CN103263484B - 一种苦荞麸皮的发酵方法及其发酵产物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种苦荞麸皮的发酵方法，包括如下步骤：（1）取苦荞麸皮，用70～90%（v/v）乙醇提取，提取液回收溶剂后，得粗提物；（2）取pH为6.8～7.2的YPD液体培养基，添加步骤（1）的粗提物，粗提物用量是培养基用量的1/5～1/20（w/w），混匀，接种活化的安琪甜酒曲、甜酒曲或黑曲霉，25～35℃发酵1～4d，即可。本发明还提供了前述发酵方法制得的发酵产物、发酵产物的制药用途，发酵产物与苦荞黄酮提取物在制备联合用药物的用途。本发明发酵方法制得的发酵产物中D-手性肌醇含量高，可用于治疗糖尿病，有较强的实际应用价值。

Description

一种苦荞麸皮的发酵方法及其发酵产物

技术领域

本发明涉及苦荞麸皮的发酵方法。

背景技术

D-手性肌醇，是一种水溶性肌醇（环己六醇）的离体异构体，存在于荞麦、绿豆、鹰嘴豆等豆类及一些南瓜属植物中。D-手性肌醇具有降血糖活性，被认为是新一代的胰岛素受体促敏剂，能够有效的降低血糖浓度，还具有降低血中胰岛素、血甘油三脂水平等功效。在正常人的血液和尿液中人们发现了D-手性肌醇的存在，而非胰岛素依赖型糖尿病人却没有发现这种物质的存在，其原因就是患者自身只能产生极少量的D-手性肌醇，使得机体对胰岛素不敏感，而抑制了人体组织摄取葡萄糖，导致血糖升高进而大大提高了患糖尿病的几率。有研究者以猕猴为研究对象做了相关的药效实验，结果表明了D-手性肌醇之所以有降低血糖的效果，并不是因为提高了胰岛素的产生，而是机体对胰岛素的敏感性增加了，大大促进了葡萄糖的摄取。

苦荞(Tartary buckwheat)是一种自花授粉的作物，为一年生的草本双子叶植物，含有丰富的营养成分。对荞麦籽粒的检测发现，其含有D-手性肌醇，但含量相对较低，用色谱法检测苦荞壳、麸皮、外层粉、内层粉样品中的D-手性肌醇含量分别为0.008%、0.294%、0.176%、0.041%。

勾秋芬等检测20种不同种类的苦荞粉的D-手性肌醇含量发现，这些苦荞中的D-手性肌醇的含量在0.14%-0.78%之间，同时，以酿酒酵母作为发酵菌种，采用发酵的方式处理苦荞粉，使得D-手性肌醇的含量从0.78%增加到1.82%（勾秋芬，“酿酒酵母发酵对苦荞中D-手性肌醇含量的影响”，[D]:[硕士学位论文].四川:四川师范大学,2009,4）。该方法虽有提高了苦荞的D-肌醇含量，但是含量仍然较低，不具有实际应用价值。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种新的发酵方法，还提供了发酵方法制得的发酵产物及其制药用途。

本发明苦荞麸皮的发酵方法，包括如下步骤：

（1）取苦荞麸皮，用70～90%（v/v）乙醇提取，提取液回收溶剂后，得粗提物；

（2）取pH为6.8～7.2的YPD液体培养基，添加步骤（1）的粗提物，粗提物用量是培养基用量的1/5～1/20（w/w），混匀，接种活化的安琪甜酒曲、甜酒曲或黑曲霉，25～35℃发酵1～4d，即可。

