CN103255219A - 一种鉴别黑龙江流域野生翘嘴鳜的微卫星标记方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴别黑龙江流域野生翘嘴鳜的微卫星标记方法，包括翘嘴鳜基因组DNA的提取、DNA片段扩增、PCR产物的电泳及银染色等步骤，如样品在靠近标准图谱230bp位置扩增出1条或2条特异性DNA条带，则鉴定为是黑龙江野生翘嘴鳜群体；如样品在靠近标准图谱80bp位置扩增出1条特异性条带，则鉴定为是其他野生翘嘴鳜群体。本发明操作简单快捷，能够提高对黑龙江流域野生翘嘴鳜鉴定的效率和准确性，从而对该流域的野生翘嘴鳜群体的种质资源保护具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于水产养殖中野生群体鉴定技术领域，具体涉及一种鉴别黑龙江流域野生翘嘴鳜的微卫星标记方法。
技术背景
翘嘴鳜(Simiperca chuatisi)俗称桂花鱼，属鲈形目鲈亚目暖鲈科。具有生长快，肉质鲜美，少细刺，富含人体必需的氨基酸，脂肪含量低等特点，广泛分布于中国各主要江河湖泊的淡水名贵鱼类。除青藏高原以外的各大水系均有分布，以长江流域各江河湖泊分布最为丰富。
黑龙江水系是中国最北部的水系，虽没有长江水系发达，黑龙江仍是世界上渔业资源最丰富、鱼的种类最多的河流之一。主要鱼类有大马哈鱼（即鲑鱼）、鳌花鱼以及鲟、鳇、鲤、鲶等100多种。黑龙江鳜鱼主要分布于黑龙江、松花江水系，是黑龙江省名优鱼类“三花五罗”之一。
微卫星(Microsatellite)是广泛存在于真核生物基因组中的以几个核苷酸（一般为1-6bp）为重复单位所组成的简单串联重复 DNA 序列。微卫星由于其高度多态、共显性、PCR 检测方便、含量丰富、分布相对较均匀等特点，而被广泛的应用在群体鉴定、群体遗传学、遗传图谱的构建、QTL 作图和分子标记辅助育种等方面。目前，尚没有采用微卫星分子标记技术对黑龙江流域翘嘴鳜野生群体进行快速简洁的鉴别方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快捷准确、简便有效的鉴别黑龙江流域野生翘嘴鳜的微卫星标记方法。
上述目的是通过以下技术方案实现的：
一种鉴别黑龙江流域野生翘嘴鳜的微卫星标记方法，包括以下步骤：
1）DNA提取：采用基因组DNA提取试剂盒提取翘嘴鳜基因组DNA，并测定其纯度和浓度，取A260/A280值为1.6~2，浓度为300~3000ng/μl的基因组DNA进行扩增；
2）DNA片段扩增：采用聚合酶链式反应扩增DNA片段，PCR反应的一对引物序列为：
正向引物：5’ AGACCAGGTTATCCCAGT 3’，
反向引物：5’ CAGAAGGAACAGAAGAGC 3’；
3）PCR产物的电泳及银染色鉴定：采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，进行银染色，显影后拍照并记录电泳结果；
4）与标准图谱进行对比：与标准图谱对比，读出待测样品的目的条带所处的位置，如样品在靠近标准图谱230bp位置扩增出1条或2条特异性DNA条带，则鉴定为是黑龙江野生翘嘴鳜群体；如样品在靠近标准图谱80bp位置扩增出1条特异性条带，则鉴定为是其他野生翘嘴鳜群体。
优选的：步骤1）中所提取的基因组DNA的A260/A280值为1.8~1.9。
优选的：步骤1）中所提取的基因组DNA的浓度为1000~2000ng/μl。
其中，步骤2）中的PCR反应体系为：
其中，步骤2）中所述的PCR反应的程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸30s，30个循环；循环结束后72℃延伸10min，将产物4℃中保存。
其中，步骤3）中所述非变性聚丙烯酰胺凝胶的质量浓度为8%。
本发明的有益效果是：
本发明是用于鉴别黑龙江流域野生翘嘴鳜群体的一种分子鉴定方法，操作简单快捷，能够提高对黑龙江流域野生翘嘴鳜鉴定的效率和准确性，从而对该流域的野生翘嘴鳜群体进行种质资源的保护。
附图说明
图1：为野生翘嘴鳜群体PCR扩增的微卫星带谱，从左至右依次为沅江流域野生群体，赣江流域野生群体，陆水水库野生群体，黑龙江流域野生群体。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种鉴别黑龙江流域野生翘嘴鳜的微卫星标记方法，包括以下步骤：
