CN103245643A - 用于荧光检测的光学***和微粒分析装置 - Google Patents

用于荧光检测的光学***和微粒分析装置 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于荧光检测的光学***和微粒分析装置。该光学***包括：两个抛物面镜：第一抛物面镜和第二抛物面镜，并且从不同方向入射的荧光光束被第一抛物面镜作为平行光束反射至第二抛物面镜，并通过第二抛物面镜会聚到一点。

Description

用于荧光检测的光学***和微粒分析装置
技术领域
本公开涉及用于荧光检测的光学***和微粒分析装置。特别是，本公开涉及检测多个荧光光束的光学***和包括该光学***的微粒分析装置。背景技术
通常，当识别诸如细胞、微生物、脂质体等生物微粒时，会利用使用流式细胞测量术（流式细胞分析仪）的光学测量方法。流式细胞测量术是这样的一种分析方法，即：通过用特定波长的激光束来照射会在流路中成一行地流过的微粒并且通过检测荧光光束和从每一个微粒发出的散射光束，来逐个识别多个微粒。
特别地，为了排成一行地排列包括样本液中的多个微粒，在流路中由包括待测微粒以及样本液***流动的鞘液的样本液形成层流。当激光束照射在此状态的流路上时，微粒逐个地通过激光束。
在这种情况下，荧光光束和被激光束激发而从每一个微粒发出的散射光束被诸如电荷耦合器（CCD）或者光电倍增管（PMT）的光检测器所检测。然后，由光检测器检测到的光束被转换成电信号，进而再转换成数字。然后，通过进行统计分析确定出每个微粒的类型、大小和结构。
由于从诸如细胞的生物微粒发出的荧光光束很弱，所以，必须提高分析这些粒子的流式细胞分析仪的荧光检测性能。特别是，有必要改进多束测量中荧光检测的灵敏度，在多束测量中，用不同波长的多个激发光束照射样本，并检测所得多个荧光光束。
在光检测领域中，改进检测性能的方法，例如包括：对用光学放大器放大从样本发出的荧光光束后的荧光光束进行检测的方法（参见日本未审专利申请公开第2010-099095号），以及电性校正检测信号的方法（参见日本未审专利申请公开第2011-232259号）。至今，已经提出了用抛物面镜或椭圆面镜作为反射镜进行光检测的光学***（参见日本未审专利申请公开第2001-509266号（PCT申请的翻译）以及日本未审专利申请公开第2003-329590号和第2002-162350号（在下文中是指“专利文献3”、“专利文献4”、“专利文献5”））。
在专利文献3和4中描述的相关领域的用于光检测的光学***中，样本设置在抛物面镜的焦点附近，抛物面镜使从样本发出的光束形成平行光束，并且抛物面镜向检测器发射该光束。在专利文献5描述的荧光测量设备中，通过抛物面镜和椭圆面镜，从样本在各个方向发出的荧光光束会聚到检波器的入射面上。
发明内容
然而，使用通过提供光学放大器或者校正检测信号来改进荧光检测灵敏度的方法有时会同时放大噪声成份，所以，该方法对改进荧光检测灵敏度有局限性。因为专利文献3和4中描述的技术中的抛物面镜具有很差的轴外特性，所以很难将专利文献3和4中描述的技术应用于使用多个光源的多束测量。专利文献5中描述的技术存在的问题是其不适用于背光（将发射到激发光束侧的光），背光有利于获得荧光光束。
因此，期望提供一种用于荧光检测的光学***，其能够在使用多个光源的测量中高灵敏度地检测荧光光束，还期望提供了微粒分析装置。
根据本公开的用于荧光检测的光学***包括：两个抛物面镜，即第一抛物面镜和第二抛物面镜，并且从不同方向入射的荧光光束被第一抛物面镜作为平行光束反射至第二抛物面镜，并通过第二抛物面镜会聚到一点。
