CN103263466A - 一种化香果序高分子量单宁的制备方法及其抗菌活性 - Google Patents

一种化香果序高分子量单宁的制备方法及其抗菌活性 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种化香树果序高分子量单宁（HMWT）的制备方法及其抗菌活性测定。先将化香树果序粉碎，以纯水为提取溶剂，将料液比为1g:(6-8)mL的化香树果序和水于70-80℃水浴提取，过滤，滤液冷却后静置过夜沉淀，取上清液，得化香果单宁粗提液，粗提液经55℃减压浓缩至原体积的四分之一，浓缩液上D101大孔吸附树脂，用水洗去杂质，再分别用10%-30%甲醇、甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，再经过冷冻干燥分别得到化香果序低分子量单宁和高分子量单宁部分。本发明提取温度较低、时间短能耗小，使用大孔吸附树脂分离提纯，所得化香果序高分子量单宁具有良好的水溶性，凝胶渗透色谱（GPC）分析表明其分子量分布范围为0.5×103～5.4×103。抗菌活性测定表明化香果序高分子量单宁部分对金黄色葡萄球菌(G+)、枯草芽孢杆菌(G+)、大肠杆菌（G-）、黑曲霉（真菌）均有很好的抑制作用。

Description

一种化香果序高分子量单宁的制备方法及其抗菌活性
技术领域
本发明涉及一种植物活性成分提取物及制备方法，特别涉及一种抗菌活性的化香果序高分子量单宁及其制备方法。
背景技术
化香树果序为胡桃科植物化香树（Plotytarya strohilacea Sieb et Zuce）的果序，果序球果状，卵状椭圆形至长椭圆状圆柱形，长2.5-5 cm，直径2-3 cm，包片宿存，大质，褐色；小坚果扁平，两侧具狭翅。种子卵形，种皮膜质。我国西北、华东、华中、华南等地均出产。化香树在我国民间的应用广且历史悠久，多以叶、果序入药。化香树果序具有清热解毒．散风止痛，活血化瘀、通窍排脓的功效，主要用于鼻渊、头痛、内伤胸胀、腹痛、筋骨疼痛、痈肿、疥癣等病症。
化香树果序的研究工作起步晚，对其化学成分研究较少。国外文献中有关化香树树种及生长方面的研究较多，而有关化香树有效成分的研究报道则较少。有关化香树成分提取的研究，多采用醇等有机溶剂从其叶子、木材、树皮中提取，对化香树果序化学成分的研究则少见报道。Tanaka 等（1993）对化香果果实和树皮中的鞣质成分进行了研究，从化香果果实和树皮中分离得到 5 个新的鞣花单宁化合物。高蓉（2009）对化香树果序中总酚和总黄酮类活性成分进行了提取、分离纯化，得到了一条理想的化香树果序中总酚和总黄酮提取的工艺路线和优化的工艺条件。并通过对几种代表性的鼻窦炎、鼻炎主要感染菌金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌和铜绿假单胞菌的体外抑菌试验表明，化香树果序中的总酚和总黄酮是主要的有效成分，二者均具有较强的抑菌作用。冯辉明（1989）等人从化香果丙酮水提取物中分离鉴定了4 种化合物，分别为鞣花酸、没食子酸、英国栎鞣花素（pedunculagin）和木麻黄鞣亭（casuarictin）。陈奎（2008）通过萃取、硅胶柱色谱、结晶重结晶等手段从化香树果序中分离鉴定了 5 个化合物，分别为没食子酸、鞣花酸、槲皮素、3,3′-二甲氧基鞣花酸和3,3′-二甲氧基鞣花酸葡萄糖苷。
化香果序中含有较丰富的植物单宁。化香果单宁属于鞣花单宁，其所具有的特殊的生物学和药理学活性是其药用价值的基础。因此，开展化香果序单宁成分的提取制备和生物活性研究，对更好的开发利用化香果序资源，具有重要的指导意义。已知的国内外文献对化香果序提取物及药理活性的研究，多集中在化香树及其果序提取物对细胞毒性、肠道内有害菌的抑制作用、抗氧化作用、预防癌症和抗衰老作用，以及化香树作为复方中药治疗急慢性鼻炎、鼻窦炎的报道，但未见关于化香树果序单宁成分的提取工艺及生物活性的研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种化香果序高分子量单宁提取物（HMWT）及一种利用大孔吸附树脂制备化香果序高分子量单宁（HMWT）的制备方法。