苦荞麸皮是指苦荞籽粒的麸皮。

步骤（1）中，所述乙醇的浓度为80%（v/v）。

步骤（1）中，乙醇提取的具体操作步骤如下：加入乙醇超声提取2～4次，每次用苦荞麸皮6～15倍量（w/v）乙醇，每次提取0.5～5h。

优选地，超声提取次数为2次，每次用苦荞麸皮10倍量（w/v）乙醇，每次提取0.5h。

步骤（2）中，YPD液体培养基的pH为7.0；粗体物用量是培养基用量的1/10（w/w）。

步骤（2）中，接种的菌种为安琪甜酒曲。

步骤（2）中，菌种的接种量为1%，发酵的温度为29℃，发酵的时间为2～3d。

本发明还提供了前述方法制备得到的苦荞麸皮发酵产物。

所述发酵产物，含有15.23%～17.51%（w/w）的D-手性肌醇。

优选地，所述发酵产物，含有17.51%（w/w）的D-手性肌醇。

本发明前述发酵产物在制备治疗糖尿病的药物中的用途。

本发明前述发酵产物与苦荞黄酮提取物在制备治疗糖尿病的联合用药物中的用途；

所述苦荞黄酮提取物按照如下方法制备：取苦荞苗，用60%（v/v）乙醇超声提取2次，每次用苦荞苗6倍量（w/v）乙醇，每次提取10min，提取液回收溶剂，即得。

所述发酵产物与苦荞黄酮提取物的重量配比为1：2～2：1。优选地，所述发酵产物与苦荞黄酮提取物的重量配比为2：1。

本发明还提供了一种治疗糖尿病的联合用药物，它包含不同规格的单位制剂，用于同时、分别或者一次给8～10任意一项发酵产物与苦荞黄酮提取物；所述苦荞黄酮提取物按照如下方法制备：取苦荞苗，用60%（v/v）乙醇超声提取2次，每次用苦荞苗6倍量（w/v）乙醇，每次提取10min，提取液回收溶剂，即得。

所述发酵产物与苦荞黄酮提取物的重量配比为1：2～2：1。

本发明方法制备的发酵产物中，D-手性肌醇的含量高达15.23%～17.51%，是天然苦荞麸皮中D-手性肌醇的含量的52～60倍，也显著高于现有发酵方法制备的苦荞发酵产物中D-手性肌醇的含量，可用于治疗糖尿病，具有良好的临床应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1不同菌种对D-手性肌醇含量的影响

图2正常小鼠急性降血糖值变化率示意图

图3糖尿病小鼠急性降糖效果

图4糖尿病小鼠急性血糖下降百分率示意图

图5糖尿病小鼠长期降糖效果

图6苦荞降糖成分对糖尿病小鼠长期血糖下降百分率的影响

图7糖尿病小鼠体重变化

图8对糖尿病小鼠耐糖量的影响

具体实施方式

1、实验材料 

（1）药物与试剂：

苦荞麸皮    四川西昌农科所提供

D-手性肌醇  美国sigma公司，纯度95％

无水乙醇、正丁醇、冰醋酸、高碘酸钠、联苯胺、蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、琼脂、NaOH以上为分析级；乙腈是色谱级。

（2）菌种：

安琪甜酒曲  购于超市（安琪酵母股份有限公司生产，生产标准号Q/YB20002S）。

甜酒曲      购于当地市场（四川省内江神州助剂厂生产）。

黑曲霉      四川理工学院提供（保藏号为ATCC16404）。

安琪甜酒曲的活化培养：将配置好的固体培养基进行高温高压灭菌,倒平板,平板凝固后待用。同时，取少量的安琪甜酒曲颗粒放入少量无菌水中进行溶解至膏状,用接种环挑取一环膏状安琪甜酒曲在平板上划线后放入温度为29℃的恒温培养箱中，培养2-3天，待用。

甜酒曲的活化培养：将配置好的固体培养基进行高温高压灭菌,倒平板,平板凝固后待用。民间用的甜酒曲是在自然环境中制得的曲种，原料为米粉或米糠、麸皮，还有一些填充料及辅料。先取少量的甜酒曲放入少量无菌水中进行溶解至膏状,用接种环挑取一环膏状甜酒曲在平板上划线后放入温度为29℃的恒温培养箱中，培养2-3天，待用。

