白质，从而使滤液中活性肽分子量控制在5000D以下。
用本发明的方法提取的羊胚胎活性肽，经生物信息学分析，对胚胎活性肽的氨基酸序列、一级结构与功能进行比对分析，符合生物信息学中有关生物活性肽的特征。利用HPLC分析方法对提取物进行分析，得到多肽的质谱图，测出该蛋白峰的分子量为3520道尔顿分子量分别为2039，2481，2929，3369，4300，4959道尔顿多个多肽分峰。
与现有技术相比，本发明的具有如下明显的优点和效果：1.本发明的提取方法无需任何酸碱处理，从而有效的避免了化学方法处理带来环境污染，也避免了对产品的污染。2.本方法最大限度收集了多种生物活性肽成分，活性肽的分子量有效的控制在5000D以下，最大限度地保持了羊胚胎小分子肽的生物活性。
说明书附图
图1是本发明实施例1制备的羊胚胎活性肽HPLC分析质谱图；
图2是HPLC分析24分钟处洗脱的多肽的质谱图；
图3是HPLC分析27分钟处洗脱的多肽成分的质谱图；
图4是小牛thymosin α1标准经HPLC分析洗脱的多肽的质谱图。 
具体实施方式
下面通过实施例结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细说明，下例实施例中涉及的技术特征，均不应理解为对本发明的限制。现有技术领域中，用常规技术手段对本发明技术特征进行常规替换，都应当理解为包含在本发明中。
实施例1  羊胚胎活性肽溶液的制备及检测
取6周羊胚胎新鲜胸腺组织30g切碎，加入30ml生理盐水，经组织匀浆机匀浆；匀浆后放入-20℃冰箱快速冷冻，30分钟后取出，放入40℃水浴箱中快速融解。超声裂解，设定频段超声为3000Hz，每间隔30秒启动超声探头，超声持续时间15秒，重复此步骤3次，使细胞内小分子活性肽全部释放出来。4℃低温下，15000g转速高速离心30分钟，去除组织匀浆液中未能被超声裂解所破碎的较大的杂质碎片，取清亮透明的上清液。上清液超滤，采用Microcon YM-10(0.22μm孔径)超滤装置进行超微过滤，控制流速为10ml/min，过滤截留大分子蛋白质；用Amicon Ultra-15 超滤装置，配5k超滤膜，使滤液中活性肽分子量控制在﹤5000D，进行millipore离心超滤澄清，截留分子量大于5kD的多肽或蛋白质。回收超滤液30 ml，即为羊胚胎胸腺活性肽溶液。
对获得的羊胚胎活性肽溶液进行HPLC分析，经0.22μm孔径的滤器进行超微过滤的滤液直接在HPLC分析仪上进行脱盐，因为HPLC分析仪上的液相色谱柱具有脱盐的功能，在HPLC分析后，观察出现近20多个蛋白峰。而经Amicon Ultra-15 millipore离心超滤，截留分子量大于5kd的多肽或蛋白质，滤液中活性肽分子量控制在小于5Kd；回收全部羊胚胎天然小分子活性胸腺肽及细胞因子等成份的超滤液。采用相同的步骤经HPLC上样分析发现其蛋白峰较前者明显减少，且杂带较少，在24和27min左右出现其类似的蛋白主峰。经质谱分析，质谱图见图1，其中有2个与小牛thymosin α1 出峰位置相近似的主蛋白峰。我们采用Sigma 公司提取的小牛胸腺thymosin α1作为对照，由于小牛thymosin α1出峰时间在26.4分钟处；其分子量为3108道尔顿，见图4。所以，对本发明实施例提取的羊胚胎活性多肽24分钟和27分钟处的蛋白峰分别进行了质谱分析。 
图2为本发明羊胚胎活性肽HPLC分析24分钟处洗脱的多肽的质谱图，测出该蛋白峰的分子量为3520道尔顿。图3为HPLC分析27分钟处洗脱的多肽成分的质谱图，测出27分钟的蛋白峰则为6个多肽成分，分子量分别为2039，2481，2929，3369，4300，4959道尔顿，可能为氨基酸序列近似的几种同源胸腺肽或细胞因子。
 
 实施例2  羊胚胎活性肽冻干粉的制备
取16周羊胚胎新肝、胸腺、脾脏组织80g,切碎，加入50 ml生理盐水，经组织匀浆机匀浆。匀浆后放入-20℃冰箱快速冷冻，30分钟后取出，放入40℃水浴箱中快速融解，融解后再次放入-20℃冰箱快速冷冻，30分钟后取出，放入40℃水浴箱中再次快速融解。超声裂解，设定频段3000Hz，每间隔30秒启动超声探头，超声持续时间15秒，重复超声裂解步骤5次，使细胞内小分子活性肽全部释放出来。4℃低温15000g高速离心30分钟，去除组织匀浆液中未能被超声裂解所破碎的较大的杂质碎片，取清亮透明的上清液。上清液经超滤，控制流速20ml/min，过滤，截留大分子蛋白质。采用Amicon Ultra-15 超滤装置，配5k超滤膜，进行millipore离心超滤，回收超滤液，总体积仍有50ml左右，分装入15ml的无酶离心管中，置于真空冷冻浓缩机里，设定真空度为7.5，温度为0℃，冻干时间24小时，获得羊胚胎活性肽冻干粉约 50mg。

Claims (5)

1.一种羊胚胎活性肽的提取方法，依次包括下列步骤：（1）．取6～16周羊胚胎新鲜组织，切碎后加入生理盐水，经组织匀浆机匀浆；匀浆后快速冻融，即放入-20℃冰箱快速冷冻，30分钟后取出，放入40℃水浴箱中快速融解；（2）．超声裂解，每间隔30秒启动超声探头，超声持续时间15秒，重复3～5次；（3）．4℃低温高速离心30分钟，取上清液；（4）．将上清液用5k超滤膜离心超滤，澄清，得超滤液，即为羊胚胎活性肽溶液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤（4）后，对羊胚胎活性肽溶液低温冷冻干燥，获得羊胚胎活性肽冻干粉。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤（1）中所述匀浆后快速冻融过程重复1～2次。
4. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：在步骤（2）超声裂解时，超声频段设定为3000Hz。
5. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：在步骤（4）对上清液离心超滤时，控制流速为10～20ml/min。
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