CN103237895A - 具有提高的糖化产率的转基因植物以及产生其的方法 - Google Patents
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Abstract
披露了工程化在细胞壁中具有降低的乙酰化的植物的方法。该方法包括：在次生细胞壁沉积之后，在植物细胞壁中特别活跃的发育调节启动子的转录调控下，在植物细胞壁中表达至少一种经分离的异源多核苷酸，该异源多核苷酸编码乙酰木聚糖酯酶（AXE），从而工程化在细胞壁中具有降低的乙酰化的植物。
Description
技术领域
在本发明的一些实施方式中，其涉及表达乙酰木聚糖酯酶（AXE）和/或葡糖醛酸酯酶（GE）的转基因植物，更具体但非限制性地，本发明涉及该转基因植物在各种应用如用于生物质转化（例如，生物燃料、制氢）、用于饲料和食品应用、以及用于纸浆和造纸工业中的应用。
背景技术
与世界人口的快速增长相一致，自然资源和环境质量在不断下降。目前主要基于化石燃料的能量消耗方法被认为是对环境有害的并且促使全球变暖。为了解决该日益增长的问题，对于由可再生资源（尤其是那些来自植物生物质的可再生资源）产生燃料的关注已增加。迄今为止，大多数乙醇燃料已产生自玉米粒或甘蔗，也称为"第一代"原料。此类作物到生物燃料的生物转化与粮食生产竞争土地和水资源，因而具有较高的原料成本并且仅替代小比例的化石燃料生产。与开发"第二代"源自生物质的生物燃料有关的主要挑战包括使每年每公顷的生物质产率（产量，yield）最大化，保持可持续性，同时最大限度地减少农业投入并防止与粮食生产的竞争。
考虑到这些因素，很多关注已集中在木质纤维素生物质到可发酵糖类的转化。最终，木质纤维素来源的乙醇具有满足大部分全球运输性燃料需求的潜力，并且对粮食供给的影响小得多，以及具有较低的农业投入，并且具有较少的净二氧化碳排放量（和化石燃料相比）。然而，由于植物细胞壁的复杂结构，纤维素生物质比在第一代生物质中存在的淀粉更难以分解成糖类。木质纤维素生物质原料由复杂结构构成，其主要包含纤维素、半纤维素和木质素，其天然产生以用于提供结构支持并抵抗各种生物及其相关酶的分解。
各组分的量、它们之间的比率、和半纤维素的类型很大程度上取决于原料类型。
目前，木质纤维素生物质到生物乙醇的转化采用三步法，包括预处理阶段（例如，基于热/酸的预处理），随后是经由水解将纤维素和半纤维素糖化成简单糖类，以及最后将游离糖类发酵成乙醇或丁醇。还已设想了另外的转化途径，如那些采用中间降解产物的转化途径。预处理阶段的特征在于，除去细胞壁内在基质多糖和木质素之间的交联键，其中利用有毒溶剂和高能输入[即，反应条件可以采用，例如，多达3%的硫酸，120°C-200°C，以及3-15atm；Wyman CE et al.,Bioresour Technol(2005)96(18):1959-1966]。除了诸如这些方法的昂贵以外，预处理阶段还产生毒性副产物如乙酸和糠醛，其随后在处理的后期阶段期间抑制水解酶和发酵。
认为木质化程度和纤维素结晶度是最重要的因素，其促使木质纤维素原料耐受化学物质或酶。因此，目前的生产方法涉及大量的热能和浓酸，其引起细胞壁溶胀，从而使得能够除去木质素和/或使得能够增溶一些半纤维素，致使纤维素多糖更容易进入糖化过程。
目前用来产生更适合于糖化的木素纤维素作物的转基因策略已集中于细胞壁木质素组分的改造。例如，木质素生物合成的操作导致降低的木质素和增加的多糖降解性，但也对（基因）工程化植物的机械支持、抗病性和水分运输具有不利影响[Halpin C et al.,Tree Genetics&Genomes(2007)3(2):101-110;Pedersen JF et al.,Crop Science(2005)45(3):812-819]。
另外的背景技术包括美国申请号20070250961、美国专利号7666648、PCT申请号WO2009033071、美国申请号20100017916、美国申请号20100031400、美国申请号20100043105、PCT申请号WO2009042846、PCT申请号WO2009132008、PCT申请号WO2009155601、美国申请号20100031399和PCT申请号WO2009149304。
发明内容
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了用于工程化（改造，engineering）在细胞壁中具有降低的乙酰化的植物的方法，该方法包括，在次生细胞壁沉积之后，在植物细胞壁中特别活跃的发育调节启动子的转录调控下，在植物细胞壁中表达至少一种经分离的编码乙酰木聚糖酯酶（AXE）的异源多核苷酸，从而工程化在细胞壁中具有降低的乙酰化的植物。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了用于工程化在细胞壁中具有降低的乙酰化的植物的方法，该方法包括在植物细胞壁中表达至少一种经分离的编码乙酰木聚糖酯酶（AXE）的异源多核苷酸，其中AXE酶选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:14组成的组中，从而工程化在细胞壁中具有降低的乙酰化的植物。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了用于工程化在细胞壁中具有降低的木质素半纤维素酯交联的植物的方法，该方法包括，在次生细胞壁沉积之后，在植物细胞壁中特别活跃的发育调节启动子的转录调控下，在植物细胞壁中表达至少一种经分离的编码葡糖醛酸酯酶（GE）的异源多核苷酸，从而工程化在细胞壁中具有降低的木质素半纤维素酯交联的植物。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了用于工程化在细胞壁中具有降低的木质素半纤维素酯交联的植物的方法，该方法包括在植物细胞壁中表达至少一种经分离的编码葡糖醛酸酯酶（GE）的异源多核苷酸，其中GE酶选自由SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12组成的组中，从而工程化在细胞壁中具有降低的木质素半纤维素酯交联的植物。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了基因改造植物（genetically modified plant），在次生细胞壁沉积之后，在植物细胞壁中特别活跃的发育调节启动子的转录调控下，上述基因改造植物表达编码乙酰木聚糖酯酶（AXE）的异源多核苷酸。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了基因改造植物，其表达编码如在SEQ ID NO:2、4、6或14中给出的乙酰木聚糖酯酶（AXE）的异源多核苷酸。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了基因改造植物，在次生细胞壁沉积之后，在植物细胞壁中特别活跃的发育调节启动子的转录调控下，上述基因改造植物表达编码葡糖醛酸酯酶（GE）的异源多核苷酸。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了基因改造植物，其表达编码如在SEQ ID NO:8、10或12中给出的葡糖醛酸酯酶（GE）的异源多核苷酸。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了基因改造植物，在次生细胞壁沉积之后，在植物细胞壁中特别活跃的发育调节启动子的转录调控下，该基因改造植物共表达编码乙酰木聚糖酯酶（AXE）的异源多核苷酸和编码葡糖醛酸酯酶（GE）的异源多核苷酸。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了基因改造植物，其共表达编码如在SEQ ID NO:2、4、6或14中给出的乙酰木聚糖酯酶（AXE）的异源多核苷酸和编码如在SEQ ID NO:8、10或12中给出的葡糖醛酸酯酶（GE）的异源多核苷酸。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种植物***，包括：（i）权利要求13或14所述的第一基因改造植物；以及（ii）根据权利要求15或16所述的第二基因改造植物。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了用于产生在细胞壁中具有降低的乙酰化和降低的木质素半纤维素酯交联的植物的方法，该方法包括：（a）在次生细胞壁沉积之后，在细胞壁中特别活跃的发育调节启动子的转录调控下，在第一植物中表达编码乙酰木聚糖酯酶（AXE）的异源多核苷酸；（b）在次生细胞壁沉积之后，在细胞壁中特别活跃的发育调节启动子的转录调控下，在第二植物中表达编码葡糖醛酸酯酶（GE）的异源多核苷酸；以及（c）杂交第一植物和第二植物并选择表达乙酰木聚糖酯酶（AXE）和葡糖醛酸酯酶（GE）的子代，从而产生在细胞壁中具有降低的乙酰化和降低的木质素半纤维素酯交联的植物。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了用于产生在细胞壁中具有降低的乙酰化和降低的木质素半纤维素酯交联的植物的方法，该方法包括：（a）在第一植物中表达编码如在SEQ ID NO:2、4、6或14中给出的乙酰木聚糖酯酶（AXE）的异源多核苷酸；（b）在第二植物中表达编码如在SEQ ID NO:8、10或12中给出的葡糖醛酸酯酶（GE）的异源多核苷酸；以及（c）杂交第一植物和第二植物并选择表达乙酰木聚糖酯酶（AXE）和葡糖醛酸酯酶（GE）的子代，从而产生在细胞壁中具有降低的乙酰化和降低的木质素半纤维素酯交联的植物。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了食物或饲料，其包含权利要求13、14、15、16、17、18、20或21所述的基因改造植物。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了用于产生生物燃料的方法，该方法包括：（a）在使得降解木素纤维素能够形成水解产物混合物的条件下，培育根据权利要求13、14、15、16、17、18、20或21中任一项所述的基因改造植物；以及（b）在促使水解产物混合物的可发酵糖类转化成乙醇、丁醇、乙酸或乙酸乙酯的条件下，温育水解产物混合物，从而产生生物燃料。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了包含多核苷酸的核酸构建体，在次生细胞壁沉积之后，在植物细胞壁中特别活跃的发育调节启动子的转录调控下，该多核苷酸编码异源乙酰木聚糖酯酶（AXE）。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了包含多核苷酸的核酸构建体，在次生细胞壁沉积之后，在植物细胞壁中特别活跃的发育调节启动子的转录调控下，该多核苷酸编码异源葡糖醛酸酯酶（GE）。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种核酸构建体，该核酸构建体包含编码异源乙酰木聚糖酯酶（AXE）的多核苷酸和编码异源葡糖醛酸酯酶（GE）的多核苷酸，均在次生细胞壁沉积之后，在植物细胞壁中特别活跃的发育调节启动子的转录调控下。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种核酸构建体，该核酸构建体包含在FRA8启动子的转录调控下编码如在SEQ ID NO:1中给出的异源乙酰木聚糖酯酶（AXE）的多核苷酸。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种核酸构建体，该核酸构建体包含在FRA8启动子的转录调控下编码如在SEQ ID NO:13中给出的异源乙酰木聚糖酯酶（AXE）的多核苷酸。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种核酸构建体，该核酸构建体包含在FRA8启动子的转录调控下编码如在SEQ ID NO:7中给出的异源葡糖醛酸酯酶（GE）的多核苷酸。