（3）YPD液体培养基：

蛋白胨     2%

酵母膏     1%

葡萄糖     2%

用NaOH调pH值到6.8、7.0或7.2,高温高压灭菌后待用。

（4）仪器：

旋转蒸发仪(PE-52AA)        上海亚荣生化仪器厂

分光光度计(UV-1700)        日本岛津

精密电子天(ESJ-120-4)      辽宁沈阳龙腾电子

电热鼓风干燥（DHG-9240A）  成都天宇试验设备有限责任公司

分析电子天平(BP211D)       德国SARTORIUS

超声波清洗器（KQ3200B）    昆山市超声仪器有限公司

恒温水浴锅（B-260）        上海亚荣生化仪器厂

震荡培养箱                 上海申贤恒温设备厂

高效液相色谱仪（P680）     美国戴安

实施例1本发明发酵方法

Ⅰ、苦荞麸皮中D-手性肌醇提取 

苦荞麸皮的D-手性肌醇提取工艺流程：

准确称取苦荞麸皮粉50g，按照料液比为1:6（g/ml）的比例加入70%的乙醇，在25℃的温度下进行超声波提取5h，提取4次抽滤，弃去滤渣，然后将四次抽滤所得的滤液合并，旋转蒸发仪蒸去乙醇，浓缩后烘干得苦荞麸皮粗提物，放入冰箱待用。

Ⅱ、不同菌种接种于苦荞麸皮提取液

将已经活化的三种菌种（安琪甜酒曲、甜酒曲、黑曲霉）分别按1%的量接种于三支装有含苦荞麸皮粗提物的YPD液体培养基中，苦荞麸皮粗提物与YPD液体培养基的比值为1:5。在25℃的恒温摇床中进行发酵培养，培养1～4天。

实施例2本发明发酵方法

Ⅰ、苦荞麸皮中D-手性肌醇提取 

苦荞麸皮的D-手性肌醇提取工艺流程：

准确称取苦荞麸皮粉50g，按照料液比为1:15（g/ml）的比例加入90%的乙醇，在25℃的温度下进行超声波提取2h，提取3次抽滤，弃去滤渣，然 后将两次抽滤所得的滤液合并，旋转蒸发仪蒸去乙醇，浓缩后烘干得苦荞麸皮粗提物，放入冰箱待用。

Ⅱ、不同菌种接种于苦荞麸皮提取液

将已经活化的三种菌种（安琪甜酒曲、甜酒曲、黑曲霉）分别按1%的量接种于三支装有含苦荞麸皮粗提物的YPD液体培养基中，苦荞麸皮粗提物与YPD液体培养基的比值为1:20。在35℃的恒温摇床中进行发酵培养，培养1～4天。

实施例3本发明发酵方法

1、实验方法 

Ⅰ、苦荞麸皮中D-手性肌醇提取 

苦荞麸皮的D-手性肌醇提取工艺流程：

准确称取苦荞麸皮粉50g，按照料液比为1:10（g/ml）的比例加入80%的乙醇，在25℃的温度下进行超声波提取30min，抽滤，滤渣用上述的方法进行第2次提取，抽滤，弃去滤渣，然后将两次抽滤所得的滤液合并，旋转蒸发仪蒸去乙醇，浓缩后烘干得苦荞麸皮粗提物，放入冰箱待用。

Ⅱ、不同菌种接种于苦荞麸皮提取液

将已经活化的三种菌种（安琪甜酒曲、甜酒曲、黑曲霉）分别按1%的量接种于三支装有含苦荞麸皮粗提物的YPD液体培养基中，苦荞麸皮粗提物与YPD液体培养基的比值为1:10。在29℃的恒温摇床中进行发酵培养，从发酵24h后进行各发酵液的提取，每间隔24h提取一次，每次提取1ml，一共提取4次，即4d。测定不同菌种接种的苦荞麸皮中D-手性肌醇的含量变化，观察不同菌种发酵对D-手性肌醇含量的影响。

3、检测方法 

采用高效液相色谱法对D-手性肌醇标准品及苦荞麸皮粗提物和发酵产物中的D-手性肌醇进行含量的测定。仪器为岛津高效液相色谱仪的示差检测器（RID），将NH₂（250mm×4.6mm，5μm）作为色谱柱。

流动相：乙腈70%，超纯水30%；

柱温：25℃；

蒸发温度（Evaporator）：120；

雾化温度（Nebuliser）：90；

载气流速（Carrier flow）：0.9ml/min；

进样量：15.00μl。

4、实验结果 

实验结果如表1和图1所示：

表1不同菌种对D-手性肌醇含量的影响（%）

由表1和图1可以看出，本发明方法制备的发酵产物中，D-手性肌醇含量高达15.23%～17.51%，其中，以安琪甜酒曲发酵2天时，D-手性肌醇含量最高，为17.51%。

