CN103221531A - 具有高蛋白质水解活性的瑞士乳杆菌细菌 - Google Patents
具有高蛋白质水解活性的瑞士乳杆菌细菌 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种具有高蛋白质水解活性并因此具有极好的肽生产能力和/或氨基酸生产能力的乳酸菌。本发明还提供含有高浓度氨基酸和/或肽并具有良好风味的发酵乳。具体地，本发明提供一种属于瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)属的乳酸菌，其特征在于具有以下(a)-(d)特性的至少一种。(a)所述乳酸菌通过使动物乳发酵生产25μmol/ml以上的游离氨基酸。(b)所述乳酸菌通过使动物乳发酵生产8.5mg/ml以上的肽。(c)所述乳酸菌通过使动物乳发酵生产总量为260μg/ml以上的XP肽和/或XPP肽。(d)在通过使动物乳在30-34℃下发酵所获得的发酵乳的酸度单位下，生产以VPP的换算量计为6.0mg/g以上的IPP和VPP肽。
Description
技术领域
本发明涉及一种新的属于瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)的乳酸菌。本发明另外涉及通过用所述乳酸菌使乳发酵而获得的发酵乳和含有所述乳酸菌的组合物或饮食品。本发明另外涉及使用所述乳酸菌生产氨基酸和/或肽的方法。
背景技术
已知乳蛋白质和食物蛋白质潜在地包含功能性肽。已尝试使用通过酶解或发酵加工的乳蛋白质或食物蛋白质。例如，作为此类功能性肽，已报道三肽VPP和IPP具有血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)抑制活性并因此显示降血压作用(专利文献1-4和非专利文献1)。
已报道除VPP和IPP之外的作为乳来源的功能性肽的二肽YP具有降血压和抗焦虑作用(专利文献5)。还报道了二肽IP、AP、EP、RP、QP、TP、MP和GP为具有ACE抑制活性的难分解性的肽组(例如，专利文献6)。
同时，瑞士乳杆菌(L.helveticus)已常规用于生产乳制品，并已知其具有高蛋白质水解活性。为了提供更容易摄取和加工的发酵乳，已报道一些具有高蛋白质水解活性和良好的肽生产率的瑞士乳杆菌菌株(专利文献1-4和7、非专利文献1)。
蛋白质是由氨基酸构成，并因此可通过促进蛋白质水解而成为供给氨基酸的来源。已知氨基酸除营养和风味以外还具有多种功能。例如，因为支链氨基酸(BCAA)包含于构成肌肉的蛋白质中，其中BCAA在运动等时被消耗并用作能量，所以已知补给BCAA是重要的。丙氨酸(Ala)是生糖氨基酸，已知作为肝脏的能量源。因为Ala消耗在醇分解时产生的NADH，因此表明肝脏中的分解反应在Ala的存在下进行。另外已知Ala诱导鲜味(umami)的味觉(即，良好的味道和风味)并具有世耐尔(shionare)与苏耐尔(sunare)效果(即，降低咸和酸的味觉的效果)和掩蔽辛辣味的效果。据说赖氨酸(Lys)是必需氨基酸之中最容易缺乏的氨基酸。必须摄取Lys作为抗体、激素或酶等的原材料。已报道Lys还参与钙吸收、胶原形成和骨组织生产。丝氨酸(Ser)作为体内各种重要物质例如磷脂酰丝氨酸及其他氨基酸的前体是重要的。还已知Ser通过脑内神经元的活化来抑制血胆固醇水平的减少或脑细胞死亡，由此防止脑老化并用作皮肤保湿成分。
为生产此类氨基酸，微生物已被积极地使用。然而，可以以微生物发酵产物的形式直接摄取的氨基酸的实例并不多。关于乳酸菌，已筛选到具有良好的分解氨基酸活性的乳酸菌以便改进日本腌渍品的风味。然而，已知没有研究为了摄取功能性氨基酸和功能性肽而直接使用发酵乳的实例。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：欧洲专利1016709B
专利文献2：国际公开专利WO01/32836
专利文献3：国际公开专利WO2007/096510
专利文献4：欧洲专利1820850
专利文献5：欧洲专利0821968
专利文献6：欧洲专利1661909
专利文献7：JP公开专利(特开平)07-274949A(1995)
非专利文献
非专利文献1：Nakamura,Y.等人,J.Dairy Sci.Vol.78,1253-1257页,1995
发明内容
发明要解决的问题
因此，本发明的目的是提供具有高蛋白质水解活性和良好的肽生产能力和/或氨基酸生产能力的乳酸菌。本发明另外的目的是提供含有高浓度的氨基酸和/或肽并具有良好风味的发酵乳。
用于解决问题的方案
作为以达到上述目的深入研究的结果，本发明的发明人已经从属于瑞士乳杆菌的乳酸菌菌株中成功获得对乳蛋白质具有良好的氨基酸生产能力与良好的功能性肽生产能力和具有高于常规乳酸菌的蛋白质水解活性的菌株。此外，本发明的发明人已发现借助于该菌株来获得氨基酸和/或肽含量高的发酵乳和组合物，从而允许生产氨基酸和/或肽。结果，本发明的发明人完成本发明。