在该用于荧光检测的光学***中，反射面的曲率彼此不同的反射镜可以用作第一抛物面镜和第二抛物面镜，每一面反射镜具有一个反射面。
当第二抛物面镜的伪焦距（pseudo focal length）f2与第一抛物面镜的伪焦距f1之比（f2/f1）为β，并且被第二抛物面镜折弯的光轴的折弯角度θ2与被第一抛物面镜折弯的光轴的折弯角度θ1之差(θ2-θ1)为Δθ时，这些量可以满足以下公式（1）：
Δθ=a lnβ+b...(1)
其中：49≤a≤60，-2≤b≤8。
第一抛物面镜可以具有0.5或更高的数值孔径NA。
用于荧光检测的光学***可以进一步包括：平面镜，将被第一抛物面镜反射的多个荧光光束中的一束反射到第二抛物面镜。
第一抛物面镜和第二抛物面镜之间可以设置有间隔。
一种根据本公开实施方式的微粒分析装置包括：以上描述的用于荧光检测的光学***。
微粒分析装置可以包括两个或多个光源以及多个光检测器。在这种情况下，可以设有检测单元，其中，光源发出激发光束，并且从用激发光束照射的微粒发出的光束被光检测器检测，而且，第一抛物面镜和第二抛物面镜设在检测单元中。
第一和第二抛物面镜设在要测量的微粒和透过激光光束并反射荧光光束的半透镜之间，而且从微粒发出的多个荧光光束可以会聚到半透镜。
在检测单元中可以设置有平面镜，平面镜将被第一抛物面镜反射的荧光光束反射到第二抛物面镜，使得荧光光束被第二抛物面镜反射到第一抛物面镜的背面侧。
第一抛物面镜和第二抛物面镜之间可以设有间隔，并且激发光束可以在第一抛物面镜和第二抛物面镜之间通过以照射在微粒上。
根据本公开，从不同方向入射的荧光光束被两个抛物面镜会聚到一点，由此在使用多个光源的测量中，能够高灵敏度地检测荧光光束。
附图说明
图1为示出了根据本公开第一实施方式的用于荧光检测的光学***的构成例的概念图；
图2为示出了在第一抛物面镜处的光轴的折弯角度θ1为70°的情况下光轴的折弯角度之间的差Δθ和轴外特性（轴外像差）之间的关系的图；
图3为示出了光轴折弯角度之间的差Δθ和光学放大倍数β之间的关系的图；
图4A为示出了图1所示的光学***的光路和光点大小（spot size）的概念图；
图4B为示出了在第二抛物面镜的方向被改变的情况下光路和光点大小的概念图；
图5为示出了根据本公开第一实施方式的变形例的用于荧光检测的光学***的构成例的概念图；
图6为示出了根据本公开第二实施方式的微粒分析装置的构成的概念图。
具体实施方式
将参照附图详细地描述本公开的实施方式。本公开并不限于以下实施方式。按照以下顺序进行描述：
1.第一实施方式
（使用两种类型抛物面镜的用于荧光检测的示例性光学***）
2.第一实施方式的变形例
（包括平面镜的用于荧光检测的示例性光学***）
3.第二实施方式
（包括根据第一实施方式的用于荧光检测的光学***的示例性微粒分析装置）
1.第一实施方式
整体构成
下面将描述根据本公开第一实施方式的用于荧光检测的光学***。图1为示出了根据本公开第一实施方式的用于荧光检测的光学***的构成例的概念图。如图1所示，根据本实施方式的光学***10包括抛物面镜1和2，并且可将从样本（对象点3）发出的荧光光束5引导至检测***。在根据本实施方式的光学***10中，从样本（对象点3）发出的荧光光束5从不同的方向入射，并且被抛物面镜1反射为平行光束，从而入射到抛物面镜2上。之后，荧光光束5被抛物面镜2反射并被会聚到一点（图像点4）。
抛物面镜1和2