根据本发明的一些实施方式，该方法进一步包括在植物中表达编码葡糖醛酸酯酶（GE）的另外的异源多核苷酸。
根据本发明的一些实施方式，该方法进一步包括在植物中表达编码乙酰木聚糖酯酶（AXE）的另外的异源多核苷酸。
根据本发明的一些实施方式，在次生细胞壁沉积之后，在植物细胞壁中特别活跃的发育调节启动子的转录调控下，表达另外的异源多核苷酸。
根据本发明的一些实施方式，AXE酶选自由SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:14组成的组中。
根据本发明的一些实施方式，GE酶选自由SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12组成的组中。
根据本发明的一些实施方式，以组织特异性方式表达经分离的异源多核苷酸。
根据本发明的一些实施方式，组织选自由茎和叶组成的组。
根据本发明的一些实施方式，组织包括木质部或韧皮部。
根据本发明的一些实施方式，在次生细胞壁沉积之后，在植物细胞壁中特别活跃的发育调节启动子的转录调控下，表达异源多核苷酸。
根据本发明的一些实施方式，AXE酶是如在SEQ ID NO:2、4、6或14中给出的。
根据本发明的一些实施方式，GE酶是如在SEQ ID NO:8、10或12中给出的。
根据本发明的一些实施方式，编码AXE酶的异源多核苷酸是如在SEQ ID NO:1、3、5或13中给出的，并且编码GE酶的异源多核苷酸是如在SEQ ID NO:7、9或11中给出的。
根据本发明的一些实施方式，和同一物种的非转基因植物相比，该植物包括在植物的细胞中半纤维素和木质素之间的降低的共价连接。
根据本发明的一些实施方式，和同一物种的非转基因植物相比，该植物包括在植物的细胞中降低的乙酰化。
根据本发明的一些实施方式，植物选自由以下各项组成的组中：玉米、柳枝稷（switchgrass）、高粱、芒属、甘蔗、杨树、松树、小麦、水稻、大豆、棉花、大麦、草坪草、烟草、竹、油菜、甜菜、向日葵、柳树、***、和桉树。
根据本发明的一些实施方式，和同一物种的非转基因植物相比，所需条件包括较少的预处理化学品。
根据本发明的一些实施方式，编码AXE酶的多核苷酸是如在SEQ IDNO:1、3、5或13中给出的。
根据本发明的一些实施方式，编码GE酶的多核苷酸是如在SEQ IDNO:7、9或11中给出的。
根据本发明的一些实施方式，核酸构建体进一步包含编码信号肽的核酸序列，该信号肽能够引导AXE或GE在植物细胞壁中的表达。
根据本发明的一些实施方式，将编码AXE酶或GE酶的异源多核苷酸结合于编码信号肽的核酸序列，其中该信号肽能够引导AXE或GE在植物细胞壁中的表达。
根据本发明的一些实施方式，信号肽选自由以下各项组成的组：拟南芥内切葡聚糖酶细胞信号肽、拟南芥膨胀素样A1（拟南芥扩张蛋白样A1，Arabidopsis thaliana Expansin-like A1）、拟南芥木葡聚糖内切转葡糖基酶（Arabidopsis thaliana Xyloglucan endotransglucosylase）/水解酶蛋白22、拟南芥果胶酯酶/果胶酯酶抑制剂18、拟南芥伸展蛋白样蛋白1（Arabidopsis thaliana extensin-like protein1）、拟南芥漆酶-15和银白杨内切-1,4-β-葡聚糖酶（白杨远藤内切-1,4-β-葡聚糖酶，Populus albaEndo-1,4-beta glucanase）。
根据本发明的一些实施方式，信号肽包括拟南芥内切葡聚糖酶细胞信号肽。
根据本发明的一些实施方式，启动子选自由以下各项组成的组：4cl、CesA1、CesA7、CesA8、IRX3、IRX4、IRX10、DOT1和FRA8。
根据本发明的一些实施方式，启动子包括FRA8。
除另有定义之外，本文中使用的所有的技术和/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。虽然类似或等价于本文描述的方法和材料可以用于本发明的实施方式的实施或试验，但以下描述了示例性的方法和/或材料。在冲突的情况下，以专利说明书（包括定义）为准。另外，材料、方法、和实施例仅是说明性的而不必意图限制。
附图说明
仅通过举例的方式，并参照附图，本文描述了本发明的一些实施方式。现在详细地具体参照附图，应强调的是，显示的细节是通过举例的方式并且用于本发明的实施方式的说明性讨论的目的。在这方面，描述连同附图一起使本领域技术人员明了可以如何实施本发明的实施方式。
在附图中：
图1示出了用乙酰木聚糖酯酶（AXE）改造的乙酰化木聚糖。
图2A-图2B示出了真菌AXE在植物细胞壁中的表达，其致使增加的木聚糖溶解性。图2A示出了包含纤维素和木聚糖的紧密堆积基质的野生型纤维素微纤丝，其受限地接近水解酶；图2B示出了AXE的表达，在预处理之后木聚糖溶解度增加，将纤维素暴露至水解酶。
图3示出了葡糖醛酸酯酶（GE）去酯化在木质素和葡糖醛酸木聚糖（GX）的4-O-Me-GlcA残基之间的化学键。
图4A-图4D是AXE和GE载体的示意图，其中该载体可以根据本发明的一些实施方式产生并用于植物转化。
图5A-图5D示出了在转基因烟草植物中异源AXE/GE的表达的PCR分析。图5A示出了用FRA8::AXEI载体转化的植物的PCR结果；图5B示出了用FRA8::AXEII载体转化的植物的PCR结果；图5C示出了用FRA8::GE载体转化的植物的PCR结果；以及图5D示出了用35S::AXEII载体转化的植物的PCR结果。数字表示独立事件，+对照表示阳性对照，w.t=野生型植物（在相同培育条件下培育的非转化植物）。
图6A-图6H示出了在野生型（WT）和转基因植物中AXE和GE基因的RT-PCR产物。示出了典型的独立系（line）。图6A示出了用FRA8::AXEI载体转化的植物的结果；图6B示出了用FRA8::AXEII载体转化的植物的结果；图6C示出了用FRA8::GE载体转化的植物的结果；以及图6D示出了用35S::AXEII载体转化的植物的结果。W.T=野生型；数字表示独立系（line）。
图7示出了在表达不同AXE和野生型（WT）的4周龄转基因植物中的乙酰木聚糖酯酶活性（pNP-乙酰基用作底物）。
图8示出了释放自野生型（WT）和AXE植物的4周龄茎的细胞壁的乙酰基的定量分析。用NaOH处理茎的细胞壁材料（CWM）并分析释放的乙酰基。数据表示两次独立测定的平均值。
图9示出了来自表达不同AXE、GE的烟草植物或野生型植物（WT）的4周龄茎的生物质的糖化。利用DNS测定，测量了在热水预处理随后24小时酶水解之后释放自1mg生物质的减少的糖类。
具体实施方式
在本发明的一些实施方式中，其涉及表达乙酰木聚糖酯酶（AXE）和/或葡糖醛酸酯酶（GE）的转基因植物，更具体但不限制地，涉及上述转基因植物在各种应用如用于生物质转化（例如，生物燃料、制氢），用于饲料和食品应用，以及用于纸浆和造纸工业中的应用。
参照附图和随附的说明，可以更好地理解本发明的原理和操作。
在详细说明本发明的至少一种实施方式之前，可以理解，本发明的应用不一定限于在以下描述中陈述的细节或通过实施例例证的细节。本发明能够具有其它实施方式或能够以各种方式实施或进行。另外，可以理解，本文中采用的措辞和术语是用于描述的目的而不应看作是限制性的。
本发明人已发现用于工程化植物的新方法，其中通过改造植物细胞壁以及增加在植物的木质纤维素生物质内的纤维素可及性（accessibility）。根据本发明的教导，改造植物表型使得在植物生长期间改造植物细胞壁。这种优化改造使得能够产生这样的植物，其保持足够的木质纤维素的完整性以提供能够在田间高密度栽培的直立植物。另外，本发明使得能够产生这样的植物，其优化工业糖化过程而没有不利地影响工程化植物（工程植物，engineered plant）的机械适应性。
如在下文中和在随后的实施例部分中说明的，本发明人已产生核酸构建体，该核酸构建体包含乙酰木聚糖酯酶（AXE，例如，SEQ ID NO:1或13）或葡糖醛酸酯酶（GE，例如，SEQ ID NO:7）的多核苷酸序列，其融合至发育特异性启动子，在次生细胞壁发育之后，该发育特异性启动子能够引导酶的表达（例如，FRA8，参见实施例1）。为了将AXE和GE酶定位于细胞壁，进一步产生核酸构建体以包括框内细胞壁特异性信号肽（例如，拟南芥内切葡聚糖酶细胞信号肽，SEQ ID NO:22，参见实施例1）。本发明人已表明，在烟草植物中这些核酸构建体的表达致使产生包含活性AXEI和AXEII蛋白的直立转基因植物（数据未示出）（实施例4）。本发明人已进一步表明，在细胞壁材料（CWM，参见实施例5）中乙酸释放减少50%，和野生型植物（实施例6）相比，在表达AXE或GE的植物中糖化效率提高5%至40%。这些结果优于在组成型启动子（35S）的调控下表达AXE酶的转基因植物。
因此，根据本发明的一个方面，提供了用于工程化在细胞壁中具有降低的乙酰化的植物的方法，该方法包括，在次生细胞壁沉积之后，在植物细胞壁中特别活跃的发育调节启动子的转录调控下，在植物细胞壁中表达至少一种经分离的编码乙酰木聚糖酯酶（AXE）的异源多核苷酸，从而工程化在植物的细胞壁中具有降低的乙酰化的植物。
根据另一个方面，提供了用于工程化在植物的细胞壁中具有降低的乙酰化的植物的方法，该方法包括在植物细胞壁中表达至少一种经分离的编码乙酰木聚糖酯酶（AXE）的异源多核苷酸，其中AXE酶选自由SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:14组成的组，从而工程化在细胞壁中具有降低的乙酰化的植物。
根据另一个方面，提供了用于工程化在细胞壁中具有降低的木质素半纤维素酯交联的植物的方法，该方法包括，在次生细胞壁沉积之后，在植物细胞壁中特别活跃的发育调节启动子的转录调控下，在植物细胞壁中表达至少一种经分离的编码葡糖醛酸酯酶（GE）的异源多核苷酸，从而工程化在细胞壁中减少木质素半纤维素酯交联的植物。
根据另一个方面，提供了用于工程化在细胞壁中具有降低的木质素半纤维素酯交联的植物的方法，该方法包括在植物细胞壁中表达至少一种经分离的编码葡糖醛酸酯酶（GE）的异源多核苷酸，其中GE酶选自由SEQID NO:8、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12组成的组，从而工程化在细胞壁中减少木质素半纤维素酯交联的植物。
如在本文中所使用的，术语“植物”是指全植物、植物部分（例如，截枝、块茎、花粉）、植物器官（例如，叶、茎、花、根、果实、种子、枝等）或从其分离的细胞（细胞的同质群或异质群）。
如在本文中所使用的，短语"基因改造植物"是指这样的植物，其中利用通过人工干预方式引入的外源多核苷酸序列稳定或瞬时转化植物的一种或多种细胞。转基因植物通常表达DNA序列，其赋予植物不同于同株的原生、非转基因植物的性状。
如在本文中所使用的，短语“经分离的植物细胞”是指这样的植物细胞，其源自分解的植物细胞组织或植物细胞培育物。
根据本发明的这些实施方式，设想了任何有商业或科学价值的植物。用于本发明的方法的适宜植物可以是适合于转化技术的任何高等植物，包括单子叶或双子叶植物，以及某些低等植物如藻类和藓类。如在本文中所使用的，术语植物是指绿色田间植物以及专门为生物质能而培育的植物。本发明的植物包括，但不限于，苜蓿、竹、大麦、豆类、甜菜、花椰菜、甘蓝、油菜、番椒、胡萝卜、玉米、棉花、三叶杨（例如Populus deltoides）、桉树、***、木槿、小扁豆、莴苣、玉米、芒属、菊花、燕麦、黄秋葵、花生、豌豆、胡椒、马铃薯、杨树、松树（pinus sp.）、马铃薯、油菜、水稻、黑麦、大豆、高粱、甜菜、甘蔗、向日葵、枫香、柳枝稷、番茄、烟草、草坪草、小麦、和柳树、以及列于World Wide Web(点)nationmaster(点)com/encyclopedia/Plantae（www.nationmaster.com/encyclopedia/Plantae）中的其它植物。
因此，植物科可以包括葱科、苋科、石蒜科、夹竹桃科、菊科、紫草科、字花科、桔梗科、石竹科、藜科、菊科、十字花科、葫芦科、大戟科、豆科、禾本科、风信子科、唇形科、豆科蝶形花亚科（Leguminosae-Papilionoideae）、百合科、亚麻科、锦葵科、商陆科、禾本科、松科、蔷薇科、玄参科、茄科、旱金莲科、伞形科和堇菜科。