以下用实验例的方式说明本发明的有益效果：

实验例1本发明苦荞提取物的降血糖作用

1、材料

药物与试剂： 

苦荞麸皮                       四川西昌农科所提供

苦荞苗                         四川西昌农科所提供

糖尿乐胶囊                     吉林省东丰药业股份有限公司

四氧嘧啶（Alloxan，ALX）       美国sigma公司

火棉胶                         成都市长征生物试剂公司

动物普通饲料                   四川成都达硕公司

消炎药                         湖南科威制药有限公司

仪器：

精密电子天平(ESJ-120-4)        沈阳龙腾电子有限公司

旋转蒸发仪(PE-52AA)            上海亚荣生化仪器厂

血糖仪（博奥因BG-300）         山东基因司电子有限公司

实验动物： 

昆明种小鼠，雌雄各半，体重（20士2g），由四川成都达硕公司提供。

小鼠按5只一笼分笼饲养，雌雄混合，饲养室温22士1℃，湿度适中。饲养过程中，每24小时添加一次饲料，自由饮水。小鼠垫料为干燥木屑，其中，正常小鼠间隔2天换垫料一次，糖尿病模型小鼠一天更换一次垫料。

小鼠喂养普通动物饲料，由四川成都达硕公司提供。

实验药物： 

D-手性肌醇粗提物：

将苦荞麸皮粉200g按料液比1:10的比例加入80%的乙醇，在25℃温度下，进行超声波提取，过滤。滤渣按料液比1:10的比例加入80%的乙醇，同样条件下再进行超声提取，过滤，合并滤液。用旋转蒸发仪将滤液中的乙醇蒸发回收，浓缩到小体积，烘干即D-手性肌醇粗提物，冰箱保存待用。

本发明发酵产物（苦荞麸皮发酵产物）的制备：

取烘干后的D-手性肌醇粗提物15g按1:10的比例放入三角摇瓶的发酵液（YPD液体培养基）中，按照1%的比例接入活化的安琪甜酒曲，放入摇床，调温至29℃，摇床发酵24h。取出发酵液烘干，放入冰箱待用。

苦荞黄酮提取物（苦荞苗中粗黄酮）的制备：

取苦荞苗200g按料液比1:6的比例加入60%的乙醇，超声波提取10分钟，温度25℃，抽滤，滤渣按同样条件再加入60%的乙醇进行超声波提取，抽滤后将2次提取的滤液合并。用旋转蒸发仪将滤液中的乙醇回收并浓缩到小体积，烘干，放入冰箱待用。

2、动物药效试验

（1）试剂的配置

四氧嘧啶(ALX)：现配现用，用0.9%生理盐水配制成2%浓度的四氧嘧啶溶液。

配置试剂时应注意，因为四氧嘧啶溶液在室温情况下容易分解形成四氧嘧啶酸使其失去活性，而影响建模实验的效果，因此，应在临用前配置四氧嘧啶溶液，并放置于冰浴中。

（2）急性毒理试验

急性毒理试验是在药效试验前，将提取物按能溶解的最大浓度来配置成溶液，灌胃正常小鼠，测定小鼠的耐受性。将体重20士2g的正常小鼠随机分4组，5只/组，禁食24h，自由饮水。D-手性肌醇和黄酮分组均以上述分组方法为准。

根据灌胃小鼠的最大量为0.4ml，所能配置的苦荞麸皮发酵产物（D-手性肌醇）和苦荞苗粗提物（黄酮）的最大浓度为2000mg/ml和1000mg/ml。根据试验要求设定四个浓度梯度分别为：

苦荞麸皮发酵产物（D-手性肌醇）： 

2000mg/ml（20000mg/kg），1000mg/ml（10000mg/kg）                 500mg/ml（5000mg/kg），250mg/ml（2500mg/kg）

苦荞苗粗提物（黄酮）：

1000mg/ml（20000mg/kg），500mg/ml（10000mg/kg）                 250mg/ml（5000mg/kg），150mg/ml（3000mg/kg）

