CN103237809B - 一个集合及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本披露实现了可变重链和可变轻链对的集合，这些可变重链和可变轻链对部分地包括针对与可研发性相关的功能特性进行预选择的种系蛋白序列，其中这些集合可以用来使用例如噬菌体展示针对任何抗原进行选择。
Description
交叉引用
本申请要求提交于2011年6月8日序列号为61/494,452的美国临时申请以及提交于2010年11月19日序列号为61/415,367的美国临时申请的利益，这两个申请均通过引用以其全文结合于此。
序列表
本申请包含一个序列表，该序列表已以ASCII格式通过EFS-Web提交，并在此通过引用以其全文结合于此。所述ASCII副本生成于2011年2月15日，被命名为MS130US.txt，且大小为229,568字节。
技术领域
本申请涉及合成的抗体或其功能性片段的集合及其使用方法。
背景技术
药学发展的进展，尤其是在治疗性抗体领域，正飞快地使很多疾病的治疗成为可能和/或改善很多疾病的治疗。通过达到新的靶标空间以及提供新的作用机制，这些进展正日益改善着甚至具有最严重且最具挑战性的疾病的患者的生活质量。通常对卫生保健***来讲、以及特别地对患者来讲的一个挑战为，这些药学进展使成为可能的新药的费用也正在迅速地增长。这些高昂的费用归因于药品研发所需的投资，特别是抗体类，目前其每一市场化产品超过十亿美元。高的失败风险以及非常长的研发时间线使得这些投资不可避免。从一个潜在的治疗性抗体的鉴别时间到该抗体投放市场使患者受益可能耗费15年以上。每个阶段的研发，从鉴别、临床前、临床、至投放市场，均充满挑战与风险。制药公司正不断地努力通过缩短时间线以及降低失败风险来降低研发费用，以使得最有效的药物能够尽快到患者的手中。
下面的披露提供了一个有价值的进展，该进展允许治疗任何疾病的最佳治疗性抗体更快地被鉴别。治疗性性抗体候选物，为将其投放市场，必须满足一些研发标准，如长期稳定性、低聚集倾向、以及高表达产率。所披露的进展从一开始便增加了鉴别一个能够满足所有硬性研发标准的抗体的几率和速度。所得抗体的生产将不那么昂贵，并在众多疾病的治疗中有效且安全。
一个公知的鉴别治疗性抗体的方法为通过采用噬菌体展示技术。噬菌体展示利用生长在细菌中的类病毒颗粒展示抗体。该技术的一个益处为，所用的库是巨大的，具有达1×1011抗体，这些抗体能够被迅速地测试其与和任何疾病相关的任何靶标的结合。参见，例如，Knappik等，2000年，《基于由三核苷酸随机化的模块化保守框架和CDR全合成人组合抗体库（HuCAL）》，分子生物学杂志11；296（1）：57-86（Knappik et al.,(2000),"Fullysynthetic human combinatorial antibody libraries(HuCAL)based on modularconsensus frameworks and CDRs randomized with trinucleotides,"J.Mol.Biol.11;296(1):57-86）；以及美国专利号6,3300,0064；这些均通过引用以其全文结合于此。对如此大的数量进行操作的益处为，针对一个靶标的筛选的输出可导致上百个与治疗靶标结合的抗体，所有这些抗体均可能为与治疗相关的。但一个问题是，通常只有其中的很少数抗体是可研发的，即能够满足为进入市场所需的所有硬性标准。
为使一个新的噬菌体展示集合缩短鉴别时间线并降低固有风险，该集合应该包含具有选择和临床研发所需特性的、并将导致患者的安全有效的治疗的抗体。这些特性包括：1）高噬菌体展示率，从而使集合中的每个抗体都能够针对感兴趣的靶标进行测试；2）Fab以及IgG1形式均具有高的表达水平，以便能够有效地再生所需量的抗体或片段；3）Fab和IgG1形式均具有高的热稳定性，以确保投递给患者的分子的结构及功能的完整性；4）Fab和IgG1形式在血清内均具有高的稳定性，从而使抗体表现出延长的半衰期和持久的活性；5）Fab和IgG1形式均具有高的、如通过尺寸排阻层析（SEC）中判定的单体含量（%单体），因为这表示低的聚集特性；6）IgG1形式具有高的等电点（pI）；7）在暴露于酸之前以及之后，Fab和IgG1形式具有高的热稳定性；8）在暴露于酸之前以及之后，Fab或IgG1形式具有低的浊度；9）在暴露于酸之前以及之后的稳定的分子半径和多分散性%；10）低免疫原性风险，从而提高安全性，和/或11）高的多样性，从而使一个集合能够用于鉴别针对任何治疗靶标的很多抗体。
一种在本质上模仿了人体免疫***的集合应该是非常有价值的或甚至最佳的解决方案。该人体免疫***包括种系基因编码的抗体。在某种程度上抗体包括一个可变重链和多个可变轻链。有近50个可变重链种系基因和近50个可变轻链种系基因，组合提供近2500个不同的可变重链和轻链对的组合。被认为的是，所有这2500个组合在人类中均被生产。然而被发现的是，某些可变重链、可变轻链、和/或可变重链与轻链的组合（对）以比其他更高的水平存在。被假设的是，一定存在一些原因使得一些比另一些存在更多，且如果是这样，这些以高水平存在的种系基因可能具有有利的功能特性。因此，提供具有有利功能特性的抗体的集合的一个方法为，生成包括存在于人类免疫组库中的大量的可变重链、可变轻链、和/或可变重链和可变轻链对的一个集合。
此外，因为显然的原因，人类中存在的种系基因序列被认为是具有低免疫原性的，因此在重组抗体中能够模仿这些序列以降低免疫原性的风险。
已经采取了多种方法用于评估人类免疫组库中盛行的可变重链和轻链种系基因配对。参见de Wildt等人，《对重链和轻链配对的分析表明受体编辑塑造人类免疫组库》，分子生物学杂志22；285（3）：895-901，1999年1月（de Wildt et al.,Analysis of heavy andlight chain pairings indicates that receptor editing shapes the humanantibody repertoire,J Mol Biol.22;285(3):895-901(January1999)），该文通过引用以其全文结合于此。Wildt等人从人类供体中采集血液样本、分选经历了体细胞超突变的IgG+B细胞、进行了cDNA的PCR扩增、对每一cDNA进行了测序、并将每一序列与已知的人类可变结构域种系基因比对。Wildt等人观察到，只有少数种系基因在免疫组库中占据主导地位，并且频繁出现的重链和轻链基因片段通常是配对的。
也已经进行了试图维持个体B细胞的重链和轻链可变结构域配对的尝试。例如，可变结构域“同源对”的库已被披露。参见Meijer等人，《保留自然的重链和轻链配对的人类抗体组库的分离》，分子生物学杂志358（3）：764-72，2006年5月5（Meijer et al.,Isolationof human antibody repertoires with preservation of the natural heavy andlight chain pairing,J Mol Biol.,358(3):764-72(May52006)）和WO2005042774，这些均通过引用以其全文结合于此。从一个被免疫的宿主的个体B细胞已经生成了根据Meijer等人描述的技术的库。通常通过FACS分选B细胞，以选择代表体细胞超突变细胞的CD38HIB细胞，通过PCR扩增其cDNA，且其抗体基因产物被***Fab载体以供选择。这种同源对的库并非没有它们的局限性。例如，提供B细胞的宿主典型地为被免疫的，并且所分选的B细胞群已被超突变，因此所得的库为偏向一种特殊免疫原的。
此外，已试图利用占优势的可变重链或可变轻链生成集合。例如，在Shi等人，《从合成的被噬菌体展示的Fab库中从头选择高亲和性抗体作为pIX融合蛋白》，分子生物学杂志397（2）：385-96，2010年3月26日（Shi et al.,"De Novo Selection of High-AffinityAntibodies from Synthetic Fab Libraries Displayed on Phage as pIX FusionProteins;J Mol Biol.,397(2):385-96(March26,2010)）和对应的专利申请WO2009085462和WO2006014498，这些均通过引用以其全文结合于此。在那里，可变重链或可变轻链种系蛋白序列根据它们在人类免疫组库中的利用频率合并入库。
此外，也试图将一种特异性的种系对合并入一个集合。例如，通过引用以其全文结合于此的WO1999020749描述了一个集合，其成员包括具有由人类种系重链基因片段DP-47（IGHV3-23）编码的一个超变环的正则结构的重链、和/或由该种系基因编码的框架区、和/或具有由人类种系轻链基因片段O2/O12（IGKV1-39/1D-39）编码的一个超变环的正则结构的轻链、和/或由该种系基因编码的框架区。
因此，对于抗体或其片段的集合有很高的需求，该集合合并了人类免疫组库中存在的、具有与研发相关的有利的生物物理学特性的可变重链和可变轻链基因对，并与此同时不包括存在于自然界但不具备这种生物物理学特性的基因对。本发明能够满足这些需求以及其他需求。
发明内容
本发明针对有效鉴别任何抗原的可研发的、对病人安全有效的抗体或抗体片段的问题，提供一种有价值的解决方法。在最一般意义上，发明人的最初的想法是，以基本方式模拟人体免疫***的抗体集合可能是有益的。在某种层面上，发明人决定通过把来自人体免疫组库的最佳种系基因序列或其一部分纳入到抗体中来模拟人体免疫***。就这一点而论，在一些实施例中，集合中的抗体包含一部分，例如，其序列为种系序列的框架区。采用种系序列应该能显著降低用于治疗病人的重组抗体的免疫原性风险。
另外，发明人根据他们的假设工作，该假设为人体免疫组库中丰富的可变重链和可变轻链种系基因对很可能具有良好的生物物理学特性，其能导致更有效率的临床研发并能提高产生的抗体在病人中的安全性和疗效。作为背景，每个B细胞编码一种抗体，每个抗体包含一可变重链和可变轻链。为了确定抗体的来源，即可变重链和可变轻链是由哪个种系基因所编码的，可以将该抗体的可变重链和可变轻链中的每一个与种系序列进行比对。因此，对每个抗体来说，可变重链和可变轻链包含一个种系基因或种系蛋白对，例如，与VK1-5配对的VH3-23。
为了证明占优势的种系基因对很可能具有良好的生物物理学特性这个假设，第一步是鉴别人体免疫组库中占优势的可变重链和可变轻链种系基因对。这是通过广泛搜索可用的公开文献和从人体宿主中进行B细胞取样来完成的。下一步，对这些数据进行聚池和分析，根据人体免疫组库中存在的可变重链和可变轻链种系对的普遍性对它们进行排列。根据此数据，很显然，在人体免疫组库中，某些可变重链和可变轻链种系基因对较其他的而言出现地更频繁。
下一步，必须确定需要对哪些种系蛋白对进行与研发相关的功能特性的测试，这是因为人体免疫组库中有约2500个种系蛋白对，而对每一对进行测试并非优选。一种方法是，测试人体免疫组库中那些出现地最占优势的可变重链和可变轻链种系蛋白对，例如，见表6。例如，可以选择最高的四百对进行测试，或者选择以某一阈值数目或高于某一阈值数目出现的可变重链和可变轻链种系基因对。这种方法将会需要对很大数量的可变重链和可变轻链种系蛋白对序列进行合成和测试；因此，这样一种方法可能不是很有效率。
作为一种可替代方法，发明人选择可变重链和可变轻链种系对的一个子集，这个子集代表，精确地再现，或者涵盖人体免疫组库中的占优势的种系对的大多数。这种方法部分地基于这一观察：少数可变重链，可变κ轻链和可变λ轻链种系基因（未配对的）在人体免疫组库中是占主导地位的。Wildt等人在895-896描述了这一现象。Wildt等人还声明，频繁出现的重链和轻链基因片段常常是配对的，并发现所采样的配对中的半数只与五个种系对相对应。因此，可以将少数占优势的重链和轻链种系基因（未配对的）组合起来以产生代表人体免疫组库的一组重链和轻链对。
这种方法通过以下方式进行。分析能表明键联VH/VL对的数据（例如，见表6）和能鉴别未键联VH或VL链的存在的数据（例如，见实例3和表5），从而确定人体免疫组库中占优势的可变重链，可变κ轻链和可变λ轻链种系基因（未配对的）。
下一步，对占优势可变重链，可变κ轻链和可变λ轻链种系蛋白序列（未配对的）进行评价，以确定它们的与研发相关的生物物理学特性，见实例4。采用计算机模拟，对可变重链，可变κ轻链和可变λ轻链种系蛋白序列的以下特性进行评价：(i)CDR长度，(ii)等电点（pI）（优选等电点为7.5或以上，因为这应该会提供在中性或微酸性配制缓冲液中的稳定性），(iii)用于潜在翻译后修饰位点（PTM’s）的潜在位点（特别是，N-键联糖基化位点（NxS或NxT）或者化学修饰，比如Asp酶切（经常位于DP或DQ）），(iv)Asp异构化（DS，DG），(v)脱酰胺化（NS，NG），其可以发生于体内（血清中）或在配制缓冲液中储存时，可以导致抗原结合的损失，(vi)CDR中蛋氨酸的存在（当暴露于溶剂时，可能会易于氧化），(vii)未配对半胱氨酸的存在（会与任何其他的未配对半胱氨酸形成二硫键，因而导致蛋白交联和/或更低表达水平），(viii)与种系的偏差，(ix)可能的T细胞表位的存在，和(x)理论上的聚集倾向性。
下一步，将计算机模拟中具有良好生物物理学特性的可变重链，可变κ轻链和可变λ轻链种系蛋白序列组合起来，形成可变重链和可变轻链对。如表5和图2-3所示，通常选择前20个VH，前8个Vλ和前12个Vκ进行合成，组合及随后的功能分析。对这些种系基因序列进行合成并且然后进行组合，以产生400个种系蛋白对（20VH×20VL），这些种系蛋白对代表，精确的说，再现，或者涵盖人体免疫组库中的占优势的蛋白对的大多数，如表6所示。这是通过合成这些可变重链和轻链种系基因，将它们组合成对，将这些对表达为蛋白（种系蛋白对），并测试每一对以鉴别它们的生物物理学特性而完成的。对以下特性进行测试：(i)Fab形式的噬菌体上相对展示率，(ii)Fab形式的相对表达水平，例如，在大肠杆菌中；(iii)Fab形式的热稳定性；(iv)Fab形式的在牛或鼠血清中的稳定性；(v)IgG1形式的相对表达水平；和(vi)IgG1形式的在牛血清中的稳定性。
对400个种系蛋白对的展示、表达、热和血清稳定性的测试起着初步筛选的作用，以排除那些虽然自然存在，却不具有被认为有利于治疗学研发的生物物理学特性的种系蛋白对。目标是选择一个种系蛋白对亚组，其具有良好的可研发特性，同时在集合内保持高水平的多样性，使得该集合可以用于鉴别针对任何抗原的可研发的候选抗体。表12给出～60个粗体并带下划线的种系蛋白对，其达到本发明的一个实施例的阈值。表12之前公开于WO2010/136598（MorphoSys AG），其要求61/182,350，和61/299,401的权益，它们全部被整体引为参考。
从被测试的400个种系蛋白对（结果如表12中所示）中，选择95个进行进一步的测试。在被选择进行进一步测试的95个种系蛋白对中，一些被选定是因为它们达到了之前的标准，对它们进行进一步测试是希望的。其他的被选定以便可以进行重新评价，尽管未达到确定的阈值。对图16-24中所示的95个种系蛋白对进行合成，表达，纯化，然后以Fab和IgG1形式测试以下的指标a）纯化的Fab表达，以mg/L表示，b）纯化的Fab的单体含量（%单体），c）纯化的Fab热稳定性，d）纯化的IgG1表达，以mg/L表示，e）纯化的IgG1的单体含量（%单体），f）纯化的IgG1热稳定性，g）IgG1等电点和h）IgG1酸暴露应力测试，包括差式扫描荧光分析法（DSF），吸收，动态光散射和颗粒染色。
在一个实施例中，以下种系蛋白对（54）被鉴别为具有与可研发性相关的优越功能活性（图16-24中所示的数据）：VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK1-39(SEQ ID NO:236);VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK3-20(SEQ ID NO:239);VH1-46(SEQ ID NO:205)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH1-46(SEQ ID NO:205)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH1-46(SEQ ID NO:205)/VL3-21(SEQ ID NO:257);VH1-69*01(SEQ IDNO:206)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-16(SEQ ID NO:234);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-27(SEQID NO:235);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-39(SEQ ID NO:236);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-47(SEQ ID NO:251);VH3-07(SEQID NO:207)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VK1-05(SEQ ID NO:230);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VK1-39(SEQ ID NO:236);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VK3-15(SEQID NO:238);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-40(SEQ ID NO:250);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-47(SEQ ID NO:251);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-11(SEQID NO:208)/VL2-23(SEQ ID NO:255);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-05(SEQ ID NO:230);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-06(SEQ ID NO:231);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-12(SEQID NO:233);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-16(SEQ ID NO:234);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-27(SEQ ID NO:235);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK3-11(SEQ ID NO:237);VH3-15(SEQID NO:209)/VL1-40(SEQ ID NO:250);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-47(SEQ ID NO:251);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL2-14(SEQID NO:254);VH3-21(SEQ ID NO:210)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-21(SEQ ID NO:210)/VK1-27(SEQ ID NO:235);VH3-21(SEQ ID NO:210)/VL2-11(SEQ ID NO:253);VH3-23(SEQID NO:211)/VK1-39(SEQ ID NO:236);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL2-23(SEQ ID NO:255);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL3-1(SEQID NO:256);VH3-30(SEQ ID NO:212)/VK3-20(SEQ ID NO:239);VH3-53(SEQ ID NO:213)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-53(SEQ ID NO:213)/VL2-11(SEQ ID NO:253);VH3-74(SEQID NO:214)/VK1-05(SEQ ID NO:230);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-06(SEQ ID NO:231);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-27(SEQID NO:235);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK3-20(SEQ ID NO:239);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VK1-39(SEQ ID NO:236);VH5-51(SEQID NO:215)/VL1-40(SEQ ID NO:250);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK1-09(SEQ ID NO:232);VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK3-15(SEQ IDNO:238);VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK3-20(SEQ ID NO:239)和VH6-1(SEQ ID NO:216)/VL1-51(SEQ ID NO:252)。特别地，在本实施例中，这些种系蛋白对（54）都具有达到或超过每个标准的下述阈值的值：a)纯化的Fab表达产率（如实例9.1.1中所描述）至少2.5mg/L；b)纯化的IgG1表达产率（如实例9.2.1中所描述）至少30.0mg/L；c)纯化的Fab的热稳定性（如实例9.1.2中所描述）至少70℃；d)纯化的IgG1的热稳定性（如实例9.2.2中所描述）至少73℃；e)纯化的Fab的单体含量（如实例9.1.3中所描述）至少98%；和f)纯化的IgG1的单体含量（如实例9.2.3中所描述）至少99%。因此，包含任意数量的这些可变重链和可变轻链对的集合可以用于鉴别针对任何抗原的可研发抗体或其片段。
与WO2010/136598中的表32相比，表32仅给出了54对中的21对为具有某些不同功能特性。
本披露的实施例包括由上述具有与可研发性相关的优越功能活性的种系蛋白对的子集（54个中的36个）构成的集合。在一个实施例中，集合包括合成的抗体或其功能性片段，其中，这些抗体或功能性片段包括可变重链和可变轻链对，其中，这些可变重链和可变轻链对的框架区包括以下可变重链和可变轻链对的种系蛋白序列，VH1-18（SEQ ID NO：204)/VK3-20(SEQ ID NO:239);VH1-46(SEQ ID NO:205)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH1-46(SEQ ID NO:205)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH1-69*01(SEQ ID NO:206)/VL1-51(SEQ IDNO:252);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-27(SEQ ID NO:235);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-07(SEQID NO:207)/VL1-47(SEQ ID NO:251);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-40(SEQ ID NO:250);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-47(SEQID NO:251);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL2-23(SEQ ID NO:255);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-05(SEQ ID NO:230);VH3-15(SEQID NO:209)/VK1-06(SEQ ID NO:231);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-27(SEQ ID NO:235);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK3-11(SEQID NO:237);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-21(SEQ ID NO:210)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK1-39(SEQ ID NO:236);VH3-23(SEQID NO:211)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL2-23(SEQ ID NO:255);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL3-1(SEQ ID NO:256);VH3-53(SEQ ID NO:213)/VK3-15(SEQID NO:238);VH3-53(SEQ ID NO:213)/VL2-11(SEQ ID NO:253);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-05(SEQ ID NO:230);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-06(SEQ ID NO:231);VH3-74(SEQID NO:214)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK3-20(SEQ ID NO:239);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VK1-39(SEQ ID NO:236);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-40(SEQID NO:250);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK1-09(SEQ ID NO:232);VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK3-20(SEQ ID NO:239)和VH6-1(SEQID NO:216)/VL1-51(SEQ ID NO:252)。在本实施例中，子集（36）种系蛋白对是基于应力测试数据从54个种系蛋白对中选出的。对该应力测试数据的鉴别所采用的是实例9.2.6(a-d)中所描述的方法，图19-24、实例9.2.6（a-d）中所示的数据，图19-54以及实例9.2.7中所示的数据，图55-60所示的得分。该应力测试对95个种系蛋白对以IgG1形式进行评价，以确定它们对酸暴露和玻璃珠搅拌的承受能力。抗体对酸暴露的承受能力是一个越来越重要的因子，因为在进行化学、制造和控制（CMC）的下游处理（DSP）时，病毒灭活是一个常规的。抗体或抗体片段对剪切力的耐受能力是有用的判断标准，因为在处理过程中过滤步骤是无法避免的，并且通过注射针头或塑料管给药时剪切力也会产生。
一个实施例中的上述子集集合，（36）种系蛋白对被选定，因为相对于那54对中的其他对，它们表现出更强的对酸和搅拌应力的耐受能力，因而具有与可研发性相关的额外的优越功能特性。在本实施例中被选定的这36个种系蛋白对，具有达到或超过每个标准的以下阈值的值：a)纯化的Fab表达产率（如实例9.1.1中所描述）至少2.5mg/L；b)纯化的IgG1表达产率（如实例9.2.1中所描述）至少30.0mg/L；c)纯化的Fab的热稳定性（如实例9.1.2中所描述）至少70℃；d)纯化的IgG1的热稳定性（如实例9.2.2中所描述）至少73℃；e)纯化的Fab的单体含量（如实例9.1.3中所描述）至少98%；f)纯化的IgG1的单体含量（如实例9.2.3中所描述）至少99%，以及g)应力测试累计得分（如实例9.2.7中所描述）至少1225。
与WO2010/136598中的表32相比，表32仅给出了36对中的14对为具有某些不同功能特性。另外，WO2010/136598并没有公开这36对的特定组合。
在另一个实施例中，每个标准的阈值选择如下：a)纯化的Fab表达产率（如实例9.1.1中所描述）至少2.5mg/L；b)纯化的IgG1表达产率（如实例9.2.1中所描述）至少30.0mg/L；c)纯化的Fab的热稳定性（如实例9.1.2中所描述）至少70℃；d)纯化的IgG1的热稳定性（如实例9.2.2中所描述）至少73℃；e)纯化的Fab的单体含量（如实例9.1.3中所描述）至少99%；f)纯化的IgG1的单体含量（如实例9.2.3中所描述）至少99%；g)纯化的IgG1的等电点（如实例9.2.4中所描述）至少8.3；以及h)应力测试累计得分（如实例9.2.7中所描述）至少1225。在本实施例中，一个集合包括（33对）：VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK3-20(SEQID NO:239);VH1-46(SEQ ID NO:205)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH1-46(SEQ ID NO:205)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH1-69*01(SEQ ID NO:206)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-27(SEQ ID NO:235);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-47(SEQ ID NO:251);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-40(SEQ ID NO:250);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-47(SEQ ID NO:251);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL2-23(SEQ ID NO:255);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-05(SEQ ID NO:230);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-06(SEQ ID NO:231);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-27(SEQ ID NO:235);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK3-11(SEQ ID NO:237);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-21(SEQ ID NO:210)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-53(SEQ ID NO:213)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-53(SEQ ID NO:213)/VL2-11(SEQ ID NO:253);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-05(SEQ ID NO:230);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-06(SEQ ID NO:231);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK3-20(SEQ ID NO:239);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VK1-39(SEQ ID NO:236);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-40(SEQ ID NO:250);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK1-09(SEQ ID NO:232);VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK3-20(SEQ ID NO:239)和VH6-1(SEQ ID NO:216)/VL1-51(SEQ ID NO:252)。
与WO2010/136598中的表32相比，表32仅给出了33对中的14对为具有某些不同功能特性。另外，WO2010/136598并未公开这33对的特定组合。
在另一个实施例中，为了增加多样性，多个对被加入到一个集合中，即使这些对本身并未达到所有的每个标准内的阈值。在一个实施例中，一个集合进一步包括：VH3-23(SEQID NO:211)/VK1-39(SEQ ID NO:236);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL2-23(SEQ ID NO:255);和VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL3-1(SEQ ID NO:256)。在本实施例中，集合包括（36对）：VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK3-20(SEQ ID NO:239);VH1-46(SEQ ID NO:205)/VK3-15(SEQ IDNO:238);VH1-46(SEQ ID NO:205)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH1-69*01(SEQ ID NO:206)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-07(SEQID NO:207)/VK1-27(SEQ ID NO:235);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-47(SEQ ID NO:251);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-51(SEQID NO:252);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-40(SEQ ID NO:250);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-47(SEQ ID NO:251);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-11(SEQID NO:208)/VL2-23(SEQ ID NO:255);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-05(SEQ ID NO:230);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-06(SEQ ID NO:231);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-12(SEQID NO:233);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-27(SEQ ID NO:235);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK3-11(SEQ ID NO:237);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-21(SEQID NO:210)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK1-39(SEQ ID NO:236);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL2-23(SEQID NO:255);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL3-1(SEQ ID NO:256);VH3-53(SEQ ID NO:213)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-53(SEQ ID NO:213)/VL2-11(SEQ ID NO:253);VH3-74(SEQID NO:214)/VK1-05(SEQ ID NO:230);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-06(SEQ ID NO:231);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK3-20(SEQID NO:239);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VK1-39(SEQ ID NO:236);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-40(SEQ ID NO:250);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH6-1(SEQID NO:216)/VK1-09(SEQ ID NO:232);VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK3-20(SEQ ID NO:239)和VH6-1(SEQ ID NO:216)/VL1-51(SEQ ID NO:252)。
这样的集合克服了现有技术的很多问题。例如，B细胞来源的集合包括不具有良好生物物理学特性的VH/VL对，因为在这样一个集合中出现的VH和VL配对与B细胞样本中出现的配对是相同的。如果采集的B细胞样本足够大，大概50个VH和50个VL类的配对组合（2500）中的每一个都将出现。在本披露中，对VH和VL对的广泛测试表明很多自然存在的VH和VL种系基因对（种系蛋白对）并不具有会使其在临床中具有可研发性的特性。因此，这样的B细胞库包括许多很可能不可研发的VH和VL对。所以，生成包括具有有利功能特性的VH和VL对的、多样性大的库是希望的，然而，对B细胞集合方法来说，这是不可能的。
例如，本披露的一个方面是抗体或功能性片段的集合，该集合包括具有增强可研发性的有利特性的可变重链和轻链种系蛋白对，但不包括不具有这些特性的可变重链和轻链种系基因对，即使它们在人体免疫组库中占优势地表达。通过这种方式，该集合被设计为（从那2500对）排除了那些自然存在的不具有有利功能特性的可变重链和轻链组合或对。例如，如表5中所示，VH4-34在人体免疫组库中频繁出现，但是同样众所周知的是，这条重链种系基因来源的抗体对B细胞是有毒性的，因此，这条基因来源的抗体可以从集合设计中排除。见Bhat等人，VH4-34（VH4.21）基因编码的单克隆抗体诱导的人B淋巴细胞的快速细胞毒性，临床与实验免疫学，105(1):183-90(1996年七月)(Bhat et al.,Rapid cytotoxicityof human B lymphocytes induced by VH4-34(VH4.21)gene-encoded monoclonalantibodies,Clin Exp Immunol.,105(1):183-90(July1996))。
附图说明
图1显示了如实例1中详细地描述被选择用于结合到phoA和ompA大肠杆菌（E.coli）信号序列的C末端中的限制位点，并且包括了CDR3周围的限制位点和其各自的取向。此图在呈现大肠杆菌信号序列的同时，还代表了如也在实例1中详细地描述被选择用于结合到用于在IgG1表达中使用的人类重链和κ链前导序列的C末端限制位点。
图2显示了如实例4中详细地描述被选择用于合成、组合以及功能表征的20个VH种系基因。该图还显示了对每一种系基因的计算机模拟分析的结果，其中pI代表了等电点，PTM是互补性决定区中的潜在的翻译后修饰位点，如在此所述，NxS/T是N-键联的糖基化位点，并且CDR中的Met是蛋氨酸。
图3显示了如实例4中详细地描述被选择用于合成、组合以及功能表征的8种Vλ和12种Vκ种系基因。该图还显示了对每一种系基因的计算机模拟分析的结果，其中pI代表了等电点，PTM是互补性决定区中的潜在的翻译后修饰位点，如在此所述，NxS/T是N-键联的糖基化位点，并且CDR中的Met是蛋氨酸。此处，VL意指Vλ。
图4显示了来自实例2.1和实例2.2的聚池的数据的VH/Vκ对。数字条目代表了聚池的数据中来自经鉴别的单独的B细胞的每一VH/Vκ种系基因对的数目。Y轴显示了聚池的数据中就表达频率来说从上（最盛行的）VH3-23到下（较不盛行的）VH3-20分等级的VH种系基因。X轴显示了聚池的数据中就表达频率来说从左（最盛行的）IGKV3-20到右（较不盛行的）IGKV1D-17分等级的Vκ种系基因。数目1358是被取样的B细胞的数目。
图5显示了来自实例2.1和实例2.2的聚池的数据的VH/Vλ对。数字条目代表了聚池的数据中来自经鉴别的一种单独的B细胞的每一VH/Vλ种系基因对的数目。Y轴显示了聚池的数据中就表达频率来说从上（最盛行的）VH3-23到下（较不盛行的）VH3-20分等级的VH种系基因。X轴显示了聚池的数据中就表达频率来说从左（最盛行的）IGLV2-14到右（较不盛行的）IGLV4-60分等级的Vλ种系基因。数目779是被取样的B细胞的数目。
图6A-C显示了如以下文献中所描述由VH种系基因（按照出现顺序分别是SEQ IDNO63-118）编码的氨基酸序列：汤姆林森（Tomlinson）等人,(1992),“人类种系Vh序列的组库展现约五十组具有不同超变环的Vh片段（The Repertoire of Human Germline VhSequences Reveals about Fifty Groups of Vh Segments with DifferentHypervariable Loop）”分子生物学杂志（J.Mol.Biol.）227,776-798；松田（Matsuda）等人(1998),“人类免疫球蛋白重链可变区基因座的全核苷酸序列（The complete nucleotidesequence of the human immunoglobulin heavy chain variable region locus）”实验医学杂志（J Exp Med）188(11):2151-62；以及乐弗兰克MP（LeFranc MP）(2001)“人类免疫球蛋白重（IGH）基因的命名法（Nomenclature of the human immunoglobulin heavy(IGH)genes）”临床免疫遗传学实验（Exp Clin Immunogenet.）18(2):100-16。
图7A-C显示了如以下文献中所描述由Vκ种系基因（按照出现顺序分别是SEQ IDNO119-164）编码的氨基酸序列：沙宝（）和扎周（Zachau）(1993),“人类免疫球蛋白κ基因座的可变基因（The variable genes of the human immunoglobulin kappalocus）”,霍佩赛勒生物化学（Biol.Chem Hoppe Seyler）.374(11):1001-22；布伦辛-库帕斯（Brensing-Küppers）等人(1997),“酵母人工染色体（YAC）上的人类免疫球蛋白κ基因座（The human immunoglobulin kappa locus on yeast artificial chromosomes(YACs)）”基因（Gene）.191(2):173-81；川崎（Kawasaki）等人(2001),“Vκ基因的人类免疫球蛋白κ基因座和种系组库的进化动力学（Evolutionary dynamics of the human immunoglobulinkappa locus and the germline repertoire of the Vkappa genes）”欧洲免疫学杂志（Eur J Immunol）31(4):1017-28；以及乐弗兰克MP(2001)“人类免疫球蛋白κ（IGK）基因的命名法（Nomenclature of the human immunoglobulin kappa(IGK)genes）”临床免疫遗传学实验,18,161-174。
图8A-B显示了如以下文献中所描述由Vλ种系基因（按照出现顺序分别是SEQ IDNO165-202）编码的氨基酸序列：川崎等人,(1997)“人类免疫球蛋白λ基因座的一种兆碱基的序列分析（One-Megabase Sequence Analysis of the Human immunoglobulin lambdaGene Locus）”基因组研究（Genome Research）7(3):250-61；弗利帕特（Frippiat）等人,(1995)“染色体22q11.2上的人类免疫球蛋白λ轻链基因座的组织（Organization of thehuman immunoglobulin lambda light-chain locus on chromosome22q11.2）”人类分子遗传学（Hum.Mol.Genet.）,4,983-991；以及乐弗兰克MP(2001)“人类免疫球蛋白λ（IGL）基因的命名法（Nomenclature of the human immunoglobulin lambda(IGL)genes）”临床免疫遗传学实验.18:242-254。
图9显示了pJPd1Fab三顺反子噬菌体展示载体。
图10显示了pJPx1Fab表达载体。
图11显示了pMx11（pMORPHX11）Fab表达载体。
图12显示了pMORPH30Fab展示载体。
图13显示了pJP_h_IgG1f可变重链IgG1表达载体。
图14显示了pJP_h_Ig_κ可变κ轻链IgG表达载体。
图15显示了pJP_h_Ig_λ2可变λ轻链IgG表达载体。
图16有关如实例9中所描述进一步测试的95个种系蛋白对，此图显示了所测试的种系蛋白对编号1-32的纯化的Fab表达产率，以mg/L（培养物）为单位；纯化的Fab单体含量（单体%）；纯化的Fab热稳定性，以℃为单位；纯化的IgG1表达产率，以mg/L（细胞培养物）为单位；纯化的IgG1单体含量（单体%）；纯化的IgG1热稳定性，以℃为单位（所示的过渡是可变结构域的过渡，Fc结构域的过渡未图示）；以及IgG1等电点。使用实例9.1.1-9.1.3和9.2.1-9.2.4中所述的方法确定数据。此处，VL意指Vλ。
图17有关如实例9中所描述进一步测试的95个种系蛋白对，此图显示了所测试的种系蛋白对编号33-64的纯化的Fab表达产率，以mg/L（培养物）为单位；纯化的Fab单体含量（单体%）；纯化的Fab热稳定性，以℃为单位；纯化的IgG1表达产率，以mg/L（细胞培养物）为单位；纯化的IgG1单体含量（单体%）；纯化的IgG1热稳定性，以℃为单位（所示的过渡是可变结构域的过渡，Fc结构域的过渡未图示）；以及IgG1等电点。使用实例9.1.1-9.1.3和9.2.1-9.2.4中所述的方法确定数据。此处，VL意指Vλ。
图18有关如实例9中所描述进一步测试的95个种系蛋白对，此图显示了所测试的种系蛋白对编号65-95的纯化的Fab表达产率，以mg（纯化的Fab）/L（培养物）为单位；纯化的Fab单体含量（单体%）；纯化的Fab热稳定性，以℃为单位；纯化的IgG1表达产率，以mg（纯化的IgG1）/L（细胞培养物）为单位；纯化的IgG1单体含量（单体%）；纯化的IgG1热稳定性，以℃为单位（所示的过渡是可变结构域的过渡，Fc结构域的过渡未图示）；以及IgG1等电点。使用实例9.1.1-9.1.3和9.2.1-9.2.4中所述的方法确定数据。此处，VL意指Vλ。
图19有关如实例9中所描述进一步测试的95个种系蛋白对，此图显示了如实例9.2.5(a)中所描述如使用差示扫描荧光测定法所确定的在酸暴露之前与之后的热稳定性，以℃为单位（表观Tm）（给出的表观Tm对应于可变结构域的去折叠，Fc结构域的去折叠中点未图示）；如实例9.2.5(b)中所描述在酸暴露之前与期间以及中和之后基于紫外吸收的浊度的相对变化。所示的数据是所测试的种系蛋白对编号1-32的。此处，VL意指Vλ。
图20有关如实例9中所描述进一步测试的95个种系蛋白对，此图显示了如实例9.2.5(c)中所描述在酸暴露之前与之后的颗粒半径（nm）和在酸暴露之前与之后的多分散性；如实例9.2.5(d)中所描述在酸之前与之后的颗粒染色；以及如实例9.2.7中所描述的累计得分。所示的数据是所测试的种系蛋白对编号1-32的。此处，VL意指Vλ。
图21有关如实例9中所描述进一步测试的95个种系蛋白对，此图显示了如实例9.2.5(a)中所描述如使用差示扫描荧光测定法所确定的在酸暴露之前与之后的热稳定性，以℃为单位（表观Tm）（给出的表观Tm对应于可变结构域的去折叠，Fc结构域的去折叠中点未图示）；如实例9.2.5(b)中所描述在酸暴露之前与期间以及中和之后基于紫外吸收的浊度的相对变化。所示的数据是所测试的种系蛋白对编号33-64的。此处，VL意指Vλ。
图22有关如实例9中所描述进一步测试的95个种系蛋白对，此图显示了如实例9.2.5(c)中所描述在酸暴露之前与之后的颗粒半径（nm）和在酸暴露之前与之后的多分散性；如实例9.2.5(d)中所描述在酸之前与之后的颗粒染色；以及如实例9.2.7中所描述的累计得分。所示的数据是所测试的种系蛋白对编号33-64的。此处，VL意指Vλ。
图23有关如实例9中所描述进一步测试的95个种系蛋白对，此图显示了如实例9.2.5(a)中所描述如使用差示扫描荧光测定法所确定的在酸暴露之前与之后的热稳定性，以℃为单位（表观Tm）（给出的表观Tm对应于可变结构域的去折叠，Fc结构域的去折叠中点未图示）；如实例9.2.5(b)中所描述在酸暴露之前与期间以及中和之后基于紫外吸收的浊度的相对变化。所示的数据是所测试的种系蛋白对编号65-95的。此处，VL意指Vλ。
图24有关如实例9中所描述进一步测试的95个种系蛋白对，此图显示了如实例9.2.5(c)中所描述在酸暴露之前与之后的颗粒半径（nm）和在酸暴露之前与之后的多分散性；如实例9.2.5(d)中所描述在酸之前与之后的颗粒染色；以及如实例9.2.7中所描述的累计得分。所示的数据是所测试的种系蛋白对编号65-95的。此处，VL意指Vλ。
图25显示了某些可变重链的框架1和HCDR1区的VH种系蛋白（按照出现顺序分别是SEQ ID NO204-216）和DNA序列（按照出现顺序分别是SEQ ID NO217-229）。这些氨基酸序列是如在此定义的种系蛋白序列。已经由基因技术公司（GeneArt）对DNA序列进行密码子优化用于避免罕见人类密码子的大肠杆菌表达。所示的种系基因与图6中所示的那些相同，但仅包括了被选择用于该集合的实施例的VH种系基因。
图26显示了某些可变重链的框架2和HCDR2区的VH种系蛋白（按照出现顺序分别是SEQ ID NO204-216（接上的））和DNA序列（按照出现顺序分别是SEQ ID NO217-229（接上的））。这些氨基酸序列是如在此定义的种系蛋白序列。已经由基因技术公司对DNA序列进行密码子优化用于避免罕见人类密码子的大肠杆菌表达。所示的种系基因与图6中所示的那些相同，但仅包括了被选择用于该集合的实施例的VH种系基因。
图27显示了某些可变重链的框架3区的VH种系蛋白（按照出现顺序分别是SEQ IDNO204-216（接上的））和DNA序列（按照出现顺序分别是SEQ ID NO217-229（接上的））。这些氨基酸序列是如在此定义的种系蛋白序列。已经由基因技术公司对DNA序列进行密码子优化用于避免罕见人类密码子的大肠杆菌表达。所示的种系基因与图6中所示的那些相同，但仅包括了被选择用于该集合的实施例的VH种系基因。
图28显示了某些可变轻链的框架1和LCDR1区的Vκ种系蛋白（按照出现顺序分别是SEQ ID NO230-239）和DNA序列（按照出现顺序分别是SEQ ID NO240-249）。这些氨基酸序列是如在此定义的种系蛋白序列。已经由基因技术公司对DNA序列进行密码子优化用于避免罕见人类密码子的大肠杆菌表达。所示的种系基因与图7中所示的那些相同，但仅包括了被选择用于该集合的实施例的Vκ种系基因。
图29显示了某些可变轻链的框架2和LCDR2区的Vκ种系蛋白（按照出现顺序分别是SEQ ID NO230-239（接上的））和DNA序列（按照出现顺序分别是SEQ ID NO240-249（接上的））。这些氨基酸序列是如在此定义的种系蛋白序列。已经由基因技术公司对DNA序列进行密码子优化用于避免罕见人类密码子的大肠杆菌表达。所示的种系基因与图7中所示的那些相同，但仅包括了被选择用于该集合的实施例的Vκ种系基因。
图30显示了某些可变轻链的框架3区的Vκ种系蛋白（按照出现顺序分别是SEQ IDNO230-239（接上的））和DNA序列（按照出现顺序分别是SEQ ID NO 240-249（接上的））。这些氨基酸序列是如在此定义的种系蛋白序列。已经由基因技术公司对DNA序列进行密码子优化用于避免罕见人类密码子的大肠杆菌表达。所示的种系基因与图7中所示的那些相同，但仅包括了被选择用于该集合的实施例的Vκ种系基因。
图31显示了某些可变轻链的框架1和LCDR1区的Vλ种系蛋白（按照出现顺序分别是SEQ ID NO250-257）和DNA序列（按照出现顺序分别是SEQ ID NO 258-265）。这些氨基酸序列是如在此定义的种系蛋白序列。已经由基因技术公司对DNA序列进行密码子优化用于避免罕见人类密码子的大肠杆菌表达。所示的种系基因与图8中所示的那些相同，但仅包括了被选择用于该集合的实施例的Vλ种系基因。此处，VL意指Vλ。
图32显示了某些可变轻链的框架2和LCDR2区的Vλ种系蛋白（按照出现顺序分别是SEQ ID NO250-257（接上的））和DNA序列（按照出现顺序分别是SEQ ID NO258-265（接上的））。这些氨基酸序列是如在此定义的种系蛋白序列。已经由基因技术公司对DNA序列进行密码子优化用于避免罕见人类密码子的大肠杆菌表达。所示的种系基因与图8中所示的那些相同，但仅包括了被选择用于该集合的实施例的Vλ种系基因。此处，VL意指Vλ。
图33显示了某些可变轻链的框架3区的Vλ种系蛋白（按照出现顺序分别是SEQ IDNO250-257（接上的））和DNA序列（按照出现顺序分别是SEQ ID NO258-265（接上的））。这些氨基酸序列是如在此定义的种系蛋白序列。已经由基因技术公司对DNA序列进行密码子优化用于避免罕见人类密码子的大肠杆菌表达。所示的种系基因与图8中所示的那些相同，但仅包括了被选择用于该集合的实施例的Vλ种系基因。此处，VL意指Vλ。
图34显示了某些可变重链的框架1和HCDR1区的VH种系蛋白（按照出现顺序分别是SEQ ID NO266-278）和DNA序列（按照出现顺序分别是SEQ ID NO279-291）。已经在HCDR1内修饰氨基酸序列以去除潜在的翻译后修饰位点（PTM）。已经由基因技术公司对DNA序列进行密码子优化用于避免罕见人类密码子的大肠杆菌表达。已经在HCDR1中被修饰的氨基酸是加下划线的，并且编码每一位置的相应DNA是粗体并且加下划线的。
图35显示了某些可变重链的框架2和HCDR2区的VH种系蛋白（按照出现顺序分别是SEQ ID NO266-278（接上的））和DNA序列（按照出现顺序分别是SEQ ID NO279-291（接上的））。已经在HCDR2内修饰氨基酸序列以去除潜在的翻译后修饰位点（PTM）。已经由基因技术公司对DNA序列进行密码子优化用于避免罕见人类密码子的大肠杆菌表达。已经在HCDR2中被修饰的氨基酸是加下划线的，并且编码每一位置的相应DNA是粗体并且加下划线的。
图36显示了某些可变重链的框架3区的VH种系蛋白（按照出现顺序分别是SEQ IDNO266-278（接上的））和DNA序列（按照出现顺序分别是SEQ ID NO279-291（接上的））。这些氨基酸序列是种系的，因为在这些框架区内未去除潜在的翻译后修饰位点。已经由基因技术公司对DNA序列进行密码子优化用于避免罕见人类密码子的大肠杆菌表达。VH1-69*01和VH3-23还可以在位置94处具有核苷酸CGT。
