CN103233075A - 一种基于转录组测序开发菊属植物ssr引物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及一种基于转录组测序开发菊属植物SSR引物的方法。利用EST‐SSR的种间转移性，在转录组测序的基础上，结合Perl编程语言方法，对大量序列信息进行批量处理，进行SSR序列查找和SSR标记引物设计，克服了SSR开发效率低、耗时久、成本高等障碍。选择菊属不同种的材料对设计的SSR引物进行验证，若有条带检测出，即为成功的SSR引物。应用本方法成功地设计了1788对SSR引物，为菊属SSR引物开发进而实现分子标记辅助选择育种和比较基因组学研究提供了新的方法和思路。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种基于转录组测序开发菊属植物SSR引物的方法。
背景技术
菊属是菊科(Asteraceae)的一属，约40种，多可供观赏，原产旧大陆亚热带及温带地区。主要分布在东亚，我国产19种，3变种及9栽培变种。主要有：野菊、毛华菊、甘菊、小红菊、紫花野菊、菊花脑、栽培菊花等。其中栽培菊花原产我国，是我国十大传统名花和世界四大切花之一，距今已有1600多年的栽培历史，由毛华菊、野菊和紫花野菊等天然杂交并经人工长期选育而成。菊属植物花型、花色、株型等极其丰富，是盆栽、切花和园林地被应用的重要花卉种类，具有很高的观赏和应用价值，在花卉生产中占有十分重要的地位。
分子标记能在DNA水平上反映植物遗传基础的差异，是植物遗传育种领域内的一项新兴技术。简单重复序列（SSR）广泛分布于各类真核生物基因组的不同位置，由于SSR的重复次数不同和重复程度不同，使其呈现高度的多态性。与其它分子标记技术相比，SSR标记具有多态信息含量高、共显性遗传、技术简单、重复性好、特异性强等特点，被认为是可靠性最高的分子标记类型之一。但是使用该技术的前提是要有相应的SSR引物。SSR标记可分为基因组SSR（gSSR）和转录组SSR（EST‐SSR），与gSSR标记相比，从EST数据库中获得SSR建立EST‐SSR标记更经济，效率更高。最关键的是，EST‐SSR标记来源于DNA的转录区域，相比于gSSR标记，EST‐SSR种间通用性更高，即基于一种材料开发的EST‐SSR引物，往往在一个属内甚至属间均能适用。
近年来随着第二代测序技术的成熟，转录组序列的数量与日俱增，使得通过数据库搜寻法获得EST‐SSR成为可能。但是从第二代测序技术产生的数据往往极其巨大，对大量的EST序列进行格式处理、剔除冗余序列等仍是一个不小的工作量。Perl是一种自由且功能强大的编程语言。它被用作Web编程、数据库处理、XML处理以及***管理等等。随着生物信息学的发展，Perl更多的应用到了生物数据的操作和检索中，使得对大批量数据统一处理成为可能。在此基础上进行EST‐SSR引物开发更能提高分离效率，节约时间和资金。
目前研究表明，虽然有一定数目的菊属转录组序列信息在NCBI数据库中能检索到，但是多是采用文库构建所得，总体数量较少，并且尚未有相关SSR引物报道。因此，如果利用第二代高通量测序技术获得菊属内某一材料的转录组序列信息，批量开发EST‐SSR引物的技术成熟，将会对菊属重要性状基因的定位、克隆及分子标记辅助选择育种和比较基因组学研究等起重要推动作用。
发明内容
本发明的目的是针对EST‐SSR具有较高的种间通用性，提供一种基于转录组测序开发菊属植物SSR引物的方法。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一种基于转录组测序开发菊属植物SSR引物的方法，包括：
1）转录组数据的获得
合成并纯化菊属植物cDNA，做末端修复、加A并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增，建好的测序文库用Illumina HiSeqTM2000进行测序获得菊属植物转录组序列数据；
2）SSR序列的识别
安装Perl语言5.16版本，从http://pgrc.ipk‐gatersleben.de/misa/下载est_timmer.pl并运行est_timmer.pl去除所述的转录组序列中过短的序列和过长的序列；
从http://www.bioinformatics.org/cd‐hit/中下载CD_HIT软件，利用其去除冗余序列；