根据以上的各浓度进行小鼠灌胃，每天一次，连续七天。

（2）苦荞降糖成分对正常小鼠急性降糖效果的影响

小鼠分组及给药

将正常小鼠随机分6组，每组小鼠8只，分别为空白组（Normal control group；正常小鼠），模型对照组(Diabetes mellitus group；糖尿病小鼠不治疗)，阳性对照组（糖尿乐，0.3mg/kg）,高高剂量组，高低剂量组，低高剂量组，低低剂量组。根据人与动物剂量折算表，并且结合参考文献，本试验各复方组所配制的浓度设计如表2所示。

表2各复方组的配制浓度

分组后，用普通饲料适应性喂养各组小鼠约一周后，禁食24h，自由饮水，尾部取血，测定各组正常小鼠的空腹血糖值，即给药前空腹血糖值。然后空白组灌胃0.2ml蒸馏水；给药组即阳性对照组和4个复方组分别灌胃0.2ml药物。各组灌胃后2h测定其空腹血糖值，观察苦荞提取物对各组正常小鼠急性降血糖的效果。

（3）高血糖小鼠药效试验

ⅰ、糖尿病小鼠模型的制备

本实验将昆明种小鼠150只，体重20士2g，雌雄各半，一笼5只，随机分组。用普通饲料适应性喂养约一周后，留10只正常小鼠为空白组，其余的小鼠均禁食24h，自由饮水，每只小鼠按照180mg/kg的剂量腹腔一次性注射四氧嘧啶溶液制作小鼠模型，于7d后尾部取血，用血糖仪测空腹血糖，以血糖值>11mmol/L的小鼠纳入糖尿病模型。

ⅱ、小鼠分组及给药

本实验小鼠分组情况为：空白组（Normal control group,NC组；正常小鼠），模型对照组(Diabetes mellitus group,DM组；糖尿病小鼠不治疗)，阳性对照组（糖尿乐，0.3mg/kg）,高高剂量组，高低剂量组，低高剂量组，低低剂量组，共7组。每组小鼠10只，模型对照组和空白组每日灌胃一次0.2ml蒸馏水；给药组即阳性对照组和4个复方组每日灌胃一次0.2ml药物。本试验各复方组所配制的浓度如表1所示。

a、对糖尿病小鼠急性降糖效果的影响

各组小鼠灌胃给药第一天，先测定各组正常小鼠给药前的空腹血糖作为0h血糖值，灌胃给药后分别于2h测得其空腹血糖值，观察对糖尿病小鼠急性降糖效果的影响。

b、对糖尿病小鼠长期降糖效果的影响

各组小鼠在给药第一天灌胃前测定其空腹血糖值，然后给药相应剂量，连续灌胃21天。空腹24h后即第22天测定各组小鼠的空腹血糖值，观察对糖尿病小鼠长期降糖效果的影响。

血糖下降百分率的计算方法如下：

式中：a——给药前的血糖值；b——给药后的血糖值。

c、对糖尿病小鼠形态指标的影响

从小鼠建模前到灌胃第21天，分别记录各组小鼠的进食量、进水量、***量、活动情况、形体及毛色的变化，观察苦荞提取物对糖尿病小鼠形体指标的影响。

d、对糖尿病小鼠体重的影响

称取记录各组小鼠给药前的体重值，再分别在给药第7天，第14天，第21天称量小鼠的体重，观察对糖尿病小鼠体重变化的影响。

e、对糖尿病小鼠耐糖量的影响

各组小鼠在最后一天给药前禁食24h后尾部取血测定空腹血糖值，作为糖耐量实验的0时血糖，然后给各组小鼠灌胃，40min后，经口给予各组小鼠剂量为2.0g/kg的葡萄糖，用血糖仪测定给葡萄糖后0.5h、1h、2h的血糖值，计算血糖曲线下面积的变化，观察苦荞提取物对糖尿病小鼠糖耐量的影响。