图37显示了如实例11中所描述从子集合VH3-23/VK1-39和VH3-23/VL3-1鉴别的对Dkk3具有特异性的代表性抗体或抗体片段。该图显示了每一抗体或片段从中得以鉴别的子集合、抗原、CDR-H3和CDR-L3的长度、Fab热稳定性和亲和力、IgG1pI、表达产率（mg/L）、热稳定性以及通过SEC确定的单体含量（单体%）。此处，VL意指Vλ。
图38显示了如实例11中所描述从子集合VH3-23/VK1-39和VH3-23/VL3-1鉴别的对ErbB4/Her4_Fc具有特异性的代表性抗体或抗体片段。该图显示了每一抗体或片段从中得以鉴别的子集合、抗原、CDR-H3和CDR-L3的长度、Fab热稳定性和亲和力、IgG1pI、表达产率（mg/L）、热稳定性以及通过SEC确定的单体含量（单体%）。此处，VL意指Vλ。
图39显示了如实例9.1.2中所描述如通过差示扫描荧光测定法（DSF）确定的所选择的Fab的表观温度熔点。每一点代表了一种独特的Fab。正方形指示了如实例9中所描述的对照Fab。条线指示了中值。该对照代表了实例9中被测试功能特性的抗体，该抗体包括各自的种系蛋白对的种系FR区和CDR1和CDR2以及来自埃沃特（Ewert）等人的CDR3。在实例11中产生所选择的Fab，并且它们仅在CDR3方面与对照抗体在序列上不同。此处闭合聚簇显示该集合的输出（意指针对DKK3或ErbB4/Her4_Fc抗原选择的抗体或片段）维持了该集合设计的成员的优越功能特性。
图40显示了对本发明的集合的FR4区进行编码的氨基酸序列（按照出现顺序分别是SEQ ID NO293、295、297以及301）和密码子优化的核酸序列（按照出现顺序分别是SEQ IDNO292、294、296、298、299、300、302以及303）。
图41A和B显示了对本发明的集合的IgG1f重链恒定结构域进行编码的氨基酸序列（SEQ ID NO:305）和密码子优化的核酸序列（SEQ ID NO:304）。已经对所示的核酸序列进行了密码子优化。
图42显示了对本发明的集合的Fab重链恒定结构域进行编码的氨基酸序列（SEQID NO:307）和密码子优化的核酸序列（SEQ ID NO:306）。
图43显示了对本发明的集合的IgG1f和Fabκ轻链恒定结构域进行编码的氨基酸序列（按照出现顺序分别是SEQ ID NO309和311）和密码子优化的核酸序列（按照出现顺序分别是SEQ ID NO308和310）。已经对所示的核酸序列进行了密码子优化。
图44显示了对本发明的集合的IgG1f和Fabλ轻链恒定结构域进行编码的氨基酸序列（按照出现顺序分别是SEQ ID NO313和315）和密码子优化的核酸序列（按照出现顺序分别是SEQ ID NO312和314）。
图45显示了如实例9.2.4中所描述的所选择的IgG的等电点（pI）值。每一点代表了一种独特的IgG。正方形指示了如实例9中所描述的对照IgG。条线指示了中值。该对照代表了实例9中被测试功能特性的抗体，该抗体包括各自的种系蛋白对的种系FR区和CDR1和CDR2以及来自埃沃特等人的CDR3。在实例11中产生所选择的IgG，并且它们仅在CDR3方面与对照抗体在序列上不同。此处闭合聚簇显示该集合的输出（意指针对DKK3或ErbB4/Her4_Fc抗原选择的抗体或片段）维持了该集合设计的成员的优越功能特性。
图46显示了如实例9.2.2中所描述如通过差示扫描荧光测定法（DSF）确定的所选择的IgG的表观去折叠中点。每一点代表了一种独特的IgG。正方形指示了如实例9中所描述的对照IgG。条线指示了中值。该对照代表了实例9中被测试功能特性的抗体，该抗体包括各自的种系蛋白对的种系FR区和CDR1和CDR2以及来自埃沃特等人的CDR3。在实例11中产生所选择的IgG，并且它们仅在CDR3方面与对照抗体在序列上不同。此处闭合聚簇显示该集合的输出（意指针对DKK3或ErbB4/Her4_Fc抗原选择的抗体或片段）维持了该集合设计的成员的优越功能特性。
图47显示了如实例9.2.1中所描述如通过紫外分光光度法确定的所选择的IgG的表达产率。每一点代表了一种独特的IgG。正方形指示了如实例9中所描述的对照IgG。条线指示了中值。该对照代表了实例9中被测试功能特性的抗体，该抗体包括各自的种系蛋白对的种系FR区和CDR1和CDR2以及来自埃沃特等人的CDR3。在实例11中产生所选择的IgG，并且它们仅在CDR3方面与对照抗体在序列上不同。此处闭合聚簇显示该集合的输出（意指针对DKK3或ErbB4/Her4_Fc抗原选择的抗体或片段）维持了该集合设计的成员的优越功能特性。
图48显示了如实例9.2.3中所描述如通过尺寸排阻色谱法（SEC）确定的所选择的IgG的单体含量。每一点代表了一种独特的IgG。正方形指示了如实例9中所描述的对照IgG。条线指示了中值。该对照代表了实例9中被测试功能特性的抗体，该抗体包括各自的种系蛋白对的种系FR区和CDR1和CDR2以及来自埃沃特等人的CDR3。在实例11中产生所选择的IgG，并且它们仅在CDR3方面与对照抗体在序列上不同。此处闭合聚簇显示该集合的输出（意指针对DKK3或ErbB4/Her4_Fc抗原选择的抗体或片段）维持了该集合设计的成员的优越功能特性。此处，VL意指Vλ。
图49有关如实例9中所描述进一步测试的95个种系蛋白对，此图显示了如实例9.2.6(a)中所描述在用玻璃珠搅拌之前与期间基于紫外吸收的浊度的相对变化。所示的数据是所测试的种系蛋白对编号1-32的。此处，VL意指Vλ。
图50有关如实例9中所描述进一步测试的95个种系蛋白对，此图显示了如实例9.2.6(b)中所描述如使用差示扫描荧光测定法确定的用玻璃珠搅拌之后的热稳定性，以℃为单位（表观Tm）（给出的表观Tm对应于可变结构域的去折叠，Fc结构域的去折叠中点未图示）；显示了如实例9.2.6(c)中所描述在用玻璃珠搅拌之后的颗粒半径（nm）、在用玻璃珠搅拌之后的多分散性；以及如实例9.2.6(d)中所描述在用玻璃珠搅拌之前与之后的颗粒染色。所示的数据是所测试的种系蛋白对编号1-32的。此处，VL意指Vλ。
图51有关如实例9中所描述进一步测试的95个种系蛋白对的，此图显示了如实例9.2.6(a)中所描述在应力测试之前与期间的基于紫外吸收的浊度的相对变化。所示的数据是所测试的种系蛋白对编号33-64的。此处，VL意指Vλ。
图52有关如实例9中所描述进一步测试的95个种系蛋白对，此图显示了如实例9.2.6(b)中所描述如使用差示扫描荧光测定法确定的用玻璃珠搅拌之后的热稳定性，以℃为单位（表观Tm）（给出的表观Tm对应于可变结构域的去折叠，Fc结构域的去折叠中点未图示）；显示了如实例9.2.6(c)中所描述在用玻璃珠搅拌之后的颗粒半径（nm）、在用玻璃珠搅拌之后的多分散性；以及如实例9.2.6(d)中所描述在用玻璃珠搅拌之前与之后的颗粒染色。所示的数据是所测试的种系蛋白对编号33-64的。此处，VL意指Vλ。
图53有关如实例9中所描述进一步测试的95个种系蛋白对，此图显示了如实例9.2.6(a)中所描述在应力测试之前与期间的基于紫外吸收的浊度的相对变化。所示的数据是所测试的种系蛋白对编号65-95的。此处，VL意指Vλ。
图54有关如实例9中所描述进一步测试的95个种系蛋白对，此图显示了如实例9.2.6(b)中所描述如使用差示扫描荧光测定法确定的用玻璃珠搅拌之后的热稳定性，以℃为单位（表观Tm）（给出的表观Tm对应于可变结构域的去折叠，Fc结构域的去折叠中点未图示）；显示了如实例9.2.6(c)中所描述在用玻璃珠搅拌之后的颗粒半径（nm）、在用玻璃珠搅拌之后的多分散性；以及如实例9.2.6(d)中所描述在用玻璃珠搅拌之前与之后的颗粒染色。所示的数据是所测试的种系蛋白对编号65-95的。此处，VL意指Vλ。
图55如实例9.2.7中所描述，对于实例9.2.5-9.2.6中进行的每一应力测试实验鉴别准确值，并且对于每一准确值提供一个相应得分。此图显示了针对在实例9.2.5中完成的实验（酸测试）对每一值给出的得分，无论是0、25、75或100。所示的得分是所测试的种系蛋白对编号1-32的。此处，VL意指Vλ。
图56如实例9.2.7中所描述，对于实例9.2.5-9.2.6中进行的每一应力测试实验鉴别准确值，并且对于每一准确值提供一个相应得分。此图显示了针对在实例9.2.6中完成的实验（用玻璃珠搅拌）对每一值给出的得分，无论是0、25、75或100。另外，此图显示了累计得分，它是通过将来自实例9.2.5-9.2.6中进行的测试的得分加到一起来计算。所示的得分是所测试的种系蛋白对编号1-32的。此处，VL意指Vλ。
图57如实例9.2.7中所描述，对于实例9.2.5-9.2.6中进行的每一应力测试实验鉴别准确值，并且对于每一准确值提供一个相应得分。此图显示了针对在实例9.2.5中完成的实验（酸测试）对每一值给出的得分，无论是0、25、75或100。所示的得分是所测试的种系蛋白对编号33-64的。此处，VL意指Vλ。
图58如实例9.2.7中所描述，对于实例9.2.5-9.2.6中进行的每一应力测试实验鉴别准确值，并且对于每一准确值提供一个相应得分。此图显示了针对在实例9.2.6中完成的实验（用玻璃珠搅拌）对每一值给出的得分，无论是0、25、75或100。另外，此图显示了累计得分，它是通过将来自实例9.2.5-9.2.6中进行的测试的得分加到一起来计算。所示的得分是所测试的种系蛋白对编号33-64的。此处，VL意指Vλ。
图59如实例9.2.7中所描述，对于实例9.2.5-9.2.6中进行的每一应力测试实验鉴别准确值，并且对于每一准确值提供一个相应得分。此图显示了针对在实例9.2.5中完成的实验（酸测试）对每一值给出的得分，无论是0、25、75或100。所示的得分是所测试的种系蛋白对编号65-95的。此处，VL意指Vλ。
图60如实例9.2.7中所描述，对于实例9.2.5-9.2.6中进行的每一应力测试实验鉴别准确值，并且对于每一准确值提供一个相应得分。此图显示了针对在实例9.2.6中完成的实验（用玻璃珠搅拌）对每一值给出的得分，无论是0、25、75或100。另外，此图显示了累计得分，它是通过将来自实例9.2.5-9.2.6中进行的测试的得分加到一起来计算。所示的得分是所测试的种系蛋白对编号65-95的。此处，VL意指Vλ。
图61A-D在噬菌体上展示本发明的实施例的种系蛋白对并且针对Frizzled-4Fc、GFP或erbB4/Her4_Fc融合物进行选择。此图显示了所使用的子集合、所选择针对的抗原、所筛选的克隆的数目、ELISA阳性命中以及独特抗体的数目。此处，VL意指Vλ。
图62A-C显示了如实例11中所描述来自针对rhErbB4/Her4_Fc融合物、rhFZD-4Fc融合物以及eGFP选择的子集合的IgG。该图显示了每一抗体从中得以鉴别的子集合、抗原、CDR-H3和CDR-L3的长度、IgG1pI、IgG1表达产率（mg/L）、IgG1热稳定性以及通过SEC确定的单体含量（单体%）。此处，VL意指Vλ。
具体实施方式
定义
为了促进对本发明的理解，提供了以下定义和说明。
如在此所使用，“数据库或可读媒体”是指用于存储序列数据和因此任何信息集合的任何格式，如一份数据库文件、一个查找表、一个Excel电子表格等。在某些实施例中，数据库以电子形式存储，如一个计算机可读存储装置。这包括如以下的媒体：一个服务器、客户端、硬盘、CD、DVD、个人数字助理（如掌上计算机（Palm Pilot））、磁带、压缩磁盘、计算机的内部ROM（只读存储器）或因特网或万维网。用于存储一台计算机可进入的文件的其他媒体将对本领域普通技术人员显而易见。
“计算机模拟”是指在一台计算机上执行的操作、分析或设计，但还可以同样在纸上或精神上执行。
如在此所使用，术语“抗体”包括完全抗体。一种抗体可以是多克隆、亲和力纯化的多克隆、单克隆、人类、鼠类或啮齿类、嵌合、骆驼或人源化抗体。一种抗体可以属于任何抗体类别，如IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA（包括人类子类IgA1和IgA2）、IgD、IgE或IgM。一种“抗体”是包括通过二硫键互连的至少两条重（H）链和两条轻（L）链的一种蛋白。
如在此所使用，术语抗体“片段”或“功能性片段”包括任何抗原结合片段，如Fab、F(ab')2、Fab'、Fv、scFv，包括一个Fc部分的单链，纳米抗体以及其他抗体，如具有除可变框架区以外的骨架的结构。术语“功能性片段”包括但不限于保留了结合到一种所关注的抗原的能力的任何抗体部分。
如在此所使用，术语“亲和力”是指在抗原位点处抗体与抗原之间的相互作用的强度。在每一个抗原位点内，抗体的可变区在众多位点处经由非共价力与抗原相互作用；相互作用越大，亲和力越强。如在此所使用，对于一种抗体或其功能性片段（如一种IgG抗体），术语“高亲和力”是指对于一种靶标抗原具有10-8M或更小、10-9M或更小、或10-10M或更小、或10-11M或更小、或10-12M或更小的KD的一种抗体。然而，对于其他抗体同种型，“高亲和力”结合可以不同。例如，对于一种IgM同种型，“高亲和力”结合是指具有10-7M或更小、或10-8M或更小的KD的一种抗体。
如在此所使用，术语“K缔合（Kassoc）”或“Ka”旨在是指一种具体抗体-抗原相互作用的缔合速率常数；而如在此所使用，术语“K解离（Kdis）”或“Kd”旨在是指一种具体抗体-抗原相互作用的解离速率常数。如在此所使用，术语“KD”旨在是指平衡解离常数，它由Kd比Ka的比率（即Kd/Ka）获得并且以摩尔浓度（M）的形式表示。抗体的KD值可以使用在本领域中良好建立的方法来确定。用于确定一种抗体的KD的一种方法是通过使用表面等离子共振或使用一种生物传感器***（如***）。
术语“嵌合抗体”是一种抗体分子，其中(a)恒定区或其一部分被改变、替换或交换以使得抗原结合位点（可变区）键联到具有一种不同或改变的类别、效应子功能和/或种类的一个恒定区。
术语“同种型”是指由重链恒定区基因提供的抗体类别（例如IgM；IgE；IgG，如IgG1IgG2或IgG4）。同种型还包括这些类别之一的被修饰的形式，其中已进行修饰以改变Fc功能，例如提高或减少效应子功能或与Fc受体的结合。
术语“种系”意指从亲代传到后代的编码抗体或其功能性片段的核酸序列。
术语“种系蛋白序列”或“种系氨基酸序列”意指a）由一个种系基因编码的抗体或其功能性片段的可变区的氨基酸序列；b）由一个被修饰的核酸序列编码的氨基酸序列，该被修饰的核酸序列编码与由一个种系基因编码的抗体或其功能性片段的可变区具有相同的氨基酸序列的抗体或其功能性片段的可变区，其中该核酸序列通过例如密码子优化、加入所希望的限制位点、优化的GC含量、去除不希望的mRNA剪接位点或去除mRNA不稳定性基序来修饰；或c）由一个种系基因编码的氨基酸序列，但如为了去除不希望的半胱氨酸或引入所希望的限制位点（例如BbsI）、或起因于合成、扩增或克隆的错误而在该氨基酸序列中有微量突变。“种系蛋白序列”或“种系氨基酸序列”的实例显示在图6-8和25-33中。另外，“种系蛋白序列”或“种系氨基酸序列”包括如实例5中制备的构建体，它们包括：
a)对于VH来说：前导序列（如表1中所示，结合了一个NheI RE位点的被修饰的phoA）；种系FR1、CDR1、FR2、CDR2以及FR3（如图1中所示，结合了一个BssHII RE位点（GCGCGC））；如埃沃特S.（Ewert S.）等人,分子生物学杂志（J.Mol.Biol.）(2003)325,531-553中使用的4D5抗体的CDR-H3（WGGDGFYAMDY）（SEQ ID NO:1）；以及JH4FR4（如图1中所示，结合了一个XhoI RE位点（CTCGAG））；
b)对于Vκ来说：前导序列（如表2中所示，结合了该NdeI RE位点的ompA）；种系FR1、CDR1、FR2、CDR2以及FR3（如图1中所示，结合了一个BbsI RE位点（GAAGAC））；根据埃沃特S.等人,分子生物学杂志（J.Mol.Biol.）(2003)325,531-553的κ样CDR-L3（QQHYTTPPT）（SEQID NO:2）；以及Jk1FR4（如图1中所示，结合了一个KpnI/Acc65I RE位点（GGTACC））；以及
c)对于Vλ来说：前导序列（如表2中所示，结合了该NdeI RE位点的ompA）；种系FR1、CDR1、FR2、CDR2以及FR3（如图1中所示，结合了一个BbsI RE位点（GAAGAC））；根据埃沃特S.等人,分子生物学杂志（J.Mol.Biol.）(2003)325,531-553的λ样CDR-L3（QSYDSSLSGVV)（SEQID NO:3）；以及JI2/3FR4（如图1中所示结合了一个KpnI/Acc65I RE位点（GGTACC））。
由这些种系基因编码的抗体的“种系蛋白序列”或“种系氨基酸序列”披露于以下出版物中，对于VH来说：汤姆林森（Tomlinson）等人,(1992),“人类种系Vh序列的组库展现约五十组具有不同超变环的Vh片段”（"The Repertoire of Human Germline VhSequences Reveals about Fifty Groups of Vh Segments with DifferentHypervariable Loop"）分子生物学杂志（J.Mol.Biol.）227,776-798；松田（Matsuda）等人(1998),“人类免疫球蛋白重链可变区基因座的全核苷酸序列”（"The completenucleotide sequence of the human immunoglobulin heavy chain variable regionlocus"）实验医学杂志（J Exp Med）188(11):2151-62；以及乐弗兰克MP（LeFranc MP）(2001)“人类免疫球蛋白重（IGH）基因的命名法.”（"Nomenclature of the humanimmunoglobulin heavy(IGH)genes."）临床免疫遗传学实验（Exp Clin Immunogenet.）18(2):100-16；对于Vλ来说：川崎（Kawasaki）等人,(1997)“人类免疫球蛋白λ基因座的一种兆碱基的序列分析”（"One-Megabase Sequence Analysis of the Human immunoglobulinlambda Gene Locus"）基因组研究（Genome Research）7(3):250-61；弗利帕特（Frippiat）等人,(1995)“染色体22q11.2上的人类免疫球蛋白λ轻链基因座的组织”（"Organizationof the human immunoglobulin lambda light-chain locus on chromosome22q11.2"）人类分子遗传学（Hum.Mol.Genet.）,4,983-991；以及乐弗兰克MP(2001)“人类免疫球蛋白λ（IGL）基因的命名法”（"Nomenclature of the human immunoglobulin lambda(IGL)genes.）临床免疫遗传学实验（Exp Clin Immunogenet.）18:242-254；以及对于Vκ来说：沙宝和扎周（Schable and Zachau）(1993),“人类免疫球蛋白κ基因座的可变基因”（"Thevariable genes of the human immunoglobulin kappa locus"）霍佩赛勒生物化学（Biol.Chem Hoppe Seyler.）374(11):1001-22；布伦辛-库帕斯（Brensing-Kuppers）等人(1997),“酵母人工染色体（YAC）上的人类免疫球蛋白κ基因座”（"The humanimmunoglobulin kappa locus on yeast artificial chromosomes(YACs)"）,基因（Gene.）191(2):173-81；川崎等人(2001),“Vκ基因的人类免疫球蛋白κ基因座和种系组库的进化动力学”（"Evolutionary dynamics of the human immunoglobulin kappa locusand the germline repertoire of the Vkappa genes"）欧洲免疫学杂志（Eur JImmunol）31(4):1017-28；以及乐弗兰克MP(2001)“人类免疫球蛋白κ（IGK）基因的命名法”（"Nomenclature of the human immunoglobulin kappa(IGK)genes"）临床免疫遗传学实验（Exp Clin Immunogenet.）18,161-174，所述文献的全部内容都通过引用结合在此。
在说明书的部分（例如图5）中，本申请内所使用的可变结构域种系基因的命名法是如前一段落中引用的乐弗兰克等人的出版物中所描述的IMGT。关于命名法，“VH”和“IGHV”意指重链可变结构域，其中基因的编号是IMGT；“VL”、“Vλ”以及“IGLV”意指λ轻链可变结构域，其中基因的编号是IMGT；并且“Vκ”、“VK”以及“IGKV”意指κ轻链可变结构域，其中基因的编号是IMGT。可替代地，“VL”可以用来指可变轻链，包括Vκ和Vλ。
术语“种系基因序列”意指a）编码一种抗体或其功能性片段的可变区的一个种系基因的核酸序列；或b）编码一种抗体或其功能性片段的可变区的一种被修饰的核酸序列，该抗体或其功能性片段具有与由一个种系基因编码的抗体的可变区相同的氨基酸序列，其中该核酸序列通过例如密码子优化、加入所希望的限制位点、优化的GC含量、去除不希望的剪接位点或去除mRNA不稳定性基序来修饰。
术语“种系基因对”意指编码一种抗体或其功能性片段的可变重链和可变轻链的核酸序列对和其相应种系基因。例如，一个种系基因对可以是VH3-23/Vκ1-5，其中由VH3-23/Vκ1-5编码的抗体包括由种系基因VH3-23编码的可变重链或其一部分和由种系基因Vκ1-5编码的可变轻链或其部分。
术语“种系蛋白对”意指一种抗体或其功能性片段，其中可变重链或其部分和可变轻链或其部分a)各自由一个特异性种系基因编码；或b)各自由一种被修饰的核酸序列编码，该被修饰的核酸序列编码具有与由该特异性种系基因编码的抗体的可变区相同的氨基酸序列的抗体或其功能性片段的可变区，其中该核酸序列通过例如密码子优化、加入所希望的限制位点、优化的GC含量、去除不希望的mRNA剪接位点或去除mRNA不稳定性基序来修饰；或c)各自包括由一个种系基因编码的一种氨基酸序列，但如为了去除一种不希望的半胱氨酸或引入所希望的限制位点（例如BbsI）或起因于合成、扩增或克隆的错误而在氨基酸序列中具有点突变。例如，一个种系蛋白对可以是由VH3-23/Vκ1-5编码的抗体或功能性片段，其中该抗体包括由种系基因VH3-23编码的可变重链或其一部分和由种系基因Vκ1-5编码的可变轻链或其部分。一个“种系蛋白对”包括如实例5中制备的构建体，它们包括：
a)对于VH来说：前导序列（如表1中所示，结合了一个NheI RE位点的被修饰的phoA）；种系FR1、CDR1、FR2、CDR2以及FR3（如图1中所示，结合了一个BssHII RE位点（GCGCGC））；如埃沃特S.等人,分子生物学杂志(2003)325,531-553中使用的4D5抗体的CDR-H3（WGGDGFYAMDY）（SEQ ID NO:1）；以及JH4FR4（如图1中所示，结合了一个XhoI RE位点（CTCGAG））；
b)对于Vκ来说：前导序列（如表2中所示，结合了该NdeI RE位点的ompA）；种系FR1、CDR1、FR2、CDR2以及FR3（如图1中所示，结合了一个BbsI RE位点（GAAGAC））；根据埃沃特S.等人,分子生物学杂志(2003)325,531-553的κ样CDR-L3（QQHYTTPPT）（SEQ ID NO:2）；以及Jk1FR4（如图1中所示，结合了一个KpnI/Acc65I RE位点（GGTACC））；以及
c)对于Vλ来说：前导序列（如表2中所示，结合了该NdeI RE位点的ompA）；种系FR1、CDR1、FR2、CDR2以及FR3（如图1中所示，结合了一个BbsI RE位点（GAAGAC））；根据埃沃特S.等人,分子生物学杂志(2003)325,531-553的λ样CDR-L3（QSYDSSLSGVV）（SEQ ID NO:3）；以及JI2/3FR4（如图1中所示结合了一个KpnI/Acc65I RE位点（GGTACC））。
术语“可变重链和可变轻链对”或“VH/VL对”意指一个可变重链与一个可变轻链的组合。一种抗体和功能性片段（例如一个Fab）包括与一个可变轻链结合的至少一个可变重链，这形成了抗原结合区。一个可变重链和可变轻链对的实例是该抗体或功能性片段或其部分，该抗体或功能性片段或其部分包括来自VH3-23/Vκ1-5或由种系基因VH3-23/Vκ1-5编码的种系氨基酸序列，其中该抗体包含可变重链或其一部分，该可变重链或其一部分包括来自VH3-23或由种系基因VH3-23编码的种系氨基酸序列以及包含可变轻链或其部分，该可变轻链或其部分包括来自Vκ1-5或由种系基因Vκ1-5编码的种系氨基酸序列。
术语“基本上全部”意指至少90%。例如，基本上全部的这些抗体或功能性片段包含可变重链与可变轻链框架区，这些可变重链与可变轻链框架区包括具有某些特性的一个种系蛋白对的种系氨基酸序列，这意指至少90%的这些抗体或片段包含可变重链与可变轻链框架区，这些可变重链与可变轻链框架区包括具有这样的特性的一个种系蛋白对的种系氨基酸序列。
可变重链的JH4、可变κ轻链的Jκ1以及可变λ轻链区的Jλ2/3的序列描述于以下出版物中：斯佳维纳（Scaviner）等人,(1999),“人类免疫球蛋白重、κ以及λ可变和连接区的蛋白呈现（Protein displays of the human immunoglobulin heavy,kappa and lambdavariable and joining regions）”临床免疫遗传学实验16(4):234-40；对于JH来说：雷弗克（Ravetch）等人,(1981),“人类免疫球蛋白μ基因座的结构：胚胎和重排的J和D基因的表征（Structure of the human immunoglobulin mu locus:characterization ofembryonic and rearranged J and D genes）”细胞（Cell）27(3pt2):583-91；对于JK来说：希尔特（Hieter）等人(1982),“人类免疫球蛋白κJ区基因的进化（Evolution of humanimmunoglobulin kappa J region genes）”.生物化学杂志（J Biol Chem）257(3):1516-22；对于JL来说：川崎等人,(1997)“人类免疫球蛋白λ基因座的一种兆碱基的序列分析”基因组研究7(3):250-61，所述文献的全部内容都通过引用结合在此。JH4氨基酸序列是(YFDYWGQGTLVTVSS)（SEQ ID NO:4）；Jκ1氨基酸序列是(WTFGQGTKVEIK)（SEQ ID NO:5）；并且Jλ2/3氨基酸序列是(VVFGGGTKLTVL)（SEQ ID NO:6）。
术语“可变结构域/区/（VH或VL）”意指包括实质上由任何VL（包括Vκ和Vλ）、VH、JL（包括Jκ和Jλ）以及JH核酸编码的一个或多个Ig结构域的一种免疫球蛋白区，这些核酸分别构成轻链（包括κ和λ）和重链免疫球蛋白遗传基因座。一个轻或重链可变区（VL和VH）由通过称为“互补性决定区”或“CDR”的三个超变区穿插的“框架”或“FR”区构成。框架区和CDR的范围已使用至少以下和图25-36中使用的规定来定义：参见卡巴特（Kabat）,1991,免疫学杂志（J.Immunol.）,147,915-920；科西亚&莱斯克（Chothia&Lesk）,1987,分子生物学杂志196:901-917；科西亚等人,1989,自然（Nature）342:877-883；艾尔-垃兹卡尼（Al-Lazikani）等人,1997,分子生物学杂志273:927-948）；还参见http://www.bioc.uzh.ch/antibody/Numbering/NumFrame.html（它示出了抗体氨基酸的熟知编号规定和这些CDR与框架区的位置）。
术语“框架区”意指充当抗原结合环的一个骨架的可变结构域的一部分。这些框架区的实例包括可变重或可变轻链的FR1、FR2、FR3以及FR4。
术语“互补性决定区”或“CDR”意指一种抗体的抗原结合环。抗体Fv片段的两个可变结构域中的每一个含有三个CDR。这些互补性决定区包括可变重或可变轻链的CDR1、CDR2以及CDR3。
术语“人类免疫组库”意指从来自人类的免疫***的B细胞分离的核酸的一个组库。一个组库可以是个体或群体的组库，并且可以来自原始B细胞和/或经历了抗原的B细胞。本发明能够确定一名单一个体的免疫组库，其条件是获得足够的B细胞。优选地，免疫组库从多名个体获得以避免样本偏差。一个人类免疫组库的实例描述于实例2-3中。
一种“抗原”和“免疫原”被定义为被一种抗体特异性结合的任何分子。
术语“对于一种抗原/免疫原具特异性”意指一种抗体与一种相应分子之间的特异性缔合。特异性可以通过实例11中所描述的方法（如ELISA和/或Biacore）来确定。
“CDR多样化”或“多样化的CDR”是通过改变一个CDR内的氨基酸组成来获得。一个多样化的CDR可以发现于具有一个或多个相同框架区（例如种系框架区）的抗体或片段的集合中，其中这些抗体或片段具有包括不同氨基酸序列的CDR3。多样化的CDR可以通过本领域的技术人员已知的任何方法实现，包括由以下所描述的方法：WO9708320，美国专利第6,300,064号，其全部内容通过引用结合；WO2008053275，US12/158,181，其全部内容通过引用结合；WO07056441，US60/806,602，其全部内容通过引用结合；WO2009036379，US60/993,785，其全部内容通过引用结合；WO2009114815，12/922,153，其全部内容通过引用结合；WO020617071、US12/762,051，其全部内容通过引用结合。CDR一般已知是免疫原结合区，因此具有包括代表了CDR（尤其CDR3）内一个大多样性的成员的集合，这增加了一个集合将包括对于任何免疫原具有特异性和最佳特性的抗体或其片段的可能性。
术语“变体”意指具有与另一抗体或片段不同的一种氨基酸序列的一种抗体或片段。术语“变体”包括在框架区的序列方面基本上相同、但在一个CDR区（例如CDR3）中具有不同氨基酸序列的抗体或片段。一个可变重链和可变轻链对的变体在框架区内具有基本上相同的氨基酸序列，但在CDR3区内具有不同氨基酸序列。
术语“合成”或“合成的”意指基因合成，其中核酸序列被合成为物理性DNA，包括聚核苷酸。标准DNA合成包括单一核苷酸合成，其中产生单链寡核苷酸并且然后使用一个PCR样组件将重叠寡核苷酸连接。如斯隆宁公司（Sloning）（德国普赫海姆（Puchheim,Germany））、基因技术（Geneart）（德国雷根斯堡（Regensburg,Germany））、DNA2.0（美国加利福尼亚州门洛帕克（Menlo Park,CA USA））、Entelechon（德国雷根斯堡）以及金斯瑞（Genscript）（美国新泽西州皮斯卡塔威（Piscataway,NJ USA））的公司提供了基因合成技术。斯隆宁公司例如利用了一组预先制造的双链三联核苷酸。
术语“合成的”描述了在人体外通过合成或合成的例如DNA制造的一种分子。术语“合成的”还描述了由一种合成的DNA分子翻译的一种蛋白，例如抗体或片段。
术语“集合”或“库”意指至少两个成员。术语“成员”包括但不限于编码抗体或其片段的核酸、或抗体或其片段本身。
术语“核酸”在此与术语“聚核苷酸”或“DNA”可互换地使用并且是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸和其聚合物。该术语涵盖了含有已知核苷酸类似物或被修饰的主链残基或键联的核酸，它们是合成的、天然存在的以及非天然存在的，具有与参考核酸类似的结合特性。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、膦酸甲酯、手性膦酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸以及肽-核酸（PNAs）。
除非另有指示，否则一种具体核酸序列还隐含地涵盖了其保守地修饰的变体（例如简并密码子取代）和互补序列以及明确地指示的序列。确切地说，如下详述，简并密码子取代可以通过产生其中一个或多个被选择的（或所有）密码子的第三位置被混合的碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现（巴策尔（Batzer）等人,核酸研究（Nucleic Acid Res.）19:5081,1991；大冢（Ohtsuka）等人,生物化学杂志260:2605-2608,1985；以及罗塞利尼（Rossolini)等人,分子与细胞探测（Mol.Cell.Probes）8:91-98,1994）。
如在此所使用，术语“密码子优化的”或“密码子优化”意指已改变一个核苷酸序列以使得它包括在特定生产***（例如细胞或有机体）中是优选的密码子。将优化的核苷酸序列工程化以保持原先由起始核苷酸序列编码的氨基酸序列。另外，可以将核苷酸序列设计成完全或尽可能地无抑制基序、mRNA剪接位点、mRNA不稳定性基序以及不希望的限制位点。还可以对GC含量、所希望的限制位点以及其他参数进行优化。可以将序列优化用于在不同宿主（包括细菌或真核细胞，确切地说是哺乳动物细胞）中表达。由优化的核苷酸序列编码的氨基酸序列也可以称为优化的。
术语“氨基酸”是指天然存在和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的一种方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及后来被修饰的那些氨基酸，例如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸以及O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与一种天然存在的氨基酸相同的基本化学结构（即一个与氢、羧基、氨基以及R基团结合的α碳）的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。此类类似物具有被修饰的R基团（例如正亮氨酸）或被修饰的肽主链，但保持与一种天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的一种结构但以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的化合物。
术语“多肽”和“蛋白”在此可互换地用以指氨基酸残基的一种聚合物。
术语“相同的”在两个或更多个核酸或多肽序列的情形下是指相同的两个或更多个序列或子序列。
术语“载体”是指一种聚核苷酸分子，能够输送与其键联的另一种聚核苷酸。优选的载体是能够对它们所键联的核酸进行自主复制和/或表达的载体。能够引导可操作地与其键联的核酸的表达的载体在此被称为“表达载体”。一种类型的载体是一种“质粒”，它是指另外的DNA片段可以连接到其中的一种环状双链DNA环。另一种类型的载体是一种病毒载体，其中另外的DNA片段可以连接到该病毒基因组中。某些载体能够在它们被引入到其中的一个宿主细胞中自主复制（例如具有细菌复制起点的细菌载体和哺乳动物载体）。其他载体可以在被引入到宿主细胞中后整合到该宿主细胞的基因组中，并且从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够引导它们可操作地键联的基因的表达。此类载体在此被称为“重组表达载体”（或简单地说是“表达载体”）。一般来说，用于重组DNA技术中的表达载体通常呈质粒形式。载体可以与原核或真核细胞相容。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以可互换地使用，这是由于质粒是最常用的载体形式。然而，本发明旨在包括提供等效功能的此类其他形式的表达载体，如病毒载体（例如复制缺陷反转录病毒、腺病毒以及腺伴随病毒）。
载体典型地包括原核复制子，该原核复制子可以包括能够引导一个细菌宿主细胞（如用其转化的大肠杆菌（Escherichia coli)）中VH-和/或VL-编码同系物的表达（转录和翻译）的原核启动子。另外，载体包括用于哺乳动物细胞中的IgG表达载体，例如参见图13-15。一种启动子是由准许RNA聚合酶结合和转录发生的DNA序列形成的一种表达控制元件。典型地在含有便利性限制位点的质粒载体中提供与细菌宿主相容的启动子序列以便***一个DNA片段。此类载体质粒的实例包括可商购的pUC8、pUC9、pBR322和pBR329、pPL以及pKK223。
一种“展示载体”包括了具有引导重组DNA分子在一个用其转化的宿主细胞（如一个细菌宿主细胞）中染色体外地复制和维持的能力的一种DNA序列。此类DNA序列在本领域中被熟知。展示载体可以例如是源自fd、M13或fl丝状噬菌体类别的噬菌体载体或噬菌粒载体。此类载体能够促进一种蛋白（包括例如一种结合蛋白或其片段）在一个丝状噬菌体的表面上的展示。适合于在噬菌体、核糖体、DNA、细菌细胞或真核细胞（例如酵母或哺乳动物细胞）上展示的展示载体也在本领域中被已知，例如像病毒载体或编码嵌合蛋白的载体一般。
术语“重组宿主细胞”（或简单地说是“宿主细胞”）是指重组表达载体已引入到其中的一种细胞。应了解，此类术语旨在不仅指具体主体细胞，而且指这种细胞的后代。因为某些修饰可以在后代中由于突变或环境影响而发生，所以这种后代可能在事实上与亲代细胞不同，但是仍然包括在如在此使用的术语“宿主细胞”的范围内。典型的宿主细胞是原核的（如细菌，包括但不限于大肠杆菌）或真核的（包括酵母、哺乳动物细胞以及更多种）。细菌细胞是优选的原核宿主细胞并且典型地是大肠杆菌（E.coli)株，如例如从马里兰州贝塞斯达的贝塞斯达研究实验室公司（Bethesda Research Laboratories,Inc.,Bethesda,Md）可获得的大肠杆菌株DH5。优选的真核宿主细胞包括酵母和哺乳动物细胞，包括鼠类和啮齿动物、优选地是脊椎动物细胞，如来自小鼠、大鼠、猴或人类细胞系的细胞，例如HKB11细胞、PERC.6细胞或CHO细胞。
可以通过本领域的普通技术人员所已知的多种转化或转染方法来将载体引入宿主细胞中，包括磷酸钙沉淀、电穿孔、显微注射、脂质体融合、RBC血影融合、原生质体融合、病毒感染等。单克隆全长抗体、Fab片段、Fv片段以及scFv片段的制造是熟知的。
通过典型地取决于所使用的载体和细胞的类型的方法来用一种重组DNA分子对适当细胞宿主进行转化。关于原核宿主细胞的转化，参见例如柯亨（Cohen）等人,美国国家科学院院刊（Proceedings National Academy of Science,USA）,第69卷,第2110页(1972)；和马尼亚迪斯（Maniatis）等人,分子克隆实验指南（Molecular Cloning,a LaboratoryManual）,冷泉港实验室（Cold spring Harbor Laboratory）,冷泉港（Cold SpringHarbor）,纽约（N.Y.）(1982)。关于用含有rDNA的反转录病毒载体对脊椎动物细胞进行转化，参见例如佐尔格（Sorge）等人,分子细胞生物学（Mol.Cell.Biol.）,4:1730-1737(1984)；格雷安（Graham）等人,病毒学（Virol.）,52:456(1973)；以及威格勒（Wigler）等人,美国国家科学院院刊,第76卷,第1373-1376页(1979)。
eGFP（增强型绿色荧光蛋白）具有以下氨基酸序列：
MSGSHHHHHHGTMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKDI。带下划线的并且呈斜体的氨基酸表示His标签，并且仅带下划线的氨基酸表示添加一种限制酶识别序列。
抗体或其片段的集合
本发明实现了抗体或其功能性片段以及编码这样的抗体或片段的核酸的集合，这些集合能够用于针对任意靶标的治疗性抗体的鉴别，其中这些抗体或片段在临床上是可研发的，对病人安全有效。作为背景，发明人假设人体免疫组库中那些丰富的可变重链和可变轻链种系基因对（比如VH3-23/VK1-5）很可能具有良好的生物物理学特性，这些特性将会导致更有效的研发，并会提高所产生的抗体在病人中的安全性和疗效。这样的良好生物物理学特性可以包括：a)Fab形式的高相对展示率；b)高相对Fab表达产率；c)Fab和IgG形式的温度稳定性；d)Fab和IgG形式的牛/鼠血清稳定性；e)高IgG1表达产率；e)Fab和IgG形式的SEC单体含量（%单体）；和/或f)高IgG1等电点（pI）。
每个B细胞编码一种抗体，每种抗体包括一可变重链和可变轻链。为了确定抗体的来源，即可变重链和可变轻链来源于哪个种系基因，可以将该抗体的可变重链和可变轻链中的每一个与种系基因序列（或种系蛋白序列）进行比对。因此，对每个抗体可以这样说，该可变重链和可变轻链包括一个种系基因对，或者种系蛋白对，例如，与VK1-5配对的VH3-23。
为了证明人体免疫组库中那些丰富的种系蛋白对很可能具有良好的生物物理学特性这个假设，第一步是对人体免疫组库中存在的可变重链和可变轻链种系基因对（种系蛋白对）进行鉴别。在一些方面，数据是通过可用的公开文献或数据库以及对B细胞采样而获得的。
对以下论文进行详细鉴别和分析：Wardemann H.等人(2003)《科学》（Science）301,1374-1377和任何辅助表格；Yurasov S.等人(2005)《实验医学杂志》（J.Exp.Med.）201,703-712和任何辅助表格；Tsuiji M.等人(2006)《实验医学杂志》（J.Exp.Med.）203,393-401和任何辅助表格；Yurasov S.等人(2006)《实验医学杂志》（J.Exp.Med.）203,2255-2262和任何辅助表格，Tiller T.等人(2007)《免疫》（Immunity）26,205-213和任何辅助表格，以及Mietzner B.等人(2008)《美国科学院院报》（PNAS）105,9727-9732和任何辅助表格，这些论文全部被整体引为参考。
此外，可以采用Ig-Blast对NCBI这样的数据库进行搜索。截至2005年，该数据库包含至少25,000个FASTA格式的重排人抗体序列。在22,500个条目之中，13,235个代表VH序列，1,506个代表Vκ，2,259个代表Vλ。
通常，在相关的可用公开文献和数据库中，随后采用以下方法：从人体供体中分离B细胞，对这些B细胞分类，以确定它们的发育或分化阶段，对代表编码来自于每个B细胞的抗体的DNA的cDNA进行生成并扩增，对这些cDNA进行测序，将编码可变重链和可变轻链的cDNA与已知的种系基因序列进行比对，并且确定来自于每个B细胞的种系基因对。
在一些实施例中，该数据是通过对人B细胞的采样和分离而获得的，这包括与文献中所使用的方法相类似的方法。在这些方面，生成合成的抗体或其功能性片段的集合的方法包括获取包含人体免疫组库中存在的可变重链和可变轻链种系基因对的数据这一步骤；其中，该获取步骤进一步包括这些步骤：aa)从样品中分离人B细胞；ab)从B细胞生成cDNA；ac)PCR扩增由B细胞得到的cDNA；ad)对PCR产物进行测序；以及ae)鉴别这些PCR产物中的种系基因。两个数据集都提供了人体免疫组库中所存在的可变重链和可变轻链种系基因对。
使用抗体序列数据，本领域内的普通技术人员能够鉴别每个VH、Vκ和Vλ可变结构域的种系家族和/或基因。采用这种方法，本领域内的普通技术人员能够很容易地确定每个VH和VL种系家族和/或基因，和/或每个VH和VL结构域对的种系家族和/或基因的显著性。
对由文献和B细胞获得的原始数据进行聚池和分析，对人体免疫组库中存在的可变重链和可变轻链种系基因对，按照每一对的数量进行排列。根据此数据，很显然，在人体免疫组库中，某些可变重链和可变轻链种系基因对较其他的而言出现地更频繁。这些占优势的种系对被期待具有优越的生物物理学特性。
下一步，必须确定将要对哪些种系蛋白对进行与可研发性相关的功能特性的测试，这是因为人体免疫组库中有约2500对。一种方法将会对人体免疫组库中出现地最占优势的可变重链和可变轻链种系蛋白对进行测试，例如见表6。例如，可以选择前四百对进行测试，或者选择以超过某一阈值数目出现的可变重链和可变轻链种系蛋白对。然而，这种方法将会需要对很大数量的可变重链和可变轻链种系蛋白对序列进行合成与测试，因此，这样一种方法将不会很有效率。
作为一种可替代方法，发明人选择可变重链和可变轻链种系对的一个子集，其中这个子集代表，精确地再现，或者涵盖人体免疫组库中的占优势的种系对的大多数。这种方法部分地基于这一观察：少数可变重链，可变κ轻链和可变λ轻链种系基因在人体免疫组库中是占主导地位的。Wildt等人在895-896描述了这一现象。Wildt等人还声明，频繁表达的的重链和轻链基因片段常常是配对的，并观察到所采样的配对中的半数只与五个种系对相对应。因此，可以将少数占优势的重链和轻链种系基因（未配对的）组合起来以产生一组代表人体免疫组库的对。
因此，对原始数据进行分析，以确定人体免疫组库中占优势的可变重链，可变κ轻链和可变λ轻链（未配对的）种系基因。然后对占优势的可变重链，可变κ轻链和可变λ轻链种系蛋白序列进行评价，以确定它们的与研发相关的生物物理学特性。通过计算机模拟，对可变重链，可变κ轻链和可变λ轻链种系蛋白序列的下列特性进行评价：CDR长度，等电点（pI），优选等电点为7.5或以上，因为这应该会提供在pH5.5至pH7的标准配制缓冲液中的稳定性，用于互补性决定区中的潜在翻译后修饰位点（PTM’s）的位点（特别是，N-键联糖基化位点（NxS或NxT）或化学修饰，比如Asp酶切（常常在DP），Asp异构化（DS，DG），脱酰胺化（NS，NG），它们可以发生在体内（血清中）或在配制缓冲液中储存时，并能导致抗体结合的损失），CDR中蛋氨酸的存在（当暴露于溶剂时，可以被氧化），未配对半胱氨酸的存在（将会与任何其他未配对半胱氨酸形成二硫键，因此导致蛋白交联和/或更低表达水平），与种系的偏差，潜在的T细胞表位的存在，以及理论上的聚集倾向性。
如表5和图2与3中所示，通常选择前20个VH，前8个Vλ和前12个Vκ进行合成，组合及随后的功能分析。对种系基因序列进行合成并且然后进行组合，以形成400个种系蛋白对，这些种系蛋白对代表在免疫组库中所发现的种系基因对，其中每个可变区都具有如在计算机模拟中所鉴别的良好生物物理学特性。对这400个VH/VL种系蛋白对的以下特性进行测试：a)Fab形式的相对展示，在噬菌体产生和噬菌体ELISA之后得到；b)相对Fab表达产率，在大肠杆菌中产生Fab，大肠杆菌细胞裂解和所产生的Fab的ELISA检测之后得到；c)Fab热稳定性，在大肠杆菌中产生Fab，大肠杆菌细胞裂解和提高温度孵育后的未变性Fab的ELISA检测之后得到；d)大肠杆菌溶菌产物中Fab的牛/鼠血清稳定性，通过对在牛/鼠血清中孵育之后的未变性Fab进行ELISA检测得到；e)相对人IgG1表达产率水平，在哺乳动物细胞中产生IgG1和细胞培养上清液中分泌的IgG1的ELISA检测之后得到；以及f)人IgG1牛血清稳定性，通过对在牛/鼠血清中孵育之后的未变性Fab进行ELISA检测得到。
从所测试的这400个种系蛋白对（结果如表12所示）中，选择95对进行进一步的测试。在合成，表达和纯化之后，以Fab和IgG1的形式，对图16-24中所示的95个种系蛋白对的以下指标进行测试：a)纯化的Fab的表达产率，以mg/L表示；b)纯化的Fab的单体含量（%单体）；c)纯化的Fab的热稳定性；d)纯化的IgG1的表达产率，以mg/L表示；e)纯化的IgG1的单体含量（%单体）；f)纯化的IgG1的热稳定性；g)IgG1等电点；以及h)IgG1酸暴露应力测试，包括差式扫描荧光分析法（DSF），吸收，动态光散射和颗粒染色。结果如图16-24中所示。
在一个实施例中，设定以下阈值：i)Fab形式的表达产率至少2.5mg/L；ii)Fab形式在70℃或更高温度为热稳定性；iii)由SEC所确定的Fab形式的单体含量（%单体）至少98%；iv)IgG1形式的表达产率至少30mg/L；v)IgG1形式在73℃或更高温度为热稳定性；以及vi)由SEC所确定的IgG1形式的单体含量（%单体）至少99%。
因此，在一个实施例中，一个集合包括合成的抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，其中这些抗体或功能性片段包括包含一个种系蛋白对的种系蛋白序列的可变重链和可变轻链框架区，其中所述种系蛋白对包括以下特性：
i)Fab形式的表达产率至少2.5mg/L；
ii)Fab形式在70℃或更高温度为热稳定性；
iii)由SEC所确定的Fab形式的单体含量（%单体）至少98%；
iv)IgG1形式的表达产率至少30mg/L；
v)IgG1形式在73℃或更高温度为热稳定性；
vi)由SEC所确定的IgG1形式的单体含量（%单体）至少99%。
在另外的实施例中，一个集合包括合成的抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，其中这些抗体或功能性片段中的基本上全部的，或至少50%，或至少60%，或至少70%，或至少80%，或至少90%，或至少95%，或每一个，包括包含一个种系蛋白对的种系蛋白序列的可变重链和可变轻链框架区，其中所述种系蛋白对包括以下特性：
i)Fab形式的表达产率至少2.5mg/L；
ii)Fab形式在70℃或更高温度为热稳定性；
iii)由SEC所确定的Fab形式的单体含量（%单体）至少98%；
iv)IgG1形式的表达产率至少30mg/L；
v)IgG1形式在73℃或更高温度为热稳定性；
vi)由SEC所确定的IgG1形式的单体含量（%单体）至少99%。
在另外的实施例中，一个集合包括合成的抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，其中这些抗体或功能性片段由或基本上由包含一个种系蛋白对的种系蛋白序列的可变重链和可变轻链框架区组成，其中所述种系蛋白对包括以下特性：
i)Fab形式的表达产率至少2.5mg/L；
ii)Fab形式在70℃或更高温度为热稳定性；
iii)由SEC所确定的Fab形式的单体含量（%单体）至少98%；
iv)IgG1形式的表达产率至少30mg/L；
v)IgG1形式在73℃或更高温度为热稳定性；
vi)由SEC所确定的IgG1形式的单体含量（%单体）至少99%。
在某些实施例中，
i)Fab形式的表达产率是由紫外分光光度法所确定的，采用消光系数1.538mL/mg，并在280nm测量吸光度。
在某些实施例中，
ii)Fab形式的热稳定性是由差示扫描荧光测定法所确定的，采用PBS缓冲液。
在某些实施例中，
iii)Fab形式的单体含量（%单体）是由尺寸排阻色谱法所确定的，采用Superdex75HR10/30柱和pH7.4的Gibco D-PBS缓冲液。
在某些实施例中，
iv)IgG1形式的表达产率是由紫外分光光度法所确定的，采用消光系数1.369mL/mg，并在280nm测量吸光度。
在某些实施例中，
v)IgG1形式的热稳定性是由差示扫描荧光测定法所确定的，采用PBS缓冲液。
在某些实施例中，
vi)IgG1形式的单体含量（%单体）是由尺寸排阻色谱法所确定的，采用Tosoh TSK-Gel G3000SWxl柱和pH7.4的Gibco D-PBS缓冲液。
紫外分光光度法可以采用Nanadrop***（peqlab公司，埃朗根，德国）进行。差式扫描荧光分析法可以采用iCycler iQ5热循环仪（伯乐公司（Biorad）进行。差式扫描荧光分析法可以采用pH7.4的Gibco D-PBS（英杰公司（Invitrogen），佩斯利（Paisley），美国）进行。尺寸排阻色谱法可以采用纯化***（GE医疗公司（GE Healthcare））进行。
采用如上所述的方法，以下种系蛋白对（54）达到或超过了以下阈值：i)Fab形式的表达产率至少2.5mg/L；ii)Fab形式在70℃或更高温度为热稳定性；iii)由SEC所确定的Fab形式的单体含量（%单体）至少98%；iv)IgG1形式的表达产率至少30mg/L；v)IgG1形式在73℃或更高温度为热稳定性；以及vi)由SEC所确定的IgG1形式的单体含量（%单体）至少99%，因此，它们具有与可研发性相关的优越功能活性，（数据如图16-24所示）：VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK1-39(SEQ ID NO:236);VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK3-20(SEQ ID NO:239);VH1-46(SEQ ID NO:205)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH1-46(SEQ ID NO:205)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH1-46(SEQ ID NO:205)/VL3-21(SEQ ID NO:257);VH1-69*01(SEQ ID NO:206)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-07(SEQ IDNO:207)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-16(SEQ ID NO:234);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-27(SEQ ID NO:235);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-39(SEQID NO:236);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-47(SEQ ID NO:251);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-11(SEQID NO:208)/VK1-05(SEQ ID NO:230);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VK1-39(SEQ ID NO:236);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-40(SEQID NO:250);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-47(SEQ ID NO:251);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL2-23(SEQ ID NO:255);VH3-15(SEQID NO:209)/VK1-05(SEQ ID NO:230);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-06(SEQ ID NO:231);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-16(SEQID NO:234);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-27(SEQ ID NO:235);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK3-11(SEQ ID NO:237);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-40(SEQ ID NO:250);VH3-15(SEQID NO:209)/VL1-47(SEQ ID NO:251);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL2-14(SEQ ID NO:254);VH3-21(SEQ ID NO:210)/VK1-12(SEQID NO:233);VH3-21(SEQ ID NO:210)/VK1-27(SEQ ID NO:235);VH3-21(SEQ ID NO:210)/VL2-11(SEQ ID NO:253);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK1-39(SEQ ID NO:236);VH3-23(SEQID NO:211)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL2-23(SEQ ID NO:255);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL3-1(SEQ ID NO:256);VH3-30(SEQ ID NO:212)/VK3-20(SEQID NO:239);VH3-53(SEQ ID NO:213)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-53(SEQ ID NO:213)/VL2-11(SEQ ID NO:253);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-05(SEQ ID NO:230);VH3-74(SEQID NO:214)/VK1-06(SEQ ID NO:231);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-27(SEQ ID NO:235);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK3-20(SEQID NO:239);VH3-74(SEQ ID NO:214)VL1-51(SEQ ID NO:252);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VK1-39(SEQ ID NO:236);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-40(SEQ ID NO:250);VH5-51(SEQID NO:215)VL1-51(SEQ ID NO:252);VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK1-09(SEQ ID NO:232);VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK3-20(SEQ IDNO:239)和VH6-1(SEQ ID NO:216)/VL1-51(SEQ ID NO:252)。因此，包含任意数量的这些种系蛋白对的集合可以用于鉴别针对任意抗原的可研发的抗体或其片段。