具体地，本发明包含以下[1]至[32]。
[1]一种属于瑞士乳杆菌的乳酸菌，其具有以下(a)至(d)特性的至少一种：
(a)通过使动物乳发酵生产25μmol/ml以上的游离氨基酸；
(b)通过使动物乳发酵生产8.5mg/ml以上的肽；
(c)通过使动物乳发酵生产总量为260μg/ml以上的XP肽和/或XPP肽；和
(d)在通过使动物乳在30-34℃下发酵所获得的发酵乳的酸度单位(acidity)下，生产以VPP的换算量计为6.0mg/g以上的IPP和VPP肽。
[2]根据[1]所述的乳酸菌，其中15%以上的所述游离氨基酸为支链氨基酸。
[3]根据[1]或[2]所述的乳酸菌，其中所述游离氨基酸包括选自丙胺酸、赖氨酸和丝氨酸的至少一种氨基酸。
[4]根据[1]至[3]任一项所述的乳酸菌，其以60μg/ml以上的量生产YP肽。
[5]根据[1]至[4]任一项所述的乳酸菌，其为瑞士乳杆菌CM4菌株(登录号FERM BP-6060)的突变株。
[6]根据[1]至[5]任一项所述的乳酸菌，其为瑞士乳杆菌CP3232菌株(登录号FERM BP-11271)或其突变株。
[7]一种瑞士乳杆菌CP3232菌株(登录号FERM BP-11271)。
[8]一种用于由动物乳生产氨基酸和/或肽的组合物，其包括属于瑞士乳杆菌的至少一种乳酸菌。
[9]根据[8]所述的组合物，其通过使动物乳发酵生产25μmol/ml以上的游离氨基酸。
[10]根据[9]所述的组合物，其中所述游离氨基酸的15%以上为支链氨基酸。
[11]根据[9]或[10]所述的组合物，其中所述游离氨基酸包括选自丙胺酸、赖氨酸和丝氨酸的至少一种氨基酸。
[12]根据[8]至[11]任一项所述的组合物，其通过使动物乳发酵以8.5mg/ml以上的量生产肽。
[13]根据[8]至[12]任一项所述的组合物，其通过使动物乳发酵生产总量为260μg/ml以上的XP肽和/或XPP肽。
[14]根据[8]至[13]任一项所述的组合物，其通过使动物乳发酵以60μg/ml以上的量生产YP肽。
[15]根据[8]至[14]任一项所述的组合物，在通过使动物乳在30-34℃下发酵所获得的发酵乳的酸度单位下，其生产以VPP的换算量计为6.0mg/g以上的IPP和VPP肽。
[16]根据[8]至[15]任一项所述的组合物，其中所述乳酸菌为[1]至[7]任一项所述的乳酸菌。
[17]一种发酵乳，其通过用属于瑞士乳杆菌的至少一种乳酸菌使动物乳发酵而获得并包含以下(a)至(d)成分的至少一种：
(a)25μmol/ml以上的游离氨基酸；
(b)8.5mg/ml以上的肽；
(c)总计为260μg/ml以上的XP肽和/或XPP肽；和
(d)在酸度单位下，当以VPP的换算量计时为6.0mg/g以上的IPP和VPP肽。
[18]根据[17]所述的发酵乳，其包括属于瑞士乳杆菌的至少一种乳酸菌。
[19]根据[17]或[18]所述的发酵乳，其包括[1]至[7]任一项所述的至少一种乳酸菌。
[20]根据权利要求[17]至[19]任一项所述的发酵乳，其中所述游离氨基酸的15%以上为支链氨基酸。
[21]根据权利要求[17]至[20]任一项所述的发酵乳，其中所述游离氨基酸包括选自丙胺酸、赖氨酸和丝氨酸的至少一种氨基酸。
[22]根据权利要求[17]至[21]任一项所述的发酵乳，其包括60μg/ml以上的YP肽。
[23]根据权利要求[17]至[22]任一项所述的发酵乳，其中在30-34℃的温度下进行所述发酵。
[24]根据权利要求[17]至[23]任一项所述的发酵乳，其用于降血压药、脑功能改善剂、自主神经调节剂、副交感神经调节剂、交感神经调节剂、营养补充剂、能量补充剂、肌肉分解与肌肉损伤抑制剂、肌肉增强剂、疲劳减轻剂、耐久性改善剂、风味改善剂或醇代谢剂。
[25]一种饮食品，其包括[1]至[7]任一项所述的至少一种乳酸菌和/或其处理物、和/或[17]至[24]任一项所述的发酵乳和/或其处理物。
[26]一种氨基酸和/或肽的生产方法，其包括使用[1]至[7]任一项所述的至少一种乳酸菌或[8]至[16]任一项所述的组合物使动物乳或乳蛋白质发酵，然后从所获得的发酵产物中收集氨基酸和/或肽。
[27]根据[26]所述的方法，其中所述氨基酸为支链氨基酸。
[28]根据[26]或[27]所述的方法，其中所述氨基酸包括选自丙胺酸、赖氨酸和丝氨酸的至少一种氨基酸。
[29]根据[26]至[28]任一项所述的方法，其中所述肽为选自由XP肽和/或XPP肽组成的组的至少一种肽。
[30]根据[26]至[29]任一项所述的方法，其中在30-34℃的温度下进行所述发酵。
[31]一种具有蛋白质水解活性并属于瑞士乳杆菌的乳酸菌的获得方法，其包括以下步骤：
(a)制备瑞士乳杆菌CM4菌株(登录号FERM BP-6060)或瑞士乳杆菌CP3232菌株(登录号FERM BP-11271)的突变株；和
(b)从该突变株中筛选具有至少一种以下(a)至(d)特性的菌株：
