CN103251955A - 一种用于***灌注治疗的高分子靶向药物载体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于***灌注治疗的靶向高分子载药体系及其制备方法。所述靶向高分子载药体系，是以脂肪族聚酯为疏水相、末端功能化的聚环氧乙烷为亲水相的嵌段共聚物胶束载药体系，抗肿瘤药物包裹于胶束的疏水内核中或与亲水链段中的可修饰的官能团进行化学键合。通过对共聚物的亲水链段端基进行修饰可以得到具有靶向功能以及荧光示踪作用的高分子载药体系。该载药体系对***细胞具有显著的靶向作用，可明显的抑制***细胞的生长，并且实现稳定而持续的药物释放速度，显示了其在***灌注治疗中的重要应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于***灌注治疗的高分子靶向药物载体及其制备方法。
背景技术
***是泌尿外科中常见的疾病，目前，全球每年有超过1200万新增的***病例，其中540万发生在发达国家，670万病例在发展中国家(Martine Ploeg，Katja K.H.Aben，Lambertus A.Kiemeney，The present and future burden of urinary bladder cancerin the world，World Journal of Urology，2009，27(3)，289-293)。***在我国也是泌尿系及男生殖系中发病率很高的肿瘤疾病。在膀胱癌中，浅表膀胱癌(superficial bladdercancer)占60-80％。传统的治疗方式主要为手术切除肿瘤后辅助药物治疗，由于膀胱特殊的生理结构，一般采用膀胱内药物输送(intravesical drug delivery)即灌注治疗来避免全身的药物毒性。但由于浅表***的复杂生物学行为，50-70％浅表肿瘤术后容易复发，其中30-40％的复发导致肿瘤恶性程度的增高或浸润能力的增强，使得进一步治疗的难度急剧增大。因此，如何提高浅表***的治疗效果对于提高膀胱癌的治疗水平至关重要。
目前，在膀胱灌注治疗中比较常见的化学药物有噻替派(Thiotepa)、丝裂霉素(Mitomycin C)、阿霉素(Doxorubicin)、表柔比星(Epirubicin)等。这些小分子药物在***的灌注治疗中虽然表现出一定的治疗效果，但是，由于小分子药物容易随尿液排除，在膀胱内的停留时间短，因而需要反复灌注，不仅费用提高，也会导致副作用增大，更会造成肿瘤的抗药性，给后续的治疗带来困难。同时，由于膀胱特殊的生理特点，会导致小分子药物经膀胱而被全身吸收，产生毒副作用。
高分子载药体系由于其独特的优点而受到广泛重视，高分子载体具有独特的纳米尺寸效应所导致的在肿瘤组织部位具有增强的渗透与停留效应(enhanced permeationand retention，简称EPR效应)。同时，由于化学结构的多样性，高分子可以连接与肿瘤细胞表面受体具有高亲合性的配体(如抗体、多肽、糖类、生长因子等)，利用受体和配体的特异性结合实现高分子载药体系对肿瘤的主动靶向性，从而增大治疗效果，减小毒副作用。因此，高分子载药体系已经成为药物释放***中研究的热点之一。