如在本文中所使用的，短语"植物的细胞壁"是指这样层，其围绕植物细胞膜并向植物细胞提供结构支持和保护，并且通常作为过滤机制。本教导的植物细胞壁可以包括初生细胞壁和/或次生细胞壁。
通常，初生细胞壁主要由以下各项组成：多糖（例如，纤维素、半纤维素和果胶）以及较少量的结构糖蛋白（富含羟脯氨酸的伸展蛋白）、酚酯（阿魏酸和香豆酸）、离子键和共价键结合的矿物质（例如钙和硼）、酶和蛋白质（例如扩展蛋白）。经由半纤维素链（hemicellulosic tether）连接纤维素微纤丝以形成纤维素-半纤维素网络，其被嵌入（embed）果胶基质中。在初生细胞壁中最常见的半纤维素是木葡聚糖。
木质组织和草类的次生壁主要包括纤维素、木质素和半纤维素（木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、***木聚糖、或葡甘露聚糖）。纤维素纤丝内嵌于半纤维素和木质素的网络中。
本发明提供了细胞壁改造酶，特别是乙酰木聚糖酯酶（AXE）和葡糖醛酸酯酶（GE），其可以单独或结合使用以增加在植物的木质纤维素生物质内的纤维素可及性。
如在本文中所使用的，术语"乙酰木聚糖酯酶"（也称为乙酰基木聚糖酯酶或AXE）是指EC分类3.1.1.72的酶，其在植物的细胞壁中催化木聚糖和低聚木糖的脱乙酰。根据本发明，可以使用的示例性AXE酶是如在SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:14中给出的。
如在本文中所使用的，术语"葡糖醛酸酯酶"（也称为GE）是指EC分类3.1.1.-的酶，其在植物细胞壁中连接木质素和半纤维素的共价键中，水解在葡糖醛酸木聚糖的4-O-甲基-D-葡糖醛酸和木质素醇之间的酯键。根据本发明，可以使用的示例性GE酶是如在SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12中给出的。
木质纤维素生物质是复杂的底物，其中结晶纤维素被嵌入半纤维素和木质素的基质内。木质纤维素占大多数植物物质的约90%的干重，其中纤维素构成木质纤维素干重的约30%至50%，以及半纤维素构成木质纤维素干重的约20%至50%。通过木质纤维素酶，如乙酰木聚糖酯酶（AXE，参见图1和图2A-图2B）和葡糖醛酸酯酶（GE，参见图3），如本发明教导的，木质纤维素的破坏和降解（例如，水解）导致：（1）通过AXE，总半纤维素残基的乙酰化降低，特别是在半纤维素内的木聚糖的乙酰化的降低；以及（2）通过GE，半纤维素-纤维素-木质素、半纤维素-纤维素-果胶、葡糖醛酸木聚糖-木质素、和其组合的键断裂，从而致使降低的细胞壁结晶度和/或致使形成诸如乙酸的物质，增加聚合物的溶解度、水解酶的可及性，从而降低制浆能（pulping energy）以及生物转化酶和能量的投入成本。
如在本文中所使用的，术语"细胞壁乙酰化"是指在植物的细胞壁中木聚糖的乙酰化。
如在本文中所使用的，术语"降低的乙酰化"是指在转基因植物的细胞壁中木聚糖的脱乙酰，其相比于在同一物种的非转基因植物的细胞壁中产生的脱乙酰。优选地，相比于同一物种的非转基因植物，乙酰化的降低是降低约1%、约2%、约3%、约4%、约5%、约6%、约7%、约8%、约9%、约10%、约15%、约20%、约25%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%或约100%。具有降低的乙酰化的转基因植物通常包括增加的水解酶的可及性，因而减少的制浆能。
可以利用本领域技术人员已知的任何方法测量在植物细胞壁中的乙酰化，例如，通过首先从植物材料分离细胞壁，将约10mg样品放入配有例如气密帽或盖的离心管中，将约1ml的异丙醇/NaOH溶液（在4°C下）加入每个管中，封管，然后轻轻混合。然后可以在室温下静置混合物约2小时，随后在2,000g下（在室温下）离心约10分钟。然后可以除去上清液并放入具有隔膜的小瓶中，立即密封。然后可以将15μl的样品注入HPLC***，其装有例如rezex RHM-单糖柱和5mM的H2SO4溶剂***，流速设置为约0.6ml/分钟，温度设置为30°C。使用的折射率检测器可以设置在40°C。
如在本文中所使用的，术语"共价连接"是指在植物的细胞壁中具有的在半纤维素和木质素之间的共价键。
如在本文中所使用的，术语"降低的共价连接"是指，和在同一物种的非转基因植物的细胞壁中发现的那些共价连接相比，在转基因植物的细胞壁中发现的在半纤维素和木质素之间的共价连接的数目。优选地，和同一物种的非转基因植物相比，共价连接的减少是减少约1%、约2%、约3%、约4%、约5%、约6%、约7%、约8%、约9%、约10%、约15%、约20%、约25%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%或约100%。在半纤维素和木质素之间具有降低的共价连接的转基因植物通常具有木质素和半纤维素的增加的分离，其得到更适用于糖化过程和动物饲料的原料。
可以利用本领域普通技术人员已知的任何方法测量降低的共价连接，例如，通过测量在植物的细胞壁中木质素和半纤维素之间的酯键的量。一种示例性方法包括用FT-IR分光光度计并利用包含1%的精细磨制样品的KBr圆片获得生物质样品的FT-IR谱。其后，对每个样品以传输方式进行多次扫描，记录4000至400cm-1，分辨率为2cm-1。在约1730cm-1下峰的变化通常与糖醛基团和酯基团的量或阿魏酸和/或对香豆酸的羧基的酯连接相关。
根据本发明的一个方面，该方法包括在植物中表达另外的编码葡糖醛酸酯酶（GE）的异源多核苷酸。根据本发明的方法，可以使用的示例性GE酶是如在SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12中给出的。
根据本发明的一个方面，该方法包括在植物中表达另外的编码乙酰木聚糖酯酶（AXE）的异源多核苷酸。根据本发明的方法，可以使用的示例性AXE酶是如在SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ IDNO:14中给出的。
编码AXE和GE多肽的多核苷酸（本文设想的）还指这些酶的功能等效物。用于测定AXE和GE活性的方法是本领域公知的，并且包括，例如，测量细胞壁乙酰化（即，用于AXE的表达和活性），测量在木质素和半纤维素之间的酯键的量（即，用于GE的表达和活性），或相比于相同类型的非转化植物，测量转化植物的糖化产率和制浆效率（如在随后的实施例部分的实施例1详细描述的）。
因此，本文描述的多核苷酸可以编码多肽，其为至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约81%、至少约82%、至少约83%、至少约84%、至少约85%、至少约86%、至少约87%、至少约88%、至少约89%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约75%、至少约75%、至少约75%、至少约75%，比如100%同一于或同源于SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14（只要功能性得以保持）。
可以利用任何同源性比较软件确定同源性（例如，％同源性），包括例如，National Center of Biotechnology Information（NCBI）的BlastP软件，如通过使用默认参数。
可以利用任何同源性比较软件来确定同一性（例如，％同源性），包括例如，National Center of Biotechnology Information（NCBI）的BlastN软件如通过使用默认参数。
如在本文中所使用的，短语“经分离的多核苷酸”是指单链或双链核酸序列，其被分离并以RNA序列、互补多核苷酸序列（cDNA）、基因组多核苷酸序列和/或复合多核苷酸序列（例如，上述序列的组合）的形式提供。
如在本文中所使用的，短语"互补多核苷酸序列"是指这样的序列，其来自信使RNA的逆转录，其中利用逆转录酶或任何其它RNA依赖性DNA聚合酶。其后可以利用DNA依赖性DNA聚合酶体内或体外扩增这种序列。
如在本文中所使用的，短语"基因组多核苷酸序列"是指这样的序列，其源自（分离自）染色体，因此它表示染色体的邻近部分。
如在本文中所使用的，短语"复合多核苷酸序列"是指这样的序列，其是至少部分互补的和至少部分基因组的。复合序列可以包括编码本发明的多肽所需要的一些外显子序列，以及***其间的一些内含子序列。内含子序列可以具有任何来源，包括其它基因，并且通常将包括保守的剪接信号序列。这种内含子序列可以进一步包括顺式作用表达调节元件。
根据本发明的这一方面的优选实施方式，核酸序列是如在SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11或13中给出的。
在植物中（例如，在其细胞壁中），上文描述的AXE和/或GE酶可以表达自稳定整合或瞬时表达的核酸构建体，其包括编码AXE酶、GE酶的多核苷酸序列，或表达自共表达AXE和GE酶的构建体。在植物功能启动子的转录调控下定位多核苷酸序列。可以构建这样的核酸构建体（其在本文中也称为表达构建体），以在整个全植物中、在限定的植物组织中或在限定的植物细胞中，或在植物的限定的发育阶段进行表达。这样的构建体还可以包括选择标记物（例如抗生素抗性）、增强子元件和用于细菌复制的复制起点。
根据本发明的一种实施方式，本发明的核酸构建体包括多核苷酸，在次生细胞壁沉积之后，在植物细胞壁中特别活跃的发育调节启动子的转录调控下，其编码异源乙酰木聚糖酯酶（AXE）。
根据本发明的一种实施方式，本发明的核酸构建体包括多核苷酸，在次生细胞壁沉积之后，在植物细胞壁中特别活跃的发育调节启动子的转录调控下，其编码异源葡糖醛酸酯酶（GE）。
根据本发明的一种实施方式，本发明的核酸构建体包括编码异源乙酰木聚糖酯酶（AXE）的多核苷酸和编码异源葡糖醛酸酯酶（GE）的多核苷酸，上述编码均在次生细胞壁沉积之后并在植物细胞壁中特别活跃的发育调节启动子的转录调控下。
可以利用本领域技术人员公知的重组DNA技术构建可用于根据本发明的方法的构建体。可以将基因构建体***载体中，其可以是市售的，适用于转化到植物中且适用于在转化细胞中表达关注的基因。基因构建体可以是表达载体，其中将核酸序列可操作地连接至一种或多种调节序列，使得能够在植物细胞中表达。
在本发明特定的实施方式中，调节序列是植物可表达启动子。
如在本文中所使用的，短语"植物可表达"是指启动子序列，其包括任何另外的加入其中或其中包含的调节元件，并且至少能够诱导、赋予、激活或提高在植物细胞、组织或器官，优选单子叶或双子叶植物细胞、组织、或器官中的表达。
可以理解，产生以包括两种可表达***物（例如，AXE和GE酶）的构建体优选包括用于每个***物的单独启动子，或可替换地这些构建体可以表达单转录嵌合体，其包括来自单一启动子的两种***序列。在这种情况下，嵌合转录物包括在两个***序列之间的IRES序列，使得可以从其翻译下游***物。
本发明的构建体可以采用许多植物功能表达启动子和增强子，其可以是组织特异性的、发育特异性的、组成的或可诱导的，下文提供了一些实例。
如在本文中所使用的，在说明书以及在随附的权利要求部分中，短语"植物启动子"或"启动子"包括这样的启动子，其可以引导基因在植物细胞（包括含有DNA的细胞器）中的表达。这样的启动子可以源于植物、细菌、病毒、真菌或动物来源。这样的启动子可以是组成型启动子，即，能够在多种植物组织中引导高水平的基因表达，组织特异性启动子，即，能够在特定植物组织或多个特定植物组织中引导基因表达，诱导型启动子，即，能够在刺激下引导基因表达，或嵌合启动子，即，形成自至少两种不同启动子的部分。
根据本发明的一种实施方式，在次生细胞壁沉积之后，在植物细胞壁中特别活跃的发育调节启动子的转录调控下，表达异源多核苷酸。
因此，通常利用在次生细胞壁沉积之后在植物细胞壁中特别活跃的发育调节启动子构建本发明的GE和/或AXE表达构建体。
如在本文中所使用的，短语"发育调节启动子"是指一种启动子，其能够在植物生长或发育的特定阶段引导基因表达。
如在本文中所使用的，短语"次生细胞壁沉积"是指在次生细胞壁形成期间的阶段，其中正发育的木质部导管在植物质膜的特定部位沉积纤维素。