从http://pgrc.ipk‐gatersleben.de/misa/下载misa.pl程序以识别和定位序列中的SSR，参数设置如下：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的重复次数至少为15、6、5、4、3；
3）SSR引物的设计
使用primer3模块http://sourceforge.net/projects/primer3/files/primer3/1.1.4/primer3‐1.1.4‐WINXP.zip/download批量设计SSR引物，引物设计参数为引物长度18‐22bp，Tm55‐65℃，其中前后引物Tm值相差4℃，产物大小为100‐400bp；
4）SSR引物在菊属植物内的有效性和通用性鉴定
提取菊属及其近缘属不同野生种材料的DNA，利用引物开发所用材料的DNA进行设计引物有效性PCR鉴定，若有100‐400bp扩增子检测出，该引物即为有效引物；利用其近缘属不同野生种材料的DNA进行引物通用性鉴定，若有100‐400bp扩增子检测出，该引物即具有通用性；利用多对引物对菊属及其近缘属不同野生种材料的DNA进行PCR扩增，用于聚类分析验证整个体系的有效性和通用性。
其中步骤1）中所述的片段大小选择标准是选择大小为200‐700bp的片段用于下一步PCR扩增。
步骤2）中所述的过短的序列指小于100bp的序列；所述的过长序列是指大于2000bp的序列。
步骤4）中所述的PCR鉴定的反应体系采用10μL的反应体系，其中包括50ng模板DNA，1.5mmol·L‐1Mg2+、400μmol·L‐1dNTPs、0.5U TaqDNA聚合酶、1μmol·L‐1引物及10×PCR buffer。SSR反应程序为：94℃预变性5min；然后进入30个循环94℃变性30s，55‐60℃复性30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸10min；反应结束后，产物加入2μL loading buffer，以100bp DNA ladder为DNA分子量标准，采用8%的非变性聚丙烯酰胺进行电泳，电泳缓冲液为0.5×TBE，200V稳压电泳2‐2.5h，至loading buffer移到凝胶底部时电泳结束。电泳结束后，采用银染法染色，最后将凝胶置于凝胶成像***上拍照。所有数据重复两次，选择100‐400bp内有重复条带的数据为“1”，没有条带的为“0”，使用开发材料DNA扩增出数据“1”的引物即为有效引物；使用近缘材料DNA扩增出“1”的引物即具有通用性；材料之间的遗传相关性研究采用NTSYS‐pc2.1软件的聚类分析模式，使用UPGMA程序构建树状聚类图谱，与文献报道的树状聚类图谱对比，验证整个引物开发体系的有效性和通用性。
所述的菊属植物选自野菊、毛华菊、甘菊、小红菊、紫花野菊、菊花脑、栽培菊花中的任意一种。
基于转录组测序开发的菊属植物SSR引物，包括以下的任意一对引物：
引物1：正向引物：ACACCCGTGTGTTCTTCTGA(SEQ ID NO.1);
反向引物：TGCTTGCAATTTTGCTCAAC(SEQ ID NO.2)；
引物2：正向引物：CCGACGTAATCATCGGCTAT(SEQ ID NO.3);
反向引物：CTTGTCCACGGTTTCCTTGT(SEQ ID NO.4);
引物3：正向引物：GGCTCAATAGCGCAATTCTC(SEQ ID NO.5);
反向引物：AACTACAACCTGGCCAGCAG(SEQ ID NO.6);
引物4：正向引物：AATGAAAATGGCGACTCTCG(SEQ ID NO.7);
反向引物：AATCAAAGTGTTGGAACGGC(SEQ ID NO.8);
引物5：正向引物：AAGAAGAACACCAACGCACC(SEQ ID NO.9);
反向引物：CAGAACCTGCACGCATTCTA(SEQ ID NO.10);
引物6：正向引物：TCCCCAGAACCAAAACCATA(SEQ ID NO.11);
反向引物：CAGAACCTGCACGCATTCTA(SEQ ID NO.12);
引物7：正向引物：AAACGTGGTTTGCTGAAAGG(SEQ ID NO.13);
反向引物：ATTGGGCAAACATCAAAAGC(SEQ ID NO.14);