(a)通过使动物乳发酵生产25μmol/ml以上的游离氨基酸；
(b)通过使动物乳发酵生产8.5mg/ml以上的肽；
(c)通过使动物乳发酵生产总计为260μg/ml以上的XP肽和/或XPP肽；和
(d)在通过使动物乳在30-34℃下发酵所获得的发酵乳的酸度单位下，生产以VPP的换算量计为6.0mg/g以上的IPP和VPP肽。
[32]一种功能性饮食品的生产方法，其包括制备[1]至[7]任一项所述的至少一种乳酸菌和/或其处理物、和/或[17]至[24]任一项所述的发酵乳和/或其处理物，以及将所述乳酸菌和/或其处理物、和/或所述发酵乳和/或其处理物混合至饮食品中的步骤。
发明的效果
根据本发明，提供具有高蛋白质水解活性与良好的肽生产能力和氨基酸生产能力的属于瑞士乳杆菌的乳酸菌。由所述乳酸菌生产的氨基酸和/或肽具有多种功能。例如，肽如IPP、VPP和YP具有降血压作用。此外，通过使用所述乳酸菌发酵，可获得含有高浓度的具有各种功能的各种各样的氨基酸和/或肽的发酵乳。在由此获得的发酵乳的酸度单位(unit of acidity)下所述IPP和VPP肽的量高，因此没有由于进行常规发酵生产乳酸而导致的高酸度所引起的问题。具体地，可生产含有氨基酸和/或肽的水平高于乳酸生产水平的发酵乳。因此，借助于少量的发酵乳，可便利地生产具有良好风味且易于饮用或食用的同时保持其功能性的形式的产品。此外，可将所述产品提供给消费者。
附图说明
图1示出显示包含在通过用各指定的乳酸菌菌株在32℃(A)或37℃(B)下使乳发酵24小时而获得的发酵乳的上清液中各氨基酸的量(nmol/ml)的图。
图2示出显示包含在通过用各乳酸菌菌株在32℃或37℃下使乳发酵24小时而获得的发酵乳的上清液中游离氨基酸的总量(μmol/ml)(A)和支链氨基酸的量(μmol/ml)(B)的图。
图3为示出通过用各指定的乳酸菌菌株在32℃或37℃下使乳发酵24小时而获得的发酵乳的上清液中肽的量(mg/ml)的图。
图4示出显示包含在通过用各指定的乳酸菌菌株在32℃(A)或37℃(B)下使乳发酵24小时而获得的发酵乳的上清液中功能性肽的量(μg/ml)的图。
图5示出显示包含在通过用各指定的乳酸菌菌株在32℃(A)或37℃(B)下使乳发酵24小时而获得的发酵乳的上清液中XP肽和XPP肽的量(μg/ml)的图。
图6示出显示包含在通过用各指定的乳酸菌菌株在32℃(A)或37℃(B)下使乳发酵24小时而获得的发酵乳的上清液中各氨基酸的量(nmol/ml)的图。
图7示出显示包含在通过用各指定的乳酸菌菌株在32℃或37℃下使乳发酵24小时而获得的发酵乳的上清液中游离氨基酸的总量(μmol/ml)(A)和支链氨基酸的量(μmol/ml)(B)的图。
图8为示出在通过用各指定的乳酸菌菌株在32℃或37℃下使乳发酵24小时而获得的发酵乳的上清液中肽的量(mg/ml)的图。
图9示出显示包含在通过用各指定的乳酸菌菌株在32℃(A)或37℃(B)下使乳发酵24小时而获得的发酵乳的上清液中功能性肽的量(μg/ml)的图。
图10示出显示包含在通过用各指定的乳酸菌菌株在32℃(A)或37℃(B)下使乳发酵24小时而获得的发酵乳的上清液中XP肽和XPP肽的量(μg/ml)的图。
图11示出通过聚合酶链式反应(PCR)方法扩增各指定的乳酸菌菌株的基因组DNA而获得的片段的电泳图谱。
图12示出通过聚合酶链式反应(PCR)方法扩增各指定的乳酸菌菌株的基因组DNA而获得的片段的电泳图谱。
具体实施方式
以下将更详细地描述本发明。本申请要求2010年11月9日提交的日本专利申请2010-250754的优先权，并且本申请包括该申请的说明书和/或附图所描述的内容。
根据本发明的属于瑞士乳杆菌的乳酸菌为通过发酵由糖产生乳酸的乳酸菌，并且本文中也被称为“本发明的乳酸菌”。本发明的乳酸菌的特征在于具有高蛋白质水解活性与良好的氨基酸生产能力和/或良好的功能性肽生产能力。具体地，本发明的乳酸菌具有以下(a)至(d)特性的至少一种：
(a)通过使动物乳发酵生产25μmol/ml以上、优选30μmol/ml以上的游离氨基酸；
(b)通过使动物乳发酵生产8.5mg/ml以上、优选10mg/ml以上的肽；
(c)通过使动物乳发酵生产总量为260μg/ml以上、优选280μg/ml以上、进一步优选300μg/ml以上的XP肽和/或XPP肽；和
(d)在通过使动物乳在30-34℃下发酵所获得的发酵乳的酸度单位下，生产以VPP的换算量计为6.0mg/g以上的IPP和VPP肽。
可通过本领域已知的例如稍后在实施例中描述的方法测定上述(a)至(d)的特性。简单地，可通过用属于瑞士乳杆菌的乳酸菌在30-35℃下、优选在30-34℃下使作为底物的乳蛋白质(例如，动物乳)发酵10-30小时，然后测定包含在从所述乳蛋白质获得的发酵产物中的游离氨基酸或肽的量以及酸度等来判定(a)至(d)特性。
