CN103224555B - 植物发育相关蛋白GhSOC1及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物发育相关蛋白GhSOC1及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，命名为GhSOC1蛋白，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物开花时间相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明从陆地棉中克隆出了棉花GhSOC1基因，并成功构建植物过表达载体，采用农杆菌介导的花序浸染法转化出发植物，转基因植物比出发植物开花提前且能稳定遗传。本发明对于植物的育种具有重大价值。

Description

植物发育相关蛋白GhSOC1及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及一种植物发育相关蛋白GhSOC1及其编码基因和应用。

背景技术

棉花是我国重要的经济作物之一，在国民生产中占有重要地位，粮棉争地在一定程度限制了棉花的发展。短季棉品种的选育和推广，可以缓解粮棉争地的矛盾，是实现粮棉双丰收的有效途径。

早熟性作为棉花的重要性状之一，成为陆地棉重要的育种目标。研究表明，开花早晚与棉花的早熟性密切相关。因此，克隆开花相关基因，对其进行表达分析和转基因功能验证，可以为短季棉育种提供优质的基因资源。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物发育相关蛋白GhSOC1及其编码基因和应用。

本发明提供的蛋白质，获自棉花品种“中棉所36”，命名为GhSOC1蛋白，是如下（a）或（b）：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物开花时间相关的由序列1衍生的蛋白质。

为了使（a）中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6（通常为5个）	RRRRR
Poly-His	2-10（通常为6个）	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述（b）中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述GhSOC1蛋白的基因（命名为GhSOC1基因）也属于本发明的保护范围。

所述GhSOC1基因为如下(1）或(2）或(3）或（4）或（5）所述的DNA分子：

（1）序列表中序列2自5’末端第102至767位核苷酸所示的DNA分子；

（2）序列表中序列2自5’末端第102至785位核苷酸所示的DNA分子；

（3）序列表中序列2所示的DNA分子；

（4）在严格条件下与（1）或（2）或（3）限定的DNA序列杂交且编码与植物开花时间相关的蛋白的DNA分子；

（5）与（1）或（2）或（3）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码与植物开花时间相关的蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65oC下杂交，然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜一次。

含有所述GhSOC1基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因。

所述重组载体具体可为在载体pRI101-AN的多克隆位点（如SalⅠ和SacⅠ酶切位点之间）***所述GhSOC1基因得到的重组质粒。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是所述GhSOC1基因导入目的植物，得到开花时间早于所述目的植物的转基因植物。携带所述GhSOC1基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。所述GhSOC1基因具体可通过所述重组质粒导入所述目的植物中。所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥，如哥伦比亚生态型拟南芥。

本发明还保护所述GhSOC1蛋白或所述GhSOC1基因在调控植物开花时间中的应用。所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥，如哥伦比亚生态型拟南芥。

本发明从陆地棉中克隆出了棉花GhSOC1基因，并成功构建植物过表达载体，采用农杆菌介导的花序浸染法转化出发植物，转基因植物比出发植物开花提前且能稳定遗传。本发明对于植物的育种具有重大价值。

附图说明

图1为GhSOC1基因的时空表达模式分析结果。

图2为重组质粒pRI101-GhSOC1的结构示意图。

图3为部分样本的PCR鉴定电泳图。

图4为部分样本的southern杂交结果。

图5为长日照条件下的开花时间、莲座叶数和茎生叶数。

图6为转基因植株和哥伦比亚生态型拟南芥的表型照片。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。棉花品种“中棉所36”：中国农业科学院棉花研究所。农杆菌LBA4404：TAKARA，Code：9115。载体pRI101-AN：TAKARA，Code：3262。哥伦比亚生态型拟南芥，英文名称为Arabidopsisthaliana(ecotypecolumbia)：ABRCseedstock，OhioStateUniversityfacility。

实施例1、GhSOC1蛋白及其编码基因的发现

一、RNA提取

1、1ml提取液加入2%终体积（20μl）的巯基乙醇，65℃预热。

2、称100mg棉花品种“中棉所36”的组织在液氮中研磨，要求组织在离开活体的时候立即放入液氮保存，且研钵预冷，在研磨后液氮快挥发完时，快速将组织粉末刮入65℃预热的提取液中，马上剧烈震荡，65℃温浴3-5min,其间震荡4-5次。