在一个方面，一个集合包括合成的抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，其中这些抗体或功能性片段包括可变重链和可变轻链对，其中这些可变重链和可变轻链对的框架区包括特定可变重链和可变轻链对的种系蛋白序列，例如，VH1-18/VK1-39。这意味着，该集合包括抗体或片段，其中这些抗体或片段的框架区包含VH1-18/VK1-39的种系蛋白序列，其中这些可变重链框架区包括VH1-18的种系蛋白序列并且这些可变轻链框架区包括VK1-39的种系蛋白序列。将大量的种系蛋白对作为构建体（如实例5和实例9中所描述），对它们的与研发相关的功能特性进行测试。一些被测试的构建体表现出与可研发性相关的优越功能特性。关于这些被测试的功能特性，发明人认为，输入（用于选择的针对一种抗原的抗体集合）与输出（从该集合中鉴别出的对该抗原具有特异性的抗体）之间具有较高的相关性。因此，本发明的集合包括这样的抗体或片段，这些抗体或片段在某种程度上包括与那些被测试的构建体相同的氨基酸序列，例如框架区和/或互补性决定区。因为在一个方面这些集合包括被测试的构建体的氨基酸序列或编码它们的核酸，所以可以认为这些集合包括具有与被测试的构建体相同的与可研发性相关的优越功能特性的抗体或片段。因此，可以预计，随后从这些集合中针对一种抗原的选出的抗体或片段也将具有相同的与可研发性相关的优越功能特性。这个假设被实例11中所描述的实验和数据所支持，见图37-39，45-48，和62。
在一些实施例中，一个集合包括合成的抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，其中这些抗体或功能性片段包括可变重链和可变轻链对，其中这些可变重链和可变轻链对的框架区包括从两个或更多个，三个或更多个，四个或更多个，五个或更多个，六个或更多个，七个或更多个，八个或更多个，九个或更多个，十个或更多个，十一个或更多个，十二个或更多个，十三个或更多个，十四个或更多个，十五个或更多个，十六个或更多个，十七个或更多个，十八个或更多个，十九个或更多个，二十个或更多个，二十一个或更多个，二十二个或更多个，二十三个或更多个，二十四个或更多个，二十五个或更多个，二十六个或更多个，二十七个或更多个，二十八个或更多个，二十九个或更多个，三十个或更多个，三十一个或更多个，三十二个或更多个，三十三个或更多个，三十四个或更多个，三十五个或更多个，三十六个或更多个，三十七个或更多个，三十八个或更多个，三十九个或更多个，四十个或更多个，四十一个或更多个，四十二个或更多个，四十三个或更多个，四十四个或更多个，四十五个或更多个，四十六个或更多个，四十七个或更多个，四十八个或更多个，四十九个或更多个，五十个或更多个，五十一个或更多个，五十二个或更多个，五十三个或更多个，或五十四个下述可变重链和可变轻链对中选出的种系蛋白序列：VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK1-39(SEQ ID NO:236);VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK3-15(SEQID NO:238);VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK3-20(SEQ ID NO:239);VH1-46(SEQ ID NO:205)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH1-46(SEQ ID NO:205)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH1-46(SEQID NO:205)/VL3-21(SEQ ID NO:257);VH1-69*01(SEQ ID NO:206)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-16(SEQ ID NO:234);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-27(SEQ ID NO:235);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-39(SEQ ID NO:236);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-47(SEQ ID NO:251);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VK1-05(SEQ ID NO:230);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VK1-39(SEQ ID NO:236);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-40(SEQ ID NO:250);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-47(SEQ ID NO:251);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL2-23(SEQ ID NO:255);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-05(SEQ ID NO:230);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-06(SEQ ID NO:231);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-16(SEQ ID NO:234);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-27(SEQ ID NO:235);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK3-11(SEQ ID NO:237);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-40(SEQ ID NO:250);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-47(SEQ ID NO:251);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL2-14(SEQ ID NO:254);VH3-21(SEQ ID NO:210)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-21(SEQ ID NO:210)/VK1-27(SEQ ID NO:235);VH3-21(SEQ ID NO:210)/VL2-11(SEQ ID NO:253);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK1-39(SEQ ID NO:236);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL2-23(SEQ ID NO:255);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL3-1(SEQ ID NO:256);VH3-30(SEQ ID NO:212)/VK3-20(SEQ ID NO:239);VH3-53(SEQ ID NO:213)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-53(SEQ ID NO:213)/VL2-11(SEQ ID NO:253);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-05(SEQ ID NO:230);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-06(SEQ ID NO:231);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-27(SEQ ID NO:235);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK3-20(SEQ ID NO:239);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VK1-39(SEQ ID NO:236);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-40(SEQ ID NO:250);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK1-09(SEQ ID NO:232);VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK3-20(SEQ ID NO:239)和VH6-1(SEQ ID NO:216)/VL1-51(SEQ ID NO:252)。
在一个实施例中，一个集合包括合成的抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，其中这些抗体或功能性片段中，基本上全部，或至少50%，或至少60%，或至少70%，或至少80%，或至少90%，或至少95%，或每一个，包括可变重链和可变轻链对，其中这些可变重链和可变轻链对的框架区包括从以下可变重链和可变轻链对中选出的种系蛋白序列：VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK1-39(SEQ ID NO:236);VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK3-20(SEQ ID NO:239);VH1-46(SEQ ID NO:205)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH1-46(SEQ ID NO:205)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH1-46(SEQ ID NO:205)/VL3-21(SEQ ID NO:257);VH1-69*01(SEQ ID NO:206)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-07(SEQID NO:207)/VK1-16(SEQ ID NO:234);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-27(SEQ ID NO:235);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-39(SEQ ID NO:236);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK3-15(SEQID NO:238);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-47(SEQ ID NO:251);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VK1-05(SEQ ID NO:230);VH3-11(SEQID NO:208)/VK1-39(SEQ ID NO:236);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-40(SEQ ID NO:250);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-47(SEQID NO:251);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL2-23(SEQ ID NO:255);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-05(SEQ ID NO:230);VH3-15(SEQID NO:209)/VK1-06(SEQ ID NO:231);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-16(SEQ ID NO:234);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-27(SEQID NO:235);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK3-11(SEQ ID NO:237);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-40(SEQ ID NO:250);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-47(SEQ ID NO:251);VH3-15(SEQID NO:209)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL2-14(SEQ ID NO:254);VH3-21(SEQ ID NO:210)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-21(SEQ ID NO:210)/VK1-27(SEQID NO:235);VH3-21(SEQ ID NO:210)/VL2-11(SEQ ID NO:253);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK1-39(SEQ ID NO:236);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-23(SEQID NO:211)/VL2-23(SEQ ID NO:255);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL3-1(SEQ ID NO:256);VH3-30(SEQ ID NO:212)/VK3-20(SEQ ID NO:239);VH3-53(SEQ ID NO:213)/VK3-15(SEQID NO:238);VH3-53(SEQ ID NO:213)/VL2-11(SEQ ID NO:253);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-05(SEQ ID NO:230);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-06(SEQ ID NO:231);VH3-74(SEQID NO:214)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-27(SEQ ID NO:235);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK3-20(SEQ ID NO:239);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VL1-51(SEQID NO:252);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VK1-39(SEQ ID NO:236);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-40(SEQ ID NO:250);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH6-1(SEQID NO:216)/VK1-09(SEQ ID NO:232);VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK3-20(SEQ ID NO:239)和VH6-1(SEQ ID NO:216)/VL1-51(SEQID NO:252)。
一个实施例包括一个包含合成的抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸的集合，其中这些抗体或功能性片段包括可变重链和可变轻链对，其中这些可变重链和可变轻链对的框架区包括以下可变重链和可变轻链对的种系蛋白序列，或者包括由或基本上由以下可变重链和可变轻链对组成的种系蛋白序列：VH1-18(SEQ IDNO:204)/VK1-39(SEQ ID NO:236);VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK3-20(SEQ ID NO:239);VH1-46(SEQ ID NO:205)/VK3-15(SEQID NO:238);VH1-46(SEQ ID NO:205)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH1-46(SEQ ID NO:205)/VL3-21(SEQ ID NO:257);VH1-69*01(SEQ ID NO:206)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-16(SEQ ID NO:234);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-27(SEQ ID NO:235);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-39(SEQ ID NO:236);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-47(SEQ ID NO:251);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VK1-05(SEQ ID NO:230);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VK1-39(SEQ ID NO:236);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-40(SEQ ID NO:250);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-47(SEQ ID NO:251);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL2-23(SEQ ID NO:255);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-05(SEQ ID NO:230);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-06(SEQ ID NO:231);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-16(SEQ ID NO:234);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-27(SEQ ID NO:235);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK3-11(SEQ ID NO:237);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-40(SEQ ID NO:250);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-47(SEQ ID NO:251);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL2-14(SEQ ID NO:254);VH3-21(SEQ ID NO:210)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-21(SEQ ID NO:210)/VK1-27(SEQ ID NO:235);VH3-21(SEQ ID NO:210)/VL2-11(SEQ ID NO:253);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK1-39(SEQ ID NO:236);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL2-23(SEQ ID NO:255);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL3-1(SEQ ID NO:256);VH3-30(SEQ ID NO:212)/VK3-20(SEQ ID NO:239);VH3-53(SEQ ID NO:213)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-53(SEQ ID NO:213)/VL2-11(SEQ ID NO:253);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-05(SEQ ID NO:230);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-06(SEQ ID NO:231);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-27(SEQ ID NO:235);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK3-20(SEQ ID NO:239);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VK1-39(SEQ ID NO:236);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-40(SEQ ID NO:250);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK1-09(SEQ ID NO:232);VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK3-15(SEQ ID NO:<238);VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK3-20(SEQ ID NO:239)和VH6-1(SEQ ID NO:216)/VL1-51(SEQ ID NO:252)。
在包括这54对或其子集的实施例中，可以选择另外的对加入到该集合中，其中每一个加入的种系蛋白对包括以下特性：
i)Fab形式的表达产率至少2.5mg/L，该Fab形式的表达产率由紫外分光光度法所确定，采用消光系数1.538mL/mg，在280nm测量吸光度，
ii)Fab形式在70℃或更高温度为热稳定性，该Fab形式的热稳定性由差示扫描荧光测定法所确定，采用PBS缓冲液，
iii)Fab形式的单体含量（%单体）至少98%，该Fab形式的单体含量由尺寸排阻色谱法所确定，采用Superdex75HR10/30柱和pH7.4的Gibco D-PBS缓冲液，
iv)IgG1形式的表达产率至少30mg/L，该IgG1形式的表达产率由紫外分光光度法所确定，采用消光系数1.369mL/mg，在280nm测量吸光度，
v)IgG1形式在73℃或更高温度为热稳定性，该IgG1形式的热稳定性由差示扫描荧光测定法所确定，采用PBS缓冲液，以及
vi)IgG1形式的单体含量（%单体）至少99%，该IgG1形式的单体含量由尺寸排阻色谱法所确定，采用Tosoh TSK-Gel G3000SWxl柱和pH7.4的Gibco D-PBS缓冲液。
紫外分光光度法可以采用Nanadrop***（peqlab公司，埃朗根，德国）进行。差示扫描荧光测定法可以采用iCycler iQ5热循环仪（伯乐公司）进行。差示扫描荧光测定法可以采用pH7.4的Gibco D-PBS（英杰公司，佩斯利，美国）进行。尺寸排阻色谱法可以采用纯化***（GE医疗公司）进行。
本披露的实施例包括具有与可研发性相关的优越功能特性的上述种系蛋白对（54）的子集。在一个实施例中，基于所鉴别的应力测试数据的比较选择种系蛋白对的一个子集（54个中的36个），鉴别采用的是实例9.2.6(a-d)中所描述的方法，图19-24、实例9.2.6(a-d)中所示的数据，图49-54以及实例9.2.7中所示的数据，图55-60中所示的得分。这些应力测试方法对95个种系蛋白对以IgG1形式进行评价，以确定它们对酸暴露和玻璃珠搅拌的承受能力。在一个实施例中的这36个种系蛋白对被选定，因为它们表现出对酸和搅拌应力的强耐受性，因而它们具有与可研发性相关的另外的优越功能特性。在一个实施例中所选择的这36个种系蛋白对，达到了该54对的所有阈值功能活性，而且，在应力测试累计得分中，达到了或超过了1225（如实例9.2.7中所描述），该得分根据以下特征对这些种系蛋白对进行评价：酸暴露前后在320nm的吸收，酸暴露前后的半径和多分散性%，酸暴露前后的颗粒染色，玻璃珠搅拌前后在320nm的吸收，玻璃珠搅拌后的半径和多分散性%，以及玻璃珠搅拌后的颗粒染色。在本实施例中所选择的这36个种系蛋白对，具有达到或超过每个标准的以下阈值的值：a)纯化的Fab的表达产率（如实例9.1.1中所描述）至少2.5mg/L；b)纯化的IgG1的表达产率（如实例9.2.1中所描述）至少30.0mg/L；c)纯化的Fab的热稳定性（如实例9.1.2中所描述）至少70℃；d)纯化的IgG1的热稳定性（如实例9.2.2中所描述）至少73℃；e)纯化的Fab的单体含量（如实例9.1.3中所描述）至少98%；f)纯化的IgG1的单体含量（如实例9.2.3中所描述）至少99%，以及g)应力测试累计得分（如实例9.2.7中所描述）至少1225。
因此，在一个实施例中，一个集合包括合成的抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，其中这些抗体或功能性片段包括可变重链和可变轻链对，其中这些可变重链和可变轻链对的框架区包括以下可变重链和可变轻链对的种系蛋白序列：VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK3-20(SEQ ID NO:239);VH1-46(SEQ ID NO:205)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH1-46(SEQ ID NO:205)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH1-69*01(SEQ IDNO:206)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-27(SEQ ID NO:235);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK3-15(SEQID NO:238);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-47(SEQ ID NO:251);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-40(SEQ ID NO:250);VH3-11(SEQID NO:208)/VL1-47(SEQ ID NO:251);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL2-23(SEQ ID NO:255);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-05(SEQID NO:230);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-06(SEQ ID NO:231);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-27(SEQ ID NO:235);VH3-15(SEQID NO:209)/VK3-11(SEQ ID NO:237);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-21(SEQ ID NO:210)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK1-39(SEQID NO:236);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL2-23(SEQ ID NO:255);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL3-1(SEQ ID NO:256);VH3-53(SEQID NO:213)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-53(SEQ ID NO:213)/VL2-11(SEQ ID NO:253);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-05(SEQ ID NO:230);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-06(SEQID NO:231);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK3-20(SEQ ID NO:239);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VK1-39(SEQ ID NO:236);VH5-51(SEQID NO:215)/VL1-40(SEQ ID NO:250);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK1-09(SEQ ID NO:232);VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK3-20(SEQ IDNO:239)和VH6-1(SEQ ID NO:216)/VL1-51(SEQ ID NO:252)。
在包括这36对或其子集的实施例中，可以选择另外的对加入到该集合中，其中所加入的每个种系蛋白对都包括以下特性：
i)Fab形式的表达产率至少2.5mg/l，该Fab形式的表达产率由紫外分光光度法所确定，采用消光系数1.538mL/mg，在280nm测量吸光度，
ii)Fab形式在70℃或更高温度为热稳定性，该Fab形式的热稳定性由差示扫描荧光测定法所确定，采用PBS缓冲液，
iii)Fab形式的单体含量（%单体）至少98%，该Fab形式的单体含量由尺寸排阻色谱法所确定，采用Superdex75HR10/30柱和pH7.4的Gibco D-PBS缓冲液，
iv)IgG1形式的表达产率至少30mg/l，该IgG1形式的表达产率由紫外分光光度法所确定，采用消光系数1.369mL/mg，在280nm测量吸光度，
v)IgG1形式在73℃或更高温度为热稳定性，该IgG1形式的热稳定性由差示扫描荧光测定法所确定，采用PBS缓冲液，以及
vi)IgG1形式的单体含量（%单体）至少99%，该IgG1形式的单体含量由尺寸排阻色谱法所确定，采用Tosoh TSK-Gel G3000SWxl柱和pH7.4的Gibco D-PBS缓冲液。
紫外分光光度法可以采用Nanadrop***（peqlab公司，埃朗根，德国）进行。差示扫描荧光测定法可以采用iCycler iQ5热循环仪（伯乐公司）进行。差示扫描荧光测定法可以采用pH7.4的Gibco D-PBS（英杰公司，佩斯利，美国）进行。尺寸排阻色谱法可以采用纯化***（GE医疗公司）进行。
在实施例中，一个集合具有合成的抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，其中这些抗体或功能性片段中，基本上全部，或至少50%，或至少60%，或至少70%，或至少80%，或至少90%，或至少95%，或每一个，包括可变重链和可变轻链对，其中这些可变重链和可变轻链对的框架区包括选自以下可变重链和可变轻链对的种系蛋白序列：VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK3-20(SEQ ID NO:239);VH1-46(SEQ ID NO:205)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH1-46(SEQ ID NO:205)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH1-69*01(SEQ IDNO:206)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-27(SEQ ID NO:235);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK3-15(SEQID NO:238);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-47(SEQ ID NO:251);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-40(SEQ ID NO:250);VH3-11(SEQID NO:208)/VL1-47(SEQ ID NO:251);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL2-23(SEQ ID NO:255);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-05(SEQID NO:230);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-06(SEQ ID NO:231);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-27(SEQ ID NO:235);VH3-15(SEQID NO:209)/VK3-11(SEQ ID NO:237);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-21(SEQ ID NO:210)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK1-39(SEQID NO:236);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL2-23(SEQ ID NO:255);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL3-1(SEQ ID NO:256);VH3-53(SEQID NO:213)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-53(SEQ ID NO:213)/VL2-11(SEQ ID NO:253);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-05(SEQ ID NO:230);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-06(SEQID NO:231);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK3-20(SEQ ID NO:239);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VK1-39(SEQ ID NO:236);VH5-51(SEQID NO:215)/VL1-40(SEQ ID NO:250);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK1-09(SEQ ID NO:232);VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK3-20(SEQ IDNO:239)和VH6-1(SEQ ID NO:216)/VL1-51(SEQ ID NO:252)。
在其他实施例中，一个集合包括合成的抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，其中这些抗体或功能性片段包括可变重链和可变轻链对，其中这些可变重链和可变轻链对的框架区包括选自以下可变重链和可变轻链对中的两个或更多个，三个或更多个，四个或更多个，五个或更多个，六个或更多个，七个或更多个，八个或更多个，九个或更多个，十个或更多个，十一个或更多个，十二个或更多个，十三个或更多个，十四个或更多个，十五个或更多个，十六个或更多个，十七个或更多个，十八个或更多个，十九个或更多个，二十个或更多个，二十一个或更多个，二十二个或更多个，二十三个或更多个，二十四个或更多个，二十五个或更多个，二十六个或更多个，二十七个或更多个，二十八个或更多个，二十九个或更多个，三十个或更多个，三十一个或更多个，三十二个或更多个，三十三个或更多个，三十四个或更多个，三十五个或更多个，或三十六个的种系蛋白序列：VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK3-20(SEQ ID NO:239);VH1-46(SEQ ID NO:205)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH1-46(SEQ ID NO:205)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH1-69*01(SEQ IDNO:206)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-27(SEQ ID NO:235);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK3-15(SEQID NO:238);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-47(SEQ ID NO:251);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-40(SEQ ID NO:250);VH3-11(SEQID NO:208)/VL1-47(SEQ ID NO:251);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL2-23(SEQ ID NO:255);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-05(SEQID NO:230);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-06(SEQ ID NO:231);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-27(SEQ ID NO:235);VH3-15(SEQID NO:209)/VK3-11(SEQ ID NO:237);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-21(SEQ ID NO:210)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK1-39(SEQID NO:236);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL2-23(SEQ ID NO:255);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL3-1(SEQ ID NO:256);VH3-53(SEQID NO:213)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-53(SEQ ID NO:213)/VL2-11(SEQ ID NO:253);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-05(SEQ ID NO:230);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-06(SEQID NO:231);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK3-20(SEQ ID NO:239);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VK1-39(SEQ ID NO:236);VH5-51(SEQID NO:215)/VL1-40(SEQ ID NO:250);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK1-09(SEQ ID NO:232);VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK3-20(SEQ IDNO:239)和VH6-1(SEQ ID NO:216)/VL1-51(SEQ ID NO:252)。
在一个实施例中，一个集合包括合成的抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，其中这些抗体或功能性片段包括可变重链和可变轻链对，其中这些可变重链和可变轻链对的框架区包括以下可变重链和可变轻链对的种系蛋白序列，或者包括由或基本上由以下可变重链和可变轻链对组成的种系蛋白序列：VH1-18(SEQ IDNO:204)/VK3-20(SEQ ID NO:239);VH1-46(SEQ ID NO:205)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH1-46(SEQ ID NO:205)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH1-69*01(SEQ ID NO:206)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-27(SEQ ID NO:235);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-47(SEQ ID NO:251);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-40(SEQ ID NO:250);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-47(SEQ ID NO:251);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL2-23(SEQ ID NO:255);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-05(SEQ ID NO:230);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-06(SEQ ID NO:231);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-27(SEQ ID NO:235);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK3-11(SEQ ID NO:237);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-21(SEQ ID NO:210)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK1-39(SEQ ID NO:236);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL2-23(SEQ ID NO:255);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL3-1(SEQ ID NO:256);VH3-53(SEQ ID NO:213)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-53(SEQ ID NO:213)/VL2-11(SEQ ID NO:253);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-05(SEQ ID NO:230);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-06(SEQ ID NO:231);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK3-20(SEQ ID NO:239);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VK1-39(SEQ ID NO:236);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-40(SEQ ID NO:250);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK1-09(SEQ ID NO:232);VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK3-20(SEQ ID NO:239)和VH6-1(SEQ ID NO:216)/VL1-51(SEQ ID NO:252)。
在另一个实施例中，对每个标准选择如下阈值：a)纯化的Fab表达产率（如实例9.1.1中所描述）至少2.5mg/L；b)纯化的IgG1表达产率（如实例9.2.1中所描述）至少30.0mg/L；c)纯化的Fab的热稳定性（如实例9.1.2中所描述）至少70℃；d)纯化的IgG1的热稳定性（如实例9.2.2中所描述）至少73℃；e)纯化的Fab的单体含量（如实例9.1.3中所描述）至少99%；f)纯化的IgG1的单体含量（如实例9.2.3中所描述）至少99%；g)纯化的IgG1的等电点（如实例9.2.4中所描述）至少8.3；以及h)应力测试累计得分（如实例9.2.7中所描述）至少1225。
因此，在一个实施例中，一个集合包括合成的抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，其中这些抗体或功能性片段包括包含一个种系蛋白对的种系蛋白序列的可变重链和可变轻链框架区，其中所述种系蛋白对包括以下特性：
i)Fab形式的表达产率至少2.5mg/L；
ii)Fab形式在70℃或更高温度为热稳定性；
iii)由SEC所确定的Fab形式的单体含量（%单体）至少99%；
iv)IgG1形式的表达产率至少30mg/L；
v)IgG1形式在73℃或更高温度为热稳定性；
vi)由SEC所确定的IgG1形式的单体含量（%单体）至少99%；以及
vii)IgG1形式的等电点至少8.3。
在某些实施例中，
i)Fab形式的表达产率由紫外分光光度法所确定，采用消光系数1.538mL/mg，在280nm测量吸光度。
在某些实施例中，
ii)Fab形式的热稳定性由差示扫描荧光测定法所确定，采用PBS缓冲液。
在某些实施例中，
iii)Fab形式的单体含量（%单体）是由尺寸排阻色谱法所确定的，采用Superdex75HR10/30柱和pH7.4的Gibco D-PBS缓冲液。
在某些实施例中，
iv)IgG1形式的表达产率由紫外分光光度法所确定，采用消光系数1.369mL/mg，在280nm测量吸光度。
在某些实施例中，
v)IgG1形式的热稳定性由差示扫描荧光测定法所确定，采用PBS缓冲液。
在某些实施例中，
vi)IgG1形式的单体含量（%单体）由尺寸排阻色谱法所确定，采用Tosoh TSK-GelG3000SWxl柱和pH7.4的Gibco D-PBS缓冲液。
紫外分光光度法可以采用Nanadrop***（peqlab公司，埃朗根，德国）进行。差示扫描荧光测定法可以采用iCycler iQ5热循环仪（伯乐公司）进行。差示扫描荧光测定法可以采用pH7.4的Gibco D-PBS（英杰公司，佩斯利，美国）进行。尺寸排阻色谱法可以采用纯化***（GE医疗公司）进行。
在另外的实施例中，一个集合包括合成的抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，其中这些抗体或功能性片段中，基本上全部，或至少50%，或至少60%，或至少70%，或至少80%，或至少90%，或至少95%，或每一个，包括包含一个种系蛋白对的种系蛋白序列的可变重链和可变轻链框架区，其中所述种系蛋白对包括以下特性：
i)Fab形式的表达产率至少2.5mg/L；
ii)Fab形式在70℃或更高温度为热稳定性；
iii)由SEC所确定的Fab形式的单体含量（%单体）至少99%；
iv)IgG1形式的表达产率至少30mg/L；
v)IgG1形式在73℃或更高温度为热稳定性；
vi)由SEC所确定的IgG1形式的单体含量（%单体）至少99%；以及
vii)IgG1形式的等电点至少8.3。
在另外的实施例中，一个集合包括合成的抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，其中这些抗体或功能性片段由或基本上由包括一个种系蛋白对的种系蛋白序列的可变重链和可变轻链框架区组成，其中所述种系蛋白对包括以下特性：
i)Fab形式的表达产率至少2.5mg/L；
ii)Fab形式在70℃或更高温度为热稳定性；
iii)由SEC所确定的Fab形式的单体含量（%单体）至少99%；
iv)IgG1形式的表达产率至少30mg/L；
v)IgG1形式在73℃或更高温度为热稳定性；
vi)由SEC所确定的IgG1形式的单体含量（%单体）至少99%；以及
vii)IgG1形式的等电点至少8.3。
以下种系蛋白对（33）达到或超过了以下阈值：a)纯化的Fab表达产率（如实例9.1.1中所描述）至少2.5mg/L；b)纯化的IgG1表达产率（如实例9.2.1中所描述）至少30.0mg/L；c)纯化的Fab的热稳定性（如实例9.1.2中所描述）至少70℃；d)纯化的IgG1的热稳定性（如实例9.2.2中所描述）至少73℃；e)纯化的Fab的单体含量（如实例9.1.3中所描述）至少99%；f)纯化的IgG1的单体含量（如实例9.2.3中所描述）至少99%；g)纯化的IgG1的等电点（如实例9.2.4中所描述）至少8.3；以及h)应力测试累计得分（如实例9.2.7中所描述）至少1225，因此，它们具有与可研发性相关的优越功能活性：VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK3-20(SEQ ID NO:239);VH1-46(SEQ ID NO:205)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH1-46(SEQID NO:205)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH1-69*01(SEQ ID NO:206)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-27(SEQ ID NO:235);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-47(SEQ ID NO:251);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-40(SEQ ID NO:250);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-47(SEQ ID NO:251);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL2-23(SEQ ID NO:255);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-05(SEQ ID NO:230);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-06(SEQ ID NO:231);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-27(SEQ ID NO:235);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK3-11(SEQ ID NO:237);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-21(SEQ ID NO:210)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-53(SEQ ID NO:213)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-53(SEQ ID NO:213)/VL2-11(SEQ ID NO:253);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-05(SEQ ID NO:230);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-06(SEQ ID NO:231);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK3-20(SEQ ID NO:239);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VK1-39(SEQ ID NO:236);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-40(SEQ ID NO:250);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK1-09(SEQ ID NO:232);VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK3-20(SEQ ID NO:239)和VH6-1(SEQ ID NO:216)/VL1-51(SEQ ID NO:252)。