引物8：正向引物：CGTCACCCTTGGCTGTTAAT(SEQ ID NO.15);
反向引物：GGTTGAAAGCAAATAGGGCA(SEQ ID NO.16);
引物9：正向引物：AGCCAGGGTGTTGAAAATTG(SEQ ID NO.17);
反向引物：ATCAGTCACCCCACTCGAAC(SEQ ID NO.18);
引物10：正向引物：TCAAAACTCACCCACTTTCTTACA(SEQ ID NO.19);
反向引物：TATCGGGTAGCTTTGATCGG(SEQ ID NO.20);
引物11：正向引物：TGCATGTACCTCTATGTTTCTCTCT(SEQ ID NO.21);
反向引物：CCATTGAAGTTTGGTGTTGAGA(SEQ ID NO.22);
引物12：正向引物：GCTCATGTTGATCACGGAAA(SEQ ID NO.23);
反向引物：CGTCTCCATTACGTTCTCCC(SEQ ID NO.24);
引物13：正向引物：CATACCGGATGAGCTGACCT(SEQ ID NO.25);
反向引物：TTACTCCATCTTGATGGCCC(SEQ ID NO.26);
引物14：正向引物：TGGAGGTTGTGTGGTCAAAA(SEQ ID NO.27);
反向引物：ATGTCCGGCATTACAACCAT(SEQ ID NO.28);
引物15：正向引物：AAGTCCTCTGATGCCACGTT(SEQ ID NO.29);
反向引物：TCTTCGGGTTCATCCTCATC(SEQ ID NO.30);
引物16：正向引物：AGATGTCTTGATTGGCCCTG(SEQ ID NO.31);
反向引物：GGCAACACCCTCAACATTCT(SEQ ID NO.32);
引物17：正向引物：CCATCATCCTCATCAAGCCT(SEQ ID NO.33);
反向引物：CTCCCTTGAATCCTCCCTTC(SEQ ID NO.34);
引物18：正向引物：TCAACTGAAGTGGATGCTCG(SEQ ID NO.35);
反向引物：CGGCCAACAAAGATCTGAAT(SEQ ID NO.36);
有益效果 本发明提供的基于转录组测序，高效地完成对菊属SSR引物开发和利用的技术，与现有技术相比具有如下优点和积极效果：
（1）本发明利用第二代高通量测序技术，获得转录组序列，极大地增加了引物开发所用的原始数据。
（2）本发明利用生物信息学技术进行菊属SSR标记引物的开发，克服了菊属SSR引物获取困难和无SSR引物的问题，拓宽了菊属分子标记辅助育种的思路和领域，扩展了栽培菊花种质鉴定的方式。
（3）在Perl语言的基础上，使用est_timmer，CD_HIT，misa和primer3等软件，批量处理数据，开发SSR引物，提高了开发效率，节约了时间和资金。
（4）使用菊属不同种植物对设计的引物进行PCR鉴定，结果真实可靠。
（5）在本发明基础上，使利用SSR分子标记技术进一步开展菊属植物遗传育种研究成为可能，同时还可结合现代分子生物学等手段对菊属植物进行染色体组分析、起源演化及亲缘关系研究等，有重要的理论意义和现实意义。
附图说明
图1、不同类型的SSR重复类型比例
图2、利用20对SSR引物构建的UPGMA聚类图谱
A‐E：在遗传相似系数为0.18基础上将所有材料分为6组。A：菊组；B：太行菊组；C：蒿组；D：除虫菊组；E:菊蒿组；F：芙蓉菊组。
图3部分引物有效性及通用型验证
A:引物7仅在菊属内部材料中检测到扩增（引物在菊属内部有效且通用）。B：引物14仅在菊属内部材料中检测到扩增。C：引物6在菊属及其近缘属材料间均能检测到扩增（引物在菊属内部及其近缘属间有效且通用）。1‐14：黄蒿、黄金艾蒿、牡蒿、大籽蒿、芙蓉菊、菊蒿、太行菊、小滨菊、短舌匹菊、盐菊、多叶亚菊、细裂亚菊、矶菊、纪伊潮菊。15‐30:大岛野路菊、野路菊、栽培菊‘神马’、毛华菊、异色菊、紫花野菊、菊花脑、神农架野菊、杭州野菊、龙脑菊、那贺川野菊、南京野菊、泡黄金菊、萨摩野菊、小红菊、甘菊。
具体实施方式
本发明提供的基于转录组高通量测序，并结合Perl语言方法进行SSR序列查找和SSR标记引物设计和验证，其具体实施方式如下：
1）转录组数据的获得
