CN103255103B - 一种无血清的脂肪间充质干细胞培养基 - Google Patents

一种无血清的脂肪间充质干细胞培养基 Download PDF

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本发明涉及一种无血清的脂肪间充质干细胞培养基，由基础培养基和添加成份组成；其中，基础培养基为DMEM-LG，添加成份及其含量如下：碱性成纤维生长因子：5-20ng/mL；表皮生长因子：5-20ng/mL；青霉素：100U/mL；链霉素：100μg/mL；肝素：50-200μg/mL；L-谷氨酰胺：2-8mM；2-巯基乙醇：100-300μM；白血病抑制因子：500-2000U/mL；丙酮酸钠：0.5-2mM。本发明无血清的脂肪间充质干细胞培养基，不含血清，可避免批间差异和血清组分对细胞培养的影响；避免血清的外源性污染和对细胞毒性作用；成分明确，有利于研究细胞的生理调节机制。

Description

一种无血清的脂肪间充质干细胞培养基
技术领域
本发明涉及间充质干细胞培养基，尤其是一种无动物血清的脂肪间充质干细胞培养基。
背景技术
间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。间充质干细胞最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。
目前国内外对于间充质干细胞的扩增体系主要是基础培养基添加5-10%浓度的胎牛血清（FBS）。FBS中含有异种蛋白质，它本身有携带细菌、病毒、蛋白传染性疾病或朊病毒的风险。另外，有研究表明干细胞在培养过程中可以吞噬培养基中的蛋白，内含有牛血清蛋白(7mg-30mg/108个细胞)，可以使受者体内产生抗牛蛋白抗体，引起免疫反应，从而导致患者尤其在重复输注间充质干细胞治疗后治疗失效。因此FBS在间充质干细胞临床大规模培养中的不利因素已经逐渐暴露出来，现已有很多学者研究FBS的替代品。当前已有一些公司开发新一代无血清培养基。但是现有无血清培养基或化学成分不确定，或价格昂贵，或难以保证培养基批次间的一致性。
发明内容
有鉴于此，有必要针对上述问题，提供一种无血清的脂肪间充质干细胞培养基。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种无血清的脂肪间充质干细胞培养基，由基础培养基和添加成份组成；其中，基础培养基为DMEM-LG，添加成份及其含量如下：
碱性成纤维生长因子：5-20ng/mL；
表皮生长因子：5-20ng/mL；
青霉素：100U/mL；
链霉素：100μg/mL；
肝素：50-200μg/mL；
L-谷氨酰胺：2-8mM；
2-巯基乙醇：100-300μM；
白血病抑制因子：500-2000U/mL；
丙酮酸钠：0.5-2mM。
作为本发明无血清的脂肪间充质干细胞培养基的一种优选实施方式，所述碱性成纤维生长因子为15ng/mL；表皮生长因子为15ng/mL。
作为本发明无血清的脂肪间充质干细胞培养基的一种优选实施方式，所述肝素为100μg/mL。
作为本发明无血清的脂肪间充质干细胞培养基的一种优选实施方式，所述L-谷氨酰胺为5mM。
作为本发明无血清的脂肪间充质干细胞培养基的一种优选实施方式，所述2-巯基乙醇为0.1mM。
作为本发明无血清的脂肪间充质干细胞培养基的一种优选实施方式，所述白血病抑制因子为1000U/mL。
作为本发明无血清的脂肪间充质干细胞培养基的一种优选实施方式，所述丙酮酸钠为1mM。
本发明无血清的脂肪间充质干细胞培养基，不含血清，可避免批间差异和血清组分对细胞培养的影响，成本低；避免血清的外源性污染和对细胞毒性作用；成分明确，有利于研究细胞的生理调节机制。
附图说明
图1不同干细胞培养基培养的脂肪间充质干细胞的形态图片；图1A为本发明无血清的脂肪间充质干细胞培养基培养的脂肪间充质干细胞的形态图片；图1B为普通干细胞培养基培养的脂肪间充质干细胞的的形态图片。
具体实施方式
为了更好的了解本发明，下面结合实施例作进一步说明。
碱性成纤维细胞生长因子（Basic Fibroblast Growth Factor，bFGF）是含155个氨基酸的促有丝***的阳离子多肽，分子量为16～18.5KD。bFGF具有广泛的生物学作用，对多种细胞的生长、分化及功能有影响，在正常生理和病理过程中发挥作用，其主要生物学作用有：（1）作为血管生长因子；（2）促进创伤愈合与组织修复；（3）促进组织再生；（4）参与神经再生等。