因此，采用的植物启动子可以是组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子、嵌合启动子或发育调节启动子。
组成型植物启动子的实例包括，但不限于，CaMV35S和CaMV19S启动子、FMV34S启动子、甘蔗杆状病毒启动子、CsVMV启动子、拟南芥ACT2/ACT8肌动蛋白启动子、拟南芥遍在蛋白UBQ1启动子、大麦叶硫堇BTH6启动子、和水稻肌动蛋白启动子。
诱导型启动子是通过特定刺激，如应力条件诱导的启动子，其包括，例如，光照、温度、化学品、干燥、高盐度、渗透压冲击（shock）、氧化剂条件或在致病性的情况下，并且包括，但不限于，源自豌豆rbcS基因的光诱导型启动子、来自苜蓿rbcS基因的启动子、启动子DRE、MYC和MYB（在干燥下具有活性）；启动子INT、INPS、prxEa、Ha hsp17.7G4和RD21（在高盐度和渗透应力下具有活性）、以及启动子hsr203J和str246C（在致病应力下具有活性）。
本发明采用的启动子可以包括强组成型启动子，使得在植物转化之后进行构建***物的过表达。
如提到的，本发明采用的启动子优选为发育调节启动子，使得在次生细胞壁沉积之后在植物细胞壁中表达。这种启动子包括，但不限于，4cl（例如4cl-1）、CesA1（例如巨桉纤维素合成酶CesA1，例如SEQ ID NO:31）、CesA7（例如巨桉CesA7，例如SEQ ID NO:32）、CesA8、IRX3（例如SEQ ID NO:30）、IRX4、IRX10（例如SEQ ID NO:29）、DOT1、和FRA8（例如SEQ ID NO:21）启动子。
根据特定的实施方式，本发明采用的启动子是FRA8启动子。示例性FRA8启动子是如在SEQ ID NO:21中给出的。
根据特定的实施方式，核酸构建体包括多核苷酸，在FRA8启动子的转录调控下，其编码如在SEQ ID NO:1中给出的异源乙酰木聚糖酯酶（AXE）。
根据特定的实施方式，核酸构建体包括多核苷酸，在FRA8启动子的转录调控下，其编码如在SEQ ID NO:13中给出的异源乙酰木聚糖酯酶（AXE）。
根据特定的实施方式，核酸构建体包括多核苷酸，在FRA8启动子的转录调控下，其编码如在SEQ ID NO:7中给出的异源葡糖醛酸酯酶（GE）。
根据本发明的特定实施方式，以组织特异性方式表达AXE和/或GE多核苷酸。
因此，AXE和/或GE酶多肽表达靶向转基因植物的特定组织，使得在植物的生命周期内，这些细胞壁改造酶仅存在于一些植物组织中。例如，可以进行组织特异性表达以在叶和茎中而不是在谷粒或种子中优先表达AXE和/或GE酶。组织特异性表达具有其它益处，包括使酶的表达靶向适当底物。
可以功能上实现组织特异性表达，其中通过引入组成型表达基因以及反义基因，其仅表达在其中基因产物（例如，AXE和/或GE酶多肽）不是所期望的那些组织中。例如，可以引入编码AXE和/或GE酶多肽的基因，使得利用来自花椰菜花叶病毒的35S启动子，表达在所有组织中。利用例如玉米蛋白启动子，在玉米谷粒中基因的反义转录物的表达将防止AXE和/或GE酶多肽在种子中的积累。因此，由引入的基因编码的酶将存在于除谷粒以外的所有组织中。
另外，根据本发明的教导，可以使用一些组织特异性调节基因和/或启动子，如在植物中之前已报道的那些。一些报道的组织特异性基因包括编码种子贮藏蛋白（如油菜籽蛋白、十字花科蛋白（cruciferin）、β-伴大豆球蛋白、和云扁豆蛋白）、玉米蛋白或油体蛋白（如油质蛋白）的基因，或参与脂肪酸生物合成（包括酰基载体蛋白、硬脂酰-ACP去饱和酶、和脂肪酸去饱和酶（fad2-1））的基因，以及在胚胎发育期间表达的其它基因，如Bce4（Kridl et al.,Seed Science Research,1991,1:209）。已描述的组织特异性启动子的实例包括植物凝集素（Vodkin,Prog.Clin.Biol.Res.,1983,138:87;Lindstrom et al.,Der.Genet.,1990,11:160）、玉米醇脱氢酶1（Dennis et al.,Nucleic Acids Res.,1984,12:983）、玉米光捕获复合体（Bansal et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1992,89:3654）、玉米热激蛋白、豌豆小亚单位RuBP羧化酶、Ti质粒甘露氨酸合成酶、Ti质粒胭脂氨酸合成酶、矮牵牛查尔酮异构酶（petunia chalcone isomerase）（van Tunen et al.,EMBO J.,1988,7:125）、富含大豆甘氨酸蛋白1（Keller et al.,Genes Dev.,1989,3:1639）、截短的CaMV35s（Odell et al.,Nature,1985,313:810）、马铃薯糖蛋白（patatin）（Wenzler et al.,Plant Mol.Biol.,1989,13:347）、根细胞（Yamamoto et al.,Nucleic Acids Res.,1990,18:7449）、玉米蛋白（Reinaet al.,Nucleic Acids Res.,1990,18:6425；Kriz et al.,Mol.Gen.Genet.,1987,207:90；Wandelt et al.,Nucleic Acids Res.,1989,172354）、PEPC酶、R基因的复杂关联启动子（Chandler et al.,Plant Cell,1989,1:1175）、查耳酮合酶启动子（Franken et al.,EMBO J.,1991,10:2605）、豌豆球蛋白启动子（Czako et al.,Mol.Gen.Genet.,1992,235:33）、豆云扁豆贮藏蛋白（beanphaseolin storage protein）启动子、DLEC启动子、
启动子、玉米贮藏蛋白（zein storage protein）启动子、来自大豆的羽扁豆球蛋白γ启动子、AT2S1基因启动子、来自拟南芥的ACT11肌动蛋白启动子以及来自甘蓝型油菜的napA启动子。
根据本发明的一种实施方式，组织包括树木和植物的地上部分，其包括，但不限于，茎（包括枝、树干等）、叶、叶片或任何其它生物质原料部分。
根据本发明的另一种实施方式，组织包括木质部或韧皮部。
本发明的核酸构建体还可以包括框内融合至编码上述酶的异源多核苷酸的编码信号肽的其它核酸序列，以使得AXE或GE前肽能够转运到内质网（ER）并通过分泌途径转运到细胞壁。这样的信号肽通常框内连接至多肽的氨基端（即，其上游）并引导编码的多肽进入细胞的分泌途径以及从其最终分泌（例如，到植物细胞壁）。
根据本发明的教导，可以使用的示例性分泌信号序列包括，但不限于，拟南芥内切葡聚糖酶细胞信号肽（例如SEQ ID NO:22）、拟南芥扩展蛋白样A1（例如SEQ ID NO:23）、拟南芥木葡聚糖内转糖基酶/水解酶蛋白22（例如SEQ ID NO:24）、拟南芥果胶酯酶/果胶酯酶抑制剂18（例如SEQID NO:25）、拟南芥伸展蛋白样蛋白1（例如SEQ ID NO:26）、拟南芥漆酶-15（例如SEQ ID NO:27）和银白杨内切-1,4-β-葡聚糖酶（例如SEQ IDNO:28）。
根据实施方式，信号序列包括拟南芥内切葡聚糖酶细胞信号肽（例如SEQ ID NO:22）。
本文中可以使用的另外的示例性信号肽包括烟草病程相关蛋白（PR-S）信号序列（Sijmons et al.,1990,Bio/technology,8:217-221）、植物凝集素信号序列（Boehn et al.,2000,Transgenic Res,9(6):477-86）、来自菜豆的富含羟脯氨酸的糖蛋白的信号序列（Yan et al.,1997,Plant Phyiol.115(3):915-24和Corbin et al.,1987,Mol Cell Biol7(12):4337-44）、马铃薯糖蛋白信号序列（Iturriaga,G et al.,1989,Plant Cell1:381-390和Bevan etal.,1986,Nuc.Acids Res.41:4625-4638.）和大麦α-淀粉酶信号序列（Rasmussen and Johansson,1992,Plant Mol.Biol.18(2):423-7）。
可以理解，利用在每种构建体类型中的相同或不同的选择标记物，可以将本发明使用的任何构建体类型共转化到同一植物中。可替换地，可以将第一构建体类型引入第一植物，而可以将第二构建体类型引入第二同基因植物，其后，可以杂交由其获得的转基因植物并选择子代的双转化体。另外，这种子代的自交可以用于产生对于两种构建体为同型结合的系。
如提到的，可以产生本发明的表达构建体以包含仅AXE多核苷酸、仅GE多核苷酸，或以包含AXE和GE酶。
本发明的编码AXE酶的示例性多核苷酸是如在SEQ ID NO:1、3、5或13中给出的。
本发明的编码GE酶的示例性多核苷酸是如在SEQ ID NO:7、9或11中给出的。
本发明的多肽的核酸序列可以优化植物表达。这种序列改造的实例包括，但不限于，改变G/C含量以更接近在关注的植物物种中通常确定的G/C含量，以及除去在植物物种中非典型发现的密码子，通常被称为密码子优化。
短语"密码子优化"是指选择适当的DNA核苷酸，以用于结构基因或其片段，其接近在关注的植物内的密码子使用。因此，优化基因或核酸序列是指这样的基因，其中天然或自然产生的基因的核苷酸序列已被改造以在植物内使用统计优选的或统计有利的密码子。通常在DNA水平下检测核苷酸序列，并利用任何合适的程序以确定优化在植物物种中表达的编码区，例如如在Sardana et al.(1996,Plant Cell Reports15:677-681)中所描述的。在该方法中，可以通过首先发现，相对于高度表达的植物基因，天然基因的每种密码子的使用的平方成比例偏差，随后平均平方偏差的计算，来计算密码子使用的标准偏差（密码子使用偏倚性的量度）。使用的公式是：1SDCU=n=1N[(Xn-Yn)/Yn]2/N，其中Xn是指在高度表达的植物基因中密码子n的使用频率，其中Yn是指在关注的基因中密码子n的使用频率，以及N是指在关注的基因中密码子的总数。利用Murray等（1989,Nuc Acids Res.17:477-498）的数据编制来自双子叶植物的高表达基因的密码子使用表。
根据用于特定植物细胞类型的优选密码子使用以优化核酸序列的一种方法是基于密码子优化表的直接使用，而没有进行任何额外的统计计算，如在日本通过NIAS（国家农业生物科学研究所）DNA库由密码子使用数据库在线提供的那些密码子优化表（www.kazusa.or.jp/codon/）。密码子使用数据库包括用于多种不同物种的密码子使用表，其中每个密码子使用表已基于在基因库中存在的数据统计确定。
通过利用上述表确定在特定物种（例如，水稻）中的每种氨基酸的最优选或最有利的密码子，编码关注的蛋白质的天然产生的核苷酸序列可以是对上述特定植物物种优化的密码子。这是通过用（关于氨基酸）统计上更有利的相应密码子代替在特定物种基因组中可以具有较低统计发生率的密码子来实现。然而，可以选择一种或多种较不利的密码子，以删除现有的限制部位，在潜在有用的接合处产生新的限制位点（5'和3'端，以加入信号肽或终止盒，内部部位，其可以用来同时切割和剪接区段以产生正确的全长序列），或用来消除可以负面影响mRNA稳定性或表达的核苷酸序列。
天然产生的编码核苷酸序列可以在任何改造之前已包含有多个密码子，其对应于在特定植物物种中的统计有利的密码子。因此，天然核苷酸序列的密码子优化可以包括确定在天然核苷酸序列内并不是统计上有利的密码子（对于特定植物），并根据特定植物的密码子使用表改造这些密码子以产生密码子优化衍生物。改造核苷酸序列可以完全或部分优化植物密码子使用，前提是，和由相应天然产生或天然基因编码的蛋白质相比，以较高水平产生由改造核苷酸序列编码的蛋白质。合成基因的构建（通过改变密码子使用）描述于，例如，PCT专利申请93/07278中。
因此，本发明包括上文描述的核酸序列，其片段，可与其杂交的序列，与其同源的序列，与其直系同源的序列，借助于不同的密码子使用以编码类似多肽的序列，改变的序列，其特征在于突变，如一个或多个核苷酸的缺失、***或替换（天然产生或人为诱导的，随机地或以针对的方式）。
