CN103235055B - 双三元二维柱高效色谱法测定牙膏中三七皂苷r1和人参皂苷含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种双三元二维柱高效液相色谱法测定牙膏中三七皂苷R1和人参皂苷含量的方法，属于高效液相色谱法测定物质含量技术领域。包括以下步骤：（1）绘制标准曲线图；（2）将待测牙膏用乙醇溶解定容，称定重量；（3）制备待测溶液；（4）利用双三元高效液相色谱法二维色谱柱分离，通过多波长紫外检测器或二极管阵列检测器测定待测溶液中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1，根据标准曲线得出三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量。本发明方法简单，缩短了分析时间，实现了快速、方便、准确的检测牙膏中三七皂苷和人参皂苷等活性成分。
Description
技术领域
本发明涉及牙膏中三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、Re、Rg1含量的测定方法，属于高效液相色谱法测定物质含量技术领域。
背景技术
随着食品安全事件引起社会广泛关注，部分学者和社会舆论将视角延伸到“入口形”日化用品领域中，而牙膏作为口腔清洁用品是这一类产品的典型代表，关系到人身安全。功能单一的牙膏已不能满足人们的需求，根据传统中草药所具有性温、刺激小、安全无毒等特点，添加多种药物制成中药牙膏,以预防多种口腔疾病越来越多的受到人们的欢迎。目前，中药牙膏已占口腔清洁市场40～60%的比例。我国在中草药功效方面的研究有着辉煌悠久的历史，中草药功效型牙膏从面市至今已有几十年的历史，已经成为国内牙膏市场中的主类产品，一些国际日化用品企业为了加入中国市场也纷纷对中草药功效型牙膏进行开发和生产。
三七又名田七，为五加科植物三七Panaxnotoginseng(Burk.) F.H.Chen的干燥根和根茎。具有散血止瘀、消肿定痛等功效，并有着“金不换”的美誉。三七的主要有效成分为三七总皂苷类化合物，现已从三七中分离的皂苷成分已有75余种，其中人参皂苷Rb1（35%）、人参皂苷Rg1（40%）是三七总皂苷中含量最高的两种成分，而三七皂苷R1（15%）则是三七总皂苷的特征化合物。三七中人参皂苷Rg1和人参皂苷Re同属于20（S）-原人参三醇类，结构性质相近，极性相近，在液相色谱中的保留时间相近。
目前，口腔清洁用品市场中草药功能性牙膏的品类繁多，有些牙膏不仅仅添加一种或两种的中药有效成分，有些牙膏品种直接添加功能性的成熟的中药配方精华，如云南白药、双黄连等。牙膏基质为复杂的混合物，通常由摩擦剂、保湿剂、表面活性剂、增稠剂、甜味剂、色素、香精和活性添加物等组成。某些添加成分的化合物碳链比较长，在前处理中难以去除，同时，也对色谱柱的柱效有影响。用传统的高效液相色谱方法去分离、检测，其中的杂质对标准品氯化两面针碱的测定有干扰。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种双三元二维柱高效液相色谱法测定牙膏中三七皂苷R1和人参皂苷含量的方法，方法简单，缩短了分析时间，实现了快速、方便、准确的检测牙膏中三七皂苷和人参皂苷等活性成分。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：一种双三元二维柱高效液相色谱法测定牙膏中三七皂苷R1和人参皂苷含量的方法，包括以下步骤：（1）绘制三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的标准曲线图；
（2）称取待测牙膏放置于具塞离心管中，加入乙醇振荡、摇匀，用乙醇定容，密塞，称定重量；
（3）将步骤（1）称定重量后的具塞离心管超声处理，处理完成后冷却至室温，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，离心处理，取上清液用0.22μm的有机相滤膜过滤得待测溶液；
（4）利用双三元高效液相色谱法二维色谱柱分离，通过多波长紫外检测器或二极管阵列检测器测定待测溶液中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1，根据步骤（1）的标准曲线得出牙膏待测溶液中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量。
对流动相进行洗脱；第一维色谱柱为富集柱C18柱（2.1mm×100mm，5μm），第二维色谱柱为分析柱C18柱（4.6mm×250mm，5μm）。