关于(a)，可使用已知的氨基酸分析器例如高效液相色谱仪测定氨基酸的量。本发明的乳酸菌可通过使动物乳发酵来生产25μmol/ml以上、优选30μmol/ml以上的游离氨基酸。另外，支链氨基酸以5μmol/ml以上并更优选6或7μmol/ml以上的量生产，并且支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)优选为所生产游离氨基酸的15%以上、更优选19%或20%以上。游离氨基酸优选包含2000μg/ml以上的至少一种选自丙胺酸、赖氨酸和丝氨酸的氨基酸，并更优选包含1500μg/ml的各至少两种氨基酸。
关于(b)，可通过本领域已知的方法例如OPA法(Church等人,J.Dairy Sci.1983.66:1219-1227)测定肽的量。本发明的乳酸菌可通过使动物乳发酵来生产8.5mg/ml以上、优选10mg/ml以上的肽。
关于(c)，术语“XP肽”是指Xaa-Pro(其中Xaa表示任意的氨基酸)构成的肽。XP肽的实例包括YP(Tyr-Pro)、VP(Val-Pro)、IP(Ile-Pro)、AP(Ala-Pro)、EP(Glu-Pro)、RP(Arg-Pro)、QP(Gln-Pro)、TP(Thr-Pro)、MP(Met-Pro)和GP(Gly-Pro)。此外，术语“XPP肽”是指Xaa-Pro-Pro(其中Xaa表示任意的氨基)构成的肽。XPP肽的实例包括VPP(Val-Pro-Pro)、IPP(Ile-Pro-Pro)和LPP(Leu-Pro-Pro)。另外，作为在本文中使用的XP肽和XPP肽各自被称为“二肽”和“三肽”，或一起被称为“功能性肽”。可使用已知的LC/MS仪测定所述XP肽和/或所述XPP肽的量。本发明的乳酸菌可通过使动物乳发酵而生产总量为260μg/ml以上、优选280μg/ml以上并更优选300μg/ml以上的XP肽和/或XPP肽。特别地，优选生产60μg/ml以上、更优选65μg/ml以上并进一步优选70μg/ml以上的YP肽。
关于(d)，可通过使用已知的自动滴定器等已知的中和滴定法测定酸度(即，发酵乳中酸的浓度)。此外，可通过关于(c)所记载的方法来测定IPP肽和VPP肽。本发明的乳酸菌在通过使动物乳在30-34℃下发酵所获得的发酵乳的酸度单位下，生产的IPP和VPP肽的量以VPP的换算量计为5.5mg/ml以上、优选6.0mg/ml以上。另外，使用1.02作为发酵乳的比重来计算上述量。此外，根据基于ACE抑制活性的VPP换算量通过下式来计算IPP和VP肽(如本文所述)的量：
(VPP换算量(μg/ml))=IPP的量(μg/ml)×1.7+VPP的量(μg/ml)
本发明的乳酸菌具有至少一种上述(a)至(d)特性并优选显示上述2种、3种或全部的特性。例如，本发明的乳酸菌具有(a)、(b)、(c)或(d)的特性，或具有(a)和(b)、(a)和(c)、(a)和(d)、(b)和(c)、(b)和(d)、或(c)和(d)的特性，(a)、(b)和(c)；(a)、(b)和(d)；(a)、(c)和(d)；(b)、(c)和(d)的特性，或(a)至(d)的特性。
本发明中，本发明的乳酸菌包括任一种属于显示至少一种上述特性的瑞士乳杆菌的乳酸菌。具有此类特性的瑞士乳杆菌的优选实例为由本发明人自己从使用瑞士乳杆菌CM4菌株(登录号FERM BP-6060，专利文献1)作为亲株(parent strain)而获得的突变株中筛选的瑞士乳杆菌CP3232菌株。另外，由本申请人分别按照FERM BP-6060和FERM BP-11271于1997年8月15日和2010年8月4日将瑞士乳杆菌CM4菌株和CP3232菌株保藏于国际专利生物保藏中心(International Patent Organism Depositary)独立行政法人产业技术综合研究所(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)(AIST)(日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)TsukubaCentral6,1-1-1Higashi,Tsukuba,Ibaraki,Japan,305-8566)，所述AIST是按照布达佩斯条约(Budapest Treaty)为保藏专利微生物而建立的国际保藏单位(IDA)。如实施例中所描述，已证实所述瑞士乳杆菌CP3232菌株具有上述(a)至(d)的全部特性。
此外，所述瑞士乳杆菌CP3232菌株为源自上述作为亲株的瑞士乳杆菌CM4菌株的突变株。因此，瑞士乳杆菌CM4菌株和瑞士乳杆菌CP3232菌株的突变株可能具有任一种上述(a)至(d)的特性。本发明中也包括这些来自瑞士乳杆菌CP3232菌株或瑞士乳杆菌CM4菌株的突变株，只要其具有上述特性即可。
本发明中，术语“突变株”是指从亲株获得的任意菌株。具体地，是指通过增加自然突变频率或增加经用物理或化学诱变剂的诱变的人工突变频率的方法、或具体的突变技术(例如，遗传重组)从亲株获得的菌株。反复地筛选和分离通过这些方法生产的微生物以培育有用的微生物，因此可获得具有目的特性的突变株。