采集菊属植物菊花脑叶片和茎，用纱布包裹并置于液氮罐里，速冻后置于‐70℃冰箱内保存。使用Trizol试剂提取菊花脑的总RNA。提取样品总RNA后，用带有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA。加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物（random hexamers）合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNApolymerase I合成第二条cDNA链，在经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、加A并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增，建好的测序文库用Illumina HiSeqTM2000进行测序。
2）SSR序列的识别
安装Perl语言5.16版本，默认安装在C盘根目录下。从http://pgrc.ipk‐gatersleben.de/misa/下载est_timmer.pl并运行est_timmer.pl去除EST序列中过短的序列（<100bp）和过长的序列（>2000bp），运行命令为：C:\perl\bin>perl est_trimmer.pl A.fasta–amb=2,50–tr5=T,5,50–tr3=A,5,50–cut=100,2000。输出两个文件A.fasta.log和A.fasta.results(A为文件代号)。
从http://www.bioinformatics.org/cd‐hit/中下载CD_HIT软件，利用其去除冗余序列：把A.fasta.results复制到cd_hit文件夹中并重命名为B.fasta，运行cd_hit.exe，Perl环境下运行命令为：C:\perl\bin\cd_hit>cd_hit.exe–i B.fasta–o C.fasta–c1.00–n5–M2000，输出三个文件，其中C.fsata文件用于下一步处理(A、B和C均为文件代号)。
从http://pgrc.ipk‐gatersleben.de/misa/下载misa.pl程序以识别和定位序列中的SSR；参数设置如下：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的重复次数至少为15、6、5、4、3。
将C.fsata文件拷贝至C盘perl\bin目录下，Perl环境下运行命令：C:\perl\bin>perl misa.plC.fasta，运行后产生C.fasta.misa和C.fasta.statistics两个文件，其中C.fasta.misa用于后续引物设计。
3）SSR引物的设计
使用Perl环境下primer3模块批量设计SSR引物：引物设计参数为Tm55‐65℃，引物长度为18‐22bp。
运行p3_out.pl，Perl环境下运行命令为：C:\perl\bin>perl p3_in.pl C.fasta.misa，产生了一个名为C.fasta.p3in的primer3的输入文件；
再复制C.fasta.p3in文件到C盘perl\bin\primer3\bin根目录下，运行primer3_core.exe实现批量的引物设计，Perl环境下运行命令为：C:\perl\bin\primer3\bin>primer3_core.exe<C.fasta.p3in>C.fasta.p3out，产生一个名为C.fasta.p3out的文件；
最后将C.fasta.p3out文件复制至C盘perl\bin目录下，运行p3_out.pl，其命令为：C:\perl\bin>perl p3_out.pl C.fasta.p3out C.fasta.misa，运行后得到C.fasta.results文件，此即为设计好的引物。
4）SSR引物在菊属植物内的有效性和通用性鉴定
提取菊属及其近缘属不同野生种材料的DNA，用0.8%琼脂糖凝胶电泳法检测其质量，将DNA浓度稀释至50ng·μL‐1后置于‐20℃保存备用。利用引物开发所用材料的DNA进行引物设计成功率PCR鉴定；菊属及其近缘属不同野生种材料的DNA用于聚类分析验证。