采用C18二维色谱柱的优选测定的条件为：采用C18二维色谱柱，以乙腈和水为流动相，检测波长为203nm，进样量为10μL，色谱柱柱温为30℃，对流动相进行洗脱。
将上述步骤（4）中的流动相进行洗脱的优选程序如表1：
表1
十通阀的优选切换时间如表2：
表2
| 时间（min） | 阀 | 柱类型 |
| 进样 | 1-2 | 分析柱 |
| 2.500 | 10-1 | 富集柱+分析柱 |
| 4.750 | 1-2 | 分析柱 |
| 30.300 | 10-1 | 富集柱+分析柱 |
| 34.800 | 1-2 | 分析柱 |
步骤（2）和步骤（3）所用的乙醇为体积分数优选为75%的乙醇。
步骤（2）中每克待测牙膏定容到10mL。
步骤（3）中30℃超声处理优选为45分钟。
步骤（3）中10000rpm离心优选为2分钟。
三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的标准曲线图可采用本领域常规的标准曲线建立方法绘制，如外标法，根据标准品溶液的各浓度和对应峰面积的关系绘制标准曲线。
本发明所用仪器为双三元高效液相色谱仪 美国戴安公司 UltiMate 3000。
C18柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。C18二维色谱柱，为两个单独的C18色谱柱，两个C18色谱柱，为第一维色谱柱作为富集柱可选用C18（2.1mm×100mm ，5μm ）柱或性能相当者，第二维色谱柱作为分析柱可选用C18（4.6mm×250mm，5μm）柱或性能相当者。
本发明设备具有两套三元梯度洗脱泵，平行放置，一左一右，分别为左泵和右泵；两个泵是各自独立工作的，通过阀进行切换。
双三元高效液相色谱，为拥有两个独立压力泵的溶剂/流速双梯度三元高效液相色谱仪。
本发明采用了新的柱切换-二维色谱柱固定性液相色谱模式，实现牙膏中目的重要活性有效成分与其它干扰杂质的在线分离，减少了传统的离线分析样品制备方法中的繁琐的步骤，避免了被分析物由于过于复杂、冗繁的前处理所造成的损失，缩短了分析时间，提高了自动化程度，实现了快速、方便的牙膏中三七活性有效成分三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1的在线二维色谱柱检测。实验证明：该发明方法在牙膏中三七活性有效成分三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、Re、Rg1的含量测定中具有巨大的优越性。
在线二维色谱柱切换技术是通过改变切换阀位置实现进样器、不同流动相、不同色谱柱、检测器之间的变换连接，从而实现被分析物与其它干扰成分的分离，达到纯化与富集的目的，进而完成对被分析物的浓度测定。
柱切换技术是通过改变切换阀的位置，实现进样器、不同色谱柱、检测器之间的变换连接，从而实现被分析物与其它干扰成分的分离，达到纯化与富集的目的，进而完成对被分析物的浓度测定。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明方法操作简单，选择性好，排除了牙膏基质中干扰物的干扰，缩短了分析时间，实现了快速、方便、准确的检测牙膏中三七皂苷和人参皂苷等活性成分，解决了待测物质对色谱柱柱效高损耗的技术问题。
本发明能够使目标分析物的色谱峰与杂质色谱峰达到较好的基线分离，可以排除牙膏基质中干扰物的干扰，准确地对牙膏中的三七皂苷和人参皂苷进行定量分析，且分离效果好，线性范围宽，具有操作简单、快速选择性好、重现性好等优点，适于普遍推广，是现有检测技术的重要补充。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是实例1中非空白牙膏样品的色谱图；
1号峰为三七皂苷R1，2号峰为人参皂苷Rg1，3号峰为人参皂苷Re，4号峰为人参皂苷Rb1。
具体实施方式
实施例1
双三元二维柱高效液相色谱法测定牙膏中三七皂苷R1和人参皂苷含量的方法，包括以下步骤：（1）绘制三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的标准曲线图；
（2）准确称取待测牙膏2.0g放置于50mL具塞离心管中，加入10mL体积分数为75%的乙醇振荡、摇匀，用体积分数为75%的乙醇定容至20mL，密塞，称定重量；
（3）将步骤（1）称定重量后的具塞离心管30℃超声处理45分钟，取出冷却至室温，再称定重量，用体积分数为75%的乙醇补足减失的重量，10000rpm离心2分钟，取上清液用0.22μm的有机相滤膜过滤得待测溶液；