bFGF有很强的肝素亲和力，在其114～123位氨基酸为高亲和力区，其它部位则有低亲和力区。抗bFGF与受体结合的单克隆抗体对其与肝素结合力无影响，取消有羟基端42位氨基酸，肝素亲和力即消失，而且可丧失部分生物学活性。
肝素是一种由D-葡糖胺、L-艾杜糖醛酸、N-乙酰葡糖胺及葡糖醛酸交替组成的粘多糖硫酸酯，分子量从5至30kDa，其中硫酸根约占40%。肝素主要是由肥大细胞和嗜碱性粒细胞产生，在肺、心、肝、肌肉等组织中含量丰富，生理情况下血浆中含量甚微。无论在体内还是体外，肝素的抗凝作用都很强，故临床把它作为抗凝剂广泛使用。
表皮生长因子(Epidermal Growth Factor，EGF)是一种小肽，由53个氨基酸残基组成，EGF是一种多功能的生长因子，在体内体外都对多种组织细胞有强烈的促***作用。
L-谷氨酰胺在细胞培养时起到很重要的作用。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢；在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。L-谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置-20℃冰冻保存，用前加入培养基中。加有L-谷氨酰胺的液体培养基4℃冰箱储存两周以上时，应重新加入原来量的L-谷氨酰胺。
2-巯基乙醇（又称为β-巯基乙醇）是一种有机化合物，其化学式为HOCH2CH2SH，它兼具乙二醇（HOCH2CH2OH）和乙二硫醇（HSCH2CH2SH）的官能团，通常用于二硫键的还原，保护二硫键，从而使蛋白质不被氧化掉而失活。
白血病抑制因子（Leukemia Inhibitory Factor，LIF)具有调节细胞的增殖、分化和表型的作用；丙酮酸钠（分子式CH3COCOONa，分子量110.04g/mol）可以作为细胞培养中的替代碳源。
实施例1
一种无血清的脂肪间充质干细胞培养基，由基础培养基和添加成份组成；其中，基础培养基为DMEM-LG，添加成份及其含量如下：
碱性成纤维生长因子：15ng/mL；
表皮生长因子：15ng/mL；
青霉素：100U/mL；
链霉素：100μg/mL；
肝素：100μg/mL；
L-谷氨酰胺：5mM；
2-巯基乙醇：100μM；
白血病抑制因子：1000U/mL；
丙酮酸钠：1mM。
使用本发明无血清的脂肪间充质干细胞培养基培养脂肪间充质干细胞的效果如下。
1.把经常规胶原酶I消化法分离所得并液氮保存的脂肪间充质干细胞冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动，液体都融化后（约1-1.5分钟），拿出来喷少许酒精放到超净工作台里。
2．把上述经37℃解冻后的脂肪间充质干细胞吸到装有10mL培养基的15mL的离心管中，再用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来，1000转离心5分钟。
3．把上清液倒掉，分别加1mL制备好的上述培养基，把细胞悬浮起来；吸到装有10mL培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布。
4．标好细胞种类和日期、培养基种类人等，放到CO2培养箱中培养，细胞贴壁后换培养基。
5.培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时，采用Invitrogen公司的全自动细胞计数仪Countess进行细胞计数。
在基础培养基DMEM-LG中添加10%的胎牛血清（体积分数），作为对照培养基培养脂肪间充质干细胞。
使用本发明无血清的脂肪间充质干细胞培养基培养脂肪间充质干细胞，细胞密度为2×107个/mL，使用对照培养基培养的脂肪间充质干细胞，细胞密度为2×106个/mL。本发明提供的无血清培养基含有高浓度的谷氨酰胺，可以显著提高脂肪间充质干细胞的生长速度，有效改善脂肪间充质干细胞的生长状态，保持脂肪间充质干细胞的生物学特性不变。如图1所示，培养于本发明无血清的脂肪间充质干细胞培养基中的脂肪间充质干细胞保持良好的贴壁特性，脂肪间充质干细胞均呈现出梭形的成纤维状细胞形态。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (1)