PCR反应体系采用10μL的反应体系，其中包括50ng模板DNA，1.5mmol·L‐1Mg2+、400μmol·L‐1dNTPs、0.5U TaqDNA聚合酶、1μmol·L‐1引物及10×PCR buffer。SSR反应程序为：94℃预变性5min；然后进入30个循环94℃变性30s，55℃‐60℃复性30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸10min。
反应结束后，产物加入2μL loading buffer，以100bp DNA ladder为DNA分子量标准，采用8%的非变性聚丙烯酰胺进行电泳，电泳缓冲液为0.5×TBE，200V稳压电泳2‐2.5h，至loadingbuffer移到凝胶底部时电泳结束。电泳结束后，采用银染法染色，最后将凝胶置于凝胶成像***上拍照。所有数据重复两次，选择100‐400bp内有重复条带的数据为“1”，没有条带的为“0”。使用开发材料DNA扩增出数据“1”的引物即为有效引物；使用近缘材料DNA扩增出“1”的引物即具有通用性；材料之间的遗传相关性研究采用NTSYS‐pc2.1软件的聚类分析模式，使用UPGMA程序构建树状聚类图谱，与文献报道的树状聚类图谱对比，验证整个引物开发体系的有效性和通用性。
实施例1：
应用上述方法使用菊花脑作为材料进行高通量测序，共计产生70895条转录组序列，设计SSR引物1788对，具体说明如下：
以菊属植物菊花脑为材料，收集茎叶进行转录组高通量测序，测序共取得70895条转录组序列，去冗余后共检测到2813条潜在的SSR序列，占总数的39.68%，其中AC/TG含量最高，其次为CA/GT和CCA/GGT（图1）。使用primer3.0批量设计软件共设计获得SSR引物1788对。
从1788对设计的SSR引物中随机抽选100对，利用菊花脑DNA进行引物设计成功率检测，结果表明，有81对SSR引物在100‐400bp检测到清晰条带，说明引物设计成功率较高。选取20对引物对30份菊属及其近缘属材料进行验证，结果表明，18对引物在所有材料(黄蒿、黄金艾蒿、牡蒿、大籽蒿、芙蓉菊、菊蒿、太行菊、小滨菊、短舌匹菊、盐菊、多叶亚菊、细裂亚菊、矶菊、纪伊潮菊、大岛野路菊、野路菊、栽培菊‘神马’、毛华菊、异色菊、紫花野菊、菊花脑、神农架野菊、杭州野菊、龙脑菊、那贺川野菊、南京野菊、泡黄金菊、萨摩野菊、小红菊、甘菊)中检测到清晰条带，有2对引物（引物7，引物14）仅在菊属中检测到条带。说明18对引物中，有16对（引物1～6,引物8～13，引物15～16）可以在菊属及其近缘属间的有效性和通用性，有2对引物仅在菊属内部具有有效性和通用性。利用其数据构建的树状聚类图谱（图2）符合目前已发表的数据，说明此利用菊花脑转录组开发SSR引物的方法，适用于菊属SSR引物的开发。
Claims (6)
1.一种基于转录组测序开发菊属植物SSR引物的方法，其特征在于包括：
1）转录组数据的获得
合成并纯化菊属植物cDNA，做末端修复、加A并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增，建好的测序文库用Illumina HiSeqTM2000进行测序获得菊属植物转录组序列数据；
2）SSR序列的识别
安装Perl语言5.16版本，从http://pgrc.ipk‐gatersleben.de/misa/下载est_timmer.pl并运行est_timmer.pl去除所述的转录组序列中过短的序列和过长的序列；
从http://www.bioinformatics.org/cd‐hit/中下载CD_HIT软件，利用其去除冗余序列；
从http://pgrc.ipk‐gatersleben.de/misa/下载misa.pl程序以识别和定位序列中的SSR，参数设置如下：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的重复次数至少为15、6、5、4、3；
3）SSR引物的设计
使用primer3模块http://sourceforge.net/projects/primer3/files/primer3/1.1.4/primer3‐1.1.4‐WINXP.zip/download批量设计SSR引物，引物设计参数为引物长度18‐22bp，Tm55‐65℃，其中前后引物Tm值相差4℃，产物大小为100‐400bp；
4）SSR引物在菊属植物内的有效性和通用性鉴定