3、加入等体积的氯仿：异戊醇，剧烈震荡10min，4℃、13000rpm离心5min。

4、取上清液，加入等体积氯仿：异戊醇，剧烈震荡10min，4℃、13000rpm离心5min。

5、取上清液，加入1/4体积的10mol/LLicl,轻轻混匀，4℃过夜（3-6h），沉淀RNA。

6、将溶液4℃、13000rpm，离心12min,倒掉上清液，将沉淀溶于400μlEPC水中。

7、加入等体积的酚，马上剧烈震荡，4℃、13000rpm离心5min，吸上清液。

8、加入等体的氯仿：异戊醇（24：1），马上剧烈震荡，4℃、10000rpm离心5min。

9、取上清液，加入0.1倍体积的3mol/L的醋酸钠、2.5倍体积的无水乙醇，-70℃沉淀30分钟以上。

10、4℃、13000rpm离心20min，弃上清液。

11、70%酒精清洗1-2次，风干，溶于40μlDEPC水，-80℃保存，检测备用。

二、cDNA制备

使用clontech公司的SMARTScribe^TMreversetranscriptase，使用前离心。

1、将RNA-free管放入冰上，做好标记，加入2μgTotalRNA，1ul20μMoligo(dT)₂₀，加RNA-free水到5μl配成mix，72℃、3min后置于冰上。

2、准备cDNASynthesisMix：2μl5XFirst-StrandBuffer，1μldNTP，1μl20mMDTT，1μl100U/μlSMAATScribeRT；将10μlcDNAmix加入到RNA/Primermixture中，轻柔混匀，离心；

3、42℃孵育60-90min，70℃加热15℃终止反应，1μl检测，-20℃保存备用。

三、基因的克隆方法

GhSOC1基因的克隆主要利用生物信息学、RACE-PCR技术完成。

1、根据构建的cDNA文库结合电子克隆技术，对EST进行序列拼接。

2、进行3＇RACE以获得该基因完整的ORF。

3、根据已经获得的该基因一段EST序列设计三条特异引物：GSP1、GSP2和GSP3；以棉花各个组织的混合样为模板，按照Clontech公司的SMARTRACEcDNAAmplificationKit说明书进行一链的合成。

4、按照试剂盒的要求进行TOUCHDOWN-PCR，然后将其产物进行50倍稀释后进行NEST-PCR，将获得的特异性的目标条带回收连接pGEMT-easy载体，然后送Invitrogen公司测序，最后通过拼接获得该基因的完整从cDNA序列。

将序列表的序列1所示的蛋白质命名为GhSOC1蛋白，由221个氨基酸残基组成。将编码GhSOC1蛋白的基因命名为GhSOC1基因，其cDNA如序列表的序列2所示，开放阅读框为序列表的序列2自5’末端第102至767位核苷酸所示。

实施例2、GhSOC1基因的时空表达模式分析

一、GhSOC1基因的组织表达模式

1、提取棉花品种“中棉所36”的不同组织的总RNA，并分别反转录为cDNA。

2、以步骤1得到的cDNA的5倍体积稀释液为模板，进行荧光定量PCR。

用于检测GhSOC1基因的表达量的引物如下：

F:5’-AGCATGCAGTGGCAGCATCTGA-3’；

R:5’-TGGCTCTGACGCGGGTTACG-3’。

用于检测内参基因（actin）的表达量的引物对如下：

F:5’-ATCCTCCGTCTTGACCTTG-3’；

R:5’-TGTCCGTCAGGCAACTCAT-3’。

荧光定量PCR反应体系：10μlSYBRPremixExTag，0.8μlF，0.8μlR，2μlcDNA模板，6μlddH₂O，0.4μlROXReferenceDye，总体积20ul。

荧光定量PCR反应程序：95℃预变性1min；95℃变性5s、60℃退火30s、72℃延伸30s，40个循环；72℃延伸10min；在72℃，30s处收集荧光信号。

采用相对定量ΔΔCt法分析。

GhSOC1基因的在各个组织中的表达模式（相对表达量）见图1A。结果表明：GhSOC1基因在顶芽和叶片中优势表达，根、茎、花中表达量低。

二、GhSOC1基因在顶芽不同发育时期的表达模式

方法同步骤一。

GhSOC1基因在顶芽不同发育时期的表达模式见图1B。图1B中，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ分别代表第一片真叶到第六片真叶展平时期的顶芽。

实施例3、GhSOC1基因的应用

一、重组质粒的构建

1、提取棉花品种“中棉所36”的叶片的总RNA并反转录为cDNA。

2、以步骤1的cDNA为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

F1：5’-ACATATGCCCGTCGACATGGTGAGGGGAAAGACTC-3；

R1：5’-GATCGGGGAAATTCGAGCTCGATAAGTTGGCAATGCCATC-3’。

3、用限制性内切酶SalⅠ和SacⅠ双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。

4、用限制性内切酶SalⅠ和SacⅠ双酶切载体pRI101-AN，回收约10330bp的载体骨架。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pRI101-GhSOC1。根据测序结果，对重组质粒pRI101-GhSOC1进行结构描述如下：在载体pRI101-AN的SalⅠ和SacⅠ酶切位点之间***了序列表的序列2自5’末端第102-785位核苷酸所示的双链DNA分子。重组质粒pRI101-GhSOC1的结构示意图见图2。