借助于本发明的核酸构建体，可以稳定或瞬时转化植物细胞。在稳定转化中，将本发明的核酸分子整合到植物基因组，这表示稳定和遗传性状。在瞬时转化中，核酸分子是由转化的细胞表达，但它并没有被整合到基因组，这表示瞬时性状。
存在各种方法，其将外源基因引入单子叶和双子叶植物中（Potrykus,I.,Annu.Rev.Plant.Physiol.,Plant.Mol.Biol.(1991)42:205-225;Shimamotoet al.,Nature(1989)338:274-276）。
用于引发外源性DNA稳定整合到植物基因组DNA的原理方法包括两种主要方式：
（i）土壤杆菌介导的基因转移：Klee et al.(1987)Annu.Rev.PlantPhysiol.38:467-486;Klee and Rogers in Cell Culture and Somatic CellGenetics of Plants,Vol.6,Molecular Biology of Plant Nuclear Genes,eds.Schell,J.,and Vasil,L.K.,Academic Publishers,San Diego,Calif.(1989)p.2-25;Gatenby,in Plant Biotechnology,eds.Kung,S.and Arntzen,C.J.,Butterworth Publishers,Boston,Mass.(1989)p.93-112。
（ii）DNA直接吸收：Paszkowski et al.,in Cell Culture and SomaticCell Genetics of Plants,Vol.6,Molecular Biology of Plant Nuclear Geneseds.Schell,J.,and Vasil,L.K.,Academic Publishers,San Diego,Calif.(1989)p.52-68；包括使DNA直接吸收到原生质体中的方法，Toriyama,K.et al.(1988)Bio/Technology6:1072-1074。通过植物细胞的短暂电击诱导的DNA吸收：Zhang et al.Plant Cell Rep.(1988)7:379-384.Fromm et al.Nature(1986)319:791-793。通过粒子轰击，将DNA注入到植物细胞或组织中，Klein et al.Bio/Technology(1988)6:559-563;McCabe et al.Bio/Technology(1988)6:923-926;Sanford,Physiol.Plant.(1990)79:206-209；通过使用微量加液器***：Neuhaus et al.,Theor.Appl.Genet.(1987)75:30-36;Neuhaus and Spangenberg,Physiol.Plant.(1990)79:213-217；细胞培育物、胚胎或胼胝组织的玻璃纤维或碳化硅晶须转化，美国专利号5,464,765；或通过用萌发花粉进行的DNA的直接温育，DeWet et al.in ExperimentalManipulation of Ovule Tissue,eds.Chapman,G.P.and Mantell,S.H.and Daniels,W.Longman,London,(1985)p.197-209；和Ohta,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)83:715-719。
土壤杆菌***包括使用质粒载体，该质粒载体包含整合到植物基因组DNA中的限定的DNA区段。植物组织的接种方法有所不同，其取决于植物物种和土壤杆菌递送***。广泛使用的方式是叶盘程序，其可以用任何组织外植体进行，其中组织外植体提供用于引发全植物分化的良好来源。Horsch et al.in Plant Molecular Biology Manual A5,Kluwer AcademicPublishers,Dordrecht(1988)p.1-9。一种补充方式采用土壤杆菌递送***以及真空渗入。土壤杆菌***尤其可用于产生转基因双子叶植物。
存在将DNA直接转移到植物细胞中的各种方法。在电穿孔中，将原生质体短暂暴露至强电场。在显微注射中，利用非常小的微量移液器，将DNA机械地直接注射到细胞种。在微粒轰击中，将DNA吸附于微粒（microprojectile）如硫酸镁晶体或钨颗粒，然后使微粒物理加速进入细胞或植物组织。
在稳定转化之后，进行植物繁殖。植物繁殖最常用的方法是通过种子。然而，通过种子繁殖的再生有不足之处：由于杂合性，导致在作物中缺乏均一性，这是因为植物根据由孟德尔法则控制的遗传变异产生种子。基本上，各个种子的基因是不同的并且各自将以其自身的特定性状生长。因此，优选的是，产生转化植物，使得再生植物具有母本转基因植物的相同的性状和特征。因此，优选的是，通过微繁殖使转化植物再生，其中上述微繁殖提供转化植物的快速、一致的繁殖。
微繁殖是由单片组织培育新生代（new generation）植物的过程，其中单片组织已从选定的母本植物或栽培品种切除。此过程使得植物能够大量繁殖，其中上述植物具有表达融合蛋白的优选组织。产生的新生代植物在基因上同一于原植物，并且具有原植物的所有特性。微繁殖使得能够在短时间段内大量产生优质的植物材料并提供所选栽培品种的快速繁殖，同时保存原始转基因或转化植物的特性。克隆植物的优点是植物繁殖的速度以及所产生的植物的品质和均一性。
微繁殖是多阶段过程，其需要在各阶段之间改变培养基或生长条件。因此，微繁殖过程涉及4个基本阶段：第一阶段，最初的组织培养；第二阶段，组织培养繁殖；第三阶段，分化和植物形成；以及第四阶段，温室培养和硬化。在第一阶段（最初的组织培养）期间，建立组织培养物并确保无污染。在第二阶段期间，倍增最初的组织培养物，直到产生足够数量的组织样品以满足生产目标。在第三阶段期间，将第二阶段中培育的组织样品切分并培育成单独的小植株。在第四阶段，将转化小植株转移到温室，用于硬化，其中逐渐增加植物的光耐受性，以使其可以在自然环境中生长。
虽然目前优选稳定转化，但本发明还设想了叶细胞、分生细胞或全植物的瞬时转化。
可以通过上文描述的任何DNA直接转移方法或通过病毒感染（利用经改造的植物病毒）进行瞬时转化。
已表明可用于植物宿主转化的病毒包括CaMV、TMV和BV。利用植物病毒进行的植物转化描述于美国专利号4,855,237（BGV）、EP-A67,553（TMV）、日本公开申请号63-14693（TMV）、EPA194,809（BV）、EPA278,667（BV）、以及Gluzman,Y.et al.,Communications in MolecularBiology:Viral Vectors,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,pp.172-189（1988）中。用于在许多宿主（包括植物）中表达外源DNA的假病毒颗粒描述于WO87/06261中。
用于向植物中引入和表达非病毒外源核酸序列的植物RNA病毒的构建示出于上述文献以及Dawson,W.O.et al.,Virology(1989)172:285-292;Takamatsu et al.EMBO J.(1987)6:307-311；French et al.Science(1986)231:1294-1297；和Takamatsu et al.FEBS Letters(1990)269:73-76中。
当病毒是DNA病毒时，可以对病毒本身进行适当改造。可替换地，可以首先将病毒克隆到细菌质粒，以便构建具有外源DNA的所期望的病毒载体。然后可以从质粒切除病毒。如果病毒是DNA病毒，则可以将细菌复制起点连接至病毒DNA，然后通过细菌复制。这种DNA的转录和翻译将产生将包裹病毒DNA的外壳蛋白。如果病毒是RNA病毒，则通常将病毒克隆为cDNA并***质粒中。然后质粒用来进行所有的构建。然后通过转录质粒的病毒序列和病毒基因的翻译产生RNA病毒以产生包裹病毒RNA的外壳蛋白。
用于向植物中引入和表达非病毒外源核酸序列（如那些包括在本发明的构建体中的非病毒外源核酸序列）的植物RNA病毒的构建示出于上述文献以及美国专利号5,316,931中。
在一种实施方式中，提供了一种植物病毒核酸，其中天然外壳蛋白编码序列已从病毒核酸中删除，并已***非天然植物病毒外壳蛋白编码序列和非天然启动子，优选非天然外壳蛋白编码序列的亚基因组启动子，其能够在植物宿主中表达，包装重组植物病毒核酸，以及确保通过重组植物病毒核酸的宿主的***性感染。可替换地，可以通过在其中***非天然核酸序列以使外壳蛋白基因减活，使得产生蛋白质。重组植物病毒核酸可以包含一种或多种另外的非天然亚基因组启动子。每种非天然亚基因组启动子能够在植物宿主中转录或表达邻近基因或核酸序列以及不能够与彼此和与天然亚基因组启动子重组。如果包括多于一种核酸序列，则可以相邻于天然植物病毒亚基因组启动子或天然和非天然植物病毒亚基因组启动子***非天然（外源）核酸序列。在亚基因组启动子的调控下，在寄主植物中，转录或表达非天然核酸序列以产生所期望的产物。
在第二种实施方式中，如在第一种实施方式中，提供了重组植物病毒核酸，不同之处在于，相邻于非天然外壳蛋白亚基因组启动子中的一个放置天然外壳蛋白编码序列来代替非天然外壳蛋白编码序列。
在第三种实施方式中，提供了重组植物病毒核酸，其中天然外壳蛋白基因相邻于其亚基因组启动子，并且一个或多个非天然亚基因组启动子已被***病毒核酸中。***的非天然亚基因组启动子能够在植物宿主中转录或表达相邻基因，并且不能够与彼此和与天然亚基因组启动子重组。可以相邻于非天然亚基因组植物病毒启动子***非天然核酸序列，使得在亚基因组启动子的调控下在寄主植物中转录或表达所述序列以产生所期望的产物。
在第四种实施方式中，如在第三种实施方式中，提供了重组植物病毒核酸，不同之处在于，用非天然外壳蛋白编码序列代替天然外壳蛋白编码序列。
用由重组植物病毒核酸编码的外壳蛋白封装病毒载体以产生重组植物病毒。重组植物病毒核酸或重组植物病毒用来感染合适的寄主植物。重组植物病毒核酸能够在宿主中复制、在宿主中***扩散、以及在宿主中转录或表达外源基因（经分离的核酸），以产生所期望的蛋白质。
除了上述以外，还可以将本发明的核酸分子引入叶绿体基因组，从而使得能够叶绿体表达。
用于将外源核酸序列引入到叶绿体的基因组中的技术是已知的。此技术涉及以下过程。首先，化学处理植物细胞以使每个细胞的叶绿体数目减少至约1个。然后，经由粒子轰击，将外源核酸引入细胞中，其目的是将至少一个外源核酸分子引入叶绿体中。选择外源核酸，使得经由同源重组（通过叶绿体本身的酶，其容易实现），可以将其整合到叶绿体的基因组。为此，除了关注的基因以外，外源核酸还包括至少一段核酸序列，其源于叶绿体的基因组。另外，外源核酸包括可选择的标记物，通过顺序选择过程，以及在这样的选择之后，其用来确保叶绿体基因组的所有或基本上所有的复制体都将包括外源核酸。关于这种技术的进一步详情可参见美国专利号4,945,050和5,693,507，其以引用方式结合于本文中。因此，多肽可以通过叶绿体的蛋白表达***产生并被整合到叶绿体的内膜中。
可以理解，本发明的AXE和GE酶可以共表达在单个植物中，或可替换地，可以表达在两个独立的植物中。如果酶表达在两个独立的植物中，那么可以培育这些植物以获得共表达两种酶的植物。
因此，根据本发明的一种实施方式，表达AXE的第一植物可以与表达GE的第二植物杂交。
应当指出，虽然上述植物培育方式采用两个独立转化的植物，但还可以采用使用三个以上独立转化的植物的方式，各自表达一种或两种组分。
本领域技术人员将明了各种植物培育技术，因此本文未提供这些技术的进一步描述。
虽然可以使用植物培育方式，但应当指出，可以经由若干转化事件，各自用于将一种或多种可表达组分引入细胞中，产生表达AXE和GE的单个植物。在这种情况下，可以利用特定的选择标记物来证实每个转化事件的稳定性。
在任何情况下，转化和植物培育方式可以用来产生任何植物和表达任何数量的组分。