抛物面镜1和2的反射面的曲率没有特别的限制，它们可以根据光学***10的光学放大倍数进行适当的设置。例如，虽然具有大曲率、短焦距的反射面的抛物面镜1被设置在图1所示构成例中的对象点3侧，但是，也可将具有小曲率、长焦距的反射面的抛物面镜2设置在对象点3侧。在根据本实施方式的光学***10中，可以使用反射面的曲率彼此相同且焦距彼此相等的两个抛物面镜，每一个抛物面镜具有一个反射面。
例如，在根据本实施方式的光学***10中，当必须用激发光束照射样本时，可以在抛物面镜1和2之间设置一个间隔，以使激发光束在抛物面镜1和抛物面镜2之间通过，并照射在样本上。结果，能够节省空间。由于抛物面镜1和抛物面镜2之间的荧光光束5具有平行光束的形式，所以很容易设计光学滤光器并且能够改善激发光束和荧光光束之间的分离性能。虽然在抛物面镜1和抛物面镜2之间设置一个间隔的构成例显示在图1中，但是本公开并不限于此，并且显而易见的是，抛物面镜1和抛物面镜2之间可以不设置间隔。
轴外特性
在根据本实施方式的光学***10中，优选在光学放大倍数β和光轴折弯角度间的差Δθ之间的关系满足以下公式2。这里，光学放大倍数β是抛物面镜2的伪焦距与抛物面镜1的伪焦距之比（f2/f1），并且光轴折弯角度间的差Δθ是被抛物面镜2折弯的光轴的折弯角度θ2与被抛物面镜1折弯的光轴的折弯角度θ1之差(θ2-θ1)：
Δθ=a lnβ+b...(2)
式中：49≤a≤60，-2≤b≤8
图2为示出了在物面镜1处的光轴的折弯角度θ1为70°的情况下光轴折弯角度之间的差Δθ和轴外特性（轴外像差）之间的关系的图。图3为示出了光轴折弯角度之间的差Δθ和光学放大倍数β之间的关系的图。如图2所示，在轴外像差量最少的光轴的折弯角度之间的差Δθ随着光学放大倍数Δθ而变化。换句话说，当被抛物面镜1折弯的光轴的折弯角度θ1是固定的时，被抛物面镜2折弯的光轴的折弯角度θ2可以根据光学放大倍数Δθ而改变，以获得最佳的轴外特性。
由于在包括光轴的面（子午面）内的轴外特性在根据本实施方式的光学***10中是不对称的，所以进行了对该面的正（+）侧和负（-）侧的研究。如图3所示，作为这项研究的结果，虽然在正侧和负侧上存在少量的差异，但是该量可以与被抛物面镜1折弯的光轴的折弯角度θ1无关地、用以上公式2表示的函数近似。通过调节折弯角度之间的差Δθ，能够提供具有优异轴外特性的光学***，以使公式2中所示的a和b分别在49≤a≤60和-2≤b≤8范围内。
数值孔径NA
考虑到改善检测灵敏度，优选用具有0.5或更高的数值孔径的抛物面镜作为抛物面镜1，从样本发出的荧光光束5首先入射在抛物面镜1上。抛物面镜2的数值孔径没有严格的限制，其可以根据所设置的或期望的光学放大倍数来进行适当地选择。
操作
现将描述根据本实施方式的光学***10的操作。在根据本实施方式的光学***10中，在抛物面镜1上入射从样本发出的荧光光束5。入射到不同位置的荧光光束5通过抛物面镜1的反射而成为彼此平行的平行光束，并且入射到抛物面镜2上。然后，通过抛物面镜2的反射，平行光束将会聚到同一个图像点4上。即，从样本发出的在不同方向上的光束能够在根据本实施方式的光学***10中会聚到一个点上。
如以上的详细描述，在根据本实施方式的光学***10中，入射在不同位置的多个荧光光束5通过抛物面镜1和2会聚到一个点（图像点4）。结果，改善了轴外特性和会聚效率，从而能够改善用于检测荧光光束的灵敏度。从抛物面镜1至抛物面镜2的光束成为平行光束通量，这使得当装配模块时便于调整光轴。结果，在多束测量中也能高灵敏度地检测荧光光束。
2.第一实施方式的变形例