高分子载药体系在***灌注治疗中的应用研究，文献报道很少。一些研究主要集中在药物的选择、作用时间、剂量等(Shelley MD et al.Intravesic al therapy forsuperficial bladder cancer：A systematic review of randomised trials and meta-analyses.Cancer Treatment Reviews.2010，36，195-205)。有报导利用壳聚糖涂覆PCL、PLL制备了包埋丝裂霉素的纳米粒子而实现了膀胱灌注治疗并取得了一定的效果(Erem Bilensoya，Can Sarisozena，Gunes et al.Intravesical cationic nanoparticles of chitosan andpolycaprolactone for the delivery of Mitomycin C to bladder tumors，International Journalof Pharmaceutics.2009，371，170-176)。也有报导将各种表皮生长因子受体应用于***的治疗中，但是其较低的响应率限制了其应用(Peter C.Black，Piyush K.Agarwal etal，Targeted therapies in bladder cancer-an update，Urologic Oncology：Seminars andOriginal Investigations，2007，25，433-438)。还有报导将CS-PAA磁性聚合物微球进行动物实验取得一定的效果，但是需要外加磁场，给治疗带来一定的麻烦。
发明内容
本发明提供了一种***灌注治疗用的靶向药物载体及其制备方法。
本发明所提供的***灌注治疗用的靶向药物载体为两亲性嵌段共聚物的胶束，所述胶束具有核壳结构，其外壳由所述两亲性嵌段共聚物中的亲水链段组成，内核由所述两亲性嵌段共聚物中的疏水链段组成；所述亲水链段为具有功能端基的聚环氧乙烷，所述功能端基为下述1)或2)：1)对***细胞具有靶向作用的生物功能分子，2)对***细胞具有靶向作用的生物功能分子和荧光分子；所述疏水链段为生物可降解的脂肪族聚酯。
其中，所述胶束的尺寸为10～500nm。
所述两亲性嵌段共聚物的数均分子量为1,500～600,000，其中脂肪族聚酯链段与聚环氧乙烷链段的平均分子量之比为0.01～1,000，脂肪族聚酯链段的数均分子量为1,000～500,000，聚环氧乙烷链段的数均分子量为500～100,000。
所述脂肪族聚酯具体可选自下述任意一种单体形成的均聚物和至少两种单体形成的共聚物中的一种或多种：己内酯(CL)、丙交酯(LA)和乙交酯(GA)。所述丙交酯包括消旋丙交酯、左旋丙交酯及右旋丙交酯。
上述胶束的亲水外壳通过化学修饰连接了各种功能分子，而疏水内核则可以物理包埋各种抗肿瘤药物。胶束表面连接各种靶向分子，具有两重靶向作用，包括(1)主动靶向，利用肿瘤细胞表面的特异性受体等对胶束表面进行设计而使其与肿瘤细胞具有特异性结合而达到对肿瘤细胞的靶向作用，使药物载体富集于肿瘤部位并进入肿瘤细胞进而实现药物释放遏制肿瘤细胞的生长，实现肿瘤的靶向治疗；(2)被动靶向，所制备的胶束尺寸在20～200nm之间，很容易进入肿瘤部位并停留在肿瘤部位，即EPR被动靶向作用。此外，通过在胶束表面亲水链段的官能团连接异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明等荧光分子从而使高分子载药体系具有荧光示踪作用，方便观察其在细胞内的分布、定量表征及药效评价。
所述对***细胞具有靶向作用的生物功能分子包括叶酸、线性多肽(如RGD)或者环状多肽等靶向分子及生长因子受体等，以使胶束载体具有对***细胞的主动靶向功能。
所述荧光分子包括异硫氰酸荧光素(FITC)、四乙基罗丹明(RBITC)等荧光指示分子，以使胶束载体具有荧光示踪功能。