通过证实外源mRNA和/或多肽的存在（通过利用核酸或蛋白探针（例如抗体）），可以选择来自培育或可替换的多转化（multiple-transformed）植物的子代。可替换地，相比于相同类型的非转化植物，通过测量细胞壁乙酰化，通过测量在木质素和半纤维素之间的酯键的量，或通过测量转化植物的糖化产率和制浆效率，可以证实本发明的酶的表达（如在以下实施例部分的实施例1中详细描述的）。
根据本发明的教导，还可以通过相比于同一物种的未转化植物的植物生理特性监测，例如，转基因植物的生长速率、形态、总重量、干重和/或开花时间，选择来自培育或转化的子代。
在确定了AXE、GE或共表达子代之后，在使改造酶和/或作物的生物质的表达最大化的条件下，进一步培育上述植物。
因此，可以在适合于各物种的最佳生物质生产的不同条件下，培育AXE、GE或共表达子代。
本领域技术人员能够确定是否产生表达单一酶（即，AXE或GE）的植物或共表达AXE和GE的植物，尤其是根据本文提供的详细披露。将可以理解，当作这样的决定时，需要考虑植物的类型和其用途，因为在一些植物中，单一酶的表达将使得能够获得高糖化和可消化性，而在其它植物中可能需要共表达以改善植物的糖化和可消化性。
本发明提供了用于产生在植物的细胞壁中具有降低的乙酰化和降低的木质素半纤维素酯交联的植物的方法。该方法包括：（a）在次生细胞壁沉积之后，在细胞壁中特别活跃的发育调节启动子的转录调控下，在第一植物中表达编码乙酰木聚糖酯酶（AXE）的异源多核苷酸；（b）在次生细胞壁沉积之后，在细胞壁中特别活跃的发育调节启动子的转录调控下，在第二植物中表达编码葡糖醛酸酯酶（GE）的异源多核苷酸；以及（c）杂交第一植物和第二植物，并选择表达乙酰木聚糖酯酶（AXE）和葡糖醛酸酯酶（GE）的子代，从而产生在细胞壁中具有降低的乙酰化和降低的木质素半纤维素酯交联的植物。
本发明进一步提供了用于产生在植物的细胞壁中具有降低的乙酰化和降低的木质素半纤维素酯交联的植物的方法。该方法包括：（a）在第一植物中表达编码如在SEQ ID NO:2、4、6或14中给出的乙酰木聚糖酯酶（AXE）的异源多核苷酸；（b）在第二植物中表达编码如在SEQ ID NO:8、10或12中给出的葡糖醛酸酯酶（GE）的异源多核苷酸；以及（c）杂交第一植物和第二植物并选择表达乙酰木聚糖酯酶（AXE）和葡糖醛酸酯酶（GE）的子代，从而产生在细胞壁中具有降低的乙酰化和降低的木质素半纤维素酯交联的植物。
根据本发明的一种实施方式，提供了一种转化植物，该转化植物包含在植物的细胞中在半纤维素和木质素之间的降低的共价连接。通过在植物的细胞壁中GE酶的表达产生这样的植物。
根据本发明的另一种实施方式，提供了一种转化植物，该转化植物包含在植物的细胞中降低的乙酰化。通过在植物的细胞壁中AXE酶的表达产生这样的植物。
根据本发明的另一种实施方式，提供了一种转化植物，该转化植物包含在植物的细胞壁中在半纤维素和木质素之间的降低的共价连接以及包含在植物的细胞中降低的乙酰化。通过在植物的细胞壁中GE酶和AXE酶的共表达产生这样的植物。
本发明的植物组织具有改善的糖化和可消化性的植物可广泛用于生物质转化（例如生物燃料、制氢），用于饲料和食品应用，以及用于纸浆和造纸工业。
如在本文中所使用的，短语"植物生物质"是指这样的生物质，其包括在植物中发现的多种组分，如木质素、纤维素、半纤维素、β-葡聚糖、同型半乳糖醛酸聚糖、和鼠李半乳糖醛酸聚糖。植物生物质可以，例如，获自表达AXE和/或GE的转基因植物（尤其如在本文中描述的）。植物生物质可以获自植物的任何部分，其包括，但不限于，叶、茎、种子、以及它们的组合。
根据本发明的一种实施方式，提供了用于产生生物燃料的方法，该方法包括在使得能够降解木质纤维素以形成水解产物混合物的条件下，培育基因改造的AXE和/或GE表达植物，在促使水解产物混合物的可发酵糖类转化成乙醇、丁醇、乙酸或乙酸乙酯的条件下，温育水解产物混合物。
将可以理解，和同一物种的非转基因植物所需要的相比，本发明的用于生产生物燃料的基因改造的AXE和/或GE表达植物需要较少的预处理化学品。
将可以理解，本发明的用于生产生物燃料的基因改造的AXE和/或GE表达植物将使得植物生物质更适于微生物和/或物理降解，例如，在预处理过程中，包括存储在青贮饲料容器中，其中将生物质暴露至微生物和/或长期预处理机制（regime），该机制包括加热和将酶加入该过程中，从而和由同一物种的非转基因植物所需要的相比，致使需要较少的预处理化学品。
因此，根据本发明转化的植物提供了一种方式，其通过降低生物质的糖化所需的酸/热预处理，和/或降低其它植物生产和处理成本，如通过使得能够具有多种应用以及使得商业上有价值的副产物能够分离，增加生物燃料（例如，乙醇）产率，降低预处理成本。
根据本发明的另一种实施方式，本发明的AXE和/或GE表达植物可以用于纸张和纸浆行业。
在本发明的另一方面，将AXE表达和/或GE表达转基因植物或其部分包括在食品或饲料产品（例如，干燥、液体、糊状）中。食品或饲料产品是任何可摄取制剂，其包含本发明的AXE表达和/或GE表达转基因植物或其部分，或由这些植物制备的制剂。因此，这些植物或制剂适合于人（或动物）消耗（consumption），即，更容易消化AXE表达和/或GE表达转基因植物或其部分。本发明的饲料产品进一步包括适合动物消耗的饮品。
将可以理解，本发明的AXE表达和/或GE表达转基因植物或其部分可以直接用作饲料产品，或可替换地，可以并入饲料产品中或与饲料产品混合以供消耗。包含AXE表达和/或GE表达转基因植物或其部分的实例性饲料产品包括，但不限于，谷物、谷类如燕麦（例如黑燕麦）、大麦、小麦、黑麦、高粱、玉米、蔬菜、豆科植物（尤其是大豆）、根用蔬菜（rootvegetable）和甘蓝、或绿色饲料（如青草或干草）。
如在本文中所使用的，术语“约”是指±10%。
术语“包含”、“包括”、“含有”、“具有”和它们的变化形式是指"包括，但不限于"。
术语“由…组成”是指“包括，并且限于”。
术语“基本上由…组成”是指，组合物、方法或结构可以包括另外的成分、步骤和/或部分，但仅当另外的成分、步骤和/或部分并不本质上改变所要求保护的组合物、方法或结构的基本和新的特征。
如在本文中所使用的，除非上下文另外明确指出，单数形式“一”、“一种”和“该”包括复数指代物。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括它们的混合物。
在整个本申请中，可以以范围的方式提供本发明的各种实施方式。应当理解，采用范围方式的描述仅是为了方便和简要，而不应当被解释为对本发明的范围的绝对限制。因此，范围的描述应视为已具体披露了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，范围的描述如1至6应视为已具体披露了子范围，如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单个数值，例如，1、2、3、4、5、和6。这是适用的，而不管范围的宽度。
当本文中指定数值范围时，其意图包括在该指定范围内的任何引用数字（分数或整数）。短语在第一指定数字和第二指定数字之间的“范围”和在第一指定数字至第二指定数字的“范围”内可互换使用，并且是指包括在第一和第二指定数字以及在其间的所有分数和整数。
如在本文中所使用的，术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和过程，包括，但不限于，化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知的，或由化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者容易由已知方式、手段、技术和程序开发的那些方式、手段、技术和程序。
如在本文中所使用的，术语“治疗”包括消除，基本抑制、减缓或逆转病症的进展，基本改善病症的临床或表观症状（aesthetical symptom），或基本预防病症的临床或表观症状的出现。
可以理解，为清楚起见，本发明的某些特点描述在独立的实施方式中，还可以结合提供在单独的实施方式中。相反地，为简便起见，本发明的各种特点描述在单独的实施方式中，还可以单独地或以任何合适的子结合或当适合时，提供在本发明的任何其它描述的实施方式中。在各种实施方式中描述的某些特点不认为是那些实施方式的必要特征，除非在没有那些要素的情况下，该实施方式不起作用。
如上文描述的以及如在以下权利要求部分中要求保护的本发明的各种实施方式和方面在以下实施例中提供了实验支持。
实施例
现在参照以下实施例，其连同以上描述一起，以非限制性方式示出本发明。
通常，本文中使用的术语和在本发明中使用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。在文献中详细解释了这些技术。参见，例如，"Molecular Cloning:A laboratory Manual"Sambrook et al.,(1989)；"Current Protocols in Molecular Biology"Volumes I-III Ausubel,R.M.,ed.(1994)；Ausubel et al.,"Current Protocols in Molecular Biology",JohnWiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,"A Practical Guide toMolecular Cloning",John Wiley&Sons,New York(1988)；Watson et al.,"Recombinant DNA",Scientific American Books,New York；Birren et al.(eds)"Genome Analysis:A Laboratory Manual Series",Vols.1-4,Cold SpringHarbor Laboratory Press,New York(1998)；如在美国专利号4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659和5,272,057中给出的方法；"Cell Biology:A Laboratory Handbook",Volumes I-III Cellis,J.E.,ed.(1994)；"CurrentProtocols in Immunology"Volumes I-III Coligan J.E.,ed.(1994)；Stites et al.(eds),"Basic and Clinical Immunology"(8th Edition),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell and Shiigi(eds),"Selected Methods in CellularImmunology",W.H.Freeman and Co.,New York(1980)；可用的免疫测定广泛地描述于专利和科学文献中，参见，例如，美国专利号3,791,932、3,839,153、3,850,752、3,850,578、3,853,987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,345、4,034,074、4,098,876、4,879,219、5,011,771和5,281,521；"Oligonucleotide Synthesis"Gait,M.J.,ed.(1984)；“NucleicAcid Hybridization"Hames,B.D.,and Higgins S.J.,eds.(1985)；"Transcription and Translation"Hames,B.D.,and Higgins S.J.,Eds.(1984)；"Animal Cell Culture"Freshney,R.I.,ed.(1986);"Immobilized Cells andEnzymes"IRL Press,(1986);"A Practical Guide to Molecular Cloning"Perbal,B.,(1984)and"Methods in Enzymology"Vol.1-317,Academic Press；"PCRProtocols:A Guide To Methods And Applications",Academic Press,SanDiego,CA(1990)；Marshak et al.,"Strategies for Protein Purification andCharacterization-A Laboratory Course Manual"CSHL Press(1996)；所有上述各项以引用方式结合于本文，如同完全在本文中给出的。在整个文档中提供了其它的一般参考文献。认为，其中的程序是本领域中公知的并为方便读者而提供。其中包含的所有信息以引用方式结合于本文。