（4）利用双三元高效液相色谱法二维色谱柱分离，通过紫外检测器测定待测溶液中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1，根据步骤（1）的标准曲线得出牙膏待测溶液中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量；
测定条件为：采用C18二维色谱柱，以乙腈和水为流动相，检测波长为203nm，可同时设置次检测波长=245nm，用于对待测目标物的辅助鉴别，进样量为10μL，色谱柱柱温为30℃，流动相洗脱程序如下表3：
表3
第一维色谱柱为富集柱C18柱（2.1mm×100mm，5μm），第二维色谱柱为分析柱C18柱（4.6mm×250mm，5μm），十通阀的切换时间如下表4：
表4
| 时间（min） | 阀 | 柱类型 |
| 进样 | 1-2 | 分析柱 |
| 2.500 | 10-1 | 富集柱+分析柱 |
| 4.750 | 1-2 | 分析柱 |
| 30.300 | 10-1 | 富集柱+分析柱 |
| 34.800 | 1-2 | 分析柱 |
1、本发明方法的线性方程检出限及定量限
以各个浓度下化合物的浓度和色谱峰面积作线性回归分析得出标准曲线，在0.5～200μg/mL范围内，峰面积对浓度呈现良好的线性关系，线性回归方程和相关性系数见表5。依据色谱峰信噪比S/N > 3 ,S/N>10计算方法检出限和定量限，得到本方法的检出限4.64～8.77mg/kg，定量限15.48～29.24mg/kg。
表5
2、本发明方法的精密度试验
将浓度为25μg/mL的混合标准溶液重复进样7次，计算其RSD值，结果如下表6所示。
表6 方法精密度试验
3、回收率试验
采用三个不同浓度水平加标试验，按照该方法前处理步骤处理样品，根据标准曲线计算测定值，进而计算回收率，每个添加浓度重复两次试验，三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、Re、Rg1回收率试验结果见表7、表8。
表7 非空白牙膏样品加标回收率试验结果
计算结果显示，非空白牙膏样品加标回收率为84.29～113.45% 。
表8 空白样品加标回收率实验结果
计算结果显示，空白样品加标回收率为82.54～108.41% 。
计算结果显示，不同牙膏基质的回收率为82.54～113.45% 。
Claims (5)
1.一种双三元二维柱高效液相色谱法测定牙膏中三七皂苷R1和人参皂苷含量的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）绘制三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的标准曲线图；
（2）称取待测牙膏放置于具塞离心管中，加入乙醇振荡、摇匀，用乙醇定容，密塞，称定重量；
（3）将步骤（1）称定重量后的具塞离心管超声处理，处理完成后冷却至室温，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，离心处理，取上清液用0.22μm的有机相滤膜过滤得待测溶液；
（4）利用双三元高效液相色谱法，进行二维色谱柱分离，通过多波长紫外检测器或二极管阵列检测器测定待测溶液中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1，根据步骤（1）的标准曲线得出牙膏待测溶液中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量；
采用C18二维色谱柱测定；
第一维色谱柱为富集柱C18柱，内径为2.1mm，柱长为100mm，填料粒径为5μm，第二维色谱柱为分析柱C18柱，内径为4.6mm，柱长为250mm，填料粒径为5μm；
采用C18二维色谱柱测定的条件为，以乙腈和水为流动相，检测波长为203nm，进样量为10μL，色谱柱柱温为30℃，对流动相进行洗脱；
步骤（4）中的流动相进行洗脱的程序如下：
；
十通阀的切换时间如下：
。
2.如权利要求1所述的双三元二维柱高效液相色谱法测定牙膏中三七皂苷R1和人参皂苷含量的方法，其特征在于：步骤（2）和步骤（3）所用的乙醇为体积分数为75%的乙醇。
3.如权利要求1所述的双三元二维柱高效液相色谱法测定牙膏中三七皂苷R1和人参皂苷含量的方法，其特征在于：步骤（2）中每克待测牙膏定容到10mL。
4.如权利要求1所述的双三元二维柱高效液相色谱法测定牙膏中三七皂苷R1和人参皂苷含量的方法，其特征在于：步骤（3）中30℃超声处理45分钟。
5.如权利要求1所述的双三元二维柱高效液相色谱法测定牙膏中三七皂苷R1和人参皂苷含量的方法，其特征在于：步骤（3）中10000rpm离心2分钟。
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