血糖曲线下面积的计算方法如下：

$\mathrm{AUC}\backslash (\mathrm{mmol}/L)=\frac{0.5A+B+C+0.5D}{2}$

式中A、B、C、D分别是给药后0、0.5、1.0、2.0h的血糖值。

（4）数据分析

本实验的数据经统计学的方差分析处理后用x±s表示，各组之间的差异用t检验。

3、结果与讨论 

（1）苦荞降糖成分的制备结果

苦荞苗粗提物得率为8.26%，其中黄酮的含量为29.43%，苦荞麸皮粗提物得率为8.66%，将苦荞麸皮粗提物发酵后发酵产物中的D-手性肌醇的含量为17.51%，将苦荞2种降糖成分按照高高，高低，低高和低低剂量分组，制备出苦荞苗粗提物和苦荞麸皮发酵产物所需量（见表3）。

表3苦荞提取物的制备

（2）急性毒理试验

灌胃苦荞麸皮提取发酵产物（D-手性肌醇）和苦荞苗粗提物（黄酮）给小鼠，7天后观察得知，小鼠均无死亡情况，但小鼠都有进食量也减少，活动能力减弱的症状产生，参考急性毒性（LD50值）剂量分级表可知本试验灌胃剂量远大于5000mg/kg，说明苦荞两种提取物实际无毒。

（3）苦荞降糖成分对正常小鼠急性降糖效果的影响

本次试验经不同剂量的苦荞提取物混合液灌胃正常小鼠，检测对正常小鼠急性降血糖变化的影响。根据图2可知，空白组的小鼠血糖值是线性下降的，而阳性对照组在0-4h期间血糖值下降较快，4h以后就基本趋于稳定，到6h时才略有上升，这与空白组相比较差异显著，其原因可能是因为药物代谢完全，导致血糖的轻微上升；而灌胃高高剂量组和高低剂量组的小鼠，其血糖下降百分率与空白组比较较接近。

表4苦荞降糖成分对正常小鼠急性降血糖值的影响

注：与空白组相比，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，给药前是给药前的空腹血糖值，给药后是给药后的空腹血糖值。

由表4的数据归纳得知，各实验组与空白组之间的差异都没有显著性(P>0．05)，由此说明了苦荞提取物混合液对正常小鼠的血糖值没有太大影响，可忽略不计。

（4）对糖尿病小鼠急性降糖效果的影响

根据图3的柱型变化所示，灌胃阳性药物糖尿乐和苦荞提取物混合液后，在短时间内，各组糖尿病小鼠空腹血糖都有不同程度的下降。由图4的血糖 下降百分率柱型图所示，阳性对照组的柱型最高，即灌胃阳性药物的糖尿病小鼠在短时间内的空腹血糖下降百分率最大，随后是高低剂量组、高高剂量组、低高剂量组，而柱型最低的是低低剂量组，各组小鼠的血糖下降百分率依次是24.06%、18.77%、17.6%、13.57%、4.54%（见表5）。

表5苦荞降糖成分对糖尿病小鼠急性降糖效果的影响

注：与模型对照组相比，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，0h是指建模成功后给药前的空腹血糖值，2h是指给药2h后的空腹血糖值。

根据图表综合分析，阳性对照组的糖尿病小鼠短时间内空腹血糖显著降低，表明糖尿乐具有非常显著的急性降血糖作用；灌胃高高剂量组，高低剂量组和低高剂量组后，小鼠的空腹血糖下降效果明显（P<0．01），其中以高低剂量组的效果最好；而灌胃低低剂量组对糖尿病小鼠有一定的降糖作用（P<0．05）。实验说明，本发明发酵产物与黄酮提取物联用可以具有降糖作用，其中，以高低剂量组急性降血糖效果最优。

（5）苦荞降糖成分对糖尿病小鼠长期降糖效果的影响

建立小鼠糖尿病模型后，各小鼠的空腹血糖值均有明显的升高，说明了本试验糖尿病小鼠造模成功。根据图5的柱型变化所知，在给药不同组小鼠进行治疗后，模型对照组小鼠的空腹血糖值仍然维持着较高水平，而阳性对照组和各试验组小鼠的血糖值都有不同程度的下降。由图6的糖尿病小鼠血糖下降百分率柱型图所示，阳性对照组的柱型最高，即长期灌胃阳性药物对糖尿病小鼠的空腹血糖下降百分率最大，然后是高低剂量组、高高剂量组、低高剂量组，而低低剂量组所表示的柱型最低，各组小鼠的空腹血糖下降百分率依次是48.55%、41.88%、40.81%、35.68%、29.07%（见表6）。