因此，在一个实施例中，一个集合包括合成的抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，其中这些抗体或功能性片段包括可变重链和可变轻链对，其中这些可变重链和可变轻链对的框架区包括以下可变重链和可变轻链对的种系蛋白序列：VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK3-20(SEQ ID NO:239);VH1-46(SEQ ID NO:205)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH1-46(SEQ ID NO:205)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH1-69*01(SEQ IDNO:206)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-27(SEQ ID NO:235);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK3-15(SEQID NO:238);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-47(SEQ ID NO:251);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-40(SEQ ID NO:250);VH3-11(SEQID NO:208)/VL1-47(SEQ ID NO:251);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL2-23(SEQ ID NO:255);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-05(SEQID NO:230);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-06(SEQ ID NO:231);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-27(SEQ ID NO:235);VH3-15(SEQID NO:209)/VK3-11(SEQ ID NO:237);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-21(SEQ ID NO:210)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK3-15(SEQID NO:238);VH3-53(SEQ ID NO:213)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-53(SEQ ID NO:213)/VL2-11(SEQ ID NO:253);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-05(SEQ ID NO:230);VH3-74(SEQID NO:214)/VK1-06(SEQ ID NO:231);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK3-20(SEQ ID NO:239);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VK1-39(SEQID NO:236);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-40(SEQ ID NO:250);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK1-09(SEQ ID NO:232);VH6-1(SEQ IDNO:216)/VK3-20(SEQ ID NO:239)和VH6-1(SEQ ID NO:216)/VL1-51(SEQ ID NO:252)。
在包括这33对或其子集的实施例中，可以选择另外的对加入到该集合中，其中所加入的每一个种系蛋白对包括以下特性：
i)Fab形式的表达产率至少2.5mg/L，该Fab形式的表达产率由紫外分光光度法所确定，采用消光系数1.538mL/mg，在280nm测量吸光度，
ii)Fab形式在70℃或更高温度为热稳定性，该Fab形式的热稳定性由差示扫描荧光测定法所确定，采用PBS缓冲液，
iii)Fab形式的单体含量（%单体）至少99%，该Fab形式的单体含量由尺寸排阻色谱法所确定，采用Superdex75HR10/30柱和pH7.4的Gibco D-PBS缓冲液，
iv)IgG1形式的表达产率至少30mg/L，该IgG1形式的表达产率由紫外分光光度法所确定，采用消光系数1.369mL/mg，在280nm测量吸光度，
v)IgG1形式在73℃或更高温度为热稳定性，该IgG1形式的热稳定性由差示扫描荧光测定法所确定，采用PBS缓冲液，以及
vi)IgG1形式的单体含量（%单体）至少99%，该IgG1形式的单体含量由尺寸排阻色谱法所确定，采用Tosoh TSK-Gel G3000SWxl柱和pH7.4的Gibco D-PBS缓冲液。
紫外分光光度法可以采用Nanadrop***（peqlab公司，埃朗根，德国）进行。差示扫描荧光测定法可以采用iCycler iQ5热循环仪（伯乐公司）进行。差示扫描荧光测定法可以采用pH7.4的Gibco D-PBS（英杰公司，佩斯利，美国）进行。尺寸排阻色谱法可以采用纯化***（GE医疗公司）进行。
在包括这33对或其子集的实施例中，可以选择另外的对加入到该集合中，其中所加入的每一个种系蛋白对进一步包括以下特性：
vii)IgG1形式的等电点至少8.3。
在另一个实施例中，为了提高多样性，多个对被加入到一个集合中，即使这些对本身并未达到所有的每个标准内的阈值。在一个实施例中，33个种系蛋白对的集合进一步包括：VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK1-39(SEQ ID NO:236);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL2-23(SEQ ID NO:255);和VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL3-1(SEQ ID NO:256)。在本实施例中，该集合包括（36对）：VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK3-20(SEQ ID NO:239);VH1-46(SEQ ID NO:205)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH1-46(SEQ ID NO:205)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH1-69*01(SEQ ID NO:206)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-12(SEQID NO:233);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-27(SEQ ID NO:235);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-47(SEQ ID NO:251);VH3-07(SEQID NO:207)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-40(SEQ ID NO:250);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-47(SEQ ID NO:251);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-51(SEQID NO:252);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL2-23(SEQ ID NO:255);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-05(SEQ ID NO:230);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-06(SEQ ID NO:231);VH3-15(SEQID NO:209)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-27(SEQ ID NO:235);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK3-11(SEQ ID NO:237);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-51(SEQID NO:252);VH3-21(SEQ ID NO:210)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK1-39(SEQ ID NO:236);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-23(SEQID NO:211)/VL2-23(SEQ ID NO:255);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL3-1(SEQ ID NO:256);VH3-53(SEQ ID NO:213)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-53(SEQ ID NO:213)/VL2-11(SEQID NO:253);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-05(SEQ ID NO:230);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-06(SEQ ID NO:231);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-74(SEQID NO:214)/VK3-20(SEQ ID NO:239);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VK1-39(SEQ ID NO:236);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-40(SEQ ID NO:250);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-51(SEQID NO:252);VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK1-09(SEQ ID NO:232);VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK3-20(SEQ ID NO:239)和VH6-1(SEQ ID NO:216)/VL1-51(SEQ ID NO:252)。
在实施例中，包含任意数量的这些种系蛋白对或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸的集合可以用于鉴别针对任意抗原的可研发的抗体或其片段。
在一些实施例中，一个集合包括合成的抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，其中这些抗体或功能性片段包括可变重链和可变轻链对，其中这些可变重链和可变轻链对的框架区包括种系蛋白序列，这些种系蛋白序列选自两个或更多个，三个或更多个，四个或更多个，五个或更多个，六个或更多个，七个或更多个，八个或更多个，九个或更多个，十个或更多个，十一个或更多个，十二个或更多个，十三个或更多个，十四个或更多个，十五个或更多个，十六个或更多个，十七个或更多个，十八个或更多个，十九个或更多个，二十个或更多个，二十一个或更多个，二十二个或更多个，二十三个或更多个，二十四个或更多个，二十五个或更多个，二十六个或更多个，二十七个或更多个，二十八个或更多个，二十九个或更多个，三十个或更多个，三十一个或更多个，三十二个或更多个，三十三个或更多个可变重链和可变轻链对，这些可变重链和可变轻链对选自下组，该组由以下各项组成：VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK3-20(SEQ ID NO:239);VH1-46(SEQ IDNO:205)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH1-46(SEQ ID NO:205)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH1-69*01(SEQ ID NO:206)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-27(SEQ ID NO:235);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-47(SEQ ID NO:251);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-40(SEQ ID NO:250);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-47(SEQ ID NO:251);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL2-23(SEQ ID NO:255);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-05(SEQ ID NO:230);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-06(SEQ ID NO:231);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-27(SEQ ID NO:235);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK3-11(SEQ ID NO:237);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-21(SEQ ID NO:210)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-53(SEQ ID NO:213)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-53(SEQ ID NO:213)/VL2-11(SEQ ID NO:253);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-05(SEQ ID NO:230);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-06(SEQ ID NO:231);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK3-20(SEQ ID NO:239);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VK1-39(SEQ ID NO:236);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-40(SEQ ID NO:250);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK1-09(SEQ ID NO:232);VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK3-20(SEQ ID NO:239)和VH6-1(SEQ ID NO:216)/VL1-51(SEQ ID NO:252)。
在一个实施例中，一个集合包括合成的抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，其中这些抗体或功能性片段中，基本上全部，或至少50%，或至少60%，或至少70%，或至少80%，或至少90%，或至少95%，或每一个，包括可变重链和可变轻链对，其中这些可变重链和可变轻链对的框架区包括选自以下可变重链和可变轻链对的种系蛋白序列：VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK3-20(SEQ ID NO:239);VH1-46(SEQ ID NO:205)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH1-46(SEQ ID NO:205)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH1-69*01(SEQ ID NO:206)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-27(SEQ ID NO:235);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-47(SEQ ID NO:251);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-40(SEQ ID NO:250);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-47(SEQ ID NO:251);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL2-23(SEQ ID NO:255);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-05(SEQ ID NO:230);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-06(SEQ ID NO:231);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-27(SEQ ID NO:235);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK3-11(SEQ ID NO:237);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-21(SEQ ID NO:210)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-53(SEQ ID NO:213)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-53(SEQ ID NO:213)/VL2-11(SEQ ID NO:253);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-05(SEQ ID NO:230);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-06(SEQ ID NO:231);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK3-20(SEQ ID NO:239);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VK1-39(SEQ ID NO:236);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-40(SEQ ID NO:250);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK1-09(SEQ ID NO:232);VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK3-20(SEQ ID NO:239)和VH6-1(SEQ ID NO:216)/VL1-51(SEQ ID NO:252)。
一个实施例包括一个合成的抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸的集合，其中这些抗体或功能性片段包括可变重链和可变轻链对，其中这些可变重链和可变轻链对的框架区包括以下可变重链和可变轻链对的种系蛋白序列，或者包括由或基本上由以下可变重链和可变轻链对组成的种系蛋白序列：VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK3-20(SEQ ID NO:239);VH1-46(SEQ ID NO:205)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH1-46(SEQ ID NO:205)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH1-69*01(SEQ ID NO:206)/VL1-51(SEQ IDNO:252);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-27(SEQ ID NO:235);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-07(SEQID NO:207)/VL1-47(SEQ ID NO:251);VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-40(SEQ ID NO:250);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-47(SEQID NO:251);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL2-23(SEQ ID NO:255);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-05(SEQ ID NO:230);VH3-15(SEQID NO:209)/VK1-06(SEQ ID NO:231);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-27(SEQ ID NO:235);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK3-11(SEQID NO:237);VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH3-21(SEQ ID NO:210)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-53(SEQID NO:213)/VK3-15(SEQ ID NO:238);VH3-53(SEQ ID NO:213)/VL2-11(SEQ ID NO:253);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-05(SEQ ID NO:230);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-06(SEQID NO:231);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-12(SEQ ID NO:233);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK3-20(SEQ ID NO:239);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VK1-39(SEQ ID NO:236);VH5-51(SEQID NO:215)/VL1-40(SEQ ID NO:250);VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-51(SEQ ID NO:252);VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK1-09(SEQ ID NO:232);VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK3-20(SEQ IDNO:239)和VH6-1(SEQ ID NO:216)/VL1-51(SEQ ID NO:252)。
本发明的另一个方面是集合可用于鉴别针对任意免疫原的抗体或其功能性片段的能力。因此在一些实施例中，这些集合包括可变重链框架区和可变轻链框架区，这些可变重链框架区和可变轻链框架区包含至少两个不同种系蛋白对；至少三个不同种系蛋白对；至少四个不同种系蛋白对；至少五个不同种系蛋白对；至少六个不同种系蛋白对；至少七个不同种系蛋白对；至少八个不同种系蛋白对；至少九个不同种系蛋白对；至少十个不同种系蛋白对；至少十一个不同种系蛋白对；至少十二个不同种系蛋白对；至少十三个不同种系蛋白对；至少十四个不同种系蛋白对；至少十五个不同种系蛋白对；至少十六个不同种系蛋白对；至少十七个不同种系蛋白对；至少十八个不同种系蛋白对；至少十九个不同种系蛋白对；至少二十个不同种系蛋白对；至少21个不同种系蛋白对；至少22个不同种系蛋白对；至少23个不同种系蛋白对；至少24个不同种系蛋白对；至少25个不同种系蛋白对；至少26个不同种系蛋白对；至少27个不同种系蛋白对；至少28个不同种系蛋白对；至少29个不同种系蛋白对；至少30个不同种系蛋白对；至少31个不同种系蛋白对；至少32个不同种系蛋白对；至少33个不同种系蛋白对；至少34个不同种系蛋白对；至少35个不同种系蛋白对；至少36个不同种系蛋白对；至少37个不同种系蛋白对；至少38个不同种系蛋白对；至少39个不同种系蛋白对；至少40个不同种系蛋白对；至少41个不同种系蛋白对；至少42个不同种系蛋白对；至少43个不同种系蛋白对；至少44个不同种系蛋白对；至少45个不同种系蛋白对；至少46个不同种系蛋白对；至少47个不同种系蛋白对；至少48个不同种系蛋白对；至少49个不同种系蛋白对；至少50个不同种系蛋白对；至少51个不同种系蛋白对；至少52个不同种系蛋白对；至少53个不同种系蛋白对；至少54个不同种系蛋白对的种系蛋白序列。
因为在人体中的较低的潜在免疫原性是治疗性抗体的一个目标，在一个方面，这些集合包括包含种系蛋白序列或编码它们的核酸的框架区。另外，为了维持低免疫原性风险，可以采用包括种系蛋白序列的互补性决定区。在一个实施例中，这些集合包括合成的抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，这些抗体或功能性片段包括一个或多个互补性决定区，该一个或多个互补性决定区包含来自各自的可变重链和可变轻链对的种系蛋白序列，其中这些可变重链和可变轻链的互补性决定区的氨基酸和核酸序列在图25-33中描述。更特别地，在一个实施例中，一个集合包括抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，这些抗体或功能性片段包括CDR1区，这些CDR1区包含来自各自的可变重链和/或可变轻链对的种系蛋白序列，其中这些可变重链和可变轻链的CDR1区的氨基酸和核酸序列在图25，28，和31以及对应的SEQ ID NO:204-265中描述在一个实施例中，一个集合包括抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，这些抗体或功能性片段包括HCDR1区，这些CDR1区包含来自各自的可变重链和可变轻链对的种系蛋白序列，其中这些可变重链和可变轻链的HCDR1区的氨基酸和核酸序列在图25以及对应的SEQ ID NO：204-229中描述。在一个实施例中，一个集合包括抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，这些抗体或功能性片段包括LCDR1区，这些LCDR1区包含来自各自的可变重链和可变轻链对的种系蛋白序列，其中这些可变重链和可变轻链的LCDR1区的氨基酸和核酸序列在图28和31以及对应的SEQ ID NO：230-265中描述。在另一个实施例中，一个集合包括抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，这些抗体或功能性片段包括CDR2区，这些CDR2区包含来自各自的可变重链和可变轻链对的种系蛋白序列，其中这些可变重链和可变轻链的CDR2区的氨基酸和核酸序列在图26，29和32以及对应的SEQ IDNO：204-265中描述。在另一个实施例中，一个集合包括抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，这些抗体或功能性片段包括HCDR2区，这些HCDR2区包含来自各自的可变重链和可变轻链对的种系蛋白序列，其中这些可变重链和可变轻链的HCDR2区的氨基酸和核酸序列在图26以及对应的SEQ ID NO：204-229中描述。在另一个实施例中，一个集合包括抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，这些抗体或功能性片段包括LCDR2区，这些LCDR2区包含来自各自的可变重链和可变轻链对的种系蛋白序列，其中这些可变重链和可变轻链的LCDR2区的氨基酸和核酸序列在图29和32以及对应的SEQ ID NO：230-265中描述。
本披露的一个方面包括对种系互补性决定区进行修饰，以消除潜在的翻译后修饰位点（PTM）。经修饰以消除PTM的可变重链互补性决定区的实例在图34-36中给出。在一个方面，一个集合包括抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，这些抗体或功能性片段包括一个或多个具有氨基酸修饰的互补性决定区，这些氨基酸修饰消除了潜在的翻译后修饰位点。在一个实施例中，一个集合包括抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，这些抗体或功能性片段包括一个或多个互补性决定区，该一个或多个互补性决定区包含来自各自的可变重链的、在图34-36中所描述的互补性决定区序列或编码它们的核酸序列。在另一个实施例中，一个集合包括抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，这些抗体或功能性片段包括HCDR1区，这些HCDR1区包含来自各自的可变重链的、在图34-36中所描述的HCDR1或编码其的核酸。低PTM HCDR1的氨基酸序列被描述于SEQ ID NO：266-278。低PTM HCDR1的核酸序列被描述于SEQ ID NO：279-291。在另一个实施例中，一个集合包括抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，这些抗体或功能性片段包括HCDR2区，这些HCDR2区包含来自各自的可变重链的、在图34-36中所描述的HCDR2区或编码它们的核酸。低PTM HCDR2的氨基酸序列被描述于SEQ ID NO：266-278。低PTM HCDR2的核酸序列被描述于SEQ ID NO：279-291。
本披露的一个方面包括在这些集合中使用种系FR4序列。在一个实施例中，一个集合包括抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，这些抗体或功能性片段包含选自下组的FR4区，该组由以下各项组成：JH4(SEQ ID NO:293)、Jκ1(SEQ IDNO:297)、和Jλ2/3(SEQ ID NO:301)。在一个实施例中，一个集合包括抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，这些抗体或功能性片段包括一个种系JH4FR4区，该JH4FR4区的氨基酸或核酸序列在图40中描述。该JH4FR4氨基酸序列在(SEQ IDNO:293)和(SEQ ID NO:295)中描述。该JH4FR4核酸序列在(SEQ ID NO:292)和(SEQ ID NO:294)中描述。在一个实施例中，一个集合包括抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，这些抗体或功能性片段包括一个种系Jκ1FR4区，该Jκ1FR4区的氨基酸或核酸序列在图40中描述。该Jκ1FR4氨基酸序列在(SEQ ID NO:297)中描述。该Jκ1FR4核酸序列在(SEQ ID NO:296)、(SEQ ID NO:298)和(SEQ ID NO:299)中描述。在一个实施例中，一个集合包括抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，这些抗体或功能性片段包括一个种系Jλ2/3FR4区，该Jλ2/3FR4区的氨基酸或核酸序列在图40中描述。该Jλ2/3FR4氨基酸序列在(SEQ ID NO:301)中描述。该Jλ2/3FR4核酸序列在(SEQID NO:300)、(SEQ ID NO:302)和(SEQ ID NO:303)中描述。
在一个方面，为了增强对针对任意抗原的抗体或其片段进行鉴别的能力，集合包括一个多样化CDR3区。在一个实施例中，一个集合包括抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，这些抗体或功能性片段包括一个多样化HCDR3区。在一个实施例中，一个集合包括抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，这些抗体或功能性片段包括一个多样化LCDR3区。
在另一个方面，为了增强对针对任意抗原的抗体或其片段进行鉴别的能力，集合包括至少1×104个抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，至少1×105个抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，至少1×106个抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，至少1×107个抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，至少1×108个抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，至少1×109个抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，至少1×1010个抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，至少1×1011个抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸。
在一个实施例中，这些集合包括抗体或合成的编码这样的抗体的核酸，这些抗体选自由人IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA，IgE，IgM和IgD组成的组。在一个实施例中，这些集合包括抗体片段或合成的编码这样的片段的核酸，这些片段选自由Fab，F(ab’)2，Fab’，Fv和scFv组成的组。
在实施例中，这些集合的抗体的IgG重链恒定结构域包括图41A-B中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:305)。在其他实施例中，编码该集合的抗体的IgG重链恒定结构域的核酸包括图41A-B中所示的核酸序列(SEQ ID NO:304)。在实施例中，这些这些集合的抗体片段的Fab重链恒定结构域包括图42中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:307)。在其他实施例中，编码该集合的抗体的Fab重链恒定结构域的核酸包括图42中所示的核酸序列(SEQ ID NO:306)。在实施例中，这些集合的抗体或抗体片段的IgG(SEQ ID NO:309)和/或Fab(SEQ IDNO:311)kappa轻链恒定结构域包括图43中所示的氨基酸序列。在其他实施例中，编码这些集合的抗体或抗体片段的IgG(SEQ ID NO:308)和/或Fab(SEQ ID NO:310)kappa轻链恒定结构域的核酸包括图43中所示的核酸序列。在实施例中，这些集合的抗体或抗体片段的IgG(SEQ ID NO:313)和/或Fab(SEQ ID NO:315)lambda轻链恒定结构域包括图44中所示的氨基酸序列。在其他实施例中，编码这些集合的抗体或抗体片段的IgG(SEQ ID NO:312)和/或Fab(SEQ ID NO:314)lambda轻链恒定结构域的核酸包括图44中所示的核酸序列。
一个方面包括一个载体，该载体包括在此所描述的核酸的集合。在一个实施例中，该载体包括一个展示载体。在一个实施例中，该载体包括一个噬菌粒载体，酵母展示或哺乳动物展示载体。一个方面是重组宿主细胞，该重组宿主细胞包括在此描述的核酸，或一个在此描述的载体。在一个实施例中，该重组宿主是原核的或真核的。在实施例中，该重组宿主细胞是大肠杆菌，哺乳动物细胞或酵母。
制造方法
一个方面包括在此描述的生产这些集合的方法。
一个方面包括生产一个集合的一个方法，该集合是合成的抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸的集合，该方法包括
a)鉴别人类免疫组库中存在的可变重链和可变轻链种系基因对；
b)测试步骤a)中鉴别的可变重链和可变轻链种系蛋白对的以下特性：
i)Fab形式的表达产率至少2.5mg/L；
ii)Fab形式在70℃或更高温度的热稳定性；
iii)如通过SEC确定的Fab形式的单体含量（%单体）至少98%；
iv)IgG1形式的表达产率至少为30mg/L的；
v)IgG1形式在73℃或更高温度的热稳定性；以及
vi)如通过SEC确定的IgG1形式的单体含量（%单体）至少99%；
c)产生一个集合，其中基本上全部的、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或至少95%、或其中的各个、或这些抗体或其功能性片段包括可变重链和可变轻链对，其中这些可变重链和可变轻链对的框架区包括满足步骤b)的特性的种系蛋白对的种系蛋白序列。
在该方法的某些实施例中，
i)Fab形式的表达产率是通过紫外分光光度法采用1.538mL/mg的消光系数和在280nm测量吸收度而确定的。
在某些实施例中，
ii)Fab形式的热稳定性是由差示扫描荧光测定法所确定的，采用PBS缓冲液。
在某些实施例中，
iii)Fab形式的单体含量（%单体）是由尺寸排阻色谱法所确定的，采用Superdex75HR10/30柱和pH7.4的Gibco D-PBS缓冲液。
在某些实施例中，
iv)IgG1形式的表达产率是通过紫外分光光度法采用1.369mL/mg的消光系数和在280nm测量吸收度而确定的。
在某些实施例中
v)IgG1形式的热稳定性是由差示扫描荧光测定法所确定的，采用PBS缓冲液。
在某些实施例中，
vi)IgG1形式的单体含量（%单体）是由尺寸排阻色谱法所确定的，采用Tosoh TSK-Gel G3000SWxl柱和pH7.4的Gibco D-PBS缓冲液。
可采用Nanadrop***（peqlab公司，埃朗根，德国）进行紫外分光光度测定。可采用iCycler iQ5热循环仪（伯乐公司）进行差示扫描荧光测定法。可采用pH7.4的Gibco D-PBS（英杰公司，佩斯利，美国）进行差示扫描荧光测定法。可采用AKTA纯化***（GE医疗公司）进行尺寸排阻色谱分析。
在一个实施例中，步骤a)进一步包含步骤
aa)从一个样品中分离人类B细胞；
ab)从这些B细胞中生成cDNA；
ac)对从这些B细胞中分离的cDNA进行PCR扩增；
ad)对这些PCR产物进行测序；
ae)鉴别每个PCR产物的种系基因。
从每个B细胞中分离编码抗体及其片段的DNA、并扩增，例如在一个PCR反应中对重链和轻链进行物理上的分离。DNA优选为已测序的。该已测序的DNA可以是用B细胞的mRNA生成的cDNA。从真核细胞（如B细胞）中提取mRNA是一个公知的技术程序。存在大量的报告，且商业的试剂盒是可获得的。例如PolyATtract(R)的mRNA分离***（美国、威斯康辛州、麦迪逊（Madison）、普洛麦格公司（Promega））或各种RNeasy和Oligotex DirectmRNA试剂盒（这两种均来自德国、希尔顿（Hilden）、Qiagen公司）。这些技术中的很多利用了真核mRNA的polyA尾巴，例如通过寡聚脱氧胸苷（dT）基质（如寡聚脱氧胸苷纤维素（dT））的亲和提纯。
按照传统的PCR，能够通过逆转录利用特异性引物从分离的mRNA选择性地扩增cDNA。特异性引物被用于扩增可变重链区和可变轻链结构域的核酸。参见，癌症调查，1997，30：21-44（Cancer Surv.1997;30:21-44）；临床病理学杂志，1994，47：493-6（JClin.Pathol.1994;47:493-6）；临床病理学杂志，1990，43：888-90（J.Clin.Pathol.1990;43:888-90）；或分子病理学，2002年4月，55（2）：98-101（Mol.Pathol.2002April;55(2):98-101）。将编码一个B细胞的可变以及轻链结构域的DNA一同保留，以鉴别可变结构域重链及轻链类型配对。分离编码个体B细胞中的可变结构域配对的核酸的技术为现有技术中所公知的。参见实例如WO01/92291；W092/15678；WO93/03151；WO2005/042774；Mullinax RL等人，1992，生物技术12：6864-868（Mullinax RL et al.,1992Biotechniques 12:6864-868）；Chapal,N.等人，1997，生物技术23，518-524（Chapal,N.etal.1997Biotechniques23,518-524,）；Embleton MJ等人，1992，核算研究20：15，3831-3837（Embleton MJ et al.,1992Nucleic Acids Res.20:15,3831-3837）；Coronella,J.A.等，2000，核算研究28：20，E85（Coronella,J.A.et al.2000Nucleic Acids Res.28:20,E85）；Thirion S等，1996，欧洲癌症预防杂志5：6，507-511（Thirion S et al.,1996EuropeanJournal of Cancer Prevention5:6507-511）；以及Wang,X等，2000，免疫法杂志20，217-225（Wang,X et al.2000J.Immunol.Methods20,217-225）。
优选地，对每个B细胞的DNA进行测序。存在能够对整个基因组进行测序的各种公司，例如螺旋生物科学公司（Helicos Biosciences Corporation）（美国、麦迪逊州、坎布里奇（Cambridge））。利用其单分子测序技术（Single Molecule SequencingTMtechnology），螺旋生物科学公司（Helicos）能够以高的速度和效率直接对DNA或RNA的单个分子进行测序。其他能够进行类似的序列工作的公司包括lllumina公司（美国、加利福尼亚州、圣地亚哥，Solexa***）和罗氏公司（Roche）（瑞士、巴塞尔，454***）。测序前无需克隆步骤。
在另一个方面中，本披露使鉴别存在于人类免疫组库中的重链和轻链可变结构域对的种系家族的方法成为可能。利用本领域技术人员所公知的方法能够将所有的抗体或其片段追溯到它们的种系家族中。通过分析编码一个抗体或其片段的核酸的序列，VH和VL的种系家族均能够通过本领域技术人员所公知的方法确定。例如,Wildt等人（1999）从3位患者中提取了B细胞，并鉴别了365个VH和VL类型配对。用从每个B细胞中得到的RNA用于cDNA的合成，并对编码VH和VL区的cDNA进行PCR扩增和测序。如Wildt的图1所示，某些VH和VL类比其他配对更频繁，例如，VH3-8与Vκ3-1、Vκ3-19、Vκ4-1、Vλ2-3、或Vλ1-2，以及VH3-9与Vκ3-1、Vκ3-3或Vλ1-5。
在一个实施例中，步骤b)进一步包括以下步骤
ba)合成编码抗体或其功能性片段的DNA，这些抗体或其功能性片段包括代表人类免疫组库中存在的对的可变重链和可变轻链种系蛋白对；
bb)表达ba)中合成的种系蛋白对；以及
bc)测试bb)中的种系蛋白对的各特性。
在该方法的一个方面中，编码本发明中的抗体或其片段的集合的核酸被合成并表达为可被用于针对一个抗原选择的集合。在这个实施例中，该方法包括步骤c)，其中步骤c)包括步骤ca)合成编码这些抗体或其功能性片段的核酸；cb)将这些核酸克隆到一个载体中；cc)表达这些抗体或其功能性片段。
在该方法的另一个实施例中，这些抗体或其功能性片段包括可变重链和可变轻链对，其中这些可变重链和可变轻链对的框架区包括来自以下可变重链和可变轻链对的种系蛋白序列：VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK3-20(SEQ ID NO:239)、VH1-46(SEQ ID NO:205)/VK3-15(SEQ ID NO:238)、VH1-46(SEQ ID NO:205)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH1-69*01(SEQ ID NO:206)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-12(SEQ ID NO:233)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-27(SEQ ID NO:235)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK3-15(SEQ ID NO:238)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-47(SEQ ID NO:251)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-40(SEQ ID NO:250)、VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-47(SEQ ID NO:251)、VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL2-23(SEQ ID NO:255)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-05(SEQ ID NO:230)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-06(SEQ ID NO:231)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-12(SEQ ID NO:233)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-27(SEQ ID NO:235)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK3-11(SEQ ID NO:237)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH3-21(SEQ ID NO:210)/VK1-12(SEQ ID NO:233)、VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK1-39(SEQ ID NO:236)、VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK3-15(SEQ ID NO:238)、VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL2-23(SEQ ID NO:255)、VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL3-1(SEQ ID NO:256)、VH3-53(SEQ ID NO:213)/VK3-15(SEQ ID NO:238)、VH3-53(SEQ ID NO:213)/VL2-11(SEQ ID NO:253)、VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-05(SEQ ID NO:230)、VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-06(SEQ ID NO:231)、VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-12(SEQ ID NO:233)、VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK3-20(SEQ ID NO:239)、VH5-51(SEQ ID NO:215)/VK1-39(SEQ ID NO:236)、VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-40(SEQ ID NO:250)、VH5-51(SEQ ID NO:215)VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK1-09(SEQ ID NO:232)、VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK3-20(SEQ ID NO:239)、和VH6-1(SEQ ID NO:216)/VL1-51(SEQ ID NO:252)。
在该方法的另一个实施例中，这些抗体或其功能性片段包括可变重链和可变轻链对，其中这些可变重链和可变轻链对的框架区包括种系蛋白序列，这些种系蛋白序列包括两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个、十个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个、20个或更多个、21个或更多个、22个或更多个、23个或更多个、24个或更多个、25个或更多个、26个或更多个、27个或更多个、28个或更多个、29个或更多个、30个或更多个、31个或更多个、32个或更多个、33个或更多个、34个或更多个、35个或更多个、或36个或更多个、37个或更多个、38个或更多个、39个或更多个、40个或更多个、41个或更多个、或42个或更多个、或43个或更多个、或44个或更多个、或45个或更多个、或46个或更多个、或47个或更多个、或48个或更多个、或49个或更多个、或50个或更多个、或51个或更多个、或52个或更多个、或53个或更多个、或54个选自下组的可变重链和可变轻链对，该组由以下各项组成：VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK1-39(SEQ ID NO:236)、VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK3-15(SEQID NO:238)、VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK3-20(SEQ ID NO:239)、VH1-46(SEQ ID NO:205)/VK3-15(SEQ ID NO:238)、VH1-46(SEQ ID NO:205)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH1-46(SEQID NO:205)/VL3-21(SEQ ID NO:257)、VH1-69*01(SEQ ID NO:206)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-12(SEQ ID NO:233)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-16(SEQ ID NO:234)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-27(SEQ ID NO:235)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-39(SEQ ID NO:236)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK3-15(SEQ ID NO:238)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-47(SEQ ID NO:251)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH3-11(SEQ ID NO:208)/VK1-05(SEQ ID NO:230)、VH3-11(SEQ ID NO:208)/VK1-39(SEQ ID NO:236)、VH3-11(SEQ ID NO:208)/VK3-15(SEQ ID NO:238)、VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-40(SEQ ID NO:250)、VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-47(SEQ ID NO:251)、VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL2-23(SEQ ID NO:255)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-05(SEQ ID NO:230)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-06(SEQ ID NO:231)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-12(SEQ ID NO:233)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-16(SEQ ID NO:234)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-27(SEQ ID NO:235)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK3-11(SEQ ID NO:237)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-40(SEQ ID NO:250)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-47(SEQ ID NO:251)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL2-14(SEQ ID NO:254)、VH3-21(SEQ ID NO:210)/VK1-12(SEQ ID NO:233)、VH3-21(SEQ ID NO:210)/VK1-27(SEQ ID NO:235)、VH3-21(SEQ ID NO:210)/VL2-11(SEQ ID NO:253)、VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK1-39(SEQ ID NO:236)、VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK3-15(SEQ ID NO:238)、VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL2-23(SEQ ID NO:255)、VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL3-1(SEQ ID NO:256)、VH3-30(SEQ ID NO:212)/VK3-20(SEQ ID NO:239)、VH3-53(SEQ ID NO:213)/VK3-15(SEQ ID NO:238)、VH3-53(SEQ ID NO:213)/VL2-11(SEQ ID NO:253);VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-05(SEQ ID NO:230)、VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-06(SEQ ID NO:231)、VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-12(SEQ ID NO:233)、VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-27(SEQ ID NO:235)、VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK3-20(SEQ ID NO:239)、VH3-74(SEQ ID NO:214)VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH5-51(SEQ ID NO:215)/VK1-39(SEQ ID NO:236)、VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-40(SEQ ID NO:250)、VH5-51(SEQ ID NO:215)VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK1-09(SEQ ID NO:232)、VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK3-15(SEQ ID NO:238)、VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK3-20(SEQ ID NO:239)、和VH6-1(SEQ ID NO:216)/VL1-51(SEQ ID NO:252)。