本文中使用的此类突变株的实例包括从作为亲株的CM4菌株、CP3232菌株或其突变株而获得的菌株。具体地，CM4菌株的突变株的实例另外包括CM4菌株经若干反复的突变后筛选的突变株。
例如，基于通过聚合酶链式反应(PCR)法扩增的片段(乳酸菌的基因组DNA的片段)的分子量分布，可以容易地使来自瑞士乳杆菌CM4菌株、瑞士乳杆菌CP3232菌株及其突变株的突变株区别于其他乳酸菌菌株。简言之，制备目的乳酸菌菌株的DNA样品，通过PCR法使用具有例如SEQ ID NOS：1和2所示序列的引物进行基因扩增，分析由此获得的片段的电泳图谱，并可判定所得到的菌株是否为起源于瑞士乳杆菌CP3232菌株或瑞士乳杆菌CM4菌株的突变株。然而，证实此类对象菌株(subject strain)是否为突变株的方法并不限于此方法。即使当没有检出上述PCR片段时，所得菌株可能是来自瑞士乳杆菌CM4菌株的突变株或来自瑞士乳杆菌CP3232菌株的突变株。可通过检测其他基因片段、微生物学特性或本领域已知的技术来证实此类对象菌株是否为突变株。
通过判断此类突变株是否具有上述(a)至(d)的特性，可获得可用作本发明的乳酸菌的菌株。
本发明的乳酸菌可通过使用通常用于培养乳酸菌的培养基在适当的条件下培养来制备。天然培养基或合成培养基可用作培养基，只要它包含碳源、氮源、无机盐及其他成分并且能够有效地培养乳酸菌即可。本领域技术人员可适当地选择已知的适用于待用菌株的培养基。可使用的碳源的实例包括乳糖、葡萄糖、半乳糖和赤糖糊(blackstrap molasses)。可使用的氮源的实例包括有机含氮物质，例如酪蛋白水解物、乳清蛋白质水解物和大豆蛋白质水解物。可使用的无机盐的实例包括磷酸盐、钠、钾和镁。培养乳酸菌的适当的培养基的实例包括MRS液体培养基、GAM培养基、BL培养基、Briggs肝肉汤(Briggs Liver Broth)、动物乳、脱脂乳和乳清衍生的乳。优选使用含有已灭菌的脱脂奶粉的乳培养基。
另外，可在20℃至50℃、优选25℃至42℃、并更优选28℃至37℃借助厌氧条件进行本发明的乳酸菌的培养。可使用恒温槽、覆套式加热器(mantleheater)或夹套等来调整温度条件。另外，在文中使用的术语“厌氧条件”是指乳酸菌可以增殖的低氧环境。例如，可通过使用厌氧培养室、厌氧箱或者含有除氧剂的密封容器或袋子等，或通过简单地密封培养容器来提供厌氧条件。培养的形式包括静置培养、振荡培养和槽式培养(tank culture)。培养时间可以为3-96小时。在培养开始时优选保持培养基的pH在4.0-8.0。
以下简单地描述制备本发明的乳酸菌的具体实例。例如，当使用瑞士乳杆菌CP3232菌株时，将乳酸菌接种至已灭菌的乳培养基(例如，含有9.00%(w/w)复原脱脂奶粉(reconstituted powdered skim milk)的乳培养基)、接着在28-37℃下过夜培养(约18-28小时)。优选反复地进行该培养步骤。
培养后，所获得的乳酸菌的培养物可直接使用，或可进一步任选地通过离心等进行粗纯化和/或通过过滤等进行固液分离和灭菌。
此外，可使用通过处理本发明的乳酸菌而获得的乳酸菌的处理物，只要它具有目的特性即可。可选地，乳酸菌的处理物可进行进一步的处理。以下描述此类处理的实例。
使用乳酸菌细胞和/或其处理物使生乳、脱脂乳或豆乳发酵，因此可制备发酵产物。例如，将乳酸菌或进行另外处理的乳酸菌接种至生乳、脱脂乳或豆乳，接着通过本领域已知的条件下(基本上相当于上述培养乳酸菌的条件)发酵。所获得的发酵产物可以直接使用，或进行另外的处理例如过滤、灭菌、稀释或浓缩。
可通过在适当溶剂中悬浮或稀释而将乳酸菌细胞和/或其处理物制备为悬浮液或稀释液的形式。可使用的溶剂的实例包括水、生理盐水和磷酸盐缓冲液(PBS)。
可使乳酸菌细胞和/或其处理物灭菌，因此可制备灭菌产物。为了使乳酸菌细胞和/或其处理物灭菌，例如，可进行已知的灭菌处理例如过滤灭菌、放射性灭菌、过热灭菌(superheat sterilization)或加压灭菌。
可使乳酸菌细胞和/或其处理物进行热处理，因此可制备热处理物。为了制备此类热处理物，对乳酸菌细胞和/或其处理物进行高温处理(例如，在80-150℃下)约10-60分钟(例如，约10-20分钟)。
可使乳酸菌细胞和/或其处理物破碎、研磨或粉碎，因此可制备破碎产物或无细胞提取物。例如，可通过物理破碎(例如，搅拌或过滤器过滤)、酶解处理、化学处理或自我分解处理等进行此类处理。
使用适当的水性溶剂或有机溶剂提取乳酸菌细胞和/或其处理物，因此可获得提取物。提取方法并不特别限定，只要它是使用水性溶剂或有机溶剂作为提取溶剂的提取方法即可。然而，此类方法的实例为已知方法例如包括使乳酸菌或其处理物(通过乳酸菌的另外处理而制备)浸入水性溶剂或有机溶剂(例如，水、甲醇或乙醇)中并将其在溶剂中搅拌或回流的方法。