1.一种无血清的脂肪间充质干细胞培养基，由基础培养基和添加成份组成，其特征在于：基础培养基为DMEM-LG，添加成份及其含量如下：
碱性成纤维生长因子：15ng/mL；
表皮生长因子：15ng/mL；
青霉素：100U/mL；
链霉素：100μg/mL；
肝素：100μg/mL；
L-谷氨酰胺：5mM；
2-巯基乙醇：100μM；
白血病抑制因子：1000U/mL；
丙酮酸钠：1mM。
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103555661B (zh) * 2013-10-25 2015-07-29 中国科学院动物研究所 一种无血清、无饲养层的多能干细胞培养方法
CN103740641A (zh) * 2013-12-26 2014-04-23 广州爱菲科生物科技有限公司 一种诱导人脂肪间充质干细胞分化为胰岛样细胞的培养基及其诱导方法
CN105112360A (zh) * 2015-07-17 2015-12-02 深圳爱生再生医学科技有限公司 脐带间充质干细胞的大量培养方法
CN108410811A (zh) * 2016-03-06 2018-08-17 李倩 一种用于培养人脂肪干细胞的培养基
US10513689B2 (en) 2016-04-29 2019-12-24 Hope Biosciences, Llc Culture media for multipotent stem cells
CN106434549A (zh) * 2016-12-20 2017-02-22 江西宜信堂医疗科技有限公司 一种无血清干细胞培养基及其制备方法
CN106754675B (zh) * 2016-12-21 2019-11-22 广东科玮生物技术股份有限公司 一种脂肪干细胞无血清培养基及其制备方法和用途
CN106635979A (zh) * 2017-01-16 2017-05-10 广东万海细胞生物科技有限公司 脂肪间充质干细胞的无血清培养基
CN106906179A (zh) * 2017-04-28 2017-06-30 四川农业大学 一种高生长性多功能干细胞培养基
CN111150746A (zh) * 2020-01-06 2020-05-15 湖南护宫福生物科技有限公司 一种用于***给药治疗妇科炎症的干细胞修复液

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101974486A (zh) * 2010-11-25 2011-02-16 王泰华 从微量人脂肪组织提取间充质干细胞及规模化培养的方法
WO2011159359A2 (en) * 2010-06-17 2011-12-22 Stemrd, Inc. Serum-free chemically defined cell culture medium
CN102433301A (zh) * 2011-12-02 2012-05-02 上海安集协康生物技术有限公司 一种提取扩增单克隆间充质干细胞的方法及所用培养液
CN102827807A (zh) * 2012-09-19 2012-12-19 北京京蒙高科干细胞技术有限公司 一种间充质干细胞无血清培养基

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011159359A2 (en) * 2010-06-17 2011-12-22 Stemrd, Inc. Serum-free chemically defined cell culture medium
CN101974486A (zh) * 2010-11-25 2011-02-16 王泰华 从微量人脂肪组织提取间充质干细胞及规模化培养的方法
CN102433301A (zh) * 2011-12-02 2012-05-02 上海安集协康生物技术有限公司 一种提取扩增单克隆间充质干细胞的方法及所用培养液
CN102827807A (zh) * 2012-09-19 2012-12-19 北京京蒙高科干细胞技术有限公司 一种间充质干细胞无血清培养基

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
大鼠皮下脂肪分离间充质干细胞的体外培养及鉴定(英文);秦宇红等;《中国组织工程研究与临床康复》;20070819;第11卷(第33期);第6701-6705页 *

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