在该方法的另外的实施例中，基本上全部的、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或至少95%、或其中的各个、或这些抗体或功能性片段包括可变重链和可变轻链框架区，这些框架区包括一个种系蛋白对的种系蛋白序列，其中所述种系蛋白对包括以下特性：
i)Fab形式的表达产率至少2.5mg/L；
ii)Fab形式在70℃或更高温度的热稳定性；
iii)如通过SEC确定的Fab形式的单体含量（%单体）至少99%；
iv)IgG1形式的表达产率至少30mg/L；
v)IgG1形式在73℃或更高温度的热稳定性；
vi)如通过SEC确定的IgG1形式的单体含量（%单体）至少99%；以及
vii)IgG1形式的等电点至少8.3。
在该方法的这个实施例中，这些抗体或功能性片段包括可变重链和可变轻链对，其中这些可变重链和可变轻链对的框架区包括来自以下可变重链和可变轻链对的种系蛋白序列：VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK3-20(SEQ ID NO:239)、VH1-46(SEQ ID NO:205)/VK3-15(SEQ ID NO:238)、VH1-46(SEQ ID NO:205)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH1-69*01(SEQID NO:206)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-12(SEQ ID NO:233)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-27(SEQ ID NO:235)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK3-15(SEQID NO:238)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-47(SEQ ID NO:251)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-40(SEQ ID NO:250)、VH3-11(SEQID NO:208)/VL1-47(SEQ ID NO:251)、VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL2-23(SEQ ID NO:255)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-05(SEQID NO:230)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-06(SEQ ID NO:231)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-12(SEQ ID NO:233)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-27(SEQ ID NO:235)、VH3-15(SEQID NO:209)/VK3-11(SEQ ID NO:237)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH3-21(SEQ ID NO:210)/VK1-12(SEQ ID NO:233)、VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK3-15(SEQID NO:238)、VH3-53(SEQ ID NO:213)/VK3-15(SEQ ID NO:238)、VH3-53(SEQ ID NO:213)/VL2-11(SEQ ID NO:253)、VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-05(SEQ ID NO:230)、VH3-74(SEQID NO:214)/VK1-06(SEQ ID NO:231)、VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-12(SEQ ID NO:233)、VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK3-20(SEQ ID NO:239)、VH5-51(SEQ ID NO:215)/VK1-39(SEQID NO:236)、VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-40(SEQ ID NO:250)、VH5-51(SEQ ID NO:215)VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK1-09(SEQ ID NO:232)、VH6-1(SEQ IDNO:216)/VK3-20(SEQ ID NO:239)、和VH6-1(SEQ ID NO:216)VL1-51(SEQ ID NO:252)。
在该方法的另一个实施例中，这些抗体或功能性片段包括可变重链和可变轻链对，其中这些可变重链和可变轻链对的框架区进一步包括来自以下可变重链和可变轻链对的种系蛋白序列：VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK1-39(SEQ ID NO:236)、VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL2-23(SEQ ID NO:255)、和VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL3-1(SEQ ID NO:256)。该方法的本实施例中，该集合包括（36对）：VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK3-20(SEQ ID NO:239)、VH1-46(SEQ ID NO:205)/VK3-15(SEQ ID NO:238)、VH1-46(SEQ ID NO:205)/VL1-51(SEQID NO:252)、VH1-69*01(SEQ ID NO:206)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-12(SEQ ID NO:233)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-27(SEQ ID NO:235)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK3-15(SEQ ID NO:238)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-47(SEQ ID NO:251)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-40(SEQ ID NO:250)、VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-47(SEQ ID NO:251)、VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL2-23(SEQ ID NO:255)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-05(SEQ ID NO:230)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-06(SEQ ID NO:231)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-12(SEQ ID NO:233)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-27(SEQ ID NO:235)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK3-11(SEQ ID NO:237)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH3-21(SEQ ID NO:210)/VK1-12(SEQ ID NO:233)、VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK1-39(SEQ ID NO:236)、VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK3-15(SEQ ID NO:238)、VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL2-23(SEQ ID NO:255)、VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL3-1(SEQ ID NO:256)、VH3-53(SEQ ID NO:213)/VK3-15(SEQ ID NO:238)、VH3-53(SEQ ID NO:213)/VL2-11(SEQ ID NO:253)、VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-05(SEQ ID NO:230)、VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-06(SEQ ID NO:231)、VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-12(SEQ ID NO:233)、VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK3-20(SEQ ID NO:239)、VH5-51(SEQ ID NO:215)/VK1-39(SEQ ID NO:236)、VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-40(SEQ ID NO:250)、VH5-51(SEQ ID NO:215)VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK1-09(SEQ ID NO:232)、VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK3-20(SEQ ID NO:239)、和VH6-1(SEQ ID NO:216)/VL1-51(SEQ IDNO:252)。
使用方法
一个方面包括使用本文中描述的集合鉴别对一种抗原具有特异性的抗体或片段的方法。
该披露的一个方面包括鉴别对一种抗原具有特异性的一种抗体或抗体片段的方法，包括：
(a)将该抗原与抗体或其片段的一个集合接触，其中，基本上全部的、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或至少95%、或其中的各个、或该集合的这些抗体或功能性片段包括可变重链和可变轻链对，其中这些可变重链和可变轻链对的框架区包括种系蛋白对的种系蛋白序列，这些种系蛋白对包括以下特性：
i)Fab形式的表达产率至少2.5mg/L；
ii)Fab形式在70℃或更高温度的热稳定性；
iii)如通过SEC确定的Fab形式的单体含量（%单体）至少98%；
iv)IgG1形式的表达产率至少30mg/L的；
v)IgG1形式在73℃或更高温度的热稳定性；
vi)如通过SEC确定的IgG1形式的单体含量（%单体）至少99%；以及
(b)选择一种或多种与所述抗原结合的抗体或抗体片段。
在某些实施例中，
i)Fab形式的表达产率是由紫外分光光度法所确定的，采用消光系数1.538mL/mg，并在280nm测量吸光度。
在某些实施例中，
ii)Fab形式的热稳定性是由差示扫描荧光测定法所确定的，采用PBS缓冲液。
在某些实施例中，
iii)Fab形式的单体含量（%单体）是由尺寸排阻色谱法所确定的，采用Superdex75HR10/30柱和pH7.4的Gibco D-PBS缓冲液。
在某些实施例中，
iv)IgG1形式的表达产率是由紫外分光光度法所确定的，采用消光系数1.369mL/mg，并在280nm测量吸光度。
在某些实施例中，
v)IgG1形式的热稳定性是由差示扫描荧光测定法所确定的，采用PBS缓冲液。
在某些实施例中，
vi)IgG1形式的单体含量（%单体）是由尺寸排阻色谱法所确定的，采用Tosoh TSK-Gel G3000SWxl柱和pH7.4的Gibco D-PBS缓冲液。
可采用Nanadrop***（peqlab公司，埃朗根，德国）进行紫外分光光度测定可采用iCycler iQ5热循环仪（伯乐公司）进行差示扫描荧光测定法。可采用pH7.4的Gibco D-PBS（英杰公司，佩斯利，美国）进行差示扫描荧光测定法。可采用AKTA纯化***（GE医疗公司）进行尺寸排阻色谱分析。
在该方法的一个实施例中，这些可变重链和可变轻链对的框架区包括来自以下各项的种系蛋白序列：VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK3-20(SEQ ID NO:239)、VH1-46(SEQ IDNO:205)/VK3-15(SEQ ID NO:238)、VH1-46(SEQ ID NO:205)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH1-69*01(SEQ ID NO:206)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-12(SEQ ID NO:233)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-27(SEQ ID NO:235)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK3-15(SEQ ID NO:238)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-47(SEQ ID NO:251)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-40(SEQ ID NO:250)、VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-47(SEQ ID NO:251)、VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL2-23(SEQ ID NO:255)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-05(SEQ ID NO:230)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-06(SEQ ID NO:231)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-12(SEQ ID NO:233)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-27(SEQ ID NO:235)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK3-11(SEQ ID NO:237)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH3-21(SEQ ID NO:210)/VK1-12(SEQ ID NO:233)、VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK1-39(SEQ ID NO:236)、VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK3-15(SEQ ID NO:238)、VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL2-23(SEQ ID NO:255)、VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL3-1(SEQ ID NO:256)、VH3-53(SEQ ID NO:213)/VK3-15(SEQ ID NO:238)、VH3-53(SEQ ID NO:213)/VL2-11(SEQ ID NO:253)、VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-05(SEQ ID NO:230)、VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-06(SEQ ID NO:231)、VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-12(SEQ ID NO:233)、VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK3-20(SEQ ID NO:239)、VH5-51(SEQ ID NO:215)/VK1-39(SEQ ID NO:236)、VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-40(SEQ ID NO:250)、VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK1-09(SEQ ID NO:232)、VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK3-20(SEQ ID NO:239)、和VH6-1(SEQ ID NO:216)/VL1-51(SEQ ID NO:252)。
在该方法的一个实施例中，这些抗体或其功能性片段包括两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个、十个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个、20个或更多个、21个或更多个、22个或更多个、23个或更多个、24个或更多个、25个或更多个、26个或更多个、27个或更多个、28个或更多个、29个或更多个、30个或更多个、31个或更多个、32个或更多个、33个或更多个、34个或更多个、35个或更多个、或36个或更多个、37个或更多个、38个或更多个、39个或更多个、40个或更多个、41个或更多个、或42个或更多个、或43个或更多个、或44个或更多个、或45个或更多个、或46个或更多个、或47个或更多个、或48个或更多个、或49个或更多个、或50个或更多个、或51个或更多个、或52个或更多个、或53个或更多个、或54个选自下组的可变重链和可变轻链对，该组由选自以下各项的可变重链和可变轻链对组成：VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK1-39(SEQ ID NO:236)、VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK3-15(SEQ ID NO:238)、VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK3-20(SEQ ID NO:239)、VH1-46(SEQ ID NO:205)/VK3-15(SEQ ID NO:238)、VH1-46(SEQ ID NO:205)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH1-46(SEQ ID NO:205)/VL3-21(SEQ ID NO:257)、VH1-69*01(SEQ ID NO:206)/VL1-51(SEQ IDNO:252)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-12(SEQ ID NO:233)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-16(SEQ ID NO:234)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-27(SEQ ID NO:235)、VH3-07(SEQID NO:207)/VK1-39(SEQ ID NO:236)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK3-15(SEQ ID NO:238)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-47(SEQ ID NO:251)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-51(SEQID NO:252)、VH3-11(SEQ ID NO:208)/VK1-05(SEQ ID NO:230)、VH3-11(SEQ ID NO:208)/VK1-39(SEQ ID NO:236)、VH3-11(SEQ ID NO:208)/VK3-15(SEQ ID NO:238)、VH3-11(SEQID NO:208)/VL1-40(SEQ ID NO:250)、VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-47(SEQ ID NO:251)、VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL2-23(SEQID NO:255)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-05(SEQ ID NO:230)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-06(SEQ ID NO:231)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-12(SEQ ID NO:233)、VH3-15(SEQID NO:209)/VK1-16(SEQ ID NO:234)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-27(SEQ ID NO:235)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK3-11(SEQ ID NO:237)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-40(SEQID NO:250)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-47(SEQ ID NO:251)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL2-14(SEQ ID NO:254)、VH3-21(SEQID NO:210)/VK1-12(SEQ ID NO:233)、VH3-21(SEQ ID NO:210)/VK1-27(SEQ ID NO:235)、VH3-21(SEQ ID NO:210)/VL2-11(SEQ ID NO:253)、VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK1-39(SEQID NO:236)、VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK3-15(SEQ ID NO:238)、VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL2-23(SEQ ID NO:255)、VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL3-1(SEQ ID NO:256)、VH3-30(SEQID NO:212)/VK3-20(SEQ ID NO:239)、VH3-53(SEQ ID NO:213)/VK3-15(SEQ ID NO:238)、VH3-53(SEQ ID NO:213)/VL2-11(SEQ ID NO:253)、VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-05(SEQID NO:230)、VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-06(SEQ ID NO:231)、VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-12(SEQ ID NO:233)、VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-27(SEQ ID NO:235)、VH3-74(SEQID NO:214)/VK3-20(SEQ ID NO:239)、VH3-74(SEQ ID NO:214)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH5-51(SEQ ID NO:215)/VK1-39(SEQ ID NO:236)、VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-40(SEQID NO:250)、VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK1-09(SEQ ID NO:232)、VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK3-15(SEQ ID NO:238)、VH6-1(SEQ IDNO:216)/VK3-20(SEQ ID NO:239)、和VH6-1(SEQ ID NO:216)/VL1-51(SEQ ID NO:252)。
在该方法的实施例中，基本上全部的、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或至少95%、或其中的各个、或这些抗体或功能性片段包括可变重链和可变轻链框架区，这些框架区包括一个种系蛋白对的种系蛋白序列，其中所述种系蛋白对包括以下特性：
i)Fab形式的表达产率至少2.5mg/L；
ii)Fab形式在70℃或更高温度的热稳定性；
iii)如通过SEC确定的Fab形式的单体含量（%单体）至少为99%；
iv)IgG1形式的表达产率至少30mg/L；
v)IgG1形式在73℃或更高温度的热稳定性；
vi)如通过SEC确定的IgG1形式的单体含量（%单体）至少为99%；以及
vii)IgG1形式的等电点至少8.3。
在该方法的这个实施例中，这些可变重链和可变轻链对的框架区包括来自以下各项的种系蛋白序列：VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK3-20(SEQ ID NO:239)、VH1-46(SEQ IDNO:205)/VK3-15(SEQ ID NO:238)、VH1-46(SEQ ID NO:205)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH1-69*01(SEQ ID NO:206)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-12(SEQ ID NO:233)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-27(SEQ ID NO:235)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK3-15(SEQ ID NO:238)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-47(SEQ ID NO:251)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-40(SEQ ID NO:250)、VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-47(SEQ ID NO:251)、VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL2-23(SEQ ID NO:255)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-05(SEQ ID NO:230)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-06(SEQ ID NO:231)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-12(SEQ ID NO:233)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-27(SEQ ID NO:235)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK3-11(SEQ ID NO:237)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH3-21(SEQ ID NO:210)/VK1-12(SEQ ID NO:233)、VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK3-15(SEQ ID NO:238)、VH3-53(SEQ ID NO:213)/VK3-15(SEQ ID NO:238)、VH3-53(SEQ ID NO:213)/VL2-11(SEQ ID NO:253)、VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-05(SEQ ID NO:230)、VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-06(SEQ ID NO:231)、VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-12(SEQ ID NO:233)、VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK3-20(SEQ ID NO:239)、VH5-51(SEQ ID NO:215)/VK1-39(SEQ ID NO:236)、VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-40(SEQ ID NO:250)、VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK1-09(SEQ ID NO:232)、VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK3-20(SEQ ID NO:239)、和VH6-1(SEQ ID NO:216)/VL1-51(SEQ ID NO:252)。
在该方法的另一个实施例中，这些可变重链和可变轻链对的框架区包括进一步选自以下可变重链和可变轻链对的种系蛋白序列：VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK1-39(SEQ IDNO:236)、VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL2-23(SEQ ID NO:255)、和VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL3-1(SEQ ID NO:256)。在本实施例中，一个集合包括（36对）：VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK3-20(SEQ ID NO:239)、VH1-46(SEQ ID NO:205)/VK3-15(SEQ ID NO:238)、VH1-46(SEQID NO:205)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH1-69*01(SEQ ID NO:206)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-12(SEQ ID NO:233)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-27(SEQ ID NO:235)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK3-15(SEQ ID NO:238)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-47(SEQ ID NO:251)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-40(SEQ ID NO:250)、VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-47(SEQ ID NO:251)、VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL2-23(SEQ ID NO:255)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-05(SEQ ID NO:230)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-06(SEQ ID NO:231)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-12(SEQ ID NO:233)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-27(SEQ ID NO:235)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK3-11(SEQ ID NO:237)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH3-21(SEQ ID NO:210)/VK1-12(SEQ ID NO:233)、VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK1-39(SEQ ID NO:236)、VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK3-15(SEQ ID NO:238)、VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL2-23(SEQ ID NO:255)、VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL3-1(SEQ ID NO:256)、VH3-53(SEQ ID NO:213)/VK3-15(SEQ ID NO:238)、VH3-53(SEQ ID NO:213)/VL2-11(SEQ ID NO:253)、VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-05(SEQ ID NO:230)、VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-06(SEQ ID NO:231)、VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-12(SEQ ID NO:233)、VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK3-20(SEQ ID NO:239)、VH5-51(SEQ ID NO:215)/VK1-39(SEQ ID NO:236)、VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-40(SEQ ID NO:250)、VH5-51(SEQ ID NO:215)VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK1-09(SEQ ID NO:232)、VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK3-20(SEQ ID NO:239)、和VH6-1(SEQ ID NO:216)/VL1-51(SEQ ID NO:252)。
方法的方面
在此披露的方法的另外的方面中，这些集合包括合成的抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，这些抗体或功能性片段包括一个或多个互补性决定区，该一个或多个互补性决定区包括来自各自的可变重链和可变轻链对的种系蛋白序列，其中图25-33中描述了这些可变重链和可变轻链的互补性决定区的氨基酸序列。更确切地说，在该方法的一个实施例中，一个集合包括抗体或其功能性片段或合成的编码这些抗体或功能性片段的核酸，这些抗体或功能性片段包括CDR1区，这些CDR1区包括来自各自的可变重链和/或可变轻链对的种系蛋白序列，其中图25、28、和31以及对应的SEQ ID NO:204-265中描述了这些可变重链和可变轻链的CDR1区的氨基酸和核酸序列。在该方法的一个实施例中，一个集合包括抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，这些抗体或功能性片段包括HCDR1区，这些HCDR1区包括来自各自的可变重链和可变轻链对的种系蛋白序列，其中图25以及对应的SEQ ID NO:204-229中描述了这些可变重链和可变轻链的HCDR1区的氨基酸和核酸序列。在该方法的一个实施例中，一个集合包括抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，这些抗体或功能性片段包括LCDR1区，这些LCDR1区包括来自各自的可变重链和可变轻链对的种系蛋白序列，其中图28和31以及对应的SEQ ID NO:230-265中描述了这些可变重链和可变轻链的LCDR1区的氨基酸和核酸序列。在该方法的一个另外的实施例中，一个集合包括抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，这些抗体或功能性片段包括CDR2区，这些CDR2区包括来自各自的可变重链和可变轻链对的种系蛋白序列，其中图26、29和32以及对应的SEQ ID NO:204-265中描述了这些可变重链和可变轻链的CDR2区的氨基酸和核酸序列。在该方法的一个另外的实施例中，一个集合包括抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，这些抗体或功能性片段包括HCDR2区，这些HCDR2区包括来自各自的可变重链和可变轻链对的种系蛋白序列，其中图26以及对应的SEQ ID NO:204-229中描述了这些可变重链和可变轻链的HCDR2区的氨基酸和核酸序列。在该方法的一个另外的实施例中，一个集合包括抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，这些抗体或功能性片段包括LCDR2区，这些LCDR2区包括来自各自的可变重链和可变轻链对的种系蛋白序列，其中图29和32以及对应的SEQ ID NO:230-265中描述了这些可变重链和可变轻链的LCDR2区的氨基酸和核酸序列。
在本发明的一个实施例中，一个集合包括抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，这些抗体或功能性片段包括一个或多个互补性决定区，该一个或多个互补性决定区包括去除潜在的翻译后修饰位点的氨基酸修饰。在本发明的一个实施例中，一个集合包括抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，这些抗体或功能性片段包括一个或多个互补性决定区，该一个或多个互补性决定区包括来自各自的可变重链的图34-36中描述的互补性决定区序列或编码它们的核酸序列。在该方法的另一个实施例中，一个集合包括抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，这些抗体或功能性片段包括HCDR1区，这些HCDR1区包括来自各自的可变重链的图34-36中描述的HCDR1或编码其的核酸。SEQ ID NO:266-278中描述了这些低PTMHCDR1的氨基酸序列。SEQ ID NO:279-291中描述了这些低PTM HCDR1的核酸序列。在本发明的另一个实施例中，一个集合包括抗体或其功能性片段或编码这样的抗体或功能性片段的合成核酸，这些抗体或功能性片段包括HCDR2区，这些HCDR2区包括来自各自的可变重链的图34-36中描述的这些HCDR2区或编码其的核酸。SEQ ID NO:266-278中描述了这些低PTMHCDR2的氨基酸序列。SEQ ID NO:279-291中描述了这些低PTM HCDR2的核酸序列。
在该方法的一个实施例中，一个集合包括抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，这些抗体或功能性片段包括选自下组的一个FR4区，该组由以下各项组成：JH4(SEQ ID NO:293)、Jκ1(SEQ ID NO:297)、和Jλ2/3(SEQ ID NO:301)。在该方法的一个实施例中，一个集合包括抗体或其功能性片段或合成的编码这样的包含一个种系JH4FR4区的抗体或功能性片段的核酸，图40中描述了该种系JH4FR4的氨基酸或核酸序列。(SEQ ID NO:293)和(SEQ ID NO:295)中描述了JH4FR4的氨基酸序列。(SEQ ID NO:292)和(SEQ ID NO:294)中描述了JH4FR4的核酸序列。在该方法的一个实施例中，一个集合包括抗体或其功能性片段或合成的编码这样的包含一个种系Jκ1FR4区的抗体或功能性片段，图40中描述了该Jκ1FR4区的氨基酸或核酸序列。(SEQ ID NO:297)中描述了该Jκ1FR4的氨基酸序列。(SEQ ID NO:296)、(SEQ ID NO:298)、和(SEQ ID NO:299)中描述了该Jκ1FR4的核酸序列。在该方法的一个实施例中，一个集合包括抗体或其功能性片段或合成的编码这样的包含一个种系Jλ2/3FR4区的抗体或功能性片段的核酸，图40中描述了该种系Jλ2/3FR4区的氨基酸或核酸序列。(SEQ ID NO:301)中描述了该Jλ2/3FR4的氨基酸序列。(SEQ ID NO:300)、(SEQ ID NO:302)、和(SEQ ID NO:303)中描述了该Jλ2/3FR4的核酸序列。
在一个方面中，为了增强鉴别针对任何抗原的抗体或其片段的能力，集合包括多样化的CDR3区。在该方法的一个实施例中，一个集合包括抗体或其功能性片段或合成的编码这样的包含一个多样化的HCDR3区的抗体或功能性片段的核酸。
在另一个方面中，为了增强鉴别针对任何抗原的抗体或其片段的能力，本方法的集合包括至少1×104个抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，至少1×105个抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，至少1×106个抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，至少1×107个抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，至少1×108个抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，至少1×109个抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，至少1×1010个抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，或至少1×1011个抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸。
在该方法一个实施例中，这些集合包括抗体或合成的编码这样的抗体的核酸，这些抗体选自下组，该组由人IgG1、lgG2、lgG3、lgG4、IgA、IgE、IgM、和IgD组成。在该方法的一个实施例中，这些集合包括抗体片段或合成的编码这样的片段的核酸，这些片段选自下组，该组由Fab、F(ab')2、Fab'、Fv、和scFv组成。
在该方法的一个实施例中，这些集合的抗体的IgG重链恒定结构域包括图41A-B(SEQ ID NO:35)中所示的氨基酸序列。在该方法的其他实施例中，这些编码该集合的抗体的IgG重链恒定结构域的核酸包括图41A-B(SEQ ID NO:304）中所示的核酸序列。在实施例中，这些集合的抗体片段的Fab重链恒定结构域包括图42(SEQ ID NO:307)中所示的氨基酸序列。在该方法的其他实施例中，这些编码该集合的抗体的Fab重链恒定结构域的核酸包括图42(SEQ ID NO:306)中所示的核酸序列。在该方法的实施例中，这些集合的抗体或抗体片段的IgG(SEQ ID NO:309)和/或Fab(SEQ ID NO:311)kappa轻链恒定结构域包括图43中所示的氨基酸序列。在该方法的其他实施例中，编码这些集合的抗体或抗体片段的IgG(SEQID NO:308)和/或Fab(SEQ ID NO:310)kappa轻链恒定结构域的核酸包括图43中所示的核酸序列。在该方法的实施例中，这些集合的抗体或抗体片段的IgG(SEQ ID NO:313)和/或Fab(SEQ ID NO:315)lambda轻链恒定结构域包括图44中所示的氨基酸序列。在该方法的其他实施例中，编码这些集合的抗体或抗体片段的IgG(SEQ ID NO:312)和/或Fab(SEQ IDNO:314)lambda轻链恒定结构域的核酸包括图44中所示的核酸序列。
发明的抗体
在另一个方面中，该披露提供了一种合成的抗体或其功能性片段或一种合成的编码这样的抗体或功能性片段的核酸，其中该抗体或功能性片段包括一个可变重链和可变轻链对，其中该可变重链和可变轻链对的框架区包括选自以下的可变重链和可变轻链对的种系蛋白序列：VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK1-39(SEQ ID NO:236)、VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK3-15(SEQ ID NO:238)、VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK3-20(SEQ ID NO:239)、VH1-46(SEQID NO:205)/VK3-15(SEQ ID NO:238)、VH1-46(SEQ ID NO:205)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH1-46(SEQ ID NO:205)/VL3-21(SEQ ID NO:257)、VH1-69*01(SEQ ID NO:206)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-12(SEQ ID NO:233)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-16(SEQ ID NO:234)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-27(SEQ ID NO:235)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-39(SEQ ID NO:236)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK3-15(SEQ ID NO:238)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-47(SEQ ID NO:251)、VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH3-11(SEQ ID NO:208)/VK1-05(SEQ ID NO:230)、VH3-11(SEQ ID NO:208)/VK1-39(SEQ ID NO:236)、VH3-11(SEQ ID NO:208)/VK3-15(SEQ ID NO:238)、VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-40(SEQ ID NO:250)、VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-47(SEQ ID NO:251)、VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL2-23(SEQ ID NO:255)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-05(SEQ ID NO:230)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-06(SEQ ID NO:231)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-12(SEQ ID NO:233)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-16(SEQ ID NO:234)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-27(SEQ ID NO:235)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK3-11(SEQ ID NO:237)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-40(SEQ ID NO:250)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-47(SEQ ID NO:251)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL2-14(SEQ ID NO:254)、VH3-21(SEQ ID NO:210)/VK1-12(SEQ ID NO:233)、VH3-21(SEQ ID NO:210)/VK1-27(SEQ ID NO:235)、VH3-21(SEQ ID NO:210)/VL2-11(SEQ ID NO:253)、VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK1-39(SEQ ID NO:236)、VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK3-15(SEQ ID NO:238)、VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL2-23(SEQ ID NO:255)、VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL3-1(SEQ ID NO:256)、VH3-30(SEQ ID NO:212)/VK3-20(SEQ ID NO:239)、VH3-53(SEQ ID NO:213)/VK3-15(SEQ ID NO:238)、VH3-53(SEQ ID NO:213)/VL2-11(SEQ ID NO:253)、VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-05(SEQ ID NO:230)、VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-06(SEQ ID NO:231)、VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-12(SEQ ID NO:233)、VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-27(SEQ ID NO:235)、VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK3-20(SEQ ID NO:239)、VH3-74(SEQ ID NO:214)/VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH5-51(SEQ ID NO:215)/VK1-39(SEQ ID NO:236)、VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-40(SEQ ID NO:250)、VH5-51(SEQ ID NO:215)VL1-51(SEQ ID NO:252)、VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK1-09(SEQ ID NO:232)、VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK3-15(SEQ ID NO:238)、VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK3-20(SEQ ID NO:239)、和VH6-1(SEQ ID NO:216)/VL1-51(SEQ IDNO:252)。