当以上述两亲性嵌段共聚物的胶束为载体制备用于***灌注治疗的载药体系时，所负载的抗肿瘤药物为疏水性药物，其可通过物理作用在制备过程中被包埋于胶束的疏水内核中；所负载的抗肿瘤药物为亲水性药物，其可通过改变其亲水性使其疏水然后物理包埋或者通过与亲水链段端基中的可修饰的官能团进行化学键合而负载。所述抗肿瘤药物具体可选自阿霉素(Doxrubin)、丝裂霉素C(Mitomycin C)、紫杉醇(Paclitaxel)、吡柔比星(pirarubicin)、羟基喜树碱(Hydroxycamptothecin)、噻替哌(Thiotepa)、卡介苗(Calmette-Guerin vaccine)、米托蒽醌(Mitoxantrone Hcl)、乙环氧甘醚(Ethoglucid)、健择(Gemcitabin)、吉西他滨(Gemcitabine)、顺铂(Cisplatin)中的一种或几种等。
本发明的高分子靶向药物胶束载体，使用FDA批准可在人体内安全使用的可生物降解的脂肪族聚酯和聚环氧乙烷(PEO)为原料，合成两亲性嵌段共聚物。
以脂肪族聚酯如聚己内酯(PCL)，聚丙交酯(PLA)与水溶性聚环氧乙烷(PEO)合成两亲性嵌段共聚物PEO-b-PCL/PLA为例，作为药物载体的两亲性嵌段共聚物胶束的制备步骤如下：
1、开环阴离子聚合合成两亲性嵌段共聚物
聚环氧乙烷与脂肪族聚酯(包括左旋聚乳酸、右旋聚乳酸、消旋聚乳酸以及聚己内酯)嵌段共聚物(PEO-b-PCL/PDLA/PLLA/PLA)的合成路线如下：
以双(三甲基硅)氮钾([(CH3)3Si]2NK)为引发剂，在氩气保护下，通过环氧乙烷单体(EO)和脂肪族酯单体：己内酯(CL)或者丙交酯(LA)，左旋丙交酯(DLA)，右旋丙交酯(LLA)中的一种或数种进行阴离子开环聚合得到脂肪族酯与环氧乙烷的嵌段共聚物，如聚(环氧乙烷-b-己内酯)嵌段共聚物(PEO-b-PCL)、聚(环氧乙烷-b-乳酸)嵌段共聚物(PEO-b-PLA)、聚(环氧乙烷-b-己内酯/左旋聚乳酸/右旋聚乳酸/消旋聚乳酸)嵌段共聚物(PEO-b-PCL/PDLA/PLLA/PDLLA)。
本发明中所用的聚合物的分子结构式如下：
2、靶向分子修饰的两亲性嵌段聚合物的合成
利用两亲性嵌段聚合物中亲水末端的官能团如氨基NH2、羧基COOH、羟基OH、甲氧基CH3O等与靶向分子叶酸(FA)、多肽(如线性RGD或环状多肽C(RGDfk))等进行结合反应，得到靶向分子修饰的目标产物。
3、荧光分子修饰的两亲性嵌段共聚物的合成
利用两亲性嵌段聚合物中亲水末端的官能团如氨基NH2、羧基COOH、羟基OH、甲氧基CH3O等与异硫氰酸荧光素(FITC)、四乙基罗丹明(RBITC)等荧光分子进行化学结合反应，得到荧光分子修饰的目标产物。
4、制备荧光和/或靶向修饰的胶束
将步骤2、或步骤2和3中所得到的靶向分子和/或荧光分子修饰的两亲性嵌段共聚物溶于有机溶剂中形成油相，将上述油相在搅拌条件下缓慢滴加到水相中，搅拌2～24小时后透析除去有机溶剂得到荧光和/或靶向修饰的胶束溶液。
5、制备高分子载药体系
将步骤2)得到的靶向分子修饰的两亲性嵌段共聚物或步骤2)和3)得到的荧光和靶向分子修饰的两亲性嵌段共聚物溶于有机溶剂中；将疏水性抗肿瘤药物或经疏水处理后的亲水性抗肿瘤药物溶于所述有机溶剂中形成油相，或将亲水性抗肿瘤药物与步骤1)制备的两亲性嵌段共聚物中的可修饰官能团进行化学键合后溶于所述有机溶剂中形成油相；将所述油相在搅拌条件下滴加到过量水相中，搅拌2～24小时后透析除去有机溶剂得到载药胶束溶液。