1）DNA提取：
采用TIANGEN血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取翘嘴鳜基因组DNA。1.2%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测DNA的纯度和浓度，取A260/A280值为1.8~1.9，浓度为1000~2000ng/μl的基因组DNA进行扩增。
所述的翘嘴鳜样品选自黑龙江野生群体，陆水水库野生群体，赣江野生群体，沅江野生群体，每个野生群体随机选取18个样品，同一群体中每2个样品提取DNA后取相同体积做为1个混合模板。
2）DNA片段扩增：
采用聚合酶链式反应，以下为PCR反应的相关信息：
用于PCR反应的一对引物名称为MDJ，序列为：
正向引物：5’ AGACCAGGTTATCCCAGT 3’，
反向引物：5’ CAGAAGGAACAGAAGAGC 3’；
PCR反应体系如下：
PCR的反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸30s，30个循环；循环结束后72℃延伸10min，将产物4℃中保存；
3）PCR产物的电泳及银染色鉴定：
制胶：8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶。
电泳：每个产物上样3μl，同时点上标准酶切片段作为分子量标记对比，用1×TBE电泳缓冲液，120V恒压电泳，电泳蓝色染料至凝胶低端终止。
银染色：染色过程如下：蒸馏水漂洗两次，0.1%硝酸银染色10min，蒸馏水快速漂洗2次（时间控制在15s以内），2%的无水氢氧化钠和0.04%碳酸钠的甲醛显影，显影在10min时将聚丙烯酰胺凝胶放入凝胶成像***中拍照。
电泳图谱见附图1，从左至右依次为沅江流域野生群体，赣江流域野生群体，陆水水库野生群体，黑龙江流域野生群体。对比标准图谱，靠近180bp处扩增出1条明显特异性DNA条带的为除黑龙江流域野生群体的其他三个群体；在靠近230bp位置扩增出2条或3条特异性DNA条带的为黑龙江流域野生翘嘴鳜群体，根据扩增样品的位置不同，可以方便快速的鉴别出黑龙江流域野生翘嘴鳜群体。
Claims (6)
1.一种鉴别黑龙江流域野生翘嘴鳜的微卫星标记方法，其特征在于包括以下步骤：
1）DNA提取：采用基因组DNA提取试剂盒提取翘嘴鳜基因组DNA，并测定其纯度和浓度，取A260/A280值为1.6~2，浓度为300~3000ng/μl的基因组DNA进行扩增；
2）DNA片段扩增：采用聚合酶链式反应扩增DNA片段，PCR反应的一对引物序列为：
正向引物：5’ AGACCAGGTTATCCCAGT 3’，
反向引物：5’ CAGAAGGAACAGAAGAGC 3’；
3）PCR产物的电泳及银染色鉴定：采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，进行银染色，显影后拍照并记录电泳结果；
4）与标准图谱进行对比：与标准图谱对比，读出待测样品的目的条带所处的位置，如样品在靠近标准图谱230bp位置扩增出1条或2条特异性DNA条带，则鉴定为是黑龙江野生翘嘴鳜群体；如样品在靠近标准图谱80bp位置扩增出1条特异性条带，则鉴定为是其他野生翘嘴鳜群体。
2.根据权利要求1所述的鉴别黑龙江流域野生翘嘴鳜的微卫星标记方法，其特征在于：步骤1）中所提取的基因组DNA的A260/A280值为1.8~1.9。
3.根据权利要求1所述的鉴别黑龙江流域野生翘嘴鳜的微卫星标记方法，其特征在于：步骤1）中所提取的基因组DNA的浓度为 1000~2000ng/μl。
4.根据权利要求1所述的鉴别黑龙江流域野生翘嘴鳜的微卫星标记方法，其特征在于：步骤2）中的PCR反应体系为：
5.根据权利要求1所述的鉴别黑龙江流域野生翘嘴鳜的微卫星标记方法，其特征在于：步骤2）中所述的PCR反应的程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸30s，30个循环；循环结束后72℃延伸10min，将产物4℃中保存。
6.根据权利要求1所述的一种鉴别翘嘴鳜黑龙江流域野生群体的微卫星标记方法，其特征在于：步骤3）中所述非变性聚丙烯酰胺凝胶的质量浓度为8%。
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