另外，可经干燥将乳酸菌细胞和/或其处理物加工成粉状产物(粉末)或粒状产物的形式。干燥方法的具体实例包括，但不特别限于喷雾干燥、转鼓干燥、真空干燥和冻干，其可单独或组合使用。在干燥时，可根据需要添加通常使用的赋形剂。
本发明的乳酸菌也可以是湿的细菌细胞或干的细菌细胞。
可在适当情况下单独或组合使用上述处理的实例。本发明中，此类处理物可以与乳酸菌相似的方式使用。
上述获得的乳酸菌和/或处理物可单独或连同其他成分作为组合物用于从动物乳生产氨基酸和/或肽。具体地，本发明提供用于生产氨基酸和/或肽的组合物，其含有至少一种属于瑞士乳杆菌的乳酸菌。
本发明的组合物通过使动物乳发酵能够生产25μmol/ml以上、优选30μmol/ml以上的游离氨基酸。优选15%以上的所生产的游离氨基酸为支链氨基酸。可选地或另外地，本发明的组合物通过使动物乳发酵能够生产8.5mg/ml以上、优选10mg/ml以上的肽。可选地或另外地，本发明的组合物通过使动物乳发酵能够生产总量为260μg/ml以上、优选280μg/ml并更优选300μg/ml以上的XP肽和/或XPP肽。可选地或另外地，在通过使动物乳在30-34℃下发酵所获得的发酵乳的酸度单位下，本发明的组合物生产以VPP的换算量计为6.0mg/g以上的IPP和VPP肽。
本发明的组合物包括上述乳酸菌和/或其处理物作为活性成分。具体地，所述组合物可包含1种类型的乳酸菌和/或其处理物、多种不同的乳酸菌和/或处理物、或多种经不同处理的乳酸菌的处理物的组合。另外，本发明的组合物优选包括至少1×107个乳酸菌细胞/ml。
此外，本发明的组合物可单独或组合地补充有除作为活性成分的乳酸菌之外的本领域已知的添加剂和赋形剂，只要它们不抑制目的作用即可。本发明的组合物还可包括促进乳酸菌发酵的添加剂(例如，谷氨酸和糖如葡萄糖)。本发明的组合物的形式并不特别限定，并且可将其制剂成悬浮液、颗粒、粉末或胶囊等。本发明的组合物中活性成分(乳酸菌)的含量根据其形式不同，作为乳酸菌的量，通常在0.0001质量%至99质量%、优选0.001质量%至80质量%、更优选0.001质量%至75质量%的范围内。本发明的组合物中含有约107个细胞/g至约1012个细胞/g的乳酸菌。
通过使用本发明的乳酸菌或组合物使动物乳发酵来获得含有高浓度氨基酸和/或肽的发酵乳组合物。因此，本发明提供通过使用至少一种属于瑞士乳杆菌的乳酸菌使动物乳发酵所获得并包含至少一种以下(a)至(d)的成分的发酵乳：
(a)25μmol/ml以上、优选30μmol/ml的游离氨基酸(优选游离氨基酸的15%以上为支链氨基酸)；
(b)8.5mg/ml以上、优选10mg/ml以上的肽；
(c)总量为260μg/ml以上、优选280μg/ml以上、更优选300μg/ml以上的XP肽和/或XPP肽；和
(d)在发酵乳的酸度单位下，在以VPP的换算量计时为6.0mg/g以上的IPP和VPP肽。
可使用本发明的乳酸菌或组合物根据本领域已知方法通过发酵来制备本发明的发酵乳。可通过将至少一种乳酸菌添加至动物乳然后在适当的条件将其培养来进行发酵。作为动物乳，可使用哺乳动物来源的乳例如牛乳、山羊乳和马乳，或加工乳例如脱脂乳、复原乳(reconstituted milk)或炼乳。具体地，可使用1种类型的乳或可使用多种类型的乳与加工乳的组合。乳的固形物浓度并不特别限定。例如，当使用脱脂乳时无脂乳的固形物浓度在大约3质量%至15质量%、优选6质量%至15质量%的范围内。可使动物乳在发酵前灭菌。可将促进乳酸菌发酵的添加剂(例如，谷氨酸或糖如葡萄糖)添加至动物乳。可选地，从动物乳中分离乳蛋白质成分，然后可使用此类乳蛋白质成分作为底物进行发酵。
作为添加至动物乳的乳酸菌，预培养的乳酸菌优选用作起子(starter)。同样，添加的乳酸菌的量并不限定，换算为干乳酸菌细胞通常在0.005质量%至10质量%、优选0.05质量%至5质量%的范围内。本文中使用的乳酸菌可以是完整的乳酸菌培养物、经过滤或离心从培养基分离到的乳酸菌，或从培养基分离之后保存的冷冻的或冻干的乳酸菌。
发酵条件几乎与如上所述的培养乳酸菌的相同。在20℃至50℃、优选25℃至42℃并更优选28℃至37℃并在厌氧条件下进行发酵。另外，稍后描述的实施例中，本发明的乳酸菌在30℃至34℃(约32℃)下生产特别高量的支链氨基酸和功能性肽。因此，特别优选在30℃至34℃下进行发酵。可使用恒温槽、覆套式加热器或夹套等来调整温度条件。发酵可以静置培养、振荡培养或槽式培养的形式进行。此外，发酵时间可在3小时至96小时并优选12至36小时的范围内。优选在发酵罐内测定pH与酸度并保持pH在4.0至8.0时进行发酵。
可处理如上所述获得的发酵乳或可进一步处理发酵乳的处理物，只要它包含所期望的成分即可。以下描述此类处理的实例。
将发酵乳和/或其处理物悬浮或稀释于适当的溶剂中，因此可制备悬浮液或稀溶液。可使用的溶剂的实例包括水、生理盐水和磷酸盐缓冲液(PBS)。