本发明的实现过程如下：
化香果序高分子量单宁提取物，通过以下步骤制备得到：
（1）    将化香树果序粉碎，粉碎成粒径为3-5 mm；
（2）    以纯水为提取溶剂，将料液比为1g:(6-8)mL的化香树果序和水于70-80℃水浴提取，提取时间为1 h，提取次数为2次，合并提取液；
（3）    提取液过滤，滤液冷却后静置过夜沉淀，取上清液，得化香果单宁粗提液；
（4）    粗提液经55℃减压浓缩至原体积的四分之一，单宁粗提液树脂上样流速为2-4 BV/h，上样后静置1 h充分吸附。在流速为3-5 BV/h的条件下先用3-5 BV的水洗去杂质，再分别用3-5 BV的10%-30%甲醇溶液、甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，45℃下减压蒸发，除去甲醇溶剂，水相冷冻干燥，10%-30%甲醇溶液洗脱部分得到化香果序低分子量单宁（LMWT），纯甲醇溶液洗脱部分得到高分子量单宁（HMWT）；
（5）    所得高分子量单宁（HMWT）经凝胶渗透色谱（GPC）分析测定其分子量分布范围为0.5×103～5.4×103。
本发明制备得到的化香果序高分子量单宁（HMWT）根据《抗菌药物敏感性试验执行标准：第十八版信息增刊M100-S18》的标准方法，对所制备得到的化香果序高分子量单宁抑菌活性进行测定。
本发明的效果及优点：本发明提取工艺简单，可操作性强，以水为提取溶剂，经济、绿色、环保、安全，使用大孔吸附树脂分离提纯，所制备得到的化香果序高分子量单宁（HMWT）经凝胶渗透色谱（GPC）分析测定其分子量分布范围为0.5×103～5.4×103。化香果序高分子量单宁（HMWT）对黄色葡萄球菌(G+)、枯草芽孢杆菌(G+)、大肠杆菌（G-）、黑曲霉（真菌）具有良好的抑制效果。
附图说明
图1是化香果序高分子量单宁（HWMT）高效液相色谱图，280 nm波长下检测；
图2是化香果序高分子量单宁（HWMT）的凝胶渗透色谱图；
图3是化香果序高分子量单宁（HWMT）的分子量分布图。
具体实施方式
本具体实施例仅是对发明的解释，并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可根据需要对本实施例作出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
实施例1：
将阴干至水分为13.2%的化香果序原料80 g，用水洗净，除去杂物及泥沙，沥干残水，粉碎至3-5 mm。加入500 mL纯水溶液在80℃水浴中提取1 h，将提取液过滤进行固液分离，重复提取两次，弃去废渣，合并提取液。将滤液冷却静置过夜沉降，弃去沉淀，保留上清液。粗提液经60℃减压浓缩至原体积的四分之一，浓缩液在上样液流速为3BV/h下，经D101大孔吸附树脂吸附。上样后静置1 h使其充分吸附。在流速为3BV/h的条件下先用5BV的水洗去杂质，再分别用5 BV的30%甲醇及3 BV甲醇溶液洗脱，分别收集洗脱液，45℃下减压蒸发，除去甲醇溶剂，水相冻干分别得到化香果序低分子量单宁（LMWT）1.865 g和高分子量单宁（HMWT）2.62 g（见图1）。
所制备得到的化香果序高分子量单宁（HMWT-1）经凝胶渗透色谱（GPC）分析测定其分子量分布范围为1.3×103～3.6×103（见图2、图3），数均分子量（M n）和重均分子量（M w）分别为1842和1933。根据《抗菌药物敏感性试验执行标准：第十八版信息增刊M100-S18》的标准方法，对黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、黑曲霉（真菌）的抑菌情况进行检测，结果表明化香果序高分子量单宁（HMWT-1）对黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、黑曲霉（真菌）的最小抑菌浓度分别为12.50，50.00，3.125，25.00 mg/mL。