表6苦荞降糖成分对糖尿病小鼠长期降糖效果的影响

注：与模型对照相比，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，给药前是指建模成功后给药前的空腹血糖值，给药后是指最后一次给药后的空腹血糖值

根据图表综合分析，阳性对照组长期治疗糖尿病小鼠，其空腹血糖显著降低，表明长期灌胃糖尿乐对糖尿病小鼠具有非常显著的降血糖作用；长期灌胃不同剂量的试验组后，小鼠的空腹血糖下降效果明显（P<0．01），其中以高低剂量组的效果最好；而灌胃低低剂量组的降糖效果相对较差。由以上分析可得知，除阳性对照组外，长期灌胃高高剂量组和高低剂量组均可以取得良好的降血糖效果，根据对实验的总体评价，高低剂量组优先。

实验说明，本发明发酵产物与黄酮提取物联用可以具有降糖作用，其中，以高低剂量组急性降血糖效果最优。

（6）苦荞降糖成分对糖尿病小鼠形态指标的影响

参考文献可知，“三多一少”为糖尿病比较典型的症状，糖尿病模型小鼠也有相应症状发生。“三多”即进食量的增多，喝水量的增多和排尿次数的增多;而“一少”则是体重的减少。我们以此为依据观察记录了糖尿病小鼠在不同药物的长期作用下所表现出的症状。

由表7得知，空白组即正常小鼠的各方面指标均表现正常，各组高血糖小鼠在日常生活与形态变化较正常小鼠有很明显得差异。就进食量而言，每只空白组小鼠每一天的进食量随着时间的延长表现为稳定上升的趋势，一周后空白组的每只小鼠进食量在5g/天左右；其余各组小鼠的进食量在高血糖模型建立成功后1-4天均逐渐减少，每只糖尿病小鼠的进食量约为2g/天，但随着给药时间的增加，各组糖尿病小鼠进食量有缓慢回升的趋势，并且逐渐超过了正常组小鼠，随后一段时间，各组高血糖小鼠进食量又有缓慢的回落。就进水量而言，正常小鼠进水量每只约为10ml/天，其余各组小鼠的进水量远远超过了正常小鼠，最高能达到20ml/只/天。就***量而言，空白组每笼 换垫料频率平均3天一次，而其余各组高血糖小鼠更换垫料则为一天一次，可见高血糖小鼠的***量较正常小鼠大。

表7苦荞提取物对糖尿病小鼠形态指标的影响

（7）苦荞降糖成分对糖尿病小鼠体重的影响

根据表8可以知道，空白组小鼠体重增加较明显，体重从建模前的24.31g增加到27.52g,体重增加了3.21g；图7形象清楚的表现出了在整个给药期间，各组小鼠的体重变化的情况，其中，四氧嘧啶所致糖尿病小鼠在模型建造成功后到灌胃第七天，各组的体重均有比较显著的下降。第七天到第十四天灌胃期间除了模型对照组以外，阳性对照组、高高对照组、高低对照组、低高对照组和低低对照组小鼠的体重都有不同程度的增加；而在第十四天后继续给药，模型对照组小鼠的体重从第十四天的17.02g逐渐回升到了19.51。空白组、阳性对照组和四个试验组的小鼠体重继续增长，最终其增加的幅度均大于模型对照组。