现在将描述根据本公开第一实施方式的变形例的用于荧光检测的光学***。图4A为示出了图1所示的光学***10的光路和光点大小的概念图。图4B为示出了在抛物面镜2的方向发生改变的情况下光路和光点大小的概念图。图5为示出了根据本公开第一实施方式的变形例的用于荧光检测的光学***的构成例的概念图。如图5所示，在根据该变形例的光学***30中，除了两个抛物面镜1和2之外，还设置有将由抛物面镜1反射的荧光光束5反射到抛物面镜2的平面镜6。
在图1所示的光学***中，对象点3和图像点4分别位于抛物面镜1和2反射面侧（在抛物面镜1和2的前面），而且荧光光束5的光路基本上为U形。采用这样的构成，检测来自流过流路的样本的荧光光束的***（例如流式细胞分析仪）有时会阻碍流路。在另一方面，如果设置抛物面镜2使得图像点4位于抛物面镜1的背面侧（抛物面镜1的后面），并且采用图4B所示的荧光光束5的光路基本上为Z形的构成，与使用图4A所示的构成相比，射束点变大，检测灵敏度变小。
因此，在根据本变形例的光学***30中，平面镜6设置在抛物面镜1和抛物面镜2之间，使得被抛物面镜1反射的荧光光束经平面镜6入射到抛物面镜2上。这使得图像点4位于抛物面镜1的背面侧（抛物面镜1的后面），而不会使射束点变大。因此，如果在流式细胞分析仪中使用这种构成，则能够高灵敏度地检测荧光光束5而不会阻碍流路，并且还能够减小装置占据的空间。
如果在根据该变形例的光学***30中必须要用激发光束来照射样本，则可以使用：例如，设置使激发光束能够在抛物面镜1或平面镜6中通过的孔洞的方法，或者通过在各镜子间或各焦点间放置滤光器等来引入激发光束的方法。除了以上描述的构成和效果外，根据本变形例的光学***30的构成和有益效果与第一实施方式中的类似。
3.第二实施方式
整体构成
现在来描述根据本公开第二实施方式的微粒分析装置。图6为示出了根据本实施方式的微粒分析装置的构成的概念图。根据本实施方式的微粒分析装置包括根据第一实施方式的光学***10或者根据第一实施方式的变形例的光学***30。如图6所示，在根据本实施方式的微粒分析装置中，设有至少多个光源11a至11c和多个光检测器19。在根据本实施方式的微粒分析装置中，进行多束测量。在多束测量中，不同波长的多个激发光束20a至20c照射在流经流路13的样本上，然后，光检测器19检测出所得的多个荧光光束5a至5c。
光源11a至11c
根据要测量什么等来适当地选择光源11a至11c，例如，可以使用激光二极管、二次谐波生成（SHG）激光器、气体激光器、高强度发光二极管等作为光源11a至11c。
流路13
在样本流经的流路13中，由包括样本和围绕样本液***的鞘液的样本液形成层流，使得样本排成一行地流过用激发光束20a至20c照射的测量区。流路13的形成没有特别的限制，例如，形成有微流路13的分析芯片可以用作流路13。
检测单元
透过激发光束20a至20c并反射荧光光束5a至5c的半透镜12设在流路13和光源11a至11c之间。用于荧光检测的光学***10或30设在半透镜12和流路13之间。在这种情况下，用于荧光检测的光学***10或30的抛物面镜1和抛物面镜2之间设有间隔，并且激发光束20a至20c在抛物面镜1和抛物面镜2之间通过，并照射在流经流路13的微粒上。
在另一方面，从流经流路13的微粒上发出的多个荧光光束5a至5c被用于荧光检测的光学***10或30反射，并会聚到半透镜12上。通过使用激发光束20a至20c通过半透镜12以及用于荧光检测的光学***10或30并照射在微粒上的构成，能够减小该装置的大小。