将发酵乳和/或其处理物灭菌，因此可制备灭菌产物。可通过已知的灭菌方法例如过滤灭菌、放射性灭菌、过热灭菌和加压灭菌使发酵乳和/或其处理物灭菌。
使发酵乳和/或其处理物进行热处理，因此可制备热处理物。进行高温处理(例如，80℃至150℃)一定时间例如约10-60分钟(例如，约10-20分钟)以制备此类热处理物。
此外，将发酵乳和/或其处理物过滤或离心，因此可制备其上清液(乳清)。
此外，使发酵乳和/或其处理物干燥以便获得粉状产物(粉末)或粒状产物。具体的干燥方法的实例包括，但不特别限于喷雾干燥、转鼓干燥、真空干燥和冷冻干燥。可单独使用此类干燥方法，或可组合使用这些方法。此时，还可根据需要添加通常使用的赋形剂。
可在适当情况下单独或组合使用上述处理的实例。本发明还包括此类发酵乳的处理物。
本发明的发酵乳或其处理物包含高浓度的各种氨基酸和/或肽，因此它可用于使用氨基酸和/或肽的特性的应用。例如，氨基酸涉及风味、能源、安定作用和生长促进作用等，因此本发明的发酵乳可用作风味改善剂、营养补充剂或能量补充剂。此外，包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸基的支链氨基酸(BCAA)是必需氨基酸并可用于增加肌力或防止身体疲劳。此外，认为在肝脏中进行分解反应是由于丙胺酸(Ala)的存在。此外。已知Ala诱导鲜味的味觉(即，良好的味道和风味)并具有世耐尔与苏耐尔效果(降低咸和酸的味觉的效果)和掩蔽辛辣味的效果。据说赖氨酸(Lys)是必需氨基酸之中最容易缺乏的氨基酸。Lys应作为例如抗体、激素或酶等的原材料被摄取。还报道了Lys还参与钙吸收、胶原形成和骨组织生产。丝氨酸(Ser)作为体内各种重要物质例如磷脂酰丝氨酸及其他氨基酸的前体是重要的。还已知Ser通过脑内神经元的活化等来抑制血胆固醇水平和脑细胞死亡的减少，由此防止脑老化并用作皮肤保湿成分。因此，本发明的发酵乳或其处理物可用作风味改善剂、营养补充剂、能量补充剂、脑功能改善剂、自主神经调节剂、副交感神经调节剂、交感神经调节剂、肌肉分解和肌肉损伤抑制剂、肌肉增强剂、疲劳减轻剂、耐久性改善剂或醇代谢剂等。此外，所述VPP肽和IPP肽具有ACE抑制活性和放松的效果。具体地，LPP肽具有ACE抑制活性，YP肽具有降血压作用和抗焦虑作用，以及VP、IP、AP、EP、RP、QP、TP、MP和GP肽是生物不可降解的且具有ACE抑制活性。因此，本发明的发酵乳或其处理物可用作降血压药或压力缓解剂。
使用已知的分离和/或纯化方法从由此获得的发酵乳或其处理物纯化各种氨基酸和/或肽成分，或者含有这些成分的级分。
本发明的发酵乳或其处理物包含至少一种上述(a)至(d)成分中的成分(例如，氨基酸和肽)，或可包含多种成分的组合。同样，发酵乳或其处理物可包含用于发酵的乳酸菌。
同样，本发明的组合物可单独或组合地补充添加剂、另外已知的降血压药、压力缓解剂、营养补充剂、能量补充剂、肌肉增强剂或风味改善剂等，只要所述目的作用不受抑制即可。
本发明的发酵乳的剂型包括，但并不特别限于悬浮剂(发酵后获得的完整的发酵乳)和通过本领域已知技术处理并获得的片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、粉剂、糖浆剂与干糖浆剂。所述发酵乳优选便于经口施用或摄取的剂型。另外，液体制剂例如悬浮剂在施用或摄取之前可立即悬浮于水或另外的适当媒介中。当所述发酵乳形成片剂或颗粒剂时，可通过已知方法在表面上包衣。
可根据常规方法通过掺入通常使用的添加剂例如赋形剂、崩解剂、粘结剂、湿润剂、稳定剂、缓冲剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂、甜味剂、风味剂(flavoring agent)、芳香剂、酸化剂和着色剂来生产上述剂型的发酵乳。例如，在所述发酵乳用于药品或促进健康的情况下，可将药物学可接受载体或添加剂掺入到通过发酵所获得的发酵乳中。此类药物学可接受载体和添加剂的实例包括水、药物学可接受有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚羧乙烯(carboxyvinyl polymer)、海藻酸钠、水溶性右旋糖酐、水溶性糊精、羧甲基淀粉钠、果胶、黄原胶、***胶、酪蛋白、明胶、琼脂、甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白、甘露醇、山梨醇、乳糖和可接受的作为药物学添加剂的表面活性剂。