所述对***细胞具有靶向作用的生物功能分子包括叶酸、线性多肽(如RGD)或者环状多肽等靶向分子及生长因子受体等。
所述荧光分子包括异硫氰酸荧光素(FITC)、四乙基罗丹明(RBITC)等荧光指示分子。
本发明的靶向高分子载药体系主要应用于***的灌注治疗，对***细胞具有特异的靶向作用并能富集在***细胞周围从而进入肿瘤细胞并释放药物，发挥其良好的治疗作用。本发明提出的由两亲性嵌段共聚物构建的高分子载药体系，制备方法简单易行，载药量高，对***细胞T24细胞具有良好的靶向作用，并可显著抑制肿瘤细胞的生长进而杀死肿瘤细胞，并且可以实现稳定而持续的药物释放速度，且该高分子载药体系不存在输送过程中被蛋白质吸附等问题，显示了其在***灌注治疗中的重要应用前景。
附图说明
图1为NH2-PEO-b-PCL的合成路线。
图2为FITC-PEO-b-PCL的合成路线。
图3为FA-PEO-b-PCL的合成路线。
图4为载药胶束的制备示意图。
图5为激光共聚焦显微镜观察细胞对胶束的内吞；绿色为FITC荧光胶束所发荧光；其中a为FA-PEO-b-PCL与FITC-PEO-b-PCL混合胶束与细胞相互作用的结果，b为OCH3-PEO-b-PCL与FITC-PEO-b-PCL的混合胶束与细胞相互作用的结果。
图6为胶束对T24肿瘤细胞靶向作用的定量研究结果。
图7为载药胶束对T24肿瘤细胞的毒性试验(MTT)。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：两亲性嵌段聚合物的合成
1)PEO-b-PCL的合成
合成路线如图1所示。将环氧乙烷单体(EO)和四氢呋喃(THF)溶剂除水除氧，反应装置抽排三次，充氩气保护，置于冰水浴中。利用双尖针将冷却干燥的EO单体转移至反应管中，根据实验设计分子量，在氩气保护下，将THF及双(三甲基硅)氮钾[(CH3)3Si]2NK引发剂依次加入到反应管中。反应2-5天后，在氩气保护下加入一定体积己内酯单体(CL)的THF溶液。继续反应0.5-3小时后，加入乙酸终止反应，将聚合产物在过量冷***中沉淀得到具有端氨基的两亲性嵌段共聚物NH2-PEO-b-PCL。聚合产物的结构和组成可以通过凝胶渗透色谱(GPC)和核磁共振氢谱(1HNMR)来共同确认。
称取0.020g的丁二酸酐，0.042g的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，0.0266g的4-(N，N-二甲氨基)吡啶(DMAP)溶于15mlTHF中，室温下搅拌0.5-8小时。将反应产生的沉淀离心除去，然后加入1.000g的NH2-PEO-b-PCL，继续反应2-5天后，将聚合产物在过量冷***中沉淀得到端羧基的两亲性嵌段共聚物COOH-PEO-b-PCL。聚合产物的结构和组成可以通过GPC和1H NMR来确认。
2)PEG-b-PLA的合成
在辛酸亚锡(Sn(Oct)2)催化下，以端羟基PEG为引发剂进行消旋丙交酯(DLLA)的开环聚合，得到两亲性嵌段共聚物PEG114-b-PDLLA350。
典型步骤如下：向干燥的反应瓶中加入0.100g的PEG-OH，0.5041g的DLLA，真空除氧除水后，充入氩气，加入2.55ul、浓度为0.982mol/L的Sn(Oct)2甲苯溶液和溶剂甲苯5ml。密封体系后放入一定温度的油浴中反应48h。将聚合产物在过量的冷***/甲醇混合溶剂之中沉淀，得到产物PEG114-b-PDLLA350。聚合产物的结构和组成可以通过GPC和1H NMR来确认。分别以左旋丙交酯(LLA)和右旋丙交酯(DLA)为单体，采用同样的合成方法和步骤，可以得到PEG114-b-PLLA350和PEG114-b-PDLA350。