在检测单元中，例如，设有将荧光光束5a至5c引导至光检测器19的光纤15和将由半透镜12反射的荧光光束5a至5c会聚到光纤15里的光纤耦合透镜14。此外，在光纤15和光检测器19之间还设有准直透镜16、反射镜17、长通滤光器18等。
这里，光检测器19没有特别的限制，只要它们能够检测从样本发出的荧光光束5a至5c即可，而且，例如，光电二极管（PD）、电荷耦合器（CCD）或者光电倍增管（PMT）都可以用作光检测器19。必要的话，可以在光检测单元中设置各种光学元件。
微粒分析装置的操作
现在将描述使用根据本实施方式的微粒分析装置来测量诸如微粒等样本的方法。例如，要用根据本实施方式的微粒分析装置测量的样本可以是诸如细胞或微珠的微粒、病毒、细菌和酵母，只要它们用激发光束20a-20c照射就能发出荧光光束5a至5c即可。样本可以用一个或多个荧光染料修饰。
首先，在根据本实施方式的微粒分析装置中，从光源11a至11c向微流路13发射激发光束20a至20c。激发光束20a至20c通过半透镜12和用于荧光检测的光学***10或30，并且照射在流经微流路13的样本（微粒）上。在这种状态下，要测量的样本排成一行地流经微流路13，因此能够用激发光束20a至20c个别地照射样本。
所以，从样本发出比激发光束20a至20c的波长长的荧光光束5a至5c。该荧光光束5a至5c通过用于荧光检测的光学***10或30会聚到半透镜12上，并通过光纤耦合透镜14引导入光纤15中。然后，该荧光光束5a至5c经过准直仪透镜16、反射镜17、长通滤光器18等被光检测器19检测。
正如以上的详细描述，根据本实施方式的微粒分析装置包括：根据以上描述的第一实施方式的光学***10或者根据第一实施方式的变形例的光学***30，并由此具有良好的轴外特性。在根据本实施方式的微粒分析装置中，通过用于荧光检测的光学***10或30，荧光光束能够会聚到一个较小的点上，由此，可以提高将荧光光束耦合到光纤15时的耦合效率。因此，在多束测量中，也可以高灵敏度地检测荧光光束。
本公开可以使用如下配置。
（1）一种用于荧光检测的光学***，包括：
两个抛物面镜，第一抛物面镜和第二抛物面镜，
其中，从不同方向入射的荧光光束被第一抛物面镜反射作为平行光束反射至第二抛物面镜，并通过第二抛物面镜会聚到一点上。
（2）根据（1）的用于荧光检测的光学***，
其中，第一抛物面镜和第二抛物面镜具有彼此曲率不同的反射面。
（3）根据（1）或（2）的用于荧光检测的光学***，
其中，当第二抛物面镜的伪焦距f2与第一抛物面镜的伪焦距f1之比（f2/f1）为β，并且被第二抛物面镜折弯的光轴的折弯角度θ2与被第一抛物面镜折弯的光轴的折弯角度θ1之差(θ2-θ1)为Δθ时，这些量满足以下公式（A）：
Δθ=a lnβ+b...(A)
其中：49≤a≤60，-2≤b≤8。
（4）根据（1）至（3）中任意一项的用于荧光检测的光学***，
其中，第一抛物面镜具有0.5或更高的数值孔径NA。
（5）根据（1）至（4）中任意一个的用于荧光检测的光学***，进一步包括：
平面镜，将被第一抛物面镜反射的所述荧光光束中的一束反射到第二抛物面镜。
（6）根据（1）至（5）中任意一项的用于荧光检测的光学***，
其中，第一抛物面镜和第二抛物面镜之间设置有间隔。
（7）一种微粒分析装置，包括：
根据（1）至（6）中任意一项的用于荧光检测的光学***。
（8）根据（7）的微粒分析装置，进一步包括：
两个或多个光源；
多个光检测器；以及
检测单元；
其中，光源发出激发光束，并且从用激发光束照射的微粒发出的光束在检测单元中被光检测器检测；并且
其中，第一抛物面镜和第二抛物面镜设在检测单元中。