实施例2：
将阴干至水分为13.2%的化香果序原料90 g，用水洗净，除去杂物及泥沙，沥干残水，粉碎至3-5 mm。加入600 mL纯水溶液在80℃水浴中提取１h，将提取液过滤进行固液分离，重复提取两次，弃去固体，合并提取液。将滤液冷却静置过夜沉降，弃去沉淀，保留上清液。粗提液经55℃减压浓缩至原体积的四分之一，浓缩液在上样液流速为3 BV/h下，经D101大孔吸附树脂吸附。上样后静置1 h使其充分吸附。在流速为3 BV/h的条件下先用3 BV的水洗去杂质，再分别用3 BV的10%甲醇及3 BV甲醇溶液洗脱，分别收集洗脱液，45℃下减压蒸发，除去甲醇溶剂，水相冷冻干燥分别得到化香果序低分子量单宁（LMWT）1.45 g和高分子量单宁（HMWT）5.7 g。
所制备得到的化香果序高分子量单宁（HMWT-2）经凝胶渗透色谱（GPC）分析测定其分子量分布范围为0.9×103～3.4×103，数均分子量（M n）和重均分子量（M w）分别为1454和1587。根据《抗菌药物敏感性试验执行标准：第十八版信息增刊M100-S18》的标准方法，对黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、黑曲霉（真菌）的抑菌情况检测结果为：化香果序高分子量单宁（HMWT-2）对黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、黑曲霉（真菌）的最小抑菌浓度分别为1.563，6.25，1.563，25.00 mg/mL。
实施例3：
将阴干至水分为13.2%的化香果序原料50 g，用水洗净，除去杂物及泥沙，沥干残水，粉碎至3-5 mm。加入400 mL纯水溶液在80℃水浴中提取１h，将提取液过滤进行固液分离，重复提取两次，弃去固体，合并提取液。将滤液冷却静置过夜沉降，弃去沉淀，保留上清液。粗提液经55℃减压浓缩至原体积的四分之一，浓缩液在上样液流速为3 BV/h下，经D101大孔吸附树脂吸附。上样后静置1 h使其充分吸附。在流速为5 BV/h的条件下先用3BV的水洗去杂质，再分别用3 BV的15%甲醇及3 BV甲醇溶液洗脱，分别收集洗脱液，45℃下减压蒸发，除去甲醇溶剂，水相冷冻干燥分别得到化香果序低分子量单宁（LMWT）1.58 g和高分子量单宁（HMWT）3.8 g。
所制备得到的化香果序高分子量单宁（HMWT-3）经凝胶渗透色谱（GPC）分析测定其分子量分布范围为0.5×103～2.9×103，数均分子量（M n）和重均分子量（M w）分别为1062和1244。根据《抗菌药物敏感性试验执行标准：第十八版信息增刊M100-S18》的标准方法，对黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、黑曲霉（真菌）的抑菌情况检测结果为：化香果序高分子量单宁（HMWT-3）对黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、黑曲霉（真菌）的最小抑菌浓度分别为3.125，12.50，0.780，25.00 mg/mL。
实施例4：
将阴干至水分为13.2%的化香果序原料80 g，用水洗净，除去杂物及泥沙，沥干残水，粉碎至3-5 mm。加入500 mL纯水溶液在80℃水浴中提取１h，将提取液过滤进行固液分离，重复提取两次，弃去固体，合并提取液。将滤液冷却静置过夜沉降，弃去沉淀，保留上清液。粗提液经55℃减压浓缩至原体积的四分之一，浓缩液在上样液流速为5 BV/h下，经AB-8大孔吸附树脂吸附。上样后静置1 h使其充分吸附。在流速为5 BV/h的条件下先用3 BV的水洗去杂质，再分别用5 BV的10%甲醇及3 BV甲醇溶液洗脱，分别收集洗脱液，45℃下减压蒸发，除去甲醇溶剂，水相冷冻干燥分别得到化香果序低分子量单宁（LMWT）0.98 g和高分子量单宁（HMWT）4.69 g。