3)PEG-b-P(CL-co-LA)的合成
按照实施例1中2)的方法制备PEG-b-P(CL-co-LA)。向干燥的反应瓶中加入0.100g的PEG-OH，0.5041g的LA(消旋、左旋或右旋均可)和0.2450g的CL，真空除氧除水后，充入氩气，加入2.55ul、浓度为0.982mol/L的Sn(Oct)2甲苯溶液和溶剂甲苯10ml。密封后放入一定温度的油浴中反应48h。将聚合产物在过量的冷***/甲醇混合溶剂中沉淀，得到产物PEG114-b-P(CL107-co-LA350)。该产物的结构和组成可以通过GPC和1HNMR来确认。
4)PEG-b-P(GA-co-LA)的合成
按照实施例1中2)的方法制备PEG-b-P(GA-co-LA)。向干燥的反应瓶中加入0.100g的PEG-OH，0.5041g的LA和0.3270g的1，4-二氧杂环-2，5-己二酮(乙交酯，GA)，真空除氧除水后，充入氩气，加入2.55ul、浓度为0.982mol/L的Sn(Oct)2甲苯溶液和溶剂甲苯10ml。密封后放入一定温度的油浴中反应48h。将聚合产物在过量的冷***/甲醇的混合溶剂中沉淀，得到产物PEG114-b-P(GA270-co-LA350)。该产物的结构和组成可以通过GPC和1H NMR来共同确认。
5)PEG-b-P(GA-co-LA-co-CL)的合成
按照实施例1中2)的方法制备PEG-b-P(GA-co-LA-co-CL)。向干燥的反应瓶中加入0.100g的PEG-OH，0.5041g的LA、0.2450g的CL以及0.3270g的GA，真空除氧除水后，充入氩气，加入2.55ul、浓度为0.982mol/L的Sn(Oct)2甲苯溶液和溶剂甲苯10ml。密封后放入一定温度的油浴中反应48h。将聚合产物在过量的冷***/甲醇混合溶剂中沉淀，得到产物PEG114-b-P(GA270-co-LA350-co-CL107)。该产物的结构和组成可以通过GPC和1HNMR来共同确认。
实施例2：荧光分子和靶向分子修饰的聚合物的合成
1)FITC-PEO-b-PCL的合成
合成路线如图2所示。称取0.0780g异硫氰酸荧光素(FITC)溶于5ml二甲基亚砜(DMSO)中，加入到装有1.0g的NH2-PEO5k-b-PCL5k的反应管中，在20-100℃的油浴中反应72小时，在蒸馏水中透析二次后，离心除去上层清夜，下层沉淀冷冻干燥后得到产物FITC-PEO5k-b-PCL5k。该产物的结构和组成可以通过GPC和1H NMR来共同确认。采用同样的方法，用四甲基罗丹明(RBITC)代替FITC，可以得到RBITC-PEO-b-PCL。
2)FA-PEO-b-PCL的合成
合成路线如图3所示。将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC，0.0396g)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，0.0160g)和叶酸(FA，0.0609g)溶于5mL的DMSO中，羧基活化2小时。然后加入NH2-PEO5k-b-PCL5k(0.5g)，反应72小时。在二次水中透析三天后，离心除去上层清夜，重新溶解在丙酮中除去不溶物，旋蒸得到淡黄色产物。该产物的结构和组成可以通过GPC和1H NMR来共同确认。
3)GRGDY-PEO-b-PCL的合成