表8苦荞提取物对糖尿病小鼠体重（g）的影响

结果说明，实验说明，本发明发酵产物与黄酮提取物联用可以增加体重。

（8）苦荞降糖成分对糖尿病小鼠耐糖量的影响

分析图8可得知，高高剂量组、高低剂量组、低高剂量组和低低剂量组都有不同程度的降低葡萄糖负荷以后各组糖尿病小鼠的血糖，其中以高低剂量组的作用效果最好。在葡萄糖负荷0h-0.5h期间，高高剂量组、高低剂量组、低高剂量组和低低剂量组的糖尿病小鼠的血糖值都有所上升；而到了负荷1h时，各试验组的小鼠血糖都有不同程度的下降。由表9中的数据分析可知，血糖曲线下面积最大的是模型对照组，达38.32；而最小的为空白组，仅有13.6；由此可推断血糖曲线面积越大，其降糖效果越不理想，反之，血糖曲线面积越小的剂量组的降血糖作用越显著；因此，从表中数据可知，高低剂量组的血糖曲线面积较其他几个剂量组都小，为25.19；其次是高高剂量组为25.89，低高剂量组为26.02及低低剂量组为31.71。各组的面积大小与模型对照组相比较都有显著得差异（P<0.01），而与阳性对照组的差异则相对较小，表明了高高剂量组、高低剂量组、低高剂量组和低低剂量组都可以较明显的提高四氧嘧啶致糖尿病小鼠的葡萄糖耐受量的水平，其中高低剂量组的效果最显著。

表9苦荞提取物对糖尿病小鼠耐糖量的影响

注：与模型对照组相比，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01

结果说明，实验说明，本发明发酵产物与黄酮提取物联用可以提高葡萄糖耐受水平。

综上，本发明方法制得的发酵产物中，D-手性肌醇含量高达15.23%～17.51%，显著优于现有方法制备苦荞发酵产物，将发酵产物与苦荞黄酮提取物联用，具有非常优良的急性降糖作用和长期降糖作用，能够缓解糖尿病的症状，提高葡萄糖耐受水平，应用前景非常良好。

Claims (12)

1.一种苦荞麸皮的发酵方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)取苦荞麸皮，用70～90％v/v乙醇提取，提取液回收溶剂后，得粗提物；

(2)取pH为6.8～7.2的YPD液体培养基，添加步骤(1)的粗提物，粗提物用量是培养基用量的1/5～1/20w/w，混匀，接种活化的安琪甜酒曲、甜酒曲或黑曲霉，25～35℃发酵1～4d，得发酵液，烘干，即可；

步骤(1)中，乙醇提取的具体操作步骤如下：加入乙醇超声提取2～4次，每次用苦荞麸皮6～15倍量w/v乙醇，每次提取0.5～5h；

步骤(2)中，YPD液体培养基的pH为7.0；粗体物用量是培养基用量的1/10w/w；

步骤(2)中，接种的菌种为安琪甜酒曲；

步骤(2)中，菌种的接种量为1％，发酵的温度为29℃，发酵的时间为2～3d。

2.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于：步骤(1)中，所述乙醇的浓度为80％v/v。

3.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于：所述超声提取次数为2次，每次用苦荞麸皮10倍量w/v乙醇，每次提取0.5h。

4.权利要求1～3任意一项方法制备得到的苦荞麸皮发酵产物。

5.根据权利要求4所述的发酵产物，其特征在于：它含有15.23％～17.51％w/w的D-手性肌醇。

6.根据权利要求5所述的发酵产物，其特征在于：它含有17.51％w/w的D-手性肌醇。

7.权利要求4～6任意一项发酵产物在制备治疗糖尿病的药物中的用途。

8.权利要求4～6任意一项发酵产物与苦荞黄酮提取物在制备治疗糖尿病的联合用药物中的用途；

所述苦荞黄酮提取物按照如下方法制备：取苦荞苗，用60％v/v乙醇超声提取2次，每次用苦荞苗6倍量w/v乙醇，每次提取10min，提取液回收溶剂，即得。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述发酵产物与苦荞黄酮提取物的重量配比为1：2～2：1。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述发酵产物与苦荞黄酮提取物的重量配比为2：1。

11.一种治疗糖尿病的联合用药物，其特征在于：它包含不同规格的单位制剂，用于同时、分别或者一次给4～6任意一项发酵产物与苦荞黄酮提取物；所述苦荞黄酮提取物按照如下方法制备：取苦荞苗，用60％v/v乙醇超声提取2次，每次用苦荞苗6倍量w/v乙醇，每次提取10min，提取液回收溶剂，即得。

12.根据权利要求11所述的联合用药物，其特征在于：所述发酵产物与苦荞黄酮提取物的重量配比为1：2～2：1。