一般材料及实验程序
共同或单独地，将乙酰木聚糖酯酶（AXE）和葡糖醛酸酯酶（GE）克隆和转化到烟草、杨树和桉树植物
启动子：在次生细胞壁沉积期间，通过用各种启动子融合AXE和GE基因，获得AXE和GE活性，上述启动子包括：
(1)次生细胞壁特异性启动子：4cl启动子和CesA7启动子。
(2)组成型启动子：35s启动子；和/或Rubisco启动子。
(3)木质部特异性启动子：IRX4启动子、FRA8启动子。
信号肽：为了将AXE和GE引导到细胞壁中，将各自的基因融合于编码分泌前导肽的核酸序列中，这使得能够以ER途径处理翻译基因并被被分泌到细胞外基质中。可以使用的细胞壁分泌前导肽的实例包括拟南芥内切葡聚糖酶细胞信号肽。
相比于野生型植物，在转基因植物中测定乙酰木聚糖酯酶（AXE）的活性
通过称取0.5g植物组织，添加1ml的磷酸钠缓冲液（pH7.0；100mM）以及用研钵和研杵进行均质化，测定在植物组织中AXE的活性。然后基于制备的提取物并通过测量由4-甲基伞形酮乙酸酯（4-methylumbelliferylacetate）释放的4-甲基伞形酮的量确定乙酰木聚糖酯酶的活性，具体如下：在50°C下预温育磷酸钠缓冲液100μl（pH7.0;100mM）和240μl的H2O持续12分钟。将50μl的植物提取物加入缓冲液中，并通过添加10μl的100mM4-甲基伞形酮乙酸酯（在二甲亚砜中），在1分钟内引发反应。在2至10分钟之后，通过添加600μl的50mM的柠檬酸终止反应。在354nm下测定吸光度。
测量细胞壁乙酰化
通过以下方法，从植物材料分离细胞壁：
1、称取100mg的磨成细粉的干茎。
2、添加1 ml的70%乙醇。涡旋并短暂离心（即，快速旋转），并废弃得到的上清液。
3、添加1 ml的氯仿:甲醇（1:1比率）。涡旋并短暂离心（即，快速旋转），并废弃得到的上清液。
4、通过添加500μl的丙酮和空气干燥以干燥样品。
5、通过用35μl的α-淀粉酶（50μg/1mL；来自杆菌菌种）、17μl的支链淀粉酶（18.7单位，来自嗜酸普鲁兰芽胞杆菌（bacillusacidopullulyticus））温育干颗粒以脱淀粉。封管并充分涡旋。
6、在37°C下温育过夜。
7、在加热箱（heating block）中在100°C下加热悬浮液10分钟以终止消化。离心（10,000rpm，10分钟）并废弃包含溶解淀粉的上清液。
8、用水洗涤，然后用丙酮洗涤3次。利用空气干燥器干燥颗粒。该颗粒是细胞壁材料（CWM）。
称取双份并将10mg样品CWM放入配有气密帽或盖的离心管中。
将1ml异丙醇/NaOH溶液（4°C）加入每个管中。封管并轻轻混合。在室温下静置混合物2小时，然后在2,000g下（在室温下）离心10分钟。除去上清液并放入具有隔膜的小瓶中。立即密封小瓶。
将15μl的样品注入配有rezex RHM-单糖柱的HPLC***中并使用5mM的H2SO4溶剂***，设定其流速为0.6ml/min以及温度为30°C。折光率检测器设定为40°C。
相比于野生型植物，在转基因植物中测定葡糖醛酸酯酶（GE）的活性
通过称取0.5g的植物组织，添加1ml的磷酸钠缓冲液（pH6.0，50mM）以及用研钵和研杵进行均质化，测定在植物组织中的GE活性。定量葡糖醛酸酯酶测定是基于4-硝基苯基2-O-(4-O-甲基-α-D-葡糖吡喃糖基糖醛酸甲酯)-β-D-木吡喃糖苷（4-nitrophenyl2-O-(methyl4-O-methyl-α-D-glucopyranosyluronate)-β-D-xylopyranoside）由于脱酯化而浓度降低的测量值。在30°C下在磷酸钠缓冲液（pH6.0，50mM）中，用植物提取物温育上述酯（2mM），并通过HPLC，用C18的7μm柱（250x4mm）（用乙腈:水（2:1，v/v）洗脱）并利用在308nm下运行的UV检测器，随时间监测它的浓度。葡糖醛酸酯酶活性的一个单位定义为在30°C下在1分钟内使1μmol的4-硝基苯基2-O-(4-O-甲基-α-D-葡糖吡喃糖基糖醛酸甲酯)-β-D-木吡喃糖苷去酯化的酶量。
测量木质素和半纤维素之间的酯键的量
用FT-IR分光光度计并利用包含1%的精细研磨样品的KBr圆片获得生物质样品的FT-IR谱。以传输方式，对每个样品进行32次扫描，并记录4000至400cm-1，分辨率为2cm-1。在约1730cm-1下峰的变化与糖醛和酯基团的量或阿魏酸和/或对香豆酸的羧基的酯键相关。
根据糖化、制浆效率和正常生长选择产生的最佳DNA构建体
糖化（糖释放）测定方案：
1）向200mg干生物质中添加1.8ml的1%H2SO4。
2）在120°C下高压处理20分钟（以获得棕色糖浆）。
3）用30ml的重蒸馏水洗涤和过滤（玻璃滤纸）。
4）添加1ml的纤维素酶（10FPU\ml，在50mM的柠檬酸盐缓冲液中，pH4.8）+1.5ml的柠檬酸盐缓冲液（1M，pH4.8）+15μl的麝香草酚（50g\l，在70%的乙醇中）+12.5ml的重蒸馏水。
5）在45°C和125rpm下温育。
6）将100μl的葡萄糖标准物或糖化微量液（saccharification sup）加入1000μl的二硝基水杨酸中。在100°C下温育10分钟。测量在540nm下的吸光度。
转基因烟草植物的分子、生物化学和生理学表征
细胞壁结构和组成的表征
A、通过离子交换，糖含量和组成的测定和分析
HPLC Rezex Pb
2+
RPM柱：
1）通过称取100mg磨成细粉的干茎分离细胞壁。
2）添加1 ml的70%乙醇，涡旋，短暂离心（即，快速旋转），并废弃得到的上清液。
3）添加1 ml的氯仿:甲醇（1:1比率）。涡旋，短暂离心（即，快速旋转），并废弃得到的上清液。
4）通过添加500μl的丙酮和空气干燥来干燥样品。
5）通过用35μl的α-淀粉酶（50μg/1mL；来自芽孢杆菌）、17μl的支链淀粉酶（18.7单位，来自嗜酸普鲁兰芽胞杆菌）温育干颗粒以脱淀粉。封管并充分涡旋。
6）在37°C下温育过夜。
7）在加热箱中在100°C下加热悬浮液10分钟以终止消化。离心（10,000rpm，10分钟）并废弃包含溶解淀粉的上清液。
8）用水洗涤，然后用丙酮洗涤3次。利用空气干燥器干燥颗粒。该颗粒是细胞壁材料（CWM）。
9）称取10mg的CWM并在室温下添加125ul的72%（w/w）硫酸，温育1小时。
10）添加1.35ml的重蒸馏水并在100°C下温育2小时。
11）添加150mg的碳酸钙以中和溶液。
12）将10-50μl的水解的细胞壁施加于配有Rezex Pb2+RPM柱和折射率的HPLC***。流速为0.6ml/min。使用下列标准物：纤维二糖、葡萄糖、木糖、***糖、半乳糖和甘露糖。
B、通过手工切割茎段并利用RAMAN显微镜分析进行分析，以分析细胞壁结构。
C、用电子扫描显微术（SEM）和透射电子显微术（TEM）并通过筛选这些段以分析细胞壁超微结构及形态。
植物生理表征
相比于野生型植物，在温室设备中，通过监测转基因植物的生长速率、总重量、干重和开花时间进行生理表征。
实施例1
乙酰木聚糖酯酶（AXE）和葡糖醛酸酯酶（GE）克隆和转化到烟草植物中
启动子：因为在植物中AXE和GE的过表达可以降低植物结构完整性和适应性，所以本发明人将这些酶的表达引导至特定发育阶段如次生细胞壁发育或木质部细胞发育。可以通过发育特异性启动子实现基因在特定发育阶段的表达。这些启动子的实例，例如，仅在次生壁增厚期间表达的启动子，CesA7启动子和4CL-1启动子。在木质部组织发育中表达的启动子的实例是FRA8启动子和DOT1启动子。
为在木质部发育阶段实现表达，将AXE和GE融合于FRA8启动子（SEQ ID NO:21）中。
还测试了通过CaMV35S启动子的AXE的组成型过表达。
信号肽：为了将AXE和GE引导到细胞壁，将各自的基因融合于细胞壁特异性前导肽，这使得能够以ER途径来翻译基因并被分泌到细胞外基质中。可以使用的细胞壁特异性信号肽的实例包括拟南芥内切葡聚糖酶细胞信号肽（SEQ ID NO:22）。
如图4A-图4D所示，构建了4种转化载体，即：
载体号1-FRA8启动子::AXEI（SEQ ID NO:1）。
载体号2-FRA8启动子::AXEII（SEQ ID NO:13）。
载体号3-FRA8启动子::GE（SEQ ID NO:7）。
载体号4-35S启动子::AXEII(SEQ ID NO:13)。
实施例2
烟草转化和PCR至基因组DNA
用烟草-SR1植物进行叶盘转化，如之前描述的[Block,M.D.et al.,EMBO Journal(1984)3:1681-1689]。对于每种二元载体，产生多于15种独立的烟草转化体，体外繁殖并转移到温室。相比于在FRA8启动子的调控下表达AXEII或AXEI的植物或野生型植物（在相同培养条件下生长的未转化植物），在35S启动子的调控下，过表达AXEII的烟草植物开花较早，并且呈现不同水平的改造表型，如生长迟缓和较小的茎部直径（数据未示出）。通过对于nptII蛋白的蛋白印迹分析（数据未示出）和通过对基因组DNA进行的PCR（图5A-图5D），其中利用AXE或GE的特异性引物（表1），证实了转基因的存在。二元载体用作阳性对照的模板。
表1：PCR引物
实施例3
转基因植物的转录分析
通过RT-PCR检查AXE和GE的表达模式（图6A-H）。总RNA从烟草植物的叶分离。通过DNA酶除去DNA。利用来自第一链反应的cDNA并使用对于AXE和GE具有特异性的引物（参见以上表1）进行PCR。二元载体用作阳性对照的模板。为了证实阴性DNA污染，在没有逆转录酶的情况下进行PCR。
实施例4
AXE植物的活性测定
通过在2000μl的反应混合物中温育烟草叶的粗制提取物来测量乙酰木聚糖酯酶的活性，其中上述反应混合物包含在50mM柠檬酸钠缓冲液（pH5.9）中的0.55mM的pNP-乙酰基（Sigma，N8130）。使用两种阴性对照：没有植物提取物的反应混合物和仅没有底物的植物提取物。在环境温度下进行反应并在不同的时间点终止。在微量板读数器上并在405nm下测量吸光度。图7表明在转基因植物中AXEI和AXEII蛋白均是活性的。
实施例5
乙酰基的定量测量
为了乙酸释放的测量，根据之前描述的方法[Foster,C.E.,Martin,T.M.&Pauly,M.Comprehensive compositional analysis of plant cell walls(Lignocellulosic biomass)part I:lignin.Journal of visualized experiments:JoVE5-8(2010).doi:10.3791/1745]，制备细胞壁材料（CWM）并酶促以使细胞壁材料去淀粉。在环境温度下，在550μl的0.09M NaOH中使CWM（10mg）皂化过夜。通过添加52μl的1M HCl中和样品。紧接着在乙酸的测量以前，在12,000rpm下将悬浮液离心10分钟。利用配有rezex ROA-有机酸柱的HPLC***测定乙酸。将经过滤的10μL等分试样注入在0.6mL/min流速下操作的HPLC中，然后加热HPLC柱至65°C。
由CWM释放的乙酰基的定量分析显示，和野生型相比，在35S::AXEII植物中多至75%的减少，以及在FRA8::AXEI植物中多至50%的减少（图8）。
实施例6
转基因植物的糖化：