在一个实施例中，该合成的抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或其功能性片段的核酸包括一个或多个互补性决定区，该一个或多个互补性决定区包括来自各自的可变重链和可变轻链对的种系蛋白序列，其中图25-33中描述了该可变重链和可变轻链的互补性决定区的氨基酸序列。更确切地说，在一个实施例中，该合成的抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或其功能性片段的核酸包括一个CDR1区，该CDR1区包括来自各自的可变重链和/或可变轻链对的种系蛋白序列，其中图25、28、和31以及对应的SEQ IDNO:204-265中描述了这些可变重链和可变轻链的CDR1区的氨基酸序列。在一个实施例中，该合成的抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或其功能性片段的核酸包括一个HCDR1区，该HCDR1区包括来自各自的可变重链和可变轻链对的种系蛋白序列，其中图25以及对应的SEQ ID NO:204-229中描述了该可变重链和可变轻链的HCDR1区的氨基酸序列。在一个实施例中，该合成的抗体或其功能性片段或合成的编码该抗体或其功能性片段的核酸包括一个LCDR1区，该LCDR1区包括来自各自的可变重链和可变轻链对的种系蛋白序列，其中图28和31以及对应的SEQ ID NO:230-265中描述了该可变重链和可变轻链的LCDR1区的氨基酸序列。在一个另外的实施例中，该合成的抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或其功能性片段的核酸包括一个CDR2区，该CDR2区包括来自各自的可变重链和可变轻链对的种系蛋白序列，其中图26、29、和32以及对应的SEQ ID NO:204-265中描述了该可变重链和可变轻链的CDR2区的氨基酸序列。在一个另外的实施例中，该合成的抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或其功能性片段的核酸包括一个HCDR2区，该HCDR2区包括来自各自的可变重链和可变轻链对的种系蛋白序列，其中图26以及对应的SEQ ID NO:204-229中描述了该可变重链和可变轻链的HCDR2区的氨基酸序列。在一个另外的实施例中，该合成的抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或其功能性片段的核酸包括一个LCDR2区，该LCDR2区包括来自各自的可变重链和可变轻链对的种系蛋白序列，其中图29和32以及对应的SEQ ID NO:230-265中描述了该可变重链和可变轻链的LCDR2区的氨基酸序列。
本披露的一个方面包括对种系互补性决定区进行修饰以去除潜在的翻译后修饰位点（PTM）。图34-36中示出了修饰以去除PTM的可变重链互补性决定区的实例。在一个方面中，该合成的抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或其功能性片段的核酸包括一个或多个互补性决定区，该一个或多个互补性决定区包括去除潜在的翻译后修饰位点的氨基酸修饰。在一个实施例中，该合成的抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或其功能性片段的核酸包括一个或多个互补性决定区，该一个或多个互补性决定区包括来自各自的可变重链的图34-36中描述的互补性决定区序列或编码它们的核酸序列。在另一个实施例中，该合成的抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或其功能性片段的核酸包括一个HCDR1区，该HCDR1区包括来自各自的可变重链的图34-36中描述的HCDR1或编码其的核酸。SEQ ID NO:266-278中描述了这些低PTM HCDR1的氨基酸序列。SEQ ID NO:279-291中描述了这些低PTM HCDR1的核酸序列。在另一个实施例中，该合成的抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或其功能性片段的核酸包括一个HCDR2区，该HCDR2区包括来自各自的可变重链的图34-36中描述的HCDR2区或编码它的核酸。SEQ ID NO:266-278中描述了这些低PTM HCDR2的氨基酸序列。SEQ ID NO:279-291中描述了这些低PTM HCDR2的核酸序列。
本披露的一个方面包括利用种系FR4序列。在一个实施例中，该合成的抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或其功能性片段的核酸包括一个选自下组的FR4区，该组由以下各项组成：JH4(SEQ ID NO:293)、Jκ1(SEQ ID NO:297)、和Jλ2/3(SEQ ID NO:301)。在一个实施例中，该合成的抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或其功能性片段的核酸包括一个种系JH4FR4区，图40中描述了该种系JH4FR4区的氨基酸或核酸序列。(SEQ ID NO:293)和(SEQ ID NO:295)中描述了该JH4FR4的氨基酸序列。(SEQ ID NO:292)和(SEQ ID NO:294)中描述了该JH4FR4的核酸序列。在一个实施例中，该合成的抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或其功能性片段的核酸包括一个种系Jκ1FR4区，图40中描述了该种系Jκ1FR4区的氨基酸或核酸序列。(SEQ ID NO:297)中描述了该Jκ1FR4的氨基酸序列。(SEQ ID NO:296)、(SEQ ID NO:298)、和(SEQ ID NO:299)中描述了该Jκ1FR4的核酸序列。在一个实施例中，该合成的抗体或其功能性片段或合成的编码这样的抗体或其功能性片段的核酸包括一个种系Jλ2/3FR4区，图40中描述了该Jλ2/3FR4区的氨基酸或核酸序列。(SEQ ID NO:301)中描述了Jλ2/3FR4的氨基酸序列。(SEQ ID NO:300)、(SEQ IDNO:302)、和(SEQ ID NO:303)中描述了Jλ2/3FR4的核酸序列。
在一个实施例中，该合成的抗体或合成的编码这样的抗体的核酸选自下组，该组由人lgG1、lgG2、lgG3、lgG4、IgA、IgE、IgM、和IgD组成。在一个实施例中，该合成的抗体片段或合成的编码这样的抗体片段的核酸选自下组，该组由Fab、F(ab')2、Fab'、Fv、和scFv组成。
在实施例中，该抗体的IgG重链恒定结构域包括图41A-B(SEQ ID NO:305)中所示的氨基酸序列。在其他实施例中，编码该抗体的IgG重链恒定结构域的核酸包括图41A-B(SEQ ID NO:304)中所示的核酸序列。在实施例中，这些抗体片段的Fab重链恒定结构域包括图42(SEQ ID NO:307)中所示的氨基酸序列。在其他实施例中，编码该抗体片段的Fab重链恒定结构域的核酸包括图42(SEQ ID NO:306)中所示的核酸序列。在实施例中，这些抗体或抗体片段的IgG(SEQ ID NO:309)和/或Fab(SEQ ID NO:311)kappa轻链恒定结构域包括图43中所示的氨基酸序列。在其他实施例中，编码这些抗体或抗体片段的IgG(SEQ ID NO:308)和/或Fab(SEQ ID NO:310)kappa轻链恒定结构域的核酸包括图43中所示的核酸序列。在实施例中，这些抗体或抗体片段的IgG(SEQ ID NO:313)和/或Fab(SEQ ID NO:315)lambda轻链恒定结构域包括图44中所示的氨基酸序列。在其他实施例中，编码这些抗体或抗体片段的IgG(SEQ ID NO:312)和/或Fab(SEQ ID NO:314)lambda轻链恒定结构域的核酸包括图44中所示的核酸序列。
实例
实例1：在原核信号序列和人类前导序列的C末端处产生限制位点，从而提供完全
种系FR1区
在一个方面，本披露描述了包括框架区的抗体或其片段的集合，这些框架区包含种系蛋白序列，确切地说是FR1。预期具有种系序列应降低抗体当在人类中给予时的免疫原性风险。然而，必须使用相容限制位点以便实现对编码抗体集合的核酸向展示和/或表达载体的标准克隆，以使得可以针对免疫原对这些抗体进行筛选。在过去，克隆所采用的限制位点通常位于这些框架区内，因此修饰远离种系的核酸和/或氨基酸序列。为了确保本披露的抗体中的每一种的至少框架1（FR1）区维持一个种系蛋白序列，在FR1内不应存在会导致与种系氨基酸序列的偏差的任何限制位点。因此，本披露的一个方面是在原核信号序列和人类前导序列的C末端内、确切地说是三个C末端残基内结合一个相同或至少相容的限制位点。另外，包括一个相同或相容限制位点的原核信号序列和人类前导序列必须是功能性的，并且允许抗体或其片段在原核和哺乳动物表达***两者中的良好展示和表达产率。
图1显示了所选择的限制位点和它们的相应位置。选择NheI（VLA）限制位点用于结合到原核重链信号序列（phoA）中。野生型phoA信号序列和NheI（VLA）phoA信号序列的核酸和氨基酸序列显示在表1中。
表1：
野生型大肠杆菌phoA信号序列（从位置-3到-1的C末端氨基酸序列是TKA，不具有限制位点）：
MKQSTIALALLPLLFTPVTKA
ATGAAACAGAGCACCATTGCCCTGGCCCTGCTGCCGCTGCTGTTTACCCCAGTGA CCAAA
GCC
（按照出现顺序分别是SEQ ID NO8和7）
PhoA野生型C末端 T K A
ACC AAA GCC
具有C末端VLA和NheI限制位点(=GCTAGC）的被修饰的大肠杆菌phoA信号序列：
MKQSTIALALLPLLFTPVVLA
ATGAAACAGAGCACCATTGCCCTGGCCCTGCTGCCGCTGCTGTTTACCCCA GTGGTGCTA
GCC
（按照出现顺序分别是SEQ ID NO10和9）
选择NdeI（AYA）限制位点用于结合到原核κ和λ信号序列（ompA）中。野生型ompA信号序列和被修饰的NdeI（AYA）ompA信号序列的核酸和氨基酸序列显示在表2中。
表2：
野生型大肠杆菌ompA信号序列（从位置-3到-1的C末端氨基酸序列是AQA，不具有限制位点）：
MKKTAIAIAVALAGFATVAQA
ATGAAAAAAACCGCCATTGCCATTGCCGTGGCCCTGGCAGGCTTTGCCACCGTGG CGCAG
GCC
（按照出现顺序分别是SEQ ID NO12和11）
OmpA野生型C末端 A Q A
GCG CAG GCC
具有C末端AYA和NdeI限制位点（=CATATG）的被修饰的大肠杆菌ompA信号序列：
MKKTAIAIAVALAGFATVAYA
ATGAAAAAAACCGCCATTGCCATTGCCGTGGCCCTGGCAGGCTTTGCCACC GTGGCATAT
GCC
可替代地，该DNA序列包括：
ATGAAAAAAACCGCCATTGCCATTGCCGTGGCCCTGGCAGGCTTTGCCACC GTGGCATAT
GCG
（按照出现顺序分别是SEQ ID NO14、13和15）
为了允许容易从大肠杆菌表达的Fab转换到哺乳动物表达的IgG形式，产生IgG轻链（人类κ前导序列）和IgG重链（人类重链前导序列）的人类前导序列以含有与ompA（NdeI（AYA））和phoA（NheI（VLA））信号序列的C末端相同的限制位点。野生型和被修饰的人类重链前导序列和人类κ前导序列显示在表3中。
表3
重链前导序列
A）
野生型人类重链前导序列（从位置-3到-1的C末端氨基酸序列是VLS，不具有限制位点）：
MKHLWFFLLLVAAPRWVLS
ATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTCC TGTCC
（按照出现顺序分别是SEQ ID NO17和16）
野生型重链前导序列C末端 V L S
GTC CTG TCC
B）
具有C末端VLA和NheI限制位点（=GCTAGC）的被修饰的人类重链前导序列：
MKHLWFFLLLVAAPRWVLA
ATGAAGCACCTGTGGTTCTTTCTGCTGCTGGTGGCCGCTCCCCGGTGGGTGCT AGCC
（按照出现顺序分别是SEQ ID NO19和18）
C）
野生型人类κ前导序列（从位置-3到-1的C末端氨基酸序列是AYG，不具有限制位点）：
MVLQTQVFISLLLWISGAYG
ATGGTGTTGCAGACCCAGGTCTTCATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTGGTGCCT ACGGG
（按照出现顺序分别是SEQ ID NO21和20）
κ前导序列C末端 A Y G
GCC TAC GGG
D）
具有C末端AYA和NdeI限制位点（=CATATG）的被修饰的人类κ前导序列：
MVLQTQVFISLLLWISGAYA
ATGGTGCTCCAGACCCAGGTGTTCATCAGCCTGCTGCTGTGGATCAGCGGCGCAT ATGCG
（按照出现顺序分别是SEQ ID NO23和22）
所选择的被修饰的原核信号序列和人类前导序列(a)根据所使用的载体***导致Fab和IgG蛋白的高产率；(b)提供了在原核与哺乳动物***之间的转换抗体形式、载体以及表达***的完全相容性；并且(c)位于信号/前导序列中，从而维持FR1的完全种系序列。
实例2：鉴别人类组库中最丰富的VH/VL对
在其最一般意义上，诸位发明人从以下想法开始：以基本方法模仿人类免疫***的一个抗体集合可以是有利的。诸位发明人从其以下假设入手：在人类免疫组库中丰富地表达的可变重链和可变轻链种系基因对可能具有有利生物物理学特性，该特性将导致更有效临床研发并且增加所得抗体在患者中的安全性和疗效。为了证明这一假设，第一步骤是鉴别人类免疫组库中占优势地表达的可变重链和可变轻链种系基因对。
实例2.1：确定VH/VL对种系基因的使用情况
为了鉴别来自人类免疫组库的主要表达的VH/VL种系基因对，对可公开获得的数据进行分析并且对人类B细胞进行取样。作为一个第一步骤，对可公开获得的数据进行审阅以鉴别对从人类B细胞分离的VH/VL种系基因对进行描述的文章。如所提到的，许多可公开获得的数据库提供了抗体序列，然而，许多仅提供了可变结构域VH或VL的序列，但很少提供VH/VL种系基因对的键联。鉴别了以下文章并且进行详细分析：沃德曼H.（Wardemann H.）等人(2003)科学（Science）301,1374-1377和任何辅助表格；尤拉索夫S.（Yurasov S.）等人(2005)实验医学杂志201,703-712和任何辅助表格；晔道M.（Tsuiji M.）等人(2006)实验医学杂志203,393-401和任何辅助表格；尤拉索夫S.等人(2006)实验医学杂志203,2255-2262和任何辅助表格；蒂勒T.（Tiller T.）等人(2007)免疫学（Immunity）26,205-213和任何辅助表格；以及米茨纳B.（Mietzner B.）等人(2008)PNAS105,9727-9732和任何辅助表格，所有所述文献的全部内容都通过引用结合。如下文所描述，从人类B细胞的一个样品鉴别另外的VH/VL对数据。
实例2.2：确定来自人类样品的VH/VL对基因的使用情况
为了获得另外的VH/VL种系基因对的使用情况的数据，从一个人类宿主分离PBMC。将这些PBMC分类，使用PCR将B细胞的cDNA扩增，对来自B细胞的DNA进行测序，并且然后用IgBLAST（NCBI）对序列进行序列比对以鉴别来自每一B细胞的VH/VL种系基因对。
对来自静脉血的人类PBMC和来自骨髓的单核细胞进行分离并且分类的一般方法描述于蒂勒等人,免疫学方法杂志（J Immunol Methods）,2008年1月1日;329(1-2):112-24中，其全部内容通过引用结合。分离这些PBMC，并且然后根据所关注的表型的细胞表面标记进行单一分类。然后将单一分类的成熟原始（mn）B细胞和抗体分泌细胞（asc）的Ig基因转录本PCR扩增以便确定VH/VL种系基因对。对B细胞的cDNA进行PCR扩增的一般方法和适用于其的引物也描述于蒂勒等人2008（上文引用文献）中。所使用的具体引物显示在表4中。
表4（按照出现顺序分别是SEQ ID NO24-60）：
对于μ或γ重链PCR来说：
对于κ轻链PCR来说：
合成单一分类的成熟原始（mn）B细胞和抗体分泌细胞（asc）的cDNA。进行巢式PCR，其中将人类IgH、Igk以及IgL V基因转录本独立地PCR扩增。用IgBLAST（NCBI）对测序结果进行比对以鉴别各自的VH、VK以及VL种系基因。
实例2.3人类免疫组库中所鉴别的VH/VL种系基因对
将如实例2.1中所描述从可公开获得的文献所鉴别的VH/VL种系基因对数据与如实例2.2中所描述从一个人类样品所鉴别的数据聚池。对所聚池的数据进行分析，并且显示为表6中的一个评级，即人类免疫组库中所鉴别的VH/VL种系基因对的百分比/比例（%）的评级。
实例3：确定VH和VL种系基因的使用情况
对表6的审阅显示了，与种系基因的总数目相比，少量VH/VL对在人类免疫组库中是占主导地位的。威尔特（Wildt）等人在895-896描述了这一现象。威尔特等人还描述了，频繁地表达的重和轻链基因片段通常是配对的，并且观测到，所取样的配对中的一半对应于仅五个VH/VL种系基因对。
另外，对所聚池的数据和另外的参考文献进行评估以鉴别在人类免疫组库中独立地表达（不作为对）的VH、Vκ以及Vλ种系基因。包括了未配对的VH和/或VL种系基因表达的另外的参考文献是布里辛舍科H P.（Brezinschek H P.）等人(1997)临床研究杂志（J.Clin.Invest.）99,2488；德梅松C.（Demaison C.）等人(1995)免疫遗传学（Immunogenetics）42,342；以及福斯特S.J.（Foster S.J.）等人(1997)临床研究杂志99,1614，所述参考文献的全部内容都通过引用结合。将来自实例2.1和2.2和另外的参考文献的数据聚池并且进行分等级以确定人类免疫组库中最占优势地表达的VH、Vκ以及Vλ种系基因。评级显示在表5中。
在对显示人类免疫组库中非键联的VH、Vλ以及Vκ种系基因占有率的表5与显示人类免疫组库内键联的VH/VL对种系基因占有率的表6进行比较时，显而易知，当独立于键联或配对进行评估时高度呈现的许多VH、Vλ以及Vκ种系基因也在VH/VL配对中高度呈现。
这一观测结果由图4-5中所示的图证实，这些图显示了人类免疫组库的VH/VL种系基因对。这些图显示了从所聚池的数据鉴别的每一VH/VL种系基因对的实际数目，绘制在一个矩阵上，其中Y轴包括了这些VH种系基因的评级，并且X轴包括了这些VL种系基因的评级。
实例4：选择这些VH/VL种系基因配对用于进一步评估其生物物理学特性
作为一个下一步骤，必须确定哪些种系蛋白对要进行测试，这是由于在人类免疫组库中存在约2500对，并且诸位发明人目的是鉴别哪些种系蛋白对包括将有助于选择和研发的有利生物物理学特性。一种方法将是测试人类免疫组库中最占优势地存在的可变重链和可变轻链种系蛋白对，例如参见表6。可以例如选择前四百对用于测试，或选择超过某一阈值数目存在的可变重链和可变轻链种系蛋白对。这种方法将会需要对很大数量的可变重链和可变轻链种系蛋白对序列进行合成与测试，因此，这样一种方法将不会很有效率。
作为一种可替代方法，诸位发明人选择可变重链和可变轻链种系对的一个子集，其中这个子集代表，精确地再现，或者涵盖人体免疫组库中的占优势的种系对的大多数。这种方法部分地基于以上观察：少数可变重链，可变κ轻链和可变λ轻链种系基因（未配对的）在人体免疫组库中是占主导地位的。因此，可以将少数占优势的重链和轻链种系基因（未配对的）组合起来以产生一组代表人体免疫组库的对。
这种方法按以下方式进行。在实例3中，确定可变重链、可变κ轻链以及可变λ轻链种系基因表达。作为一个下一步骤，完成对占优势的VH、Vλ以及Vκ种系基因的一个计算机模拟分析，其中至少评估以下因素：CDR长度；等电点（pI）（优选的等电点是7.5或更高，因为这应该会提供在一种标准pH5.5到pH7配制品缓冲液中的稳定性）；潜在的翻译后修饰位点（PTM's）（确切地说，N-键联的糖基化位点（NxS或NxT）或化学修饰，比如Asp酶切（常常在DP），Asp异构化（DS，DG），脱酰胺化（NS，NG），它们可以发生在体内（血清中）或在配制缓冲液中储存时，并能导致抗体结合的损失）；CDR中蛋氨酸的存在（当暴露于溶剂时可以被氧化）；未配对的半胱氨酸的存在（将与任何其他未配对的半胱氨酸形成二硫键，因此导致蛋白交联和/或更低表达产率）；与种系的偏差；潜在的T-细胞表位的存在；以及理论上的聚集倾向性。从计算机模拟分析选择的数据显示在图2-3中。
基于对最占优势的VH、Vλ以及Vκ种系基因的计算机模拟分析，选择这些基因的一个子集用于合成、组合以及后续功能测试。这一子集显示在图2-3中。当比较表5与图2-3时，显而易见的是，并未选择所有的最占优势的VH、Vλ以及Vκ种系基因用于进一步测试。在表5中所示的最占优势的VH种系基因中，没有选择IGHV4-34、IGHV4-59以及IGHV3-9。取而代之，参见图2-3，选择了IGHV3-74、IGHV3-73以及IGHV6-1。一共选择了20个VH种系基因。在表5中所示的最占优势的Vκ种系基因中，没有选择IGKV4-1、IGKV2-28/2D-28、IGKV1-33/1D-33以及IGKV1-8。一共选择了12个Vκ种系基因。在表5中所示的最占优势的Vλ种系基因中，没有选择IGLV1-44。一共选择了8个Vλ种系基因。
表5显示了来自人类免疫组库的VH、Vκ以及Vλ种系基因的使用情况的评级，并且对被选择用于进一步功能测试的种系基因进行了加粗和加下划线。
表5
实例4.1：对丰富VH、Vκ以及Vλ种系基因重组以产生人类免疫组库中VH/VL最占优
势的对的代表
作为一个下一步骤，将选择的VH、Vκ以及Vλ种系基因（20个VH、12个Vκ以及8个Vλ）合成并且组合以产生400个VH/VL种系基因对，接着测试这些对的生物物理学特性。表6显示了对于功能测试所产生的400个VH/VL种系基因对实际上确实准确复制或涵盖了人类免疫组库中的大部分显著VH/VL种系基因对。表6显示了人类免疫组库中表达的VH/VL对的评级，其中所测试的400个VH/VL对被加粗并且加下划线。
表6：进行功能测试的400个VH/VL种系基因对代表了人类免疫组库中所鉴别的VH/
VL种系基因对
“pos”：代表了如通过所聚池的总数据中每一VH/VL对的百分比（%）所确定的VH/VL对的相对评级的位置。
N=2137个B细胞
实例5：用于功能分析的种系基因的产生
作为一个下一步骤，将如表5中所示的选择用于组合和后续测试的VH、Vλ以及Vκ种系基因发送到基因技术公司（德国雷根斯堡）用于进行各自的对于大肠杆菌表达（在无罕见人类密码子的情况下的中性到哺乳动物表达）的密码子优化、进行基因优化以去除潜在抑制或剪接基序并且进行合成。
VH、Vλ以及Vκ种系基因中的每一个的种系蛋白序列显示在图6-8中。每一种系基因序列都如下合成：
a)对于VH来说：前导序列（如表1中所示，结合了一个NheI限制位点的被修饰的phoA信号序列）；种系FR1、CDR1、FR2、CDR2以及FR3（如图1中所示，结合了一个BssHII限制位点（GCGCGC））；如埃沃特S.等人,分子生物学杂志(2003)325,531-553中使用的4D5抗体的CDR-H3（WGGDGFYAMDY）（SEQ ID NO:1）；以及JH4FR4（如图1中所示，结合了一个XhoI（CTCGAG）限制位点）；
b)对于Vκ来说：前导序列（如表2中所示，结合了该NdeI限制位点的被修饰的ompA信号序列）；种系FR1、CDR1、FR2、CDR2以及FR3（如图1中所示，结合了一个BbsI限制位点（GAAGAC））；根据埃沃特S.等人,分子生物学杂志(2003)325,531-553的κ样CDR-L3（QQHYTTPPT）（SEQ ID NO:2）；以及Jk1FR4（如图1中所示，结合了一个KpnI/Acc65I RE位点（GGTACC））；
c)对于Vλ来说：前导序列（如表2中所示，结合了该NdeI限制位点的被修饰的ompA信号序列）；种系FR1、CDR1、FR2、CDR2以及FR3（如图1中所示，结合了一个BbsI限制位点（GAAGAC））；根据埃沃特S.等人,分子生物学杂志(2003)325,531-553的λ样CDR-L3（QSYDSSLSGVV）（SEQ ID NO:3）；以及JI2/3FR4（如图1中所示，结合了一个KpnI/Acc65I RE位点（GGTACC））。
实例6：对代表人类免疫组库的种系蛋白对进行功能测试
然后将400个种系蛋白对以Fab或人类IgG1形式***到噬菌体展示、大肠杆菌以及哺乳动物表达载体中，并且然后对以下特性进行测试：a)Fab形式的相对展示，在噬菌体产生和噬菌体ELISA之后得到；b)相对Fab表达产率，在大肠杆菌中产生Fab，大肠杆菌细胞裂解和所产生的Fab的ELISA检测之后得到；
c)Fab热稳定性，在大肠杆菌中产生Fab，大肠杆菌细胞裂解和在提高温度孵育后的未变性Fab的ELISA检测之后得到；d)大肠杆菌溶菌产物中Fab的牛/鼠血清稳定性，通过对在牛/鼠血清中孵育之后的未变性Fab进行ELISA检测得到；
e)相对人IgG1表达产率，在哺乳动物细胞中产生IgG1和细胞培养上清液中分泌的IgG1的ELISA检测之后得到；以及f)人IgG1牛血清稳定性，通过对在牛/鼠血清中孵育之后的未变性IgG进行ELISA检测得到。
实例6.1：用于功能表征的在噬菌体上展示的Fab池的产生
将实例5中合成、显示在表5中的抗体或抗体片段克隆到三顺反子Fab展示载体pJPd1（图9）中用于功能测试。产生含有这些主基因（20个VH）中的每一个与8个Vλ和12个Vκ进行组合的组合的Fab池，从而得到表6中所示的400个组合。
使用96孔皿小规模地制造包括以上基因对的噬菌体。通过用2xYT/CAM/TET/Gluc培养基填充每一孔并且用来自400个VH/VL组合的克隆接种来产生一个主皿，其中pMORPH30_Vκ3-11_AQA/VH3-23_TKA或pMORPH30_Vκ3-11_AYA/VH3-23_VLA（pMORPH30显示在图12中）被用作一种对照。将该皿在37℃在振荡的同时孵育过夜。将该主皿贮藏在一个最终浓度15%的甘油中，并且在-80℃冷冻。
使用2xYT/CAM/TET/Gluc作为培养基制造另外的96孔皿用于噬菌体产生，并且用来自上文所述的主皿的克隆接种。在37℃在以400rpm振荡的同时孵育这些皿约2-4小时，直到达到约0.5的OD600nm。
每个孔用5μl辅助噬菌体（超级噬菌体（Hyperphage）；培罗成（PROGEN）；1×1012pfu/ml）感染这些皿。在37℃在不振荡下孵育这些皿45分钟，并且然后在以400rpm振荡的同时孵育60分钟。在4℃以2200g旋转减慢细菌5分钟。
丢弃含有辅助噬菌体的上清液，并且用不具有葡萄糖的2xYT/Cam/TET/Kan/IPTG将被感染的大肠杆菌球粒再悬浮。将再悬浮的球粒转移到用2xYT/Cam/TET/Kan/IPTG预填充的一个新的96深孔皿中。在22℃在振荡的同时孵育这些皿过夜。通过旋转减慢并且丢弃大肠杆菌细胞和碎片来收集含有噬菌体的上清液。
实例6.2：使用ELISA评估Fab噬菌体展示评级
将如实例6.1中所描述制备的噬菌体上清液用于在噬菌体ELISA中进行Fab噬菌体展示评级。在一个噬菌体ELISA中使用两种不同捕获抗体评估Fab片段的展示：
(1)经由主要外壳蛋白g8p使用抗M13抗体（安玛西亚公司，（Amersham）编号27-9420-01）来捕获噬菌体颗粒；因此，可以确定噬菌体滴度。
(2)使用一种抗Fd抗体（结合位点公司（The Binding Site）编号PC075），它结合到所展示的Fab；因此，仅捕获了包括这些主基因的噬菌体展示Fab。
通过对于抗M13抗体来说以7.5μg/ml浓度并且对于抗Fd抗体来说以1.0μg/ml浓度分配100μl抗体溶液到不同孔中来将各自的捕获抗体固定在黑色96孔MaxisorpTM皿上，用层压的箔密封皿，并且在4℃孵育过夜。第二天，用TBST洗涤这些皿两次，并且在室温用300μlCTBST封闭每一孔1小时。
如下转移这些噬菌体上清液和参考样品两者用于检测。用TBST洗涤这些被封闭的ELISA皿两次。将100μl于CTBST中经过适当稀释的噬菌体上清液从这些稀释皿转移到被涂布的ELISA皿，在室温孵育1-2小时，并且用TBST洗涤5次。每孔加入100μl以1:5000稀释于CTBST中的抗M13过氧化酶结合物（安玛西亚公司），并且在室温孵育1-2小时。通过将1份（例如0.5ml）过氧化物溶液与9份（例如4.5ml）底物溶液混合，并且将其平衡到室温持续至少30分钟来制备Quanta Blu（皮尔斯（Pierce））工作溶液。用TBST洗涤这些ELISA皿5次，每孔加入100μl QuantaBlu工作溶液。在约2分钟的孵育时间（激发：320nm，发射：430nm）和接着5分钟的时间间隔之后测量荧光。
如下完成对ELISA数据的评估：通过使用HuCAL GOLD参考噬菌体制剂（VH3κ+λ）来形成校准曲线，并且计算噬菌体上清液和对照的滴度。对于每一样品来说，将抗Fd的滴度除以抗M13（抗pVIII）的滴度，所得比率是相对展示率。表12显示了400个种系蛋白对中大多数的相对展示率。
实例6.3：对400个VH/VL组合进行筛选ELISA以确定大肠杆菌溶菌产物中的Fab表
达产率
主皿（MP）通过以下进行接种：将由在Fab表达载体pJPx1（显示在图10中）中的VH/VL组合的池转化的克隆挑选到每孔2YT/Cam/1%Gluc培养基中。在37℃在振荡的同时孵育这些皿过夜。表达皿（EP）通过以下进行接种：让来自MP的2.5μl培养物进入每孔的2YT/Cam/0.1%葡萄糖中。从甘油储备液接种对照（参见表8）。在37℃和振荡下孵育这些皿6小时，然后通过添加IPTG诱导Fab表达，并且在22℃在振荡的同时孵育过夜。通过添加硼酸/EDTA/溶菌酶缓冲液到EP中（在22℃、振荡下孵育1小时）来制造大肠杆菌细胞溶菌产物，并且接着用12.5%MPBST封闭细菌溶菌产物，在室温振荡至少30分钟。将来自表达皿的大肠杆菌溶菌产物适当稀释于0.5%MPBS中，并且用于以下分析中。
表7显示了所使用的未标记的涂布抗体和AP标记的检测抗体。
表7：
表8描述了所使用的对照。
表8：
| 编号 | 构建体名称 |
| 3 | pMx11_FH VH1-69VLA_VI1-40AYA |
| 5 | pMx11_FH VH3-23VLA_Vκ3-11AYA |
| 空BEL | pMx9_AP填充子_FH克隆l（不含有Fab分子！） |
筛选ELISA包括以下步骤：用稀释于PBS中的抗人类IgG Fd特异性抗体涂布384孔MaxiSorp皿，并且在4℃孵育过夜。第二天，用PBST洗涤这些皿2次，并且通过添加（含5%Milkpowder的PBS）到每一孔中来封闭，并且在室温在振荡的同时孵育1-2小时。然后再次用PBST洗涤这些皿，并且添加稀释于0.5%MPBS中的预封闭的大肠杆菌溶菌产物，并且在室温在振荡的同时孵育1小时。还加入对照3号和5号。然后用PBST洗涤这些皿，并且将AP标记的检测抗体稀释于0.5%MPBS中。添加稀释的检测抗体，并且然后在室温在温和振荡的同时孵育1小时。通过下述来鉴别信号：用TBST洗涤这些孔，并且添加20μl AttoPhos（1:5稀释于ddH2O中），并且使用帝肯（Tecan）（infiniTe F200）、程序PrimeScreen在5分钟和7-8分钟时进行读数。
通过用各自的VH/VL对的ELISA信号除以参考Fab pMx11_FH VH1-69VLA_VI1-40AYA的ELISA信号来计算相对Fab表达产率。从而，同样高的ELISA信号导致相对Fab表达产率是1。参考Fab表达于pMORPHX11质粒（显示在图11中）中，包括a)包括C末端NheI限制位点的被修饰的phoA重链信号序列；b)包括C末端NdeI限制位点的被修饰的ompA轻链信号序列；c)如图6A中所示的VH1-69*01种系基因的可变重种系蛋白序列；d)如图8A中所示的IGLV1-40种系基因的可变轻种系蛋白序列；e)结合hu4D5-8抗体的CDR-H3（WGGDGFYAMDY）（SEQ IDNO:1）与重链FR4的JH4种系蛋白序列；f)结合CDR-L3区（QSYDSSLSGVV）（SEQ ID NO:3）与轻链FR4的JI2/3种系蛋白序列。hu4D5-8描述于卡特P.（Carter P.）等人(1992)“人类癌症疗法的抗p185Her2抗体的人类化（Humanization of an anti-p185Her2antibody for humancancer therapy）”美国国家科学院院刊（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）89,4285-4289）和埃沃特S.等人,分子生物学杂志(2003)325,531-553中。所有基因都由基因技术公司（德国雷根斯堡）产生。结果显示在表12中。
实例6.4：对400个VH/VL组合进行筛选ELISA以确定BEL溶菌产物中Fab的温度稳定
性
如实例6.3中一样产生表达皿。将来自表达皿的稀释的大肠杆菌溶菌产物在不同温度孵育45分钟并且用于以下分析中。表9显示了所使用的未标记的涂布抗体和AP标记的检测抗体。
表9：
该筛选ELISA包括以下步骤：用稀释于PBS中的涂布抗体（参见上表）涂布384孔MaxiSorp皿。在4℃孵育这些皿过夜。第二天，用PBST洗涤这些皿，并且通过添加5%MPBS到每一孔中来封闭，并且在室温在振荡的同时孵育1-2小时。然后将来自这些表达皿的稀释的大肠杆菌溶菌产物分布到四个96孔PCR皿（每个约40μl）中，并且在PCR循环仪中暴露于不同温度（4℃（在冰上）、60℃、70℃、80℃并且然后在冰上），每一温度持续45分钟。用PBST洗涤封闭的384孔皿，然后添加预孵育的Fab溶菌产物到这些皿中。然后在室温在振荡的同时孵育这些皿1小时。用PBST洗涤这些皿，将AP标记的检测抗体稀释于0.5%MPBS中。每孔添加20μl稀释的检测抗体，并且在室温在温和振荡的同时孵育1小时。通过下述来鉴别信号：用TBST洗涤这些孔，并且添加AttoPhos（1:5稀释于ddH2O中）到所有孔中。使用帝肯（infiniTeF200）、程序PrimeScreen在不同时间点（5分钟到10分钟）读取信号。结果显示在表12中。
实例6.5：对400个VH/VL组合进行筛选ELISA以确定大肠杆菌溶菌产物中Fab的血
清稳定性
如实例6.3中一样产生表达皿。使用以下步骤将含有Fab的大肠杆菌溶菌产物在牛和小鼠血清中稀释并且孵育：将来自这些表达皿的大肠杆菌溶菌产物稀释于50%血清（100μl总体积）中，添加1:1000Cam以防止细菌生长，并且将这些溶菌产物分到两个96孔皿中，并且冷冻这两个皿。将该第一皿解冻并且在37℃孵育12-13天。将该第二皿贮藏在-80℃直到执行ELISA（在37℃孵育0天）。
表10显示了所使用的未标记的涂布抗体和AP标记的检测抗体。
表10：
在第11或12天，用20μl稀释于PBS中的涂布抗体涂布384孔MaxiSorp皿。在4℃孵育这些皿过夜。第二天，用PBST洗涤这些皿，并且通过添加5%MPBS到每一孔中来封闭，并且在室温在振荡的同时孵育1-2小时。然后用PBST洗涤这些封闭的384孔皿。将来自-80℃和37℃样品的于血清中的大肠杆菌溶菌产物转移到被涂布的ELISA皿中，并且在室温在振荡的同时孵育1小时。用PBST洗涤这些皿，并且将AP标记的检测抗体稀释于0.5%MPBS中。添加AP标记的检测抗体，并且在室温在振荡的同时孵育该皿1小时。通过下述来鉴别信号：用TBST洗涤这些孔，并且添加AttoPhos（1:5稀释于ddH2O中）到所有孔中。使用帝肯（infiniTeF200）、程序PrimeScreen在不同时间点（5分钟到10分钟）读取信号。牛血清稳定性测试的结果显示在图19中。小鼠血清稳定性测试的结果显示在表12中。
实例7：用于评估生物物理学特性的人类IgG1的产生
为了产生400个IgG1种系蛋白对，将这20个可变区重链基因亚克隆到图13中所示的人类IgG1表达载体pJP_hIgG1f中。同时，将这12个可变区κ基因亚克隆到图14中所示的哺乳动物κ轻链表达载体pJP_hIgκ中，并且将这8个可变区λ基因亚克隆到图15中所示的哺乳动物λ轻链表达载体pJP_hIgλ2中。
通过共转染每一者，可以通过仅克隆40种表达构建体来分别地产生所有400个VH/VL对的重链和轻链表达质粒。因此，用所有20种重链构建体和所有20种轻链表达构建体共转染HEK.EBNA细胞。转染后若干天从细胞培养上清液收集或检测人类IgG1。
实例7.1：IgG1表达评级
对有待要包括在一个集合中的VH/VL配对的选择标准之一是IgG1形式的400个不同VH/VL对的表达水平。通过夹心ELISA来评估人类IgG1形式的每一VH/VL配对的表达水平。
因此，用人类IgG1形式的所有400个VH/VL组合转染HEK.EBNA细胞，并且小规模地表达。几天之后收集细胞培养上清液，并且评估IgG水平。
执行以下程序。用在PBS中2.5μg/ml的Fcγ-泛R10Z8E9（Fcγ-pan R10Z8E9）小鼠抗人类IgG以涂布384孔MaxiSorpTM皿。在4℃孵育这些皿过夜。用PBST洗涤这些皿。用含5%BSA或1×Chemiblocker的PBST封闭这些皿，并且在室温在振荡的同时孵育1小时，并且再次用PBST洗涤。将IgG表达上清液稀释于2.5%BSA-PBST中，并且将稀释的样品添加到经过封闭并且洗涤的ELISA皿中。使用以下对照：空上清液和具有一种低表达抗体、中度表达抗体以及高表达抗体的上清液。在室温在振荡的同时孵育这些皿2小时。然后用TBST洗涤这些皿。添加适当地稀释于1%BSA-TBST中的Fcγ泛R10Z8E9小鼠抗人类IgG生物素结合物。在室温孵育这些皿1小时。用TBST洗涤这些皿。添加1:2000稀释于0.5%BSA-TBST中的抗生蛋白链菌素-AP，并且在室温在振荡的同时孵育这些皿1小时。用TBST洗涤这些皿。添加在使用之前直接稀释于TBST中的AttoPhosTM荧光底物（根据制造商的说明书制备的）。5和10分钟之后，经由帝肯微皿读取器测量荧光。
通过用各自的VH/VL对的ELISA信号除以参考IgG1MOR03080（显示在表11中）的ELISA信号来计算相对IgG1表达产率。从而，同样高的ELISA信号导致相对IgG1表达产率水平是1。
表11
MOR03080的氨基酸序列如下：
03080可变重链，其中CDR是粗体：
(1)
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVSN
(51)
IYSDGSNTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNM
(101)YRWPFHYFFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:61)
03080可变轻链，其中CDR是粗体：
(1)DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDNIGNKYVSWYQQKPGQAPVVVIYGD
(51)NNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCSSYDSSYFVFGGG
(101)TKLTVLGQ(SEQ ID NO:62)
结果显示在表12中。Fc部分的序列显示在图48、50-51中。
实例7.2：IgG1血清稳定性评级
对有待要包括在一个集合中的可变重和可变轻链对的选择标准之一是IgG1形式的400个不同可变重链和可变轻链配对的血清稳定性。通过在50%小鼠血清中孵育14天，并且用小鼠抗人类IgG（CH2）克隆R10Z8E9进行后续夹心ELISA，来评估每一IgG抗体上清液的血清稳定性。再次将人类IgG1形式的所有400个VH/VL组合转染到HEK.EBNA细胞中，并且小规模地表达。几天之后收集细胞培养上清液，并且测试上清液中IgG的血清稳定性。
执行以下程序。用在PBS中2.5μg/ml的Fcγ泛R10Z8E9小鼠抗人类IgG涂布384孔MaxiSorpTM皿。在4℃孵育这些皿过夜。用PBST洗涤这些皿，并且然后用5%BSA-PBST或1×Chemiblocker来封闭，在室温在振荡的同时持续1小时。用PBST洗涤这些皿。将含有IgG1的细胞培养上清液稀释a)于2.5%BSA-PBST中；和b)于50%小鼠血清中，并且在37℃孵育至少14天，并且将这些样品添加到经过封闭并且洗涤的ELISA皿中。使用以下对照：空上清液和具有一种低表达抗体、中度表达抗体以及高表达抗体的上清液。在室温在振荡的同时孵育这些皿2小时。用TBST洗涤这些皿。添加于1%BSA-TBST中稀释到0.8μg/ml的Fcγ泛R10Z8E9小鼠抗人类IgG生物素结合物。在室温孵育这些皿1小时。用TBST洗涤这些皿。添加1:2000稀释于0.5%BSA-TBST中的抗生蛋白链菌素-AP。在室温在振荡的同时孵育这些皿1小时。用TBST洗涤这些皿。添加在使用之前直接1:5稀释于TBST中的AttoPhosTM荧光底物（根据制造商的说明书制备的）。5和10分钟之后，经由帝肯微皿读取器测量荧光。结果显示在表12中。
实例8：具有有利生物物理学特性的用于结合到集合中的VH/VL对的选择
一旦测试400个种系蛋白对的以下特性：a)Fab形式的相对展示，在噬菌体产生和噬菌体ELISA之后得到；b)相对Fab表达产率，在大肠杆菌中产生Fab，大肠杆菌细胞裂解和所产生的Fab的ELISA检测之后得到；c)Fab热稳定性，在大肠杆菌中产生Fab，大肠杆菌细胞裂解和在提高温度孵育后的未变性Fab的ELISA检测之后得到；d)大肠杆菌溶菌产物中Fab的牛/鼠血清稳定性，通过对在牛/鼠血清中孵育之后的未变性Fab进行ELISA检测得到；e)相对人IgG1表达产率，在哺乳动物细胞中产生IgG1和细胞培养上清液中分泌的IgG1的ELISA检测之后得到；以及f)人IgG1牛血清稳定性，通过对在牛/鼠血清中孵育之后的未变性IgG1进行ELISA检测得到；然后下一步骤是选择哪些VH/VL种系对将被结合到该集合中。每一VH/VL种系蛋白对的功能测试的结果显示在表12中。
表12：400个种系蛋白对中的每一个的功能数据的汇集
表12说明：
对于相对Fab展示、相对Fab表达以及相对IgG1表达来说，这些值示出了与一种对照相比的水平。越高的数目指示了越高的水平。
对于Fab热稳定性来说，数目60和70指示了在所测试的条件下在60℃或70℃稳定45分钟的VH/VL对。数目4指示了温度不稳定对并且bg（背景）指示了低表达水平。
对于Fab在小鼠血清中的稳定性、Fab在牛血清中的稳定性以及IgG1在牛血清中的稳定性来说，在所测试的条件下，S表示稳定，U表示不稳定，并且bg表示背景。
如前述实例中所描述，从人类免疫组库鉴别主要VH和VL种系基因和主要VH/VL种系基因对，然后计算机模拟分析主要VH和VL种系蛋白序列，以便鉴别并且选择具有有利生物物理学特性的可变重链和可变轻链种系蛋白序列。如表5和图2-3中所示，一般来说，选择前20个VH、前8个Vλ以及前12个Vκ用于合成、组合以及后续功能分析。合成种系基因序列，并且然后将其组合，以便产生400个种系蛋白对，这些对代表了人类免疫组库中表达的丰富种系基因对。测试400个VH/VL种系蛋白对的以下特性：a)Fab形式的相对展示，在噬菌体产生和噬菌体ELISA之后得到；b)相对Fab表达产率，在大肠杆菌中产生Fab，大肠杆菌细胞裂解和所产生的Fab的ELISA检测之后得到；c)Fab热稳定性，在大肠杆菌中产生Fab，大肠杆菌细胞裂解和在提高温度孵育后的未变性Fab的ELISA检测之后得到；d)大肠杆菌溶菌产物中Fab的牛/鼠血清稳定性，通过对在牛/鼠血清中孵育之后的未变性Fab进行ELISA检测得到；e)相对人IgG1表达产率，在哺乳动物细胞中产生IgG1和细胞培养上清液中分泌的IgG1的ELISA检测之后得到；以及f)人IgG1牛血清稳定性，通过对在牛/鼠血清中孵育之后的未变性IgG1进行ELISA检测得到。
使用表12中所提供的数据，本领域的技术人员可以容易鉴别具有有利生物物理学特性的种系蛋白对。
一般来说，选择在每一功能特性上具有一个阈值的种系蛋白对用于结合到集合中。例如，在一些实施例中，选择包括所有以下特性的种系蛋白对用于结合到一个集合中：i)Fab形式的相对展示率包括所取样的Fab的前75%内的一个值；ii)与Fab VH1-69VLA_VI1-40AYA相比，Fab形式的表达产率至少0.4；iii)Fab形式在60℃或更高温度的热稳定性持续至少45分钟；iv)Fab形式在37℃在牛或小鼠血清中的稳定性持续大于十天；v)与MOR03080相比IgG形式的表达产率是至少0.4；以及vi)IgG形式在37℃在血清中稳定性持续十四天。表32以粗体和加下划线显示了包括所有这些功能特性的种系蛋白对。
然而，如上文所描述，可以选择具有一种或多种这些功能特性的种系蛋白对用于结合到集合中。此处，形成所测试的400个种系蛋白对的一个累积评级，以使得可以针对所测试的功能特性中的每一种的另一所给权重来将每一种系蛋白对评级。这使得诸位发明人可以选择具有一种或多种或所有所列举的功能特性的一个或多个种系蛋白对。在一些实施例中，这些集合包括了具有以上特征的所有种系蛋白对。在一些实施例中，该集合包括了具有所测试的400对的最高累积得分的种系蛋白对。在一些实施例中，选择具有所测试的400对的前10%、前20%或前30%内的累积得分的种系蛋白对用于结合到集合中。
实例9：进一步测试约100种VH/VL对
在以上所测试的400个种系蛋白对（结果显示在表12中）中，选择95个用于进一步测试。对400个种系蛋白对的展示、表达产率、热和血清稳定性的前述测试充当了一种初步过滤，以将不具有被认为有利于治疗研发的特征的种系蛋白对去除。目的是选择具有有利可研发性特征的种系蛋白对的一个子集，而同时在一个集合内维持一种高多样性水平，以使得该集合可以用来鉴别针对任何抗原的可研发候选者。
表12显示了满足本披露的一个实施例的阈值的约60种粗体并且加下划线的种系蛋白对。在被选择用于进一步测试的95个种系蛋白对中，选择一些是因为它们满足了前述标准，并且希望的是对其进行进一步测试。选择其他（尽管不符合某些阈值）以使得可以对这些对进行再评估。再者，本披露的目的之一是提供一个多样性集合，它能够用来鉴别针对任何抗原的抗体或片段。如实例5中所描述来合成图16-24中所示的95个种系蛋白对。Fab和IgG1形式的合成并且表达之后，进一步测试以Fab和IgG1形式两者的95个种系蛋白对的以下：a)纯化的Fab表达产率，以mg/L（表达培养物）为单位；b)纯化的Fab单体含量（单体%）；c)纯化的Fab热稳定性，以℃为单位；d)纯化的IgG1表达产率，以mg/L（细胞培养物）为单位；e)纯化的IgG1单体含量（单体%）；f)纯化的IgG1热稳定性，以℃为单位；g)IgG1等电点；以及h)在暴露于酸的情况下的IgG应力测试，包括差示扫描荧光测定法（DSF）、吸收、动态光散射以及颗粒染色。
实例9.1纯化的Fab测试
将代表被选择用于进一步测试的95个种系蛋白对中的每一个的Fab片段表达在大肠杆菌中，并且进行纯化。在补充有0.1%葡萄糖和氯霉素的2xYT培养基的500ml培养物中进行Fab片段在大肠杆菌TG-1F细胞中的表达。振荡培养物直到OD600nm达到0.5。通过添加IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）并且进一步培养过夜来诱导Fab表达。收集细胞，并且使用溶菌酶进行破坏。经由IMAC（伯乐公司（Bio-Rad），德国慕尼黑（Munich,Germany））分离加了His6标签（SEQ ID NO:203）的Fab片段，并且使用咪唑来洗脱。使用PD10柱（GE医疗公司，慕尼黑（Munich），德国）执行将缓冲液交换成1×杜尔贝科氏（Dulbecco's）PBS（pH7.2，英杰公司（Invitrogen），达姆施塔特（Darmstadt），德国））。无菌过滤（0.2μm）样品。
实例9.1.1纯化的Fab表达产率确定
通过紫外分光光度法（Nanodrop，peqlab公司，埃朗根，德国）来确定代表了这95个种系蛋白对中的每一个的纯化的Fab片段的蛋白浓度。所使用的消光系数是1.538mL/mg并且在280nm测量吸收度。结果显示在图16-18中。
实例9.1.2纯化的Fab热稳定性确定
通过差示扫描荧光测定法（DSF）来确定代表了这95个种系蛋白对中的每一个的纯化的Fab片段的热稳定性。差示扫描荧光测定法（DSF）是一种基于荧光染料的技术，它监测一种所关注的蛋白的热去折叠（熔点）。在一个温度斜坡上监测与该去折叠蛋白的疏水性氨基酸侧链相互作用的一种疏水性染料的荧光变化。
使用以下材料：宝石橙（Sypro Orange）荧光染料（西格马公司，编号S5692）；iCycler iQ PCR皿，96孔（伯乐公司，编号2239441）；微玺B粘着密封物（Microseal BAdhesive Sealer）（伯乐公司，编号MSB-1001）；96孔光学垫（伯乐公司，编号ADR3296）；iCycler iQ5热循环仪（伯乐公司）；以及Gibco D-PBS，pH7.4（英杰公司，佩斯利，美国）。
将稀释的宝石橙添加到一个96孔iCycler iQ PCR皿的每一孔中，并且在至少0.1mg/ml的最终浓度下测试这些样品。使用iCycler iQ5热循环仪（伯乐公司）来测试。以60℃/h的加热速率将温度从20℃扫描到95℃，并且通过分析荧光过渡的中点来计算去折叠温度。这些结果显示在图16-18中的纯化的Fab Thermafluor栏。
实例9.1.3通过尺寸排阻色谱法分离纯化的Fab
通过尺寸排阻色谱法（SEC）来确定代表了95个种系蛋白对中的每一个的纯化的Fab片段的单体含量（单体%）。在一个纯化***（欧洲GE医疗有限公司（GEHealthcare Europe GmbH），弗莱堡（Freiburg），德国））上执行SEC。为了分离，使用Superdex75HR10/30柱（欧洲GE医疗有限公司，弗莱堡，德国）。对于每一样品来说，将10μl蛋白装载在柱上，以0.05ml/min的流速执行分离，并且记录，在260和280nm分析紫外吸收。运行缓冲液由Gibco D-PBS，pH7.4（英杰公司，佩斯利，美国）构成。结果显示在图16-18中。
实例9.2IgG1表达和纯化
在HKB11细胞中表达代表了被选择用于进一步测试的95个种系蛋白对中的每一个的IgG1。用一种1:1比率的IgG重链与轻链表达载体DNA转染真核HKB11细胞。在转染后第3到4天收集细胞培养上清液，并且使其进行蛋白A亲和色谱法（MabSelect SURE，GE医疗公司，慕尼黑，德国）。用1×杜尔贝科氏PBS（pH7.2，英杰公司，达姆施塔特，德国）执行缓冲液交换，并且无菌过滤（0.2μm孔隙尺寸）样品。
实例9.2.1纯化的IgG1表达产率确定
通过紫外分光光度法（Nanodrop，peqlab公司，埃朗根，德国）来确定代表了95个种系蛋白对中的每一个的纯化的IgG1的蛋白浓度。所使用的消光系数是1.369mL/mg，并且在280nm测量吸收度。结果显示在图16-18中。
实例9.2.2纯化的IgG1热稳定性确定
如方法9.1.2中所描述通过差示扫描荧光测定法（DSF）来确定纯化的IgG1的IgG1热稳定性。对于每一IgG所示的值代表了在该IgG的可变区内发生的去折叠事件。代表了Fc部分的去折叠的值未示出，这是由于它们对于每一人类IgG1来说一般相同。结果显示在图16-18中。
实例9.2.3通过尺寸排阻色谱法分离纯化的IgG1
通过尺寸排阻色谱法（SEC）来确定代表了95个种系蛋白对中的每一个的纯化的IgG1的单体含量（单体%）。使用戴安（Dionex）UltiMate3000钛HPLC***（戴安公司（DionexCorporation），格梅尔林（Germering），德国））结合怀亚特（Wyatt）miniDAWN Treos和怀亚特Optilab rEX（欧洲怀亚特技术公司（Wyatt Technology Europe），达恩巴赫（Dernbach），德国））执行HP-SEC。对于分离，使用东曹（Tosoh）TSK-Gel G3000SWxl柱（东曹生物科学公司（Tosoh Bioscience），斯图加特（Stuttgart），德国））。对于每一样品来说，将15μg蛋白装载在柱上，以0.5ml/min的流速执行分离，并且记录，在280nm分析紫外吸收。运行缓冲液由Gibco D-PBS，pH7.4（英杰公司，佩斯利，美国）构成。结果显示在图16-18中。
实例9.2.4纯化的IgG1等电点（pI）计算
计算IgG1形式的每一个系蛋白对的等电点。
本领域的技术人员已知测定一种蛋白的pI的方法。例如，可以使用以下工具：http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html；Vector NTI（英杰公司，卡尔斯巴德（Carlsbad），加利福尼亚州））。结果显示在图16-18中。
实例9.2.5在暴露于酸的情况下的纯化的IgG1的应力测试
由于在化学、制造以及控制（CMC）的下游处理（DSP）期间病毒失活步骤是标准的，因此通过降低pH并且记录每一IgG1的累积敏感性数据来测试这95个种系蛋白对经得起酸的能力。将每一种系蛋白对以2mg/mL的浓度递送到96深孔皿形式中。将150μL的每一者转移到96孔皿中。通过吸收、动态光散射（DLS）、差示扫描荧光测定法（DSF）测量以及颗粒染色来执行初始表征。使用1.8μL1M柠檬酸盐pH2.3将样品酸化。2.5小时之后使用1M Tris pH9.0将样品中和。
实例9.2.5(a)纯化的IgG1差示扫描荧光测定法
为了评估代表了被选择用于进一步测试的95个种系蛋白对中的每一个的IgG1暴露于酸之前与之后的热稳定性，如实例9.1.2中所描述执行差示扫描荧光测定法（DSF）。对于每一IgG所示的值代表了在该IgG的可变区内发生的去折叠事件。代表了Fc部分的去折叠的值未示出，这是由于它们对于每一IgG来说一般相同。如果暴露于酸之前与之后的Tm（表观熔点）值相等，那么该抗体的分子结构不受该酸影响或在暴露之后能够有效再折叠。结果显示在图19、21以及23中。
实例9.2.5(b)纯化的IgG1紫外/可见光吸收
为了鉴别聚集样品，在320nm记录浊度。对代表了被选择用于进一步测试的95个种系蛋白对中的每一个的IgG溶液在酸暴露之前与之后的浊度进行评估。结果显示在图19、21以及23中。基线吸收是透明溶液所预期的0.035消光单位。吸收增加是由导致增加吸收的光散射引起。超过0.039的值可能包含聚集体。超过0.045的值指示了明显存在聚集体。超过0.06的值代表了对于具有非常不利的稳定性的分子所发现的临界聚集水平。
实例9.2.5(c)纯化的IgG1动态光散射
另外，对代表了所选择的95个种系蛋白对的每一IgG1执行动态光散射（DLS）。动态光散射（DLS）是评估溶液中颗粒的水力半径的一种光谱方法。使用一个DynaPro Titan试管***（欧洲怀亚特技术公司，达恩巴赫，德国）执行所有DLS实验。
在应力测试之后可见颗粒污染的情况下，对IgG进行离心以便去除大聚集体。图20、22以及24显示了在酸处理之前与之后制剂中所见的表观颗粒半径和对应于单体IgG1的多分散性。根据累积量分析的所计算的半径来评估数据。除了水力半径之外，评估制剂的多分散性%。多分散性的增加（>15%）指示了IgG分子的潜在聚集，从而导致不均匀粒度分布。来自IgG的可明显识别的高分子量（HMW）颗粒（半径>3倍）未列举在表中。所有DLS结果都显示在图20、22以及24中。
实例9.2.5(d)纯化的IgG1颗粒染色
为了评估可见聚集体的量和形态，在酸暴露之前与之后对代表了所选择的95个种系蛋白对的每一IgG1执行颗粒染色。使用以下试剂来对IgG制剂中的颗粒进行过滤和染色：Ultrafree-CL0.22μm无菌过滤器（密理博公司（Millipore），编号UFC40GV0S）；抗人类λ轻链，AP结合的（西格马公司，编号A-2904）；AP结合物的显影剂，快速BCIP/NBT（西格马公司，编号B-5655）；（罗斯公司（Roth），编号T144.1）；碱性磷酸酯酶终止溶液（西格马公司，编号A5852-100ML）；TBS:0.05M Tris；0.15M NaCl；具有0.1%吐温（Tween）20的TBS；以及5M NaCl溶液。
经由一个0.22μm过滤器过滤蛋白溶液，并且接着使用小鼠抗人类Fab2碱性磷酸酯酶结合的抗体和一种免疫印迹显影剂将剩余抗体聚集体染色。根据制造商的手册执行分析。接着通过目测在1-4的范围内将样品分类，其中类别1代表非常低的颗粒含量并且类别4代表制剂的高颗粒负荷。所有颗粒染色结果都显示在图20、22以及24中。
实例9.2.6纯化的IgG1的使用搅拌的应力测试
抗体或抗体片段抵抗剪力的能力是一种有用的标准，这是由于在处理期间无法避免过滤步骤。因此，在一个深孔皿中使用玻璃珠测试IgG1形式的95个种系蛋白对，该玻璃珠在一个96孔皿中加速，该96孔皿在一个以550rpm的定轨振荡器上。使350μl的每一IgG经受这一处理。将150μL的每一者转移到一个96孔皿中。通过吸收、动态光散射（DLS）、差示扫描荧光测定法（DSF）测量以及颗粒染色来执行初始表征。
实例9.2.6(a)纯化的IgG1的紫外/可见光吸收
为了鉴别聚集样品，在320nm记录浊度。对代表了被选择用于进一步测试的95个种系蛋白对中的每一个的IgG溶液在应力暴露之前与之后的浊度进行评估。结果显示在图49、51以及53中。基线吸收是透明溶液所预期的0.035消光单位。吸收增加由导致增加吸收的光散射引起。超过0.039的值可能包含聚集体。超过0.045的值指示了明显存在聚集体。发现超过0.06的值是对于具有非常不利的稳定性的分子所发现的临界聚集水平。
实例9.2.6(b)纯化的IgG1差示扫描荧光测定法
为了评估代表了被选择用于进一步测试的95个种系蛋白对中的每一个的IgG1暴露于酸之前和之后的热稳定性，如实例9.1.2中所描述执行差示扫描荧光测定法（DSF）。对于每一IgG所示的值代表了在IgG的可变区内发生的去折叠事件。代表了Fc部分的去折叠的值未示出，这是由于它们对于每一人类IgG1来说一般相同。结果显示在图50、52以及54中。
实例9.2.6(c)纯化的IgG1动态光散射
另外，对代表了所选择的95个种系蛋白对的每一IgG1执行动态光散射（DLS）。动态光散射（DLS）是评估溶液中颗粒的水力半径的一种光谱方法。使用一个DynaPro Titan试管***（欧洲怀亚特技术公司，达恩巴赫，德国）执行所有DLS实验。