首先称取0.1132g的GRGDY(甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-酪氨酸序列)，0.0486g的N，N′-羰基二咪唑(CDI)溶于5ml的DMSO中，反应0.5-4小时后，加入1g的NH2-PEO5k-b-PCL5k，继续反应2-5天。在二次水中透析三天除去未反应的小分子后，冷冻干燥得到产物GRGDY-PEO5k-b-PCL5k。该产物的结构和组成可以通过GPC和1H NMR来共同确认。
4)C(RGDfk)-PEO-b-PCL的合成
首先称取1g的COOH-PEO5k-b-PCL5k，0.2000g的EDC，0.2300g的NHS溶于10ml的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，常温下搅拌2-12小时以活化羧基。加入0.115mg的C(RGDfk)，在20-100℃的油浴中反应72小时，在蒸馏水中透析二次后，离心除去上层清夜，下层沉淀冷冻干燥后得到产物C(RGDfk)-PEO5k-b-PCL5k。该产物的结构和组成可以通过GPC和1H NMR来共同确认。
实施列3：胶束的制备
1)普通胶束的制备
称取10mg端基为氨基、羧基或者甲氧基的PEO5k-b-PCL5k溶于1mL的DMSO中，搅拌0.5-12小时使其充分溶解。用微量进样器取100μl上述溶液在温和的搅拌下缓慢滴加于10mL的二次水中，继续搅拌2-24小时后透析三天以除去有机溶剂得到胶束溶液，置于4℃冰箱中保存备用。
2)靶向胶束的制备
制备步骤和条件同上，但所用聚合物为叶酸修饰的FA-PEO5k-b-PCL5k或线型多肽修饰的GRGDY-PEO5k-b-PCL5k或环状多肽修饰的C(RGDfk)-PEO5k-b-PCL5k。
3)荧光胶束的制备
制备步骤和条件同上，但所用聚合物为5mg荧光分子修饰的FITC-PEO5k-b-PCL5k或RBITC-PEO-b-PCL与5mg未修饰的CH3O-PEO5k-b-PCL5k的混合物。
4)具有靶向和荧光双重作用的胶束的制备
制备步骤和条件同上，但所用聚合物为5mg荧光分子修饰的FITC-PEO5k-b-PCL5k或RBITC-PEO5k-b-PCL5k与5mg靶向分子修饰的FA-PEO5k-b-PCL5k、GRGDY-PEO5k-b-PCL5k或C(RGDfk)-PEO5k-b-PCL5k中的一种聚合物的混合物。
5)载药胶束的制备
制备步骤和条件同4)，但聚合物溶液中加入了抗肿瘤药物如阿霉素，聚合物和阿霉素的质量比为2∶1。制备过程如附图4所示。
所得到的胶束利用光散射技术(DLS)，紫外分光光度计以及荧光分光光度计分别测定其粒径、载药量以及临界胶束浓度(CMC)，所得结果见表1。
表1胶束的粒径、包封率、载药量及CMC结果
实施例4：胶束对T24细胞的靶向吸附试验
1)细胞培养
选用人***细胞T24细胞进行体外实验，细胞培养在F-12培养基中(添加10％胎牛血清和1％的青霉素、链霉素)于37℃和5％CO2孵箱中孵育。实验时，取生长状态良好的细胞以1×105个/孔的密度种于24孔板中。待细胞铺展至70％时，吸弃旧培养基，用磷酸盐缓冲溶液(PBS)冲洗三遍后，加入新鲜的培养基，同时分别加入一定量的不同浓度(0.15mg/ml、0.3mg/ml、0.45mg/ml)的未修饰的CH3O-PEO5k-b-PCL5k荧光胶束溶液或具有靶向和荧光双重作用的FA-PEO5k-b-PCL5k胶束溶液继续培养。
2)激光共聚焦显微镜观察