所制备得到的化香果序高分子量单宁（HMWT-4）经凝胶渗透色谱（GPC）分析测定其分子量分布范围为0.5×103～5.4×103，数均分子量（M n）和重均分子量（M w）分别为1096和1380。根据《抗菌药物敏感性试验执行标准：第十八版信息增刊M100-S18》的标准方法，对黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、黑曲霉（真菌）的抑菌情况检测结果为：化香果序高分子量单宁（HMWT-4）对黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、黑曲霉（真菌）的最小抑菌浓度分别为12.50，12.50，0.780，50.00 mg/mL。
实施例5：
将阴干至水分为13.2%的化香果序原料80 g，用水洗净，除去杂物及泥沙，沥干残水，粉碎至3-5 mm。加入500 mL纯水溶液在80℃水浴中提取１h，将提取液过滤进行固液分离，重复提取两次，弃去固体，合并提取液。将滤液冷却静置过夜沉降，弃去沉淀，保留上清液。粗提液经55℃减压浓缩至原体积的四分之一，浓缩液在上样液流速为5 BV/h下，经NKA-9大孔吸附树脂吸附。上样后静置1 h使其充分吸附。在流速为5 BV/h的条件下先用5BV的水洗去杂质，再分别用5 BV的10%甲醇及3 BV甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，45℃下减压蒸发，除去甲醇溶剂，水相冻干得到化香果序低分子量单宁（LMWT）1.45 g和高分子量单宁（HMWT）3.552 g。
所制备得到的化香果序高分子量单宁（HMWT-5）经凝胶渗透色谱（GPC）分析测定其分子量分布范围为0.6×103～4.8×103，数均分子量（M n）和重均分子量（M w）分别为1275和1545。根据《抗菌药物敏感性试验执行标准：第十八版信息增刊M100-S18》的标准方法，对黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、黑曲霉（真菌）的抑菌情况检测结果为：化香果序高分子量单宁（HMWT-5）对黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、黑曲霉（真菌）的最小抑菌浓度分别为1.563，6.25，1.563，25.00 mg/mL。

Claims (5)

1.一种化香树果序高分子量单宁的制备方法，其特征在于通过以下步骤制备得到：
将化香树果序粉碎；
以纯水为提取溶剂，将料液比为1g:(6-8)mL的化香树果序和水于70-80℃水浴提取；
提取液过滤，滤液冷却后静置过夜沉淀，取上清液，得化香果单宁粗提液；
粗提液50-60℃减压浓缩至原体积的四分之一；
提取液经大孔吸附树脂吸附，用水洗去杂质，再分别用10%-30%甲醇溶液、纯甲醇溶液洗脱，收集洗脱液；
洗脱液45-60℃下减压蒸发，除去甲醇溶剂，水相冷冻干燥分别得到化香果序低分子量单宁（LMWT）和高分子量单宁（HMWT）。
2.根据权利要求1所述的一种化香树果序高分子量单宁的制备方法，其特征在于：
步骤（1）中化香树果序粉碎成粒径为3-5 mm；
步骤（2）中以纯水为提取溶剂，将料液比为1g:(6-8)mL的化香树果序和水于70-80℃水浴提取，提取时间为1 h，提取次数为2次；
步骤（5）单宁粗提液大孔吸附树脂上样流速为2-4 BV/h，上样后静置1 h充分吸附。
3.在流速为3-5 BV/h的条件下先用3-5 BV的水洗去杂质，再分别用3-5 BV的10%-30%甲醇溶液、甲醇溶液洗脱，收集洗脱液；
步骤（6）冷冻干燥分别得到的化香果序低分子量单宁（LMWT）为10%-30%甲醇溶液洗脱部分，高分子量单宁（HMWT）为纯甲醇洗脱部分。
4.权利要求1所述的一种化香树果序高分子量单宁的制备方法，所制备得到的化香树果序高分子量单宁（HMWT）分子量分布范围为0.5×103～5.4×103。
5.权利要求1所述的化香树果序高分子量单宁（HMWT）对黄色葡萄球菌(G+)、枯草芽孢杆菌(G+)、大肠杆菌（G-）、黑曲霉（真菌）有很好的抑菌活性。
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