在应力测试之后可见颗粒污染的情况下，对IgG进行离心以便去除大聚集体。图50、52以及54显示了在应力处理之后制剂中所见的表观颗粒半径和对应于单体IgG1的多分散性。根据累积量分析的所计算的半径来评估数据。除了水力半径之外，评估制剂的多分散性%。多分散性的增加（>15%）指示了IgG分子的潜在聚集，从而导致不均匀粒度分布。来自IgG的可明显识别的高分子量（HMW）颗粒（半径>3倍）未列举在表中。所有DLS结果都显示在图50、52以及54中。
实例9.2.6(d)纯化的IgG1颗粒染色
为了评估可见聚集体的量和形态，在应力暴露之前与之后对代表了所选择的95个种系蛋白对的每一IgG1执行颗粒染色。使用以下试剂来对IgG制剂中的颗粒进行过滤和染色：Ultrafree-CL0.22μm无菌过滤器（密理博公司，编号UFC40GV0S）；抗人类λ轻链，AP结合的（西格马公司，编号A-2904）；AP结合物的显影剂，快速BCIP/NBT（西格马公司，编号B-5655）；（罗斯公司，编号T144.1）；碱性磷酸酯酶终止溶液（西格马公司，编号A5852-100ML）；TBS:0.05M Tris；0.15M NaCl；具有0.1%吐温20的TBS；以及5M NaCl溶液。
经由一个0.22μm过滤器过滤蛋白溶液，并且接着使用小鼠抗人类Fab2碱性磷酸酯酶结合的抗体和一种免疫印迹显影剂将剩余抗体聚集体染色。根据制造商的手册执行分析。接着通过目测在1-4的范围内将样品分类，其中类别1代表非常低的颗粒含量并且类别4代表制剂的高颗粒负荷。所有颗粒染色结果都显示在图50、52以及54中。
实例9.2.7IgG应力测试累计得分
为了帮助评估暴露于酸和用玻璃珠搅拌两者的应力测试结果，产生一种评分***以使得可以比较种系蛋白对。对实例9.2.5（a-d）中所获取的每一数据点、图19-24与实例9.2.6（a-d）中所示的结果、图49-54中所示的结果在0-100（0、25、75或100）的范围内给出一个得分，并且将这些得分加到一起以产生一个累计得分。不对实例9.2.5(a)和9.2.6(b)中所鉴别的热稳定性值给出得分。
图55和56显示了来自实例9.2.5-9.2.6的种系蛋白对1-32的应力测试得分。每一得分是图19、20、49以及50中所示的原始数据点的一个代表。图19-20显示了对酸暴露的反应，并且图49-50显示了对用玻璃珠搅拌的反应。图56显示了累计得分，它是图55和56中所示的每一得分的相加。
图57和58显示了来自实例9.2.5-9.2.6的种系蛋白对33-64的应力测试得分。每一得分是图21、22、51以及52中所示的原始数据点的一个代表。图21-22显示了对酸暴露的反应，并且图51-52显示了对用玻璃珠搅拌的反应。图58显示了累计得分，它是图57和58中所示的每一得分的相加。
图59和60显示了来自实例9.2.5-9.2.6的种系蛋白对65-95的应力测试得分。每一得分是图23、24、53以及54中所示的原始数据点的一个代表。图23-24显示了对酸暴露的反应，并且图53-54显示了对用玻璃珠搅拌的反应。图60显示了累计得分，它是图59和60中所示的每一得分的相加。
实例10：选择集合组成
总之，如实例4中所描述，选择400个种系蛋白对。这400个是存在于人类免疫组库中的种系蛋白对的多样性的一个代表。如实例6-7中所描述，测试这400个种系蛋白对。在这400个中，如实例9中所描述，进一步测试其中95个。
考虑以下因素对这95个种系蛋白对进行比较：a)Fab展示率；b)Fab表达产率；c)Fab热稳定性；d)Fab血清稳定性；e)Fab SEC单体含量（单体%）；f)IgG1表达产率；g)IgG1热稳定性；h)IgG1血清稳定性；i)IgG1SEC单体含量（单体%）；以及j)IgG1等电点（pI）。这些因素中的每一种的数据显示在图16-18中。这些因素与治疗性抗体的可研发性良好相关。
Fab展示率是选择针对一种抗原的抗体或片段的一个重要因素。高比率的Fab展示在选择后暴露于抗原的可能性更高。不同Fab中的每一种的高展示率确保了集合的完全多样性在选择后暴露于抗原。在实例6.2中鉴别Fab展示率，其中参考物是一个内标（HuCALGOLD参考噬菌体制剂（VH3κ+λ））。HuCAL GOLD VH3制剂是一种高展示型制剂。Fab展示率是一个重要因素并且用于将这400对减少到95用于进一步测试，但在一些实施例中，Fab展示率不被视为选择用于结合到集合中的种系蛋白对的一个决定因素。
Fab和IgG1两者的表达产率是重要的，这是由于针对一种抗原所选择的抗体或片段首先必须通常体外或体内进行测试以确定功能活性，然后在有毒物种以及最终人类中进行测试用于临床试验。非常重要的是，针对一种抗原所选择的抗体或片段可以按足够高的量有效表达以支持治疗研发以及供应临床试验和市场所需要的所有不同测试。在实例9.1.1中鉴别纯化的Fab的表达产率（mg纯化的Fab/L表达培养物）（结果显示在图16-18中），并且在本披露的一个实施例中，选择至少2.5mg/L的一个阈值。在其他实施例中，选择其他阈值。在实例9.2.1中鉴别纯化的IgG1的表达产率（mg纯化的IgG1/L细胞培养物）（结果显示在图16-18中），并且在本披露的一个实施例中，选择至少30.0mg/L的一个阈值。在其他实施例中，选择其他阈值。
热稳定性是一个重要因素，这是由于蛋白（如抗体）对高温敏感，因此，能够经得起为了将治疗剂分配到世界各地并且具有长存放期所需要的与贮藏和运输有关的要求的抗体是必需的。在实例9.1.2中确定纯化的Fab的热稳定性（结果显示在图16-18中），并且在本披露的一个实施例中，选择至少70℃的一个阈值。在其他实施例中，选择其他阈值。在实例9.2.2中确定纯化的IgG1的热稳定性（结果显示在图16-18中），所列举的值代表了可变结构域的去稳定化，并且在一个实施例中，选择至少73℃的一个阈值。在其他实施例中，选择其他阈值。
血清稳定性是治疗性抗体的一个重要因素，这是由于治疗性蛋白尽管暴露于人类血清中存在的血清蛋白酶还必须维持功效和功能构象。通过实例6.5和7.2中所述的方法确定种系蛋白对的血清稳定性。血清稳定性是重要的，但不被视为选择种系蛋白对的一个决定因素，这是由于分析在少数情况下倾向于产生假阴性结果。
如通过尺寸排阻色谱法（SEC）确定的单体含量（单体%）是一个重要因素，这是由于其与聚集倾向良好相关。聚集是治疗性蛋白研发中的一个常见问题，它导致蛋白治疗剂失活、不均匀以及生产损失。通过实例9.1.3和9.2.3中所述的方法来确定如通过尺寸排阻色谱法（SEC）确定的纯化的Fab和纯化的IgG1形式两者的单体含量（单体%）（结果显示在图16-18中）。在实例9.1.3中确定纯化的Fab的单体含量（单体%），并且在一个实施例中，选择至少98%的一个阈值。在其他实施例中，选择其他阈值。在实例9.2.3中确定纯化的IgG1的单体含量（单体%），并且在一个实施例中，选择至少99%的一个阈值。在其他实施例中，选择其他阈值。
等电点（pI）预测了在某一pH的溶解性。当溶液的pH与一种给定蛋白的pI显著不同时，蛋白是可溶的。等电点是重要的，但在一些实施例中，不被视为选择种系蛋白对的一个决定因素。
在本披露的一个实施例中，如下选择每一标准的阈值：a)纯化的Fab表达产率（如实例9.1.1中所描述）是至少2.5mg/L；b)纯化的IgG1表达产率（如实例9.2.1中所描述）是至少30.0mg/L；c)纯化的Fab的热稳定性（如实例9.1.2中所描述）是至少70℃；d)纯化的IgG1的热稳定性（如实例9.2.2中所描述）是至少73℃；e)纯化的Fab的单体含量（如实例9.1.3中所描述）是至少98%；以及f)纯化的IgG1的单体含量（如实例9.2.3中所描述）是至少99%。以下种系蛋白对（54）被鉴别为具有这些与可研发性相关的优越功能活性，这是由于以下对中的每一个都具有与这些阈值（图16-24中所示的数据）相比相等或更好的值：VH1-18(SEQ IDNO:204)/VK1-39(SEQ ID NO:236)；VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK3-15(SEQ ID NO:238)；VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK3-20(SEQ ID NO:239)；VH1-46(SEQ ID NO:205)/VK3-15(SEQID NO:238)；VH1-46(SEQ ID NO:205)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH1-46(SEQ ID NO:205)/VL3-21(SEQ ID NO:257)；VH1-69*01(SEQ ID NO:206)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-12(SEQ ID NO:233)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-16(SEQ ID NO:234)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-27(SEQ ID NO:235)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-39(SEQ ID NO:236)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK3-15(SEQ ID NO:238)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-47(SEQ ID NO:251)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH3-11(SEQ ID NO:208)/VK1-05(SEQ ID NO:230)；VH3-11(SEQ ID NO:208)/VK1-39(SEQ ID NO:236)；VH3-11(SEQ ID NO:208)/VK3-15(SEQ ID NO:238)；VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-40(SEQ ID NO:250)；VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-47(SEQ ID NO:251)；VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL2-23(SEQ ID NO:255)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-05(SEQ ID NO:230)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-06(SEQ ID NO:231)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-12(SEQ ID NO:233)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-16(SEQ ID NO:234)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-27(SEQ ID NO:235)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK3-11(SEQ ID NO:237)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-40(SEQ ID NO:250)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-47(SEQ ID NO:251)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL2-14(SEQ ID NO:254)；VH3-21(SEQ ID NO:210)/VK1-12(SEQ ID NO:233)；VH3-21(SEQ ID NO:210)/VK1-27(SEQ ID NO:235)；VH3-21(SEQ ID NO:210)/VL2-11(SEQ ID NO:253)；VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK1-39(SEQ ID NO:236)；VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK3-15(SEQ ID NO:238)；VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL2-23(SEQ ID NO:255)；VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL3-1(SEQ ID NO:256)；VH3-30(SEQ ID NO:212)/VK3-20(SEQ ID NO:239)；VH3-53(SEQ ID NO:213)/VK3-15(SEQ ID NO:238)；VH3-53(SEQ ID NO:213)/VL2-11(SEQ ID NO:253)；VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-05(SEQ ID NO:230)；VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-06(SEQ ID NO:231)；VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-12(SEQ ID NO:233)；VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-27(SEQ ID NO:235)；VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK3-20(SEQ ID NO:239)；VH3-74(SEQ ID NO:214)VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH5-51(SEQ ID NO:215)/VK1-39(SEQ ID NO:236)；VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-40(SEQ ID NO:250)；VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK1-09(SEQ ID NO:232)；VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK3-15(SEQ ID NO:238)；VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK3-20(SEQ ID NO:239)；以及VH6-1(SEQ ID NO:216)/VL1-51(SEQ ID NO:252)。因此，包括任何数目的这些种系蛋白对的集合可以用来鉴别针对任何抗原的可研发抗体或其片段。
另外，基于对使用实例9.2.5（a-d）中所述的方法鉴别的应力测试数据、图19-24、实例9.2.6（a-d）中所示的数据、图49-54和实例9.2.7中所示的数据、图55-60中所示的得分的比较来选择种系蛋白对的一个子集。应力测试方法评估IgG1形式的95个种系蛋白对，以便确定其经得起暴露于酸和用玻璃珠搅拌的能力。在一个实施例中选择36个种系蛋白对，这是由于它们因显示出对酸和搅拌压力的强抵抗性而具有另外的与可研发性有关的优越功能特性。一种抗体经得起暴露于酸的能力是一个日益重要的因素，这是由于在化学、制造以及控制（CMC）的下游处理（DSP）期间病毒失活步骤是标准的。酸处理步骤使病毒将用于感染的病毒衣壳蛋白变性。然而，降低pH对每一种蛋白都具有去稳定化作用。在这个步骤期间不稳定抗体使天然结构变性并且松散。在病毒活化步骤中，在一段限定的时间之后，通过中和减缓酸处理，并且虽然病毒衣壳蛋白保持一种失活构象，但处理过的抗体理想地保留其天然结构。抗体或抗体片段抵抗剪力的能力是一个有用的标准，这是由于在处理期间无法避免过滤步骤。在一个实施例中所选择的这36个种系蛋白对满足了所有前述阈值功能活性并且另外得到了等于或超过1225的应力测试累计得分。在一个实施例中，如下选择每一标准的阈值：a）纯化的Fab表达产率（如实例9.1.1中所描述）是至少2.5mg/L；b）纯化的IgG1表达产率（如实例9.2.1中所描述）是至少30.0mg/L；c）纯化的Fab的热稳定性（如实例9.1.2中所描述）是至少70℃；d）纯化的IgG1的热稳定性（如实例9.2.2中所描述）是至少73℃；e）纯化的Fab（如实例9.1.3中所描述）的单体含量是至少98%；f）纯化的IgG1的单体含量（如实例9.2.3中所描述）是至少99%；以及g）应力测试累计得分（如实例9.2.7中所描述）是至少1225。因此，本披露的实施例包括包含完全功能种系蛋白对的一个子集（54个的36个）的集合，并且具有另外的与可研发性有关的优越功能特性。在这个实施例中，一个集合包括VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK3-20(SEQ ID NO:239)；VH1-46(SEQ ID NO:205)/VK3-15(SEQ IDNO:238)；VH1-46(SEQ ID NO:205)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH1-69*01(SEQ ID NO:206)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-12(SEQ ID NO:233)；VH3-07(SEQID NO:207)/VK1-27(SEQ ID NO:235)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK3-15(SEQ ID NO:238)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-47(SEQ ID NO:251)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-51(SEQID NO:252)；VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-40(SEQ ID NO:250)；VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-47(SEQ ID NO:251)；VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH3-11(SEQID NO:208)/VL2-23(SEQ ID NO:255)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-05(SEQ ID NO:230)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-06(SEQ ID NO:231)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-12(SEQID NO:233)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-27(SEQ ID NO:235)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK3-11(SEQ ID NO:237)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH3-21(SEQID NO:210)/VK1-12(SEQ ID NO:233)；VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK1-39(SEQ ID NO:236)；VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK3-15(SEQ ID NO:238)；VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL2-23(SEQID NO:255)；VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL3-1(SEQ ID NO:256)；VH3-53(SEQ ID NO:213)/VK3-15(SEQ ID NO:238)；VH3-53(SEQ ID NO:213)/VL2-11(SEQ ID NO:253)；VH3-74(SEQID NO:214)/VK1-05(SEQ ID NO:230)；VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-06(SEQ ID NO:231)；VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-12(SEQ ID NO:233)；VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK3-20(SEQID NO:239)；VH5-51(SEQ ID NO:215)/VK1-39(SEQ ID NO:236)；VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-40(SEQ ID NO:250)；VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH6-1(SEQID NO:216)/VK1-09(SEQ ID NO:232)；VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK3-20(SEQ ID NO:239)；以及VH6-1(SEQ ID NO:216)/VL1-51(SEQ ID NO:252)。
在另一实施例中，如下选择每一标准的阈值：a）纯化的Fab表达产率（如实例9.1.1中所描述）是至少2.5mg/L；b）纯化的IgG1表达产率（如实例9.2.1中所描述）是至少30.0mg/L；c）纯化的Fab的热稳定性（如实例9.1.2中所描述）是至少70℃；d）纯化的IgG1的热稳定性（如实例9.2.2中所描述）是至少73℃；e）纯化的Fab（如实例9.1.3中所描述）的单体含量是至少99%；f）纯化的IgG1的单体含量（如实例9.2.3中所描述）是至少99%；g）纯化的IgG1的等电点（如实例9.2.4中所描述）是至少8.3；以及h）应力测试累计得分（如实例9.2.7中所描述）是至少1225。In this embodiment,a collection comprises(33pairs):在这个实施例中，一个集合包括（33对）：VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK3-20(SEQ ID NO:239)；VH1-46(SEQID NO:205)/VK3-15(SEQ ID NO:238)；VH1-46(SEQ ID NO:205)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH1-69*01(SEQ ID NO:206)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-12(SEQ ID NO:233)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-27(SEQ ID NO:235)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK3-15(SEQ ID NO:238)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-47(SEQ ID NO:251)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-40(SEQ ID NO:250)；VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-47(SEQ ID NO:251)；VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL2-23(SEQ ID NO:255)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-05(SEQ ID NO:230)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-06(SEQ ID NO:231)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-12(SEQ ID NO:233)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-27(SEQ ID NO:235)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK3-11(SEQ ID NO:237)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH3-21(SEQ ID NO:210)/VK1-12(SEQ ID NO:233)；VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK3-15(SEQ ID NO:238)；VH3-53(SEQ ID NO:213)/VK3-15(SEQ ID NO:238)；VH3-53(SEQ ID NO:213)/VL2-11(SEQ ID NO:253)；VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-05(SEQ ID NO:230)；VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-06(SEQ ID NO:231)；VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-12(SEQ ID NO:233)；VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK3-20(SEQ ID NO:239)；VH5-51(SEQ ID NO:215)/VK1-39(SEQ ID NO:236)；VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-40(SEQ ID NO:250)；VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK1-09(SEQ ID NO:232)；VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK3-20(SEQ ID NO:239)；以及VH6-1(SEQ ID NO:216)/VL1-51(SEQ ID NO:252)。
在另一实施例中，多个对被加入到一个集合中，尽管这些对本身不满足每一标准内的所有阈值，但被加入到这些集合中以便提高多样性。在一个实施例中，一个集合进一步包括：VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK1-39(SEQ ID NO:236)；VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL2-23(SEQ ID NO:255)；以及VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL3-1(SEQ ID NO:256)。在这个实施例中，一个集合包括（36对）：VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK3-20(SEQ ID NO:239)；VH1-46(SEQID NO:205)/VK3-15(SEQ ID NO:238)；VH1-46(SEQ ID NO:205)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH1-69*01(SEQ ID NO:206)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-12(SEQ ID NO:233)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-27(SEQ ID NO:235)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK3-15(SEQ ID NO:238)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-47(SEQ ID NO:251)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-40(SEQ ID NO:250)；VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-47(SEQ ID NO:251)；VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL2-23(SEQ ID NO:255)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-05(SEQ ID NO:230)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-06(SEQ ID NO:231)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-12(SEQ ID NO:233)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-27(SEQ ID NO:235)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK3-11(SEQ ID NO:237)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH3-21(SEQ ID NO:210)/VK1-12(SEQ ID NO:233)；VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK1-39(SEQ ID NO:236)；VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK3-15(SEQ ID NO:238)；VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL2-23(SEQ ID NO:255)；VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL3-1(SEQ ID NO:256)；VH3-53(SEQ ID NO:213)/VK3-15(SEQ ID NO:238)；VH3-53(SEQ ID NO:213)/VL2-11(SEQ ID NO:253)；VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-05(SEQ ID NO:230)；VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-06(SEQ ID NO:231)；VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-12(SEQ ID NO:233)；VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK3-20(SEQ ID NO:239)；VH5-51(SEQ ID NO:215)/VK1-39(SEQ ID NO:236)；VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-40(SEQ ID NO:250)；VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK1-09(SEQ ID NO:232)；VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK3-20(SEQ ID NO:239)；以及VH6-1(SEQ ID NO:216)/VL1-51(SEQ IDNO:252)。
实例11：对集合进行β测试
为了证实集合设计的有效性，产生子集合（每一子集合包括一个种系蛋白对）或子集合的池并且针对抗原进行选择。然后测试以Fab和IgG1形式两者的所选择的抗体的可研发性特征，如Fab形式的热稳定性、IgG1形式的pI、Fab和IgG1形式两者的表达产率、IgG1形式的热稳定性以及如通过SEC确定的IgG1形式的单体%。另外，在一些情况下，测定Fab形式的对抗原的亲和力。
集合产生
如下合成含有种系蛋白对的子集合：通过基因技术公司（德国雷根斯堡）合成来自图25-33中所示的各自的种系蛋白序列的FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3区。将VH（经由NheI和SaII）与VL（经由NdeI和Acc65I）克隆到pJPd1展示载体中。经由BssHII和XhoI***包括恒定FR4区的CDR-H3盒，其中理论多样性介于5.5×105与1.9×1019范围之间。通过斯隆宁公司（德国马丁雷德（Martinsried,Germany））合成具有6-17个氨基酸长度的CDR-H3的CDR-H3盒。通过引入由艾拉生物技术公司（ELLA Biotech）（德国马丁雷德）合成的κ或λTRIM盒实现CDR-L3多样性，其中理论多样性介于4.6×106与2.5×109范围之间。
典型地，将这些子集合的0.25μg到2μg pJPd1噬菌粒DNA在大肠杆菌MC1061F'电转化感受态细胞中转化，并且在TB培养基中收集转化体，并且在37℃振荡1小时。将生长培养基的稀释物放置到LB/Cam/Gluc上。通过在适当量的LB/cam/1%Glu中振荡过夜来扩增库。子集合的库大小范围介于4.6×108与4.4×109之间。所有子集合的总库大小一起是约1.3×1011个成员。为了分析工程化的子集合的质量，对于每一子集合挑选至少30个克隆，并且对CDR-L3和H3区测序以确定序列的正确性和独特性。这些库以大肠杆菌甘油培养物形式贮藏。
如下制备展示Fab形式的子集合的噬菌体。对于每一库噬菌体制剂来说，用来自相应库甘油储备液的细菌接种80ml2x YT/Cam/Glc培养基，产生0.2-0.3的OD600nm。振荡培养物，直到达到0.45-0.55的OD600nm。然后以10的感染倍率添加辅助噬菌体到细菌培养物中，接着在37℃在不振荡下孵育45分钟，并且然后在37℃在以120rpm振荡下孵育45分钟。旋转减慢细菌，并且丢弃含有辅助噬菌体的上清液。将噬菌体感染的细菌再悬浮于400ml2xYT/CAM/KAN/IPTG培养基中，并且在22℃在以120rpm振荡下孵育过夜。第二天，使来自过夜培养物的细菌成球粒，并且收集含有Fab呈现噬菌体的上清液。通过添加PEG/NaCl到含有噬菌体的上清液中来执行噬菌体沉淀。在冰上孵育样品至少30分钟。旋转减慢所沉淀的噬菌体，并且将其再悬浮于PBS中。缓慢旋转样品以获得一种均相悬浮液，并且使残余细菌碎片成球粒并且将其丢弃。再次使用PEG/NaCl从含有噬菌体的上清液沉淀噬菌体。最终，将噬菌体球粒再悬浮于PBS中，转移到一个无菌管中，并且缓慢振荡以获得一种均相悬浮液。通过点滴定、ELISA以及OD268nm的UV吸收度（Nanodrop）来测定噬菌体滴度。
通过ELISA来评估每一单独的噬菌体制剂的由三顺反子展示载体pJPd1（显示在图9中）表达并且由（如WO01/05950、US6,753,136中所描述，它们的全部内容通过引用结合）在噬菌体上呈现的Fab片段的噬菌体滴度和展示水平。
使用两种不同抗体来捕获：
(1)使用抗M13抗体（安玛西亚公司，编号27-9420-01），由于它经由主要外壳蛋白g8p来捕获噬菌体颗粒；因此，可以确定噬菌体滴度。
(2)使用一种抗Fd抗体（结合位点公司，编号PC075），它结合到所展示的Fab；因此，仅噬菌体展示Fab得以捕获。
对于(1)和(2)来说，使用单独的参考曲线。使用结合到HRP的一种单克隆抗M13（针对M13噬菌体的主要外壳蛋白g8p）作为一种检测抗体。
通过对于抗M13抗体来说和对于抗Fd抗体来说将抗体溶液分配到不同孔中，用层压的箔密封皿，并且孵育过夜来将各自的捕获抗体固定在96孔MaxisorpTM皿上。第二天，用TBST洗涤这些皿，并且用CTBST封闭每一孔。
在微量滴定板中在CTBST中制备噬菌体上清液和参考样品（CS）的起始稀释液。制备抗M13和抗Fd抗体的噬菌体上清液的起始稀释液。制备参考样品VH3-23HuCALl+kVCSM13和HuCAL PLATINUM聚池的超级噬菌体κ和λ的起始稀释液。通过用CTBST预填充微量滴定板并且添加噬菌体以及用CTBST预填充一个第二微量滴定板并且添加噬菌体来制备噬菌体上清液的连续稀释液。对于参考样品来说，涂布上文所述的起始稀释液并且涂布具有抗M13和抗Fd抗体两者的连续稀释液。
如下转移噬菌体上清液和参考样品两者用于检测。用TBST洗涤被封闭的ELISA皿。将噬菌体上清液从稀释皿转移到被涂布的ELISA皿，在室温孵育，并且用TBST洗涤。添加稀释于CTBST中的抗M13过氧化酶结合物（安玛西亚公司），并且在室温孵育1-2小时。通过将1份（例如0.5ml）过氧化物溶液与9份（例如4.5ml）底物溶液混合来制备Quanta Blu（皮尔斯）工作溶液。用TBST洗涤ELISA皿，添加QuantaBlu工作溶液。在约2分钟的孵育时间（激发：320nm，发射：430nm）和接着5分钟的时间间隔之后测量荧光。如下评估ELISA数据：产生校准曲线，并且计算噬菌体上清液和对照的滴度。对于每一样品来说，将抗Fd的滴度除以抗M13（抗pVIII）的滴度，所得比率是相对展示率。
结果显示在表13中。
表13
针对人类DKK3、rhErbB4/Her4Fc融合物、rhFZD-4Fc融合物以及eGFP的噬菌体展示
选择
执行对单独的子集合或子集合的库的平行淘选策略，以便将鉴别具有所希望的生物物理学特征的多样结合抗体的机会最大化，选择人类Dickkopf-3（DKK3）（基因ID27122）、重组人类（rh）ErbB4/Her4（基因ID2066）_Fc融合蛋白、rhFZD-4（基因ID8322）Fc融合物以及eGFP（增强型绿色荧光蛋白；序列在上文提供）作为用于集合验证的模型抗原。在基于M-450环氧基珠的溶液中用共价偶合于磁性戴诺珠（Dynabead）(R)（戴诺/英杰公司（Dynal/Invitrogen），产品号140.11）的各自的抗原淘选来执行集合筛选。
针对DKK3的基于珠的溶液淘选
在室温（RT）用MPBST封闭DKK3和对照BSA涂布的羧基珠（戴诺公司），然后用预吸收的噬菌体孵育。若干洗涤步骤之后，将结合的噬菌体洗脱，并且通过感染TG1F+细胞来进行扩增，用于下一轮选择。3轮选择之后，分离pJPd1（显示在图9中）噬菌粒DNA，并且通过用XbaI和EcoRI限制消化来切除Fab编码片段（被修饰的ompA-VL和被修饰的phoA-Fd），并且将其连接到表达载体pJPx1（显示在图10中），并且转化到大肠杆菌TG1F-中。然后将被感染的培养物涂布到大LB/Cam/Gluc皿上，并且允许其生长过夜。分离单一克隆，并且通过ELISA测试其Fab表达产率和抗原结合。通过在一种被绵羊抗人类Fd（结合位点公司，目录PC075）涂布的ELISA皿上孵育含有Fab的细胞提取物，接着用与碱性磷酸酯酶（AP）（杰克逊公司，目录109-055-097）结合的山羊抗人类IgG F(ab')2片段特异性抗体检测，来检测Fab表达。用对于基于珠的分析（应用生物***8200细胞检测***/PE生物***（AppliedBiosystems8200Cellular Detection System/PE Biosystems））所用的一种荧光测定微体积分析技术（）通过用DKK3偶合的羧基珠和BSA偶合的羧基珠（戴诺公司）筛选含有Fab的细胞提取物来测试抗原特异性。主要命中被定义为导致超过被设定为200的值的背景至少5倍的FMAT平均荧光信号的Fab。在一个第二ELISA中用DKK3作为同源抗原并且用CD38_Fc作为阴性对照抗原来证实对DKK3的特异性。对于VH3-23/VK1-39、VH3-23/VL3-1以及HuCALVH3-23/κ子库挑选63、43以及44个克隆的重和轻链CDR3区用于测序，以便估计DKK3结合抗体的序列多样性。总计，分别对于VH3-23/VK1-39、VH3-23/VL3-1以及HuCAL-Pt VH3-23/κ子库来说，56个成功序列中的31个（55%）、35个序列中的20个（47%）以及44个序列中的17个（39%）是不同的，这显示出所构建的库含有DKK3结合物的一个多样组库。结果显示在表14中。
表14
I8代表了VH3-23/VK1-39，并且I19代表了VH3-23/VL3-1。
针对rhErbB4/Her4Fc融合物、rhFZD-4Fc融合物以及eGFP的基于珠的溶液淘选
在室温（RT）用Chemiblocker封闭rhErbB4/Her4_Fc融合物、rhFZD-4Fc融合物或eGFP以及对照BSA环氧基M450珠（戴诺公司）2小时，然后在室温与预吸附的噬菌体孵育2小时。若干洗涤步骤之后，将结合的噬菌体洗脱，并且通过感染TG1F+细胞来进行扩增，用于下一轮选择。3轮选择之后，分离pJPd1（显示在图9中）噬菌粒DNA，并且通过PCR扩增Fab编码片段（被修饰的ompA-VL和被修饰的phoA-Fd），纯化，并且用XbaI和EcoRI消化，并且将其连接到表达载体pJPx1（显示在图10中）中，并且转化到大肠杆菌TG1F-中。然后将被感染的培养物涂布到大LB/Cam/Gluc皿上，并且允许其生长过夜。分离单一克隆，并且通过ELISA测试其Fab表达产率和抗原结合。通过在一种被绵羊抗人类Fd（结合位点公司，目录PC075）涂布的ELISA皿上孵育含有Fab的细胞提取物，接着用与碱性磷酸酯酶（AP）（杰克逊公司，目录109-055-097）结合的山羊抗人类IgG F(ab')2片段特异性抗体检测，来检测Fab表达。通过用含有Fab的细胞提取物对直接涂布在MaxiSorp皿上的rhErbB4/Her4_Fc抗原、rhFZD-4_Fc抗原或eGFP进行ELISA筛选来测试抗原特异性。主要命中被定义为导致超过背景至少5倍的ELISA信号的Fab。结果显示在图61A-D中。
针对ErbB4/Her4Fc的Fc捕获淘选
使用通过用山羊抗人类IgG Fc特异性（杰克逊目录109-005-098）或小鼠抗人类IgG Fc特异性（杰克逊公司；目录209-005-098）捕获固定在Maxisorp皿（能肯公司（Nunc））上的加了人类ErbB4/Her4重组Fc标签的蛋白执行三轮固相Fc捕获淘选。在每一轮选择之前，用含0.1mg/ml人类、山羊以及小鼠免疫球蛋白的MPBST/BSA封闭噬菌体。若干洗涤步骤之后，将结合的噬菌体洗脱，并且通过感染TG1F+细胞来进行扩增，用于下一轮选择。第三选择轮之后，分离pJPd1（显示在图9中）噬菌粒DNA，并且通过用XbaI和EcoRI限制消化来切除Fab编码片段（被修饰的ompA-VL和被修饰的phoA-Fd），并且将其连接到表达载体pJPx1（显示在图10中），并且转化到TG1F-中。然后将被感染的培养物涂布到大LB/Cam/Gluc皿上，并且允许其生长过夜。分离单一克隆，并且通过ELISA测试其Fab表达产率和抗原结合。通过在一种被绵羊抗人类Fd（结合位点公司，目录PC075）涂布的ELISA皿上孵育含有Fab的细胞提取物，接着用与碱性磷酸酯酶（AP）（杰克逊公司目录109055097）结合的山羊抗人类IgG F(ab')2片段特异性抗体检测，来检测Fab表达。通过用含有Fab的细胞提取物对经由涂布在MaxiSorp皿上的山羊抗人类IgG抗体（杰克逊公司；目录109-005-098）捕获的ErbB4/Her4_Fc抗原进行ELISA筛选来测试抗原特异性。主要命中被定义为导致超过背景至少5倍的ELISA信号的Fab。在第二Fc捕获ELISA中用ErbB4/Her4_Fc作为同源抗原并且用CD38_Fc作为阴性对照抗原来证实对ErbB4/Her4_Fc的特异性。
分别对VH3-23/VK1-39、VH3-23/VL3-1以及HuCAL-Pt VH3-23/κ子库而言，将112、61以及95个克隆的重和轻链CDR3区测序，以便估计ErbB4/Her4_Fc结合抗体的序列多样性。总计，对于VH3-23/VK1-39、VH3-23/VL3-1以及HuCAL-Pt VH3-23/κ子库来说，106个成功序列中的31个（29%）、61个序列中的30个（49%）以及91个序列中的14个（15%）是不同的，这显示出所构建的库含有结合物的一个多样组库。序列多样性显示在表15中。
表15
*命中被定义为反应性是超过背景（Bg）至少5倍
**对于加压皿（CP）来说，挑选反应性仅超过背景（Bg）2倍的一些克隆
***独特序列/可分析序列
I8代表了VH3-23/VK1-39，并且I19代表了VH3-23/VL3-1。
以Fab形式的经由抗原捕获设置的Biacore K
D
（亲和力）确定
如下分析单体Fab部分（通过分析型SEC分析；Superdex75，安玛西亚制药公司（Amersham Pharmacia））与被捕获的抗原的结合：使用EDC/NHS化学作用在一个CM5芯片（Biacore/GE医疗公司）上共价固定一种适当的抗-抗原标签捕获抗体。通过捕获抗原并且后续注射六种不同Fab浓度（2n连续稀释）来进行动力学测量。每一循环之后，使传感芯片再生。运行缓冲液的空白注射用于双参考。使用BIA评估软件3.2（Biacore/GE医疗公司）拟合所有传感图以确定kon和koff比率常数，它们被用来计算KD。
如下执行Biacore KD确定：运行缓冲液是PBST（磷酸盐缓冲盐水pH7.2GIBCO+0.05%吐温20）。使用一种抗人类Fc抗体（Biacore/GE医疗公司）捕获约400RU具有Fc融合标签（批号FYY0310041）的抗原。使用15.6nM到500nM范围的Fab浓度与20μl/min的流速、30秒的注射时间以及100秒的解离时间。在2次注射15μl3M MgCl2试剂的情况下进行表面的再生。结果显示在图38中。
针对DKK3、rhErbB4/Her4Fc融合物、rhFZD-4Fc融合物以及eGFP鉴别的抗体和抗体
片段的可研发性测试
测试以Fab和IgG1形式两者的对抗原具有特异性的抗体或片段的可研发性特征，如Fab形式的热稳定性、Fab形式的亲和力、IgG1形式的pI、Fab和IgG形式两者的表达产率、IgG1形式的热稳定性以及如通过SEC确定的IgG1形式的单体%。如实例7.2中所描述，测试IgG1形式的血清稳定性。如实例9.1.2和9.2.2中所描述，完成Fab和IgG1形式的热稳定性测试。如实例9.2.4中所描述，完成IgG1形式的pI。如实例9.2.1中所描述，完成IgG1形式的表达产率。如实例9.2.3中所描述，完成如通过SEC确定的IgG1形式的单体%。结果显示在图37-39、45-48以及62中。
再者，诸位发明人相信，关于所测试的功能特性，输入（用于针对一种抗原进行选择的抗体集合）与输出（被鉴别为对该抗原具有特异性的抗体）之间存在高相关性。因此，本发明的集合包括抗体或片段，这些抗体或片段部分地包括与所测试的构建体（例如框架区和/或互补性决定区）相同的氨基酸序列。CDR3是多样化的。因为，在一个方面，这些集合包括这些所测试的构建体的氨基酸序列或编码其的核酸，所以认为的是这些集合包括具有与实例9中所测试的构建体相同的与可研发性相关的优越功能特性的抗体或片段。因此，预期接着针对一种抗原所选择的许多抗体或片段也将具有相同的与可研发性相关的优越功能特性。
图37-39、45-48以及62A-C中所示的数据支持了这一结论。图39显示了针对DKK3或ErbB4/Her4_Fc抗原从本发明的集合选择的Fab以及这些Fab如何具有与对照（如实例9中所描述最初测试的构建体）类似的热稳定性。另外，图45-48显示了从本发明的集合中选出的对DKK3或ErbB4/Her4_Fc抗原具有特异性的IgG以及这些IgG如何具有与对照（如实例9中所描述最初测试的构建体）类似的等电点（pI）、热稳定性、表达产率以及单体含量。图62A-C显示了针对rhErbB4/Her4_Fc融合物、rhFZD-4Fc融合物以及eGFP选择的IgG以及这些IgG如何具有与对照（如实例9中所描述最初测试的构建体）类似的等电点（pI）、表达产率、热稳定性以及单体含量。
总的来说，这显示了本发明的集合包含具有与可研发性有关的优越特性的抗体或片段，并且支持了诸位发明人的假设：输入（使用来自所测试并且显示为具有优越功能特性的种系蛋白对的序列（例如框架区和/或互补性决定区）的集合）与输出（针对任何抗原选择的具有相同的与开发相关的优越功能特性的抗体或片段）良好相关。
应当理解，本说明书、具体实例和数据在指示示例性实施例的同时，通过展示给出，并且并不旨在限制本发明。本发明内的不同变化和修改在本讨论、披露以及在此包含的数据方面对于熟练的业内人士而言应当是很明显的，并且因此被认为是本发明的一部分。
Claims (23)
1.合成的抗体或其功能性片段的集合，其中这些抗体或其功能性片段包括可变重链和可变轻链对，其中这些可变重链和可变轻链对的框架区由选自以下可变重链和可变轻链对中的二十个或更多个的种系蛋白序列组成：VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK1-39(SEQ ID NO:236)；VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK3-15(SEQ ID NO:238)；VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK3-20(SEQ ID NO:239)；VH1-46(SEQ ID NO:205)/VK3-15(SEQ ID NO:238)；VH1-46(SEQ ID NO:205)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH1-46(SEQ ID NO:205)/VL3-21(SEQ ID NO:257)；VH1-69*01(SEQ ID NO:206)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-12(SEQID NO:233)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-16(SEQ ID NO:234)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-27(SEQ ID NO:235)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-39(SEQ ID NO:236)；VH3-07(SEQID NO:207)/VK3-15(SEQ ID NO:238)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-47(SEQ ID NO:251)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH3-11(SEQ ID NO:208)/VK1-05(SEQID NO:230)；VH3-11(SEQ ID NO:208)/VK1-39(SEQ ID NO:236)；VH3-11(SEQ ID NO:208)/VK3-15(SEQ ID NO:238)；VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-40(SEQ ID NO:250)；VH3-11(SEQID NO:208)/VL1-47(SEQ ID NO:251)；VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL2-23(SEQ ID NO:255)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-05(SEQID NO:230)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-06(SEQ ID NO:231)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-12(SEQ ID NO:233)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-16(SEQ ID NO:234)；VH3-15(SEQID NO:209)/VK1-27(SEQ ID NO:235)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK3-11(SEQ ID NO:237)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-40(SEQ ID NO:250)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-47(SEQID NO:251)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL2-14(SEQ ID NO:254)；VH3-21(SEQ ID NO:210)/VK1-12(SEQ ID NO:233)；VH3-21(SEQID NO:210)/VK1-27(SEQ ID NO:235)；VH3-21(SEQ ID NO:210)/VL2-11(SEQ ID NO:253)；VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK1-39(SEQ ID NO:236)；VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK3-15(SEQID NO:238)；VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL2-23(SEQ ID NO:255)；VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL3-1(SEQ ID NO:256)；VH3-30(SEQ ID NO:212)/VK3-20(SEQ ID NO:239)；VH3-53(SEQID NO:213)/VK3-15(SEQ ID NO:238)；VH3-53(SEQ ID NO:213)/VL2-11(SEQ ID NO:253)；VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-05(SEQ ID NO:230)；VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-06(SEQID NO:231)；VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-12(SEQ ID NO:233)；VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-27(SEQ ID NO:235)；VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK3-20(SEQ ID NO:239)；VH3-74(SEQID NO:214)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH5-51(SEQ ID NO:215)/VK1-39(SEQ ID NO:236)；VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-40(SEQ ID NO:250)；VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-51(SEQID NO:252)；VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK1-09(SEQ ID NO:232)；VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK3-15(SEQ ID NO:238)；VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK3-20(SEQ ID NO:239)；以及VH6-1(SEQ ID NO:216)/VL1-51(SEQ ID NO:252)。