细胞培养一定时间后，吸弃胶束溶液与旧的培养基，PBS冲洗三遍以去除细胞外的胶束。加入70％的甘油封片。利用激光共聚焦显微镜(CLSM)观察胶束对T24细胞的靶向吸附以及进入细胞的过程。所得结果见图5。图5中绿色为荧光胶束中FITC所发荧光，其中a为FA-PEO-b-PCL靶向荧光胶束溶液与细胞相互作用的结果，由图5a可知，胶束成功进入细胞内部并表现出较强的荧光强度，说明较多的胶束已经成功进入细胞内部；b为CH3O-PEO-b-PCL荧光胶束与细胞相互作用的结果，由图5b可知，细胞内的荧光强度明显低于图5a，进入细胞的胶束的数量和速度明显低于图5a，说明我们所制备的胶束对***细胞的靶向作用明显。
3)定量研究
细胞培养一定时间后，吸弃胶束溶液与旧的培养基，PBS冲洗三遍以去除细胞外的胶束。加入一定浓度的NaOH溶液溶解细胞后转移至黑色的96孔板。选择激发波长为480nm、发射波长为535nm，测试细胞溶解液的荧光值。根据如下公式计算胶束对细胞的吸附率：
所得结果见图6。由图6可知，随着时间增加，细胞内的荧光强度随着时间增加；与靶向胶束作用的细胞内的荧光强度明显高于普通胶束作用的细胞内部的荧光强度，胶束靶向作用明显。
4)细胞毒性研究
取生长状态良好的细胞以1×105个/孔的密度种于96孔板中。待细胞铺展至70％时，吸弃旧培养基，加入新鲜的培养基，同时分别加入一定量的不同浓度(0.1mg/ml、0.2mg/ml)的由未载药的CH3O-PEO5k-b-PCL5k胶束溶液或靶向分子修饰的FA-PEO5k-b-PCL5k、GRGDY-PEO5k-b-PCL5k、C(RGDfk)-PEO5k-b-PCL5k的空白胶束中的一种或者几种与负载阿霉素的载药胶束CH3O-PEO5k-b-PCL5k/DOX，FA-PEO5k-b-PCL5k/DOX，GRGDY-PEO5k-b-PCL5k/DOX，C(RGDfk)-PEO5k-b-PCL5k中的一种或者几种继续培养。72小时后，每孔加入20ul浓度为5mg/ml的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)溶液，作用0.5-4小时后，选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，结果如图7所示。
以上细胞试验结果表明，所制备的胶束可以成功的越过细胞膜的障碍进入细胞内部，如图5所示。加入靶向胶束的实验组相对于普通胶束的实验组荧光更强，说明叶酸和多肽修饰的胶束能够更多、更快的富集于细胞膜并进入细胞，表现出对肿瘤细胞良好的靶向作用，如图5、图6所示。载药胶束与肿瘤细胞作用一段时间后，对其生长表现出明显的抑制作用，特别是靶向分子修饰的载药胶束表现出更高的细胞毒性，结果如附图7所示。
Claims (10)
1.一种靶向药物载体，为两亲性嵌段共聚物的胶束，所述胶束具有核壳结构，其外壳由所述两亲性嵌段共聚物中的亲水链段组成，内核由所述两亲性嵌段共聚物中的疏水链段组成；所述亲水链段为具有功能端基的聚环氧乙烷，所述功能端基为下述1)或2)：1)对***细胞具有靶向作用的生物功能分子，2)对***细胞具有靶向作用的生物功能分子和荧光分子；所述疏水链段为生物可降解的脂肪族聚酯。
2.根据权利要求1所述的靶向药物载体，其特征在于：所述胶束的尺寸为10～500nm；
所述两亲性嵌段共聚物的数均分子量为1,500～600,000，其中脂肪族聚酯链段与聚环氧乙烷链段的平均分子量之比为0.01～1,000，脂肪族聚酯链段的数均分子量为1,000～500,000，聚环氧乙烷链段的数均分子量为500～100,000。