提取菊属及其近缘属不同野生种材料的DNA，利用引物开发所用材料的DNA进行设计引物有效性PCR鉴定，若有100‐400bp扩增子检测出，该引物即为有效引物；利用其近缘属不同野生种材料的DNA进行引物通用性鉴定，若有100‐400bp扩增子检测出，该引物即具有通用性；利用多对引物对菊属及其近缘属不同野生种材料的DNA进行PCR扩增，用于聚类分析验证整个体系的有效性和通用性。
2.根据权利要求1所述的基于转录组测序开发菊属植物SSR引物的方法，其特征在于步骤1）中所述的片段大小选择标准是选择大小为200‐700bp的片段用于下一步PCR扩增。
3.根据权利要求1所述的基于转录组测序开发菊属植物SSR引物的方法，其特征在于步骤2）中所述的过短的序列指小于100bp的序列；所述的过长序列是指大于2000bp的序列。
4.根据权利要求1所述的基于转录组测序开发菊属植物SSR引物的方法，其特征在于步骤4）中所述的PCR鉴定的反应体系采用10μL的反应体系，其中包括50ng模板DNA，1.5mmol·L‐1Mg2+、400μmol·L‐1dNTPs、0.5U TaqDNA聚合酶、1μmol·L‐1引物及10×PCR buffer。SSR反应程序为：94℃预变性5min；然后进入30个循环94℃变性30s，55‐60℃复性30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸10min；反应结束后，产物加入2μL loading buffer，以100bp DNA ladder为DNA分子量标准，采用8%的非变性聚丙烯酰胺进行电泳，电泳缓冲液为0.5×TBE，200V稳压电泳2‐2.5h，至loading buffer移到凝胶底部时电泳结束。电泳结束后，采用银染法染色，最后将凝胶置于凝胶成像***上拍照。所有数据重复两次，100‐400bp内选择有重复条带的数据为“1”，没有条带的为“0”，其特征在于使用开发材料DNA扩增出数据“1”的引物即为有效引物；使用近缘材料DNA扩增出“1”的引物即具有通用性；材料之间的遗传相关性研究采用NTSYS‐pc2.1软件的聚类分析模式，使用UPGMA程序构建树状聚类图谱，与文献报道的树状聚类图谱对比，验证整个引物开发体系的有效性和通用性。
5.根据权利要求1所述的基于转录组测序开发菊属植物SSR引物的方法，其特征在于所述的菊属植物选自野菊、毛华菊、甘菊、小红菊、紫花野菊、菊花脑、栽培菊花中的任意一种。
6.基于转录组测序开发的菊属植物SSR引物，其特征在于包括以下的任意一对引物：
引物1：正向引物：SEQ ID NO.1，反向引物：SEQ ID NO.2；
引物2：正向引物：SEQ ID NO.3，反向引物：SEQ ID NO.4；
引物3：正向引物：SEQ ID NO.5，反向引物：SEQ ID NO.6；
引物4：正向引物：SEQ ID NO.7，反向引物：SEQ ID NO.8；
引物5：正向引物：SEQ ID NO.9，反向引物：SEQ ID NO.10；
引物6：正向引物：SEQ ID NO.11，反向引物：SEQ ID NO.12；
引物7：正向引物：SEQ ID NO.13，反向引物：SEQ ID NO.14；
引物8：正向引物：SEQ ID NO.15，反向引物：SEQ ID NO.16；
引物9：正向引物：SEQ ID NO.17，反向引物：SEQ ID NO.18；
引物10：正向引物：SEQ ID NO.19，反向引物：SEQ ID NO.20；
引物11：正向引物：SEQ ID NO.21，反向引物：SEQ ID NO.22；
引物12：正向引物：SEQ ID NO.23，反向引物：SEQ ID NO.24；
引物13：正向引物：SEQ ID NO.25，反向引物：SEQ ID NO.26；
引物14：正向引物：SEQ ID NO.27，反向引物：SEQ ID NO.28；
引物15：正向引物：SEQ ID NO.29，反向引物：SEQ ID NO.30；
引物16：正向引物：SEQ ID NO.31，反向引物：SEQ ID NO.32；
引物17：正向引物：SEQ ID NO.33，反向引物：SEQ ID NO.34；
引物18：正向引物：SEQ ID NO.35，反向引物：SEQ ID NO.36。
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