2.根据权利要求1所述的合成的抗体或其功能性片段的集合，其中这些可变重链和可变轻链对的框架区由选自以下可变重链和可变轻链对中的二十五个或更多个的种系蛋白序列组成：VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK1-39(SEQ ID NO:236)；VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK3-15(SEQ ID NO:238)；VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK3-20(SEQ ID NO:239)；VH1-46(SEQID NO:205)/VK3-15(SEQ ID NO:238)；VH1-46(SEQ ID NO:205)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH1-46(SEQ ID NO:205)/VL3-21(SEQ ID NO:257)；VH1-69*01(SEQ ID NO:206)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-12(SEQ ID NO:233)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-16(SEQ ID NO:234)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-27(SEQ ID NO:235)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-39(SEQ ID NO:236)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK3-15(SEQ ID NO:238)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-47(SEQ ID NO:251)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH3-11(SEQ ID NO:208)/VK1-05(SEQ ID NO:230)；VH3-11(SEQ ID NO:208)/VK1-39(SEQ ID NO:236)；VH3-11(SEQ ID NO:208)/VK3-15(SEQ ID NO:238)；VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-40(SEQ ID NO:250)；VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-47(SEQ ID NO:251)；VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL2-23(SEQ ID NO:255)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-05(SEQ ID NO:230)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-06(SEQ ID NO:231)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-12(SEQ ID NO:233)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-16(SEQ ID NO:234)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-27(SEQ ID NO:235)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK3-11(SEQ ID NO:237)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-40(SEQ ID NO:250)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-47(SEQ ID NO:251)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL2-14(SEQ ID NO:254)；VH3-21(SEQ ID NO:210)/VK1-12(SEQ ID NO:233)；VH3-21(SEQ ID NO:210)/VK1-27(SEQ ID NO:235)；VH3-21(SEQ ID NO:210)/VL2-11(SEQ ID NO:253)；VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK1-39(SEQ ID NO:236)；VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK3-15(SEQ ID NO:238)；VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL2-23(SEQ ID NO:255)；VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL3-1(SEQ ID NO:256)；VH3-30(SEQ ID NO:212)/VK3-20(SEQ ID NO:239)；VH3-53(SEQ ID NO:213)/VK3-15(SEQ ID NO:238)；VH3-53(SEQ ID NO:213)/VL2-11(SEQ ID NO:253)；VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-05(SEQ ID NO:230)；VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-06(SEQ ID NO:231)；VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-12(SEQ ID NO:233)；VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-27(SEQ ID NO:235)；VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK3-20(SEQ ID NO:239)；VH3-74(SEQ ID NO:214)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH5-51(SEQ ID NO:215)/VK1-39(SEQ ID NO:236)；VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-40(SEQ ID NO:250)；VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK1-09(SEQ ID NO:232)；VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK3-15(SEQ ID NO:238)；VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK3-20(SEQ ID NO:239)；以及VH6-1(SEQ ID NO:216)/VL1-51(SEQ IDNO:252)。
3.根据权利要求2所述的合成的抗体或其功能性片段的集合，其中这些可变重链和可变轻链对的框架区由选自以下可变重链和可变轻链对中的三十个或更多个的种系蛋白序列组成：VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK1-39(SEQ ID NO:236)；VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK3-15(SEQ ID NO:238)；VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK3-20(SEQ ID NO:239)；VH1-46(SEQ IDNO:205)/VK3-15(SEQ ID NO:238)；VH1-46(SEQ ID NO:205)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH1-46(SEQ ID NO:205)/VL3-21(SEQ ID NO:257)；VH1-69*01(SEQ ID NO:206)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-12(SEQ ID NO:233)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-16(SEQ ID NO:234)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-27(SEQ ID NO:235)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-39(SEQ ID NO:236)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK3-15(SEQ ID NO:238)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-47(SEQ ID NO:251)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH3-11(SEQ ID NO:208)/VK1-05(SEQ ID NO:230)；VH3-11(SEQ ID NO:208)/VK1-39(SEQ ID NO:236)；VH3-11(SEQ ID NO:208)/VK3-15(SEQ ID NO:238)；VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-40(SEQ ID NO:250)；VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-47(SEQ ID NO:251)；VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL2-23(SEQ ID NO:255)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-05(SEQ ID NO:230)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-06(SEQ ID NO:231)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-12(SEQ ID NO:233)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-16(SEQ ID NO:234)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-27(SEQ ID NO:235)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK3-11(SEQ ID NO:237)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-40(SEQ ID NO:250)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-47(SEQ ID NO:251)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL2-14(SEQ ID NO:254)；VH3-21(SEQ ID NO:210)/VK1-12(SEQ ID NO:233)；VH3-21(SEQ ID NO:210)/VK1-27(SEQ ID NO:235)；VH3-21(SEQ ID NO:210)/VL2-11(SEQ ID NO:253)；VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK1-39(SEQ ID NO:236)；VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK3-15(SEQ ID NO:238)；VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL2-23(SEQ ID NO:255)；VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL3-1(SEQ ID NO:256)；VH3-30(SEQ ID NO:212)/VK3-20(SEQ ID NO:239)；VH3-53(SEQ ID NO:213)/VK3-15(SEQ ID NO:238)；VH3-53(SEQ ID NO:213)/VL2-11(SEQ ID NO:253)；VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-05(SEQ ID NO:230)；VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-06(SEQ ID NO:231)；VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-12(SEQ ID NO:233)；VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-27(SEQ ID NO:235)；VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK3-20(SEQ ID NO:239)；VH3-74(SEQ ID NO:214)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH5-51(SEQ ID NO:215)/VK1-39(SEQ ID NO:236)；VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-40(SEQ ID NO:250)；VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK1-09(SEQ ID NO:232)；VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK3-15(SEQ ID NO:238)；VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK3-20(SEQ ID NO:239)；以及VH6-1(SEQ ID NO:216)/VL1-51(SEQ IDNO:252)。
4.根据权利要求3所述的集合，其中这些可变重链和可变轻链对的框架区由以下可变重链和可变轻链对的种系蛋白序列组成：VH1-18(SEQ ID NO:204)/VK3-20(SEQ ID NO:239)；VH1-46(SEQ ID NO:205)/VK3-15(SEQ ID NO:238)；VH1-46(SEQ ID NO:205)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH1-69*01(SEQ ID NO:206)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH3-07(SEQ IDNO:207)/VK1-12(SEQ ID NO:233)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-27(SEQ ID NO:235)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK3-15(SEQ ID NO:238)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-47(SEQID NO:251)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-40(SEQ ID NO:250)；VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-47(SEQ ID NO:251)；VH3-11(SEQID NO:208)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL2-23(SEQ ID NO:255)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-05(SEQ ID NO:230)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-06(SEQID NO:231)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-12(SEQ ID NO:233)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-27(SEQ ID NO:235)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK3-11(SEQ ID NO:237)；VH3-15(SEQID NO:209)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH3-21(SEQ ID NO:210)/VK1-12(SEQ ID NO:233)；VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK1-39(SEQ ID NO:236)；VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK3-15(SEQID NO:238)；VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL2-23(SEQ ID NO:255)；VH3-23(SEQ ID NO:211)/VL3-1(SEQ ID NO:256)；VH3-53(SEQ ID NO:213)/VK3-15(SEQ ID NO:238)；VH3-53(SEQID NO:213)/VL2-11(SEQ ID NO:253)；VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-05(SEQ ID NO:230)；VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-06(SEQ ID NO:231)；VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-12(SEQID NO:233)；VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK3-20(SEQ ID NO:239)；VH5-51(SEQ ID NO:215)/VK1-39(SEQ ID NO:236)；VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-40(SEQ ID NO:250)；VH5-51(SEQID NO:215)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK1-09(SEQ ID NO:232)；VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK3-20(SEQ ID NO:239)；以及VH6-1(SEQ ID NO:216)/VL1-51(SEQ ID NO:252)。
5.根据权利要求3所述的合成的抗体或其功能性片段的集合，其中这些可变重链和可变轻链对的框架区由以下可变重链和可变轻链对的种系蛋白序列组成：VH1-18(SEQ IDNO:204)/VK3-20(SEQ ID NO:239)；VH1-46(SEQ ID NO:205)/VK3-15(SEQ ID NO:238)；VH1-46(SEQ ID NO:205)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH1-69*01(SEQ ID NO:206)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-12(SEQ ID NO:233)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK1-27(SEQ ID NO:235)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VK3-15(SEQ ID NO:238)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-47(SEQ ID NO:251)；VH3-07(SEQ ID NO:207)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-40(SEQ ID NO:250)；VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-47(SEQ ID NO:251)；VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH3-11(SEQ ID NO:208)/VL2-23(SEQ ID NO:255)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-05(SEQ ID NO:230)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-06(SEQ ID NO:231)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-12(SEQ ID NO:233)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK1-27(SEQ ID NO:235)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VK3-11(SEQ ID NO:237)；VH3-15(SEQ ID NO:209)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH3-21(SEQ ID NO:210)/VK1-12(SEQ ID NO:233)；VH3-23(SEQ ID NO:211)/VK3-15(SEQ ID NO:238)；VH3-53(SEQ ID NO:213)/VK3-15(SEQ ID NO:238)；VH3-53(SEQ ID NO:213)/VL2-11(SEQ ID NO:253)；VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-05(SEQ ID NO:230)；VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-06(SEQ ID NO:231)；VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK1-12(SEQ ID NO:233)；VH3-74(SEQ ID NO:214)/VK3-20(SEQ ID NO:239)；VH5-51(SEQ ID NO:215)/VK1-39(SEQ ID NO:236)；VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-40(SEQ ID NO:250)；VH5-51(SEQ ID NO:215)/VL1-51(SEQ ID NO:252)；VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK1-09(SEQ ID NO:232)；VH6-1(SEQ ID NO:216)/VK3-20(SEQ ID NO:239)；以及VH6-1(SEQ ID NO:216)/VL1-51(SEQ ID NO:252)。
6.根据权利要求1-5中任何一项所述的集合，其中所述抗体或其功能性片段包括一个或多个互补性决定区，该一个或多个互补性决定区由来自所述各个可变重链和可变轻链对的种系蛋白序列组成。
7.根据权利要求1-5中任何一项所述的集合，其中所述抗体或其功能性片段包括CDR1区，这些CDR1区由来自所述各个可变重链和可变轻链对的种系蛋白序列组成。
8.根据权利要求1-5中任何一项所述的集合，其中所述抗体或其功能性片段包括CDR2区，这些CDR2区由来自所述各个可变重链和可变轻链对的种系蛋白序列组成。
9.根据权利要求1-5中任何一项所述的集合，其中所述抗体或其功能性片段包括一个或多个互补性决定区，该一个或多个互补性决定区包括去除潜在的翻译后修饰位点的氨基酸修饰。
10.根据权利要求9所述的集合，其中所述抗体或其功能性片段包括一个或多个重链互补性决定区，该一个或多个重链互补性决定区是来自SEQ ID NO:266-278中所描绘的各自的可变重链的互补性决定区序列。
11.根据权利要求10所述的集合，其中所述抗体或其功能性片段包括HCDR1区，这些HCDR1区来自SEQ ID NO:266-278中所描绘的各自的HCDR1区。
12.根据权利要求10或11所述的集合，其中所述抗体或其功能性片段包括HCDR2区，这些HCDR2区来自SEQ ID NO:266-278中所描绘的各自的HCDR2区。
13.根据权利要求1-5中任何一项所述的集合，其中所述抗体或其功能性片段包括一个FR4区，该FR4区选自下组，该组由以下各项组成：JH4(SEQ ID NO:293)、Jκ1(SEQ ID NO:297)以及Jλ2/3(SEQ ID NO:301)。
14.根据权利要求1-5中任何一项所述的集合，其中所述抗体或其功能性片段包括一个多样化的HCDR3区。
15.根据权利要求1-5中任何一项所述的集合，其中所述抗体或其功能性片段包括一个多样化的LCDR3区。
16.根据权利要求1-5中任何一项所述的集合，其中该集合包括至少1×104个抗体或其功能性片段。
17.根据权利要求1-5中任何一项所述的集合，其中所述抗体选自下组，该组由以下各项组成：人类IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM以及IgD。
18.根据权利要求1-5中任何一项所述的集合，其中所述抗体的所述功能性片段选自下组，该组由以下各项组成：Fab、F(ab')2、Fab'、Fv以及scFv。
19.核酸的集合，这些核酸对根据以上权利要求中任何一项所述的抗体或其功能性片段的集合进行编码。
20.一种载体，该载体包括根据权利要求19所述的核酸的集合。
21.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包括根据权利要求19所述的核酸或根据权利要求20所述的载体。
22.一种产生合成的抗体或其功能性片段的集合的方法，该方法包括：
a)鉴别人类免疫组库中存在的可变重链和可变轻链种系基因对；
b)测试由步骤a)中鉴别的这些可变重链和可变轻链种系基因对编码的可变重链和可变轻链种系蛋白对的以下特性：
i)在大肠杆菌中Fab形式的表达产率至少2.5mg/L；
ii)Fab形式在70℃或更高温度的热稳定性；
iii)根据通过尺寸排阻层析确定的Fab形式的单体含量至少98％；
iv)在HEK.EBNA细胞中IgG1形式的表达产率至少30mg/L；
v)IgG1形式在73℃或更高温度的热稳定性；以及
vi)根据通过尺寸排阻层析确定的IgG1形式的单体含量至少99％；以及
c)产生根据权利要求1所述的集合。
23.一种鉴别对抗原具有特异性的抗体或抗体片段的方法，该方法包括：
(a)使该抗原与根据权利要求1所述的抗体或其功能性片段的集合接触，和
(b)选择与所述抗原结合的一种或多种抗体或抗体片段。
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|---|---|---|---|---|
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| WO2015042250A1 (en) * | 2013-09-18 | 2015-03-26 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Histidine engineered light chain antibodies and genetically modified non-human animals for generating the same |
| WO2015089080A2 (en) | 2013-12-09 | 2015-06-18 | Adimab, Llc | Polyclonal mixtures of antibodies, and methods of making and using them |
| US10654933B2 (en) * | 2013-12-27 | 2020-05-19 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for purifying antibody having low isoelectric point |
| EA037813B1 (ru) | 2016-02-19 | 2021-05-24 | МорфоСис АГ | Антитела к il-17c |
| EP3538552B1 (en) | 2016-11-14 | 2023-09-13 | MorphoSys AG | Fab molecules with a rodent hinge region and a non-rodent ch1 region |
| WO2019099454A2 (en) | 2017-11-15 | 2019-05-23 | Philippe Valadon | Highly functional antibody libraries |
| EP3793596A1 (en) | 2018-05-16 | 2021-03-24 | MorphoSys AG | Antibodies targeting glycoprotein vi |
| KR102115300B1 (ko) * | 2018-06-01 | 2020-05-26 | 재단법인 목암생명과학연구소 | 항체 라이브러리 및 이를 이용한 항체 스크리닝 방법 |
| AU2021274883A1 (en) | 2020-05-20 | 2022-12-01 | Centre National De La Recherche Scientifique - Cnrs - | Synthetic single domain library |
| US20230305021A1 (en) | 2020-06-08 | 2023-09-28 | Immundiagnostik Ag | Improved method and test system for in-vitro determination of drug antibodies in blood |
| CN116209680A (zh) | 2020-09-24 | 2023-06-02 | 莫佛塞斯公司 | 与人CD3ε结合的新型人抗体 |
| WO2023180346A1 (en) | 2022-03-22 | 2023-09-28 | Morphosys Ag | Deimmunized antibodies specific for cd3 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009036379A2 (en) * | 2007-09-14 | 2009-03-19 | Adimab, Inc. | Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor |
Family Cites Families (76)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5618920A (en) | 1985-11-01 | 1997-04-08 | Xoma Corporation | Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use |
| US5091513A (en) | 1987-05-21 | 1992-02-25 | Creative Biomolecules, Inc. | Biosynthetic antibody binding sites |
| US5258498A (en) | 1987-05-21 | 1993-11-02 | Creative Biomolecules, Inc. | Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins |
| JPH02500329A (ja) | 1987-05-21 | 1990-02-08 | クリエイテイブ・バイオマリキユールズ・インコーポレーテツド | ターゲット化多機能蛋白質 |
| JP3771253B2 (ja) | 1988-09-02 | 2006-04-26 | ダイアックス コープ． | 新規な結合タンパク質の生成と選択 |
| US5223409A (en) | 1988-09-02 | 1993-06-29 | Protein Engineering Corp. | Directed evolution of novel binding proteins |
| AU634186B2 (en) | 1988-11-11 | 1993-02-18 | Medical Research Council | Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors |
| US6291160B1 (en) | 1989-05-16 | 2001-09-18 | Scripps Research Institute | Method for producing polymers having a preselected activity |
| CA2016841C (en) | 1989-05-16 | 1999-09-21 | William D. Huse | A method for producing polymers having a preselected activity |
| CA2057923A1 (en) | 1989-05-16 | 1990-11-17 | William D. Huse | Co-expression of heteromeric receptors |
| CA2016842A1 (en) | 1989-05-16 | 1990-11-16 | Richard A. Lerner | Method for tapping the immunological repertoire |
| US6291159B1 (en) | 1989-05-16 | 2001-09-18 | Scripps Research Institute | Method for producing polymers having a preselected activity |
| US6291158B1 (en) | 1989-05-16 | 2001-09-18 | Scripps Research Institute | Method for tapping the immunological repertoire |
| US6291161B1 (en) | 1989-05-16 | 2001-09-18 | Scripps Research Institute | Method for tapping the immunological repertiore |
| US5859205A (en) | 1989-12-21 | 1999-01-12 | Celltech Limited | Humanised antibodies |
| US5780225A (en) | 1990-01-12 | 1998-07-14 | Stratagene | Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules |
| WO1991010737A1 (en) | 1990-01-11 | 1991-07-25 | Molecular Affinities Corporation | Production of antibodies using gene libraries |
| DE4002897A1 (de) | 1990-02-01 | 1991-08-08 | Behringwerke Ag | Herstellung und verwendung von genbanken synthetischer menschlicher antikoerper ("synthetische human-antikoerper-bibliotheken") |
| US5427908A (en) | 1990-05-01 | 1995-06-27 | Affymax Technologies N.V. | Recombinant library screening methods |
| GB9015198D0 (en) | 1990-07-10 | 1990-08-29 | Brien Caroline J O | Binding substance |
| WO1992020791A1 (en) | 1990-07-10 | 1992-11-26 | Cambridge Antibody Technology Limited | Methods for producing members of specific binding pairs |
| ES2330052T3 (es) | 1991-03-01 | 2009-12-03 | Dyax Corporation | Proteina quimerica que comprende micro-proteinas que tienen dos o mas puentes disulfuro y relaizaciones de las mismas. |
| AU1457992A (en) | 1991-03-01 | 1992-10-06 | Stratagene | Pcr generated dicistronic dna molecules for producing antibodies |
| JPH06509473A (ja) | 1991-08-10 | 1994-10-27 | メディカル・リサーチ・カウンシル | 細胞個体群の処理 |
| US5565332A (en) | 1991-09-23 | 1996-10-15 | Medical Research Council | Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach |
| DK0605522T3 (da) | 1991-09-23 | 2000-01-17 | Medical Res Council | Fremgangsmåde til fremstilling af humaniserede antistoffer |
| ES2227512T3 (es) | 1991-12-02 | 2005-04-01 | Medical Research Council | Produccion de anticuerpos contra auto-antigenos a partir de repertorios de segmentos de anticuerpos fijados en un fago. |
| US5667988A (en) | 1992-01-27 | 1997-09-16 | The Scripps Research Institute | Methods for producing antibody libraries using universal or randomized immunoglobulin light chains |
| US5395750A (en) | 1992-02-28 | 1995-03-07 | Hoffmann-La Roche Inc. | Methods for producing proteins which bind to predetermined antigens |
| JP3507073B2 (ja) | 1992-03-24 | 2004-03-15 | ケンブリッジ アンティボディー テクノロジー リミティド | 特異的結合対の成員の製造方法 |
| US5855885A (en) | 1993-01-22 | 1999-01-05 | Smith; Rodger | Isolation and production of catalytic antibodies using phage technology |
| CA2175579A1 (en) | 1993-10-26 | 1995-05-04 | Chang Yi Wang | Structured synthetic antigen libraries as diagnostics, vaccines and therapeutics |
| US20010049107A1 (en) | 1994-01-31 | 2001-12-06 | Boston University | Polyclonal antibody libraries |
| US5605793A (en) | 1994-02-17 | 1997-02-25 | Affymax Technologies N.V. | Methods for in vitro recombination |
| AU6113396A (en) | 1995-06-14 | 1997-01-15 | Regents Of The University Of California, The | Novel high affinity human antibodies to tumor antigens |
| US6706484B1 (en) | 1995-08-18 | 2004-03-16 | Morphosys Ag | Protein/(poly)peptide libraries |
| WO1997008320A1 (en) | 1995-08-18 | 1997-03-06 | Morphosys Gesellschaft Für Proteinoptimierung Mbh | Protein/(poly)peptide libraries |
| GB9603507D0 (en) | 1996-02-20 | 1996-04-17 | Isis Innovation | Antibody variants |
| CA2297070A1 (en) | 1997-08-01 | 1999-02-11 | Morphosys Ag | Novel method and phage for the identification of nucleic acid sequences encoding members of a multimeric (poly)peptide complex |
| GB9722131D0 (en) | 1997-10-20 | 1997-12-17 | Medical Res Council | Method |
| IL144559A0 (en) | 1999-03-01 | 2002-05-23 | Genentech Inc | Antibodies for cancer therapy and diagnosis |
| EP1990409A3 (en) | 1999-07-20 | 2011-05-18 | MorphoSys AG | Bacteriophage |
| IL136459A0 (en) | 2000-05-30 | 2001-06-14 | Galim Galil Immunology Ltd | Antibody library |
| ES2430857T3 (es) | 2000-12-18 | 2013-11-22 | Dyax Corp. | Bibliotecas focalizadas de paquetes genéticos |
| US7117096B2 (en) | 2001-04-17 | 2006-10-03 | Abmaxis, Inc. | Structure-based selection and affinity maturation of antibody library |
| ATE434040T1 (de) | 2001-10-01 | 2009-07-15 | Dyax Corp | Mehrkettige eukaryontische display-vektoren und deren verwendungen |
| GB0130267D0 (en) | 2001-12-19 | 2002-02-06 | Neutec Pharma Plc | Focussed antibody technology |
| CA2471116A1 (en) | 2001-12-21 | 2003-07-03 | Serge Muyldermans | Method for cloning of variable domain sequences |
| US7244592B2 (en) | 2002-03-07 | 2007-07-17 | Dyax Corp. | Ligand screening and discovery |
| WO2004013276A2 (en) | 2002-07-30 | 2004-02-12 | Morphosys Ip Gmbh | Novel tricistronic vectors and uses therefor |
| US8557743B2 (en) | 2002-09-05 | 2013-10-15 | Dyax Corp. | Display library process |
| GB0309126D0 (en) | 2003-04-17 | 2003-05-28 | Neutec Pharma Plc | Clostridium difficile focussed antibodies |
| US20120202710A1 (en) | 2003-09-09 | 2012-08-09 | Integrigen, Inc. | Methods and compositions for generation of germline human antibody genes |
| TWI333977B (en) | 2003-09-18 | 2010-12-01 | Symphogen As | Method for linking sequences of interest |
| EP1742969A2 (en) | 2003-11-12 | 2007-01-17 | OncoMab GmbH | Methods of identifying neoplasm-specific antibodies and uses thereof |
| US20080003566A1 (en) | 2004-01-26 | 2008-01-03 | David Vaux | Molecular Analysis |
| ATE505727T1 (de) | 2004-05-26 | 2011-04-15 | Fraunhofer Ges Forschung | Isolation allergen-spezifischer immunoglobulin- gene aus humanen b-zellen von atopikern |
| MX2007000103A (es) | 2004-07-06 | 2007-05-11 | Bioren Inc | Bibliotecas de anticuerpos universales. |
| WO2006028987A2 (en) | 2004-09-02 | 2006-03-16 | Bioarray Solutions Ltd. | Nucleic acid amplification with integrated multiplex detection |
| US20060078898A1 (en) | 2004-10-12 | 2006-04-13 | Curry Bo U | Methods and compositions for reducing label variation in array-based comparative genome hybridization assays II |
| US8551920B2 (en) | 2005-02-01 | 2013-10-08 | Morpho Sys AG | Libraries and methods for isolating antibodies |
| RU2311927C2 (ru) * | 2005-08-15 | 2007-12-10 | Федеральное государственное унитарное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" | КОМБИНАТОРНАЯ ФАГМИДНАЯ БИБЛИОТЕКА ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫХ АНТИТЕЛ ЧЕЛОВЕКА, ОБОГАЩЕННАЯ АНТИТЕЛАМИ ПРОТИВ ВИРУСА ОСПОВАКЦИНЫ, РЕКОМБИНАНТНАЯ ФАГМИДНАЯ ДНК pHEN-2A8, СОДЕРЖАЩАЯ УНИКАЛЬНЫЙ ГЕН ОДНОЦЕПОЧЕЧНОГО АНТИТЕЛА ЧЕЛОВЕКА, СПОСОБНОГО НЕЙТРАЛИЗОВАТЬ ВИРУС ОСПОВАКЦИНЫ И ВИРУС ОСПЫ КОРОВ, И ИСКУССТВЕННОЕ ОДНОЦЕПОЧЕЧНОЕ АНТИТЕЛО ЧЕЛОВЕКА 2A8, СПОСОБНОЕ НЕЙТРАЛИЗОВАТЬ ВИРУС ОСПОВАКЦИНЫ И ВИРУС ОСПЫ КОРОВ |
| WO2007056441A2 (en) | 2005-11-07 | 2007-05-18 | Genentech, Inc. | Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences |
| CA2634387C (en) | 2005-12-20 | 2015-11-24 | Morphosys Ag | Novel collection of hcdr3 regions and uses therefor |
| EP2021795A4 (en) | 2006-05-04 | 2009-05-13 | Abmaxis Inc | CROSS SPECIES AND MULTI-SPECIAL PRESENTATION SYSTEMS |
| EP1918302A3 (en) * | 2006-05-18 | 2009-11-18 | AvantGen, Inc. | Methods for the identification and the isolation of epitope specific antibodies |
| JP2011504722A (ja) | 2007-08-21 | 2011-02-17 | モルフォシス・アー・ゲー | ジスルフィド結合形成のための改良された方法 |
| WO2009085462A1 (en) | 2007-12-19 | 2009-07-09 | Centocor, Inc. | Design and generation of human de novo pix phage display libraries via fusion to pix or pvii, vectors, antibodies and methods |
| EP2088432A1 (en) | 2008-02-11 | 2009-08-12 | MorphoSys AG | Methods for identification of an antibody or a target |
| US9873957B2 (en) | 2008-03-13 | 2018-01-23 | Dyax Corp. | Libraries of genetic packages comprising novel HC CDR3 designs |
| US8143007B2 (en) | 2008-03-13 | 2012-03-27 | National Institute Of Immunology | Nested primer sets for amplifying mouse immunoglobulin variable gene segments |
| CA2736277C (en) | 2008-09-10 | 2016-06-21 | Philochem Ag | Display library for antibody selection |
| JP2012508017A (ja) | 2008-11-07 | 2012-04-05 | ファブラス エルエルシー | 抗ｄｌｌ４抗体及びその使用 |
| WO2010130824A2 (en) * | 2009-05-15 | 2010-11-18 | Morphosys Ag | Collections and uses thereof |
| CN102449149B (zh) * | 2009-05-29 | 2014-04-23 | 莫佛塞斯公司 | 集合及其使用方法 |
| EP2528944B1 (en) | 2010-01-29 | 2015-08-12 | MorphoSys AG | Rodent combinatorial antibody libraries |
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009036379A2 (en) * | 2007-09-14 | 2009-03-19 | Adimab, Inc. | Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Biophysical Properties of Human Antibody Variable Domains;Stefan Ewert，et al.;《J. Mol. Biol.》;20030117;第325卷(第3期);第531-553页 * |
| Stability improvement of antibodies for extracellular and intracellular applications: CDR grafting to stable frameworks and structure-based framework engineering;Stefan Ewert，et al.;《Methods》;20041031;第34卷(第2期);第184–199页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP6253986B2 (ja) | 2017-12-27 |
| US9541559B2 (en) | 2017-01-10 |
| US20140206575A1 (en) | 2014-07-24 |
| IL226364A0 (en) | 2013-07-31 |
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| MX353795B (es) | 2018-01-30 |
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| US20120129717A1 (en) | 2012-05-24 |
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