3.根据权利要求1或2所述的靶向药物载体，其特征在于：所述脂肪族聚酯选自下述任意一种单体形成的均聚物和至少两种单体形成的共聚物中的一种或多种：己内酯、丙交酯和乙交酯。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的靶向药物载体，其特征在于：所述对***细胞具有靶向作用的生物功能分子包括叶酸、线性多肽、环状多肽或生长因子受体；
所述荧光分子包括异硫氰酸荧光素和/或四乙基罗丹明。
5.权利要求1-4中任一项所述的靶向药物载体在制备用于***灌注治疗的靶向高分子载药体系中的应用。
6.制备权利要求1-4中任一项所述的靶向药物载体的方法，包括下述步骤：
1)合成生物可降解的脂肪族聚酯与聚环氧乙烷的两亲性嵌段共聚物；所述两亲性嵌段共聚物中聚环氧乙烷链段的端基为可修饰的官能团；所述可修饰的官能团具体为氨基、羧基、羟基或者甲氧基；
2)利用步骤1)合成的两亲性嵌段共聚物中聚环氧乙烷链段末端的可修饰的官能团与对***细胞具有靶向作用的生物功能分子进行反应，得到靶向分子修饰的两亲性嵌段共聚物；
3)利用步骤1)合成的两亲性嵌段共聚物中聚环氧乙烷链段末端的可修饰的官能团与荧光分子进行反应，得到荧光分子修饰的两亲性嵌段共聚物；
4)将步骤2)得到的两亲性嵌段共聚物或步骤2)和3)得到的两亲性嵌段共聚物，溶于有机溶剂形成油相；将所述油相在搅拌条件下滴加到过量水相中，搅拌2～24小时后透析除去有机溶剂得到靶向药物载体胶束溶液。
7.一种用于***灌注治疗的靶向高分子载药体系，由权利要求1-4中任一项所述的靶向药物载体和抗肿瘤药物组成。
8.根据权利要求7所述的靶向高分子载药体系，其特征在于：所述抗肿瘤药物为疏水性药物，所述抗肿瘤药物物理包埋在权利要求1-4中任一项所述靶向药物载体的疏水内核中；
所述抗肿瘤药物为亲水性药物，所述抗肿瘤药物进行疏水处理后物理包埋在权利要求1-4中任一项所述靶向药物载体的疏水内核中，或所述抗肿瘤药物与端基为可修饰官能团的两亲性嵌段共聚物中可修饰官能团进行化学键合，所述两亲性嵌段共聚物为脂肪族聚酯与聚环氧乙烷的两亲性嵌段共聚物，其中聚环氧乙烷链段的端基为可修饰的官能团；所述可修饰的官能团具体为氨基、羧基、羟基或者甲氧基；
所述抗肿瘤药物具体选自下述至少一种：阿霉素、丝裂霉素C、紫杉醇、吡柔比星、羟基喜树碱、噻替哌、卡介苗、米托蒽醌、乙环氧甘醚、健择、吉西他滨和顺铂。
9.权利要求7或8所述的靶向高分子载药体系，其特征在于：所述靶向高分子载药体系是按照权利要求10中所述方法制备得到的。
10.制备权利要求7或8所述靶向高分子载药体系的方法，包括下述步骤：
1)合成生物可降解的脂肪族聚酯与聚环氧乙烷的两亲性嵌段共聚物；所述两亲性嵌段共聚物中聚环氧乙烷链段的端基为可修饰的官能团；所述可修饰的官能团具体为氨基、羧基、羟基或者甲氧基；
2)利用步骤1)合成的两亲性嵌段共聚物中聚环氧乙烷链段末端的可修饰的官能团与对***细胞具有靶向作用的生物功能分子进行反应，得到靶向分子修饰的两亲性嵌段共聚物；
3)利用步骤1)合成的两亲性嵌段共聚物中聚环氧乙烷链段末端的可修饰的官能团与荧光分子进行反应，得到荧光分子修饰的两亲性嵌段共聚物；
4)将步骤2)得到的两亲性嵌段共聚物或步骤2)和3)得到的两亲性嵌段共聚物溶于有机溶剂中；将疏水性抗肿瘤药物或经疏水处理后的亲水性抗肿瘤药物溶于所述有机溶剂中形成油相，或将亲水性抗肿瘤药物与步骤1)制备的两亲性嵌段共聚物中的可修饰官能团进行化学键合后溶于所述有机溶剂中形成油相；将所述油相在搅拌条件下滴加到过量水相中，搅拌2～24小时后透析除去有机溶剂得到载药胶束溶液。
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