（9）根据（8）的微粒分析装置，
其中，在所述检测单元中设置有平面镜，平面镜将被第一抛物面镜反射的所述荧光光束中的一束反射到第二抛物面镜，并且
其中，荧光光束被第二抛物面镜反射到第一抛物面镜的背面侧。
（10）根据（8）或(9)的微粒分析装置，
其中，第一和第二抛物面镜设置在要测量的微粒和透过激光光束并反射荧光光束的半透镜之间，并且
其中，从微粒发出的多个荧光光束会聚到半透镜上。
（11）根据（8）或(10)的微粒分析装置，
其中，第一抛物面镜和第二抛物面镜之间设有间隔，并且
其中，激发光束在第一抛物面镜和第二抛物面镜之间通过，并照射在微粒上。
本公开包括在2012年2月7日在日本专利局申请的日本在先专利申请JP2012-023854中公开的主题相关的主题，其全部内容通过引用结合到本文中。
本领域技术人员应理解的是，只要在所附权利要求或其等同技术方案的范围内，根据设计要求和其它因素，可以存在各种变形、组合、子组合以及替换。

Claims (12)

1.一种用于荧光检测的光学***，包括：
两个抛物面镜：第一抛物面镜和第二抛物面镜，
其中，从不同方向入射的荧光光束被所述第一抛物面镜作为平行光束反射至所述第二抛物面镜，并通过所述第二抛物面镜会聚到一点。
2.根据权利要求1所述的用于荧光检测的光学***，
其中，所述第一抛物面镜和所述第二抛物面镜具有彼此曲率不同的反射面。
3.根据权利要求1所述的用于荧光检测的光学***，
其中，当所述第二抛物面镜的伪焦距f2与所述第一抛物面镜的伪焦距f1之比f2/f1为β，并且被所述第二抛物面镜折弯的光轴的折弯角度θ2与被所述第一抛物面镜折弯的光轴的折弯角度θ1之差θ2-θ1为Δθ时，这些量满足以下公式：
Δθ=a lnβ+b
其中：49≤a≤60，-2≤b≤8。
4.根据权利要求1所述的用于荧光检测的光学***，
其中，所述第一抛物面镜具有0.5或更高的数值孔径NA。
5.根据权利要求1所述的用于荧光检测的光学***，进一步包括：
平面镜，将被所述第一抛物面镜反射的所述荧光光束中的一束反射到所述第二抛物面镜。
6.根据权利要求1所述的用于荧光检测的光学***，
其中，所述第一抛物面镜和所述第二抛物面镜之间设置有间隔。
7.一种微粒分析装置，包括：
根据权利要求1所述的用于荧光检测的光学***。
8.根据权利要求7所述的微粒分析装置，进一步包括：
两个或更多光源；
多个光检测器；以及
其中，所述光源发出激发光束，并且从用所述激发光束照射的微粒发出的光束被在所述检测单元中的所述光检测器检测；并且
其中，所述第一抛物面镜和所述第二抛物面镜设在所述检测单元中。
9.根据权利要求8所述的微粒分析装置，
其中，在所述检测单元中设置有平面镜，所述平面镜将被所述第一抛物面镜反射的所述荧光光束中的一束反射到所述第二抛物面镜，并且
其中，所述荧光光束被所述第二抛物面镜反射到所述第一抛物面镜的背面侧。
10.根据权利要求8所述的微粒分析装置，
其中，所述第一和第二抛物面镜设置在所要测量的微粒与透过所述激发光束并反射荧光光束的半透镜之间，并且
其中，从所述微粒发出的多个荧光光束会聚到所述半透镜上。
11.根据权利要求8所述的微粒分析装置，
其中，所述第一抛物面镜和所述第二抛物面镜之间设有间隔，并且
其中，所述激发光束在所述第一抛物面镜和所述第二抛物面镜之间通过，并照射到所述微粒上。
12.根据权利要求8所述的微粒分析装置，
所述微粒是细胞、微珠、病毒、细菌和/或酵母。
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