在65°C下干燥4周龄的茎过夜，磨成细粉并通过1mm的筛加以筛选。使60mg的干粉与500μL的水混合，然后在120°C下高压处理15分钟。通过添加1000μL的75mM柠檬酸钠缓冲液（pH5）引发糖化，该柠檬酸钠缓冲液包含0.045%w/v的叠氮化钠、3.75%v/v的Celluclast1.5L（Sigma C2730）和0.25%w/w的β-葡糖苷酶（Novozymes）。在50°C和摇动（250rpm）下温育24小时之后，将样品离心（12,000rpm，5分钟），稀释至10倍，然后利用DNS测定并使葡萄糖溶液作为标准物，测试100μl的上清液的还原糖含量，如之前描述的[Ghose,T.K.Measurment of cellulaseactivities.Pure&Appl.Chem(1987)59,257-268]。
如图9所示，和野生型相比，表达AXE和GE的植物的热水处理生物质释放较多的还原糖。对于不同的转基因植物系，检测到的糖化效率提高为5%至40%。
虽然已结合其具体实施方式描述了本发明，但是可以明了对于本领域技术人员而言，许多替换、改变和变型将是显而易见的。因此，本发明意图涵盖所有这样的替换、改变和变型，其属于所附权利要求的精神和广阔范围。
在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请的全部内容以引用方式结合于本说明书，如同各单独的出版物、专利、或专利申请特别地并且单独地表明以引用方式结合于本文中。另外，在本申请中任何参考文献的引用或确定不应解释为承认这样的参考文献可作为本发明的现有技术。在使用章节标题的情况下，它们不应被解释为必要的限制。
Claims (45)
1.一种工程化在细胞壁中具有降低的乙酰化的植物的方法，所述方法包括：在次生细胞壁沉积之后，在所述植物细胞壁中特别活跃的发育调节启动子的转录调控下，在所述植物细胞壁中表达至少一种经分离的异源多核苷酸，所述异源多核苷酸编码乙酰木聚糖酯酶（AXE），从而工程化在所述细胞壁中具有降低的乙酰化的所述植物。
2.一种工程化在细胞壁中具有降低的乙酰化的植物的方法，所述方法包括：在所述植物细胞壁中表达至少一种经分离的编码乙酰木聚糖酯酶（AXE）的异源多核苷酸，其中所述AXE酶选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:14组成的组中，从而工程化在所述细胞壁中具有降低的乙酰化的所述植物。
3.一种工程化在细胞壁中具有降低的木质素半纤维素酯交联的植物的方法，所述方法包括：在次生细胞壁沉积之后，在所述植物细胞壁中特别活跃的发育调节启动子的转录调控下，在所述植物细胞壁中表达至少一种经分离的异源多核苷酸，所述异源多核苷酸编码葡糖醛酸酯酶（GE），从而工程化在所述细胞壁中具有降低的木质素半纤维素酯交联的所述植物。
4.一种工程化在细胞壁中具有降低的木质素半纤维素酯交联的植物的方法，所述方法包括：在所述植物细胞壁中表达至少一种经分离的编码葡糖醛酸酯酶（GE）的异源多核苷酸，其中所述GE酶选自由SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12组成的组中，从而工程化在所述细胞壁中具有降低的木质素半纤维素酯交联的所述植物。
5.根据权利要求1或2所述的方法，进一步包括在所述植物中表达另外的编码葡糖醛酸酯酶（GE）的异源多核苷酸。
6.根据权利要求3或4所述的方法，进一步包括在所述植物中表达另外的编码乙酰木聚糖酯酶（AXE）的异源多核苷酸。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中，在次生细胞壁沉积之后，在所述植物细胞壁中特别活跃的发育调节启动子的转录调控下，表达所述另外的异源多核苷酸。
8.根据权利要求1、6或7所述的方法，其中，所述AXE酶选自由SEQID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:14组成的组中。
9.根据权利要求3、5或7所述的方法，其中，所述GE酶选自由SEQID NO:8、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12组成的组中。
10.根据权利要求2或4所述的方法，其中，以组织特异性方式表达所述经分离的异源多核苷酸。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述组织选自由茎和叶组成的组中。
12.根据权利要求10所述的方法，其中，所述组织包括木质部或韧皮部。
13.一种基因改造植物，在次生细胞壁沉积之后，在所述植物细胞壁中特别活跃的发育调节启动子的转录调控下，所述植物表达编码乙酰木聚糖酯酶（AXE）的异源多核苷酸。
14.一种基因改造植物，所述植物表达编码如在SEQ ID NO:2、4、6或14中给出的乙酰木聚糖酯酶（AXE）的异源多核苷酸。
15.一种基因改造植物，在次生细胞壁沉积之后，在所述植物细胞壁中特别活跃的发育调节启动子的转录调控下，所述植物表达编码葡糖醛酸酯酶（GE）的异源多核苷酸。
16.一种基因改造植物，所述植物表达编码如在SEQ ID NO:8、10或12中给出的葡糖醛酸酯酶（GE）的异源多核苷酸。
17.一种基因改造植物，在次生细胞壁沉积之后，在所述植物细胞壁中特别活跃的发育调节启动子的转录调控下，所述基因改造植物共表达编码乙酰木聚糖酯酶（AXE）的异源多核苷酸和编码葡糖醛酸酯酶（GE）的异源多核苷酸。
18.一种基因改造植物，所述基因改造植物共表达编码如在SEQ ID NO:2、4、6或14中给出的乙酰木聚糖酯酶（AXE）的异源多核苷酸以及编码如在SEQ ID NO:8、10或12中给出的葡糖醛酸酯酶（GE）的异源多核苷酸。
19.根据权利要求14、16或18所述的基因改造植物，其中，在次生细胞壁沉积之后，在所述植物细胞壁中特别活跃的发育调节启动子的转录调控下，表达所述异源多核苷酸。
20.根据权利要求13或17所述的基因改造植物，其中，所述AXE酶是如在SEQ ID NO:2、4、6或14中给出的。
21.根据权利要求15或17所述的基因改造植物，其中，所述GE酶是如在SEQ ID NO:8、10或12中给出的。
22.一种植物***，包括：
（i）根据权利要求13或14所述的第一基因改造植物；以及
（ii）根据权利要求15或16所述的第二基因改造植物。
23.一种用于产生在细胞壁中具有降低的乙酰化和降低的木质素半纤维素酯交联的植物的方法，所述方法包括：
（a）在次生细胞壁沉积之后，在所述细胞壁中特别活跃的发育调节启动子的转录调控下，在第一植物中表达编码乙酰木聚糖酯酶（AXE）的异源多核苷酸；
（b）在次生细胞壁沉积之后，在所述细胞壁中特别活跃的发育调节启动子的转录调控下，在第二植物中表达编码葡糖醛酸酯酶（GE）的异源多核苷酸；以及
（c）杂交所述第一植物和所述第二植物，并选择表达所述乙酰木聚糖酯酶（AXE）和所述葡糖醛酸酯酶（GE）的子代，从而产生在所述细胞壁中具有所述降低的乙酰化和所述降低的木质素半纤维素酯交联的所述植物。
24.一种产生在细胞壁中具有降低的乙酰化和降低的木质素半纤维素酯交联的植物的方法，所述方法包括：
（a）在第一植物中表达编码如在SEQ ID NO:2、4、6或14中给出的乙酰木聚糖酯酶（AXE）的异源多核苷酸；
（b）在第二植物中表达编码如在SEQ ID NO:8、10或12中给出的葡糖醛酸酯酶（GE）的异源多核苷酸；以及
（c）杂交所述第一植物和所述第二植物，并选择表达所述乙酰木聚糖酯酶（AXE）和所述葡糖醛酸酯酶（GE）的子代，从而产生在所述细胞壁中具有所述降低的乙酰化和所述降低的木质素半纤维素酯交联的所述植物。
25.根据权利要求23所述的方法，其中，编码所述AXE酶的所述异源多核苷酸是如在SEQ ID NO:1、3、5或13中给出的，并且编码所述GE酶的所述异源多核苷酸是如在SEQ ID NO:7、9或11中给出的。
26.根据权利要求23或24所述的方法，其中，和同一物种的非转基因植物相比，所述植物包括在所述植物的细胞中在半纤维素和木质素之间降低的共价连接。
27.根据权利要求23或24所述的方法，其中，和同一物种的非转基因植物相比，所述植物包括在所述植物的细胞中降低的乙酰化。
28.根据权利要求1、2、3、4、23或24所述的方法，根据权利要求13、14、15、16、17、18、20或21所述的基因改造植物，或根据权利要求22所述的植物***，其中，所述植物选自由以下各项组成的组中：玉米、柳枝稷、高粱、芒属、甘蔗、杨树、松树、小麦、水稻、大豆、棉花、大麦、草坪草、烟草、竹、油菜、甜菜、向日葵、柳树、***、和桉树。
29.一种食物或饲料，包含根据权利要求13、14、15、16、17、18、20或21所述的基因改造植物。
30.一种用于产生生物燃料的方法，所述方法包括：
（a）在使得木素纤维素能够降解以形成水解产物混合物的条件下，培育根据权利要求13、14、15、16、17、18、20或21中任一项所述的基因改造植物；以及
（b）在促使将所述水解产物混合物的可发酵糖类转化为乙醇、丁醇、乙酸或乙酸乙酯的条件下，温育所述水解产物混合物，从而产生所述生物燃料。
31.根据权利要求30所述的方法，其中，所述条件包括和同一物种的非转基因植物相比需要较少的预处理化学品。
32.一种核酸构建体，包含：在次生细胞壁沉积之后，在植物细胞壁中特别活跃的发育调节启动子的转录调控下，编码异源乙酰木聚糖酯酶（AXE）的多核苷酸。
33.一种核酸构建体，包含：在次生细胞壁沉积之后，在植物细胞壁中特别活跃的发育调节启动子的转录调控下，编码异源葡糖醛酸酯酶（GE）的多核苷酸。
34.一种核酸构建体，包含：在次生细胞壁沉积之后，在植物细胞壁中特别活跃的发育调节启动子的转录调控下，编码异源乙酰木聚糖酯酶（AXE）的多核苷酸和编码异源葡糖醛酸酯酶（GE）的多核苷酸。
35.根据权利要求32或34所述的核酸构建体，其中，编码所述AXE酶的所述多核苷酸是如在SEQ ID NO:1、3、5或13中给出的。
36.根据权利要求33或34所述的核酸构建体，其中，编码所述GE酶的所述多核苷酸是如在SEQ ID NO:7、9或11中给出的。
37.一种核酸构建体，包含多核苷酸，所述多核苷酸在FRA8启动子的转录调控下，编码如在SEQ ID NO:1中给出的异源乙酰木聚糖酯酶（AXE）。
38.一种核酸构建体，包含多核苷酸，所述多核苷酸在FRA8启动子的转录调控下，编码如在SEQ ID NO:13中给出的异源乙酰木聚糖酯酶（AXE）。
39.一种核酸构建体，包含多核苷酸，所述多核苷酸在FRA8启动子的转录调控下，编码如在SEQ ID NO:7中给出的异源葡糖醛酸酯酶（GE）。
40.根据权利要求32-39中任一项所述的核酸构建体，进一步包括编码信号肽的核酸序列，其中所述信号肽能够引导AXE或GE在植物细胞壁中的表达。
41.根据权利要求1、2、3、4、23或24所述的方法，根据权利要求13、14、15、16、17、18、20或21所述的基因改造植物，或根据权利要求22所述的植物***，其中，将编码所述AXE酶或所述GE酶的所述异源多核苷酸结合至编码信号肽的核酸序列，所述信号肽能够引导AXE或GE在植物细胞壁中的表达。
42.根据权利要求40所述的核酸构建体，或根据权利要求41所述的方法、基因改造植物或植物***，其中，所述信号肽选自由以下各项组成的组中：拟南芥内切葡聚糖酶细胞信号肽、拟南芥膨胀素样A1、拟南芥木葡聚糖内切转糖基酶/水解酶蛋白22、拟南芥果胶酯酶/果胶酯酶抑制剂18、拟南芥伸展蛋白样蛋白1、拟南芥漆酶-15和银白杨内切-1,4-β-葡聚糖酶。
43.根据权利要求40所述的核酸构建体，或根据权利要求41所述的方法、基因改造植物或植物***，其中，所述信号肽包括拟南芥内切葡聚糖酶细胞信号肽。
44.根据权利要求1、3、7、23或30所述的方法，根据权利要求13、15、17或19所述的基因改造植物，或根据权利要求32、33或34所述的核酸构建体，其中，所述启动子选自由4cl、CesA1、CesA7、CesA8、IRX3、IRX4、IRX10、DOT1和FRA8组成的组中。
45.根据权利要求1、3、7、23或30所述的方法，根据权利要求13、15、17或19所述的基因改造植物，或根据权利要求32、33或34所述的核酸构建体，其中，所述启动子包括FRA8。
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