二、GhSOC1基因拟南芥的获得

1、将重组质粒pRI101-GhSOC1导入农杆菌LBA4404感受态细胞，得到重组农杆菌菌。

2、将哥伦比亚生态型拟南芥种子消毒后在无菌滤纸上晾干，然后将其挑至MS固体培养基上，用封口膜封口，再包上锡箔纸放置4℃春化48h，然后去掉锡箔纸并转移至光温培养箱（22℃；16h光照/8h黑暗）进行培养，7天后移栽至土中并转移至培养室（22℃；16h光照/8h黑暗）。

3、将步骤1得到的重组农杆菌接种至5ml含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基，28℃、180rpm振荡过夜；然后以1:50的体积比转接到200mlLB液体培养基，28℃、180rpm培养至OD_600nm=1.2-1.6；然后5000rpm离心10min，收集菌体，将菌体重悬于渗透缓冲液（含5g/100mL蔗糖、体积百分含量为0.02%的silwet-77的水溶液），得到OD_600nm=0.6-0.8的菌悬液。

4、将步骤2得到的拟南芥的花在步骤3得到的菌悬液中浸染50s，然后黑暗培养24h，然后在培养室继续培养（22℃；16h光照/8h黑暗），待果荚成熟后收集种子，即为T0代种子。

5、将T0代种子消毒春化后播种于含50μg/ml卡那霉素的1/2MS固体培养基，长出的植株即为T0代植株。

6、取T0代植株的叶片，提取总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，用F2(5’-TTCCCACTGAATCAAAGGCCAT-3’)和R2(5’-CAATCTGTTGAGTTGGGTTGCAC-3’)组成的引物对进行PCR鉴定（靶序列约为1200bp）。部分样本的PCR鉴定电泳图见图3(CK1为以水为模板的阴性对照,CK2为以重组质粒pRI101-GhSOC1为模板的阳性对照)。

7、将PCR鉴定为阳性的T0代植株自交并收获T1代种子，将T1代种子消毒春化后播种于含50μg/ml卡那霉素的1/2MS固体培养基，长出的植株即为T1代植株，采用相同的方法依次得到T2代植株、T3代植株和T4代植株。对于某T0代植株，如果其随机抽样检测的T1代植株、T2代植株、T3代植株和T4代植株均能在含有卡那霉素的培养基上生长，该T0代植株及其子代为1个稳定的转GhSOC1基因株系。共得到5个稳定的转GhSOC1基因株系，依次命名为S-8株系、S-6株系、S-4株系、S-2株系和S-1株系。

8、分别提取S-8株系、S-6株系、S-4株系、S-2株系和S-1株系的T4代植株的基因组DNA，采用序列表的序列2所示的DNA分子作为探针进行southern杂交，部分结果见图4(P为以重组质粒pRI101-GhSOC1为模板的阳性对照)。结果表明，各个株系中，目的基因均为单拷贝。

三、转空载体植株的获得

将出发质粒代替重组质粒进行步骤二，得到转空载体植株。

四、表型鉴定

分别将S-6株系、S-4株系和S-2株系的T4代种子、哥伦比亚生态型拟南芥的种子、转空载体对照植株的T4代种子进行如下操作：播种于1/2MS固体培养基，在长日照条件（22℃；16h光照/8h黑暗）下培养，统计开花时间（即从播种至第一朵花开放所历经的天数）、该植株初次开花当天统计莲座叶数和茎生叶数。进行三次重复实验，每次重复实验中每个株系取20粒种子。

结果见表1和图5（**代表P<0.05，***代表P<0.001）。

表1长日照条件下的统计数据

表型	开花时间	莲座叶数	茎生叶数
				哥伦比亚生态型拟南芥	29.29±1.312	10.94±0.827	2.76±0.437
转空载体对照植株	29.36±1.216	10.89±0.628	2.73±0.492
				S-6株系	24.94±1.983	7.24±0.903	3.82±0.636
S-4株系	26.56±1.822	7.61±0.850	3.06±0.539
				S-2株系	26.00±1.745	7.74±0.548	4.05±0.900

结果表明，在长日照条件下，转基因植株开花提前3.75天，莲座叶减少3.52片，茎生叶增加0.85片，均达到极显著水平。

某次重复实验中，S-4株系的植株初次开花3天后的表型，以及与S-4株系进行平行实验的哥伦比亚生态型拟南芥的表型见图6。图6中，A中左边为哥伦比亚生态型拟南芥，右边为S-4株系的植株（35S::GhSOC1），B是哥伦比亚生态型拟南芥的结荚状况，C是S-4株系的植株的结荚状况。

Claims (1)

1.GhSOC1蛋白，或编码GhSOC1蛋白的基因，在调控植物开花时间中的应用；所述植物为拟南芥；

所述GhSOC1蛋白是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述编码GhSOC1蛋白的基因为如下(1）或(2）或(3）所述的DNA分子：

（1）序列表中序列2自5’末端第102至767位核苷酸所示的DNA分子；

（2）序列表中序列2自5’末端第102至785位核苷酸所示的DNA分子；

（3）序列表中序列2所示的DNA分子。