另外，本发明的发酵乳可进一步包含多种用于生产药品、饮食品或饲料的添加剂以及其他各种物质。此类物质和添加剂的实例包括多种油脂(例如，植物油例如豆油、玉米油、红花油和橄榄油，和动物油脂例如牛脂或沙丁鱼油)、草药(例如，蜂王浆和人参(ginseng))、氨基酸(例如，谷氨酰胺、半胱氨酸、亮氨酸和精氨酸)、多元醇(例如，乙二醇、聚乙二醇、丙二醇、甘油和糖醇例如山梨糖醇、赤藓醇、木糖醇、麦芽糖醇和甘露醇)、天然聚合物(例如，***胶、琼脂、水溶性玉米纤维、明胶、黄原胶、酪蛋白、谷蛋白或谷蛋白水解物、卵磷脂、淀粉和糊精)、维生素(例如，维生素C和维生素B族)、矿物质(例如，钙、镁、锌和铁)、膳食纤维(例如，甘露聚糖、果胶和半纤维素)、表面活性剂(例如，脂肪酸的甘油酯和脂肪酸的山梨聚糖酯)、纯水、赋形剂(例如，葡萄糖、玉米淀粉、乳糖和糊精)、稳定剂、pH调节剂、抗氧化剂、甜味剂、风味剂、酸化剂、着色剂和芳香剂。
另外，除上述活性成分之外，可将功能性成分或添加剂掺入到本发明的发酵乳中。其实例包括牛磺酸、谷胱甘肽、肉毒碱、肌酸、辅酶Q、葡糖醛酸、葡糖醛酸内酯、辣椒提取物、姜提取物、可可提取物、瓜拉那提取物、藤黄属植物提取物、茶氨酸、γ-氨基丁酸、辣椒素、辣椒素酯(capsiate)、各种有机酸、类黄酮、多酚、儿茶素、黄嘌呤衍生物、难消化的寡糖如低聚果糖(fructooligosaccharide)和聚乙烯吡咯烷酮。此类添加剂的掺入量可依据添加剂的类型和所期望的摄取量而适当地确定。
施用或摄取本发明的发酵乳的受试者可为脊椎动物。其具体实例包括哺乳动物例如人、灵长类(例如，猴子和黑猩猩)、家畜动物(例如，牛、马、猪、羊和鸟)、宠物动物(例如，狗和猫)和实验动物(例如，小鼠和大鼠)。另外，此类受试者可为爬虫动物和鸟类。特别优选那些期望摄取氨基酸和/或肽的受试者，例如高血压患者、具有压力诱发症状(stress-induced symptoms)的人和运动前后的人。
本发明的发酵乳的施用或摄取剂量根据受试者的年龄和体重、施用/摄取途径、施用/摄取剂量的次数和施用目的等而不同，并可由本领域熟练技术人员自由裁量而广泛变化以达到所期望的效果。发酵乳中活性成分的含量并不特别限定，并可根据例如易于生产的程度和优选的每日剂量而适当地调整。本发明的发酵乳是十分安全的，且因此还可增加摄取剂量。每日剂量可以一次剂量摄取，或可将其分为多次剂量来摄取。另外，施用或摄取的频率并不特别限定，并可根据各种条件例如施用/摄取途径、受试者的年龄和体重以及所期望的效果而适当地选择。
本发明的发酵乳的施用/摄取途径并不特别限定，并优选经口施用或经口摄取。例如，将发酵乳掺入到饮食品或饲料中或制成片剂或颗粒剂等，并因此可经口施用或摄取。
本发明的发酵乳可与其他的药品、治疗方法或预防方法等组合使用。可将此类其他的药品和本发明的发酵乳制成单一制剂。可选地，可将它们制成单独的制剂以便同时或间隔施用。
如上所述，本发明的发酵乳可用作降血压药、脑功能改善剂、自主神经调节剂、副交感神经调节剂、交感神经调节剂、营养补充剂、能量补充剂、肌肉分解和肌肉损伤抑制剂、肌肉增强剂、疲劳减轻剂、耐久性改善剂、风味改善剂或醇代谢剂等。
本发明的乳酸菌和发酵乳是十分安全的，并因此容易用于长期持续的摄取。因此，本发明的乳酸菌和发酵乳还可用于饮食品和饲料。本发明的乳酸菌生产大量的具有各种功能的氨基酸和/或肽。另外，本发明的发酵乳包含高浓度的此类氨基酸和/或肽。此外，本发明的乳酸菌显示出功能性肽相对于酸度的产量高，可抑制酸味，并且即使当添加至各种饮食品时也并不抑制饮食品自身的风味。因此，本发明的乳酸菌和发酵乳被添加至各种饮食品，可持续摄取，并因此期望显示各种效果。
因此，本发明的饮食品包含至少一种本发明的乳酸菌和/或其处理物、和/或本发明的发酵乳和/或其处理物。本发明中，本发明的饮食品的实例还包括饮料(beverages)。除促进健康的保健饮食品、功能性饮食品和借助于氨基酸和/或肽的特殊保健用途的饮食品之外，本发明的饮食品的实例包括可将本发明的乳酸菌和发酵乳掺入其中的所有饮食品。
功能性饮食品特别优选作为本发明的饮食品。本发明的术语“功能性饮食品”是指对生物体具有预定功能的饮食品，并包括，例如所谓的一般保健饮食品(例如，包括特殊保健用途的饮食品(包括合格的FOSHU[即，特殊保健用途食品])的具有健康声明的饮食品和具有营养功能声明的饮食品)、特殊膳食用途的饮食品、营养补充剂、健康补充剂、补充剂(例如，具有多种剂型如片剂、包衣片剂、糖衣片剂、胶囊剂和液剂的那些)和美容饮食品(例如，减肥饮食品)。
饮食品的具体实例包括剂型为例如流质饮食(例如，管肠内营养补充剂)、片剂糖果、片剂、咀嚼片、片剂、粉剂、散剂、胶囊剂、颗粒剂和滋补饮料等的健康饮食品和营养补充剂；茶饮料例如绿茶、乌龙茶和红茶；饮品(drinks)或饮料例如软饮料、果冻饮料、等渗饮料、乳饮料、碳酸饮料、蔬菜饮料、果汁饮料、发酵蔬菜饮料、发酵果汁饮料、发酵乳饮料、发酵乳(例如，饮用酸奶和固体酸奶)、发酵乳饮料(已灭菌的)、乳酸菌饮料、浓缩饮料、浓缩固形物、乳饮料(例如，咖啡乳)、含有饮料粉末的饮料、可可饮料、乳和纯水；涂抹调味品(spreads)例如黄油、果酱、干调味品和人造奶油；蛋黄酱；起酥油(shortening)；乳蛋糕乳脂；敷料剂(dressings)；面包；米饭；面条；意大利面；味增汤；豆腐；酸奶；汤或酱油；和甜食(例如，饼干和曲奇、巧克力、糖果、蛋糕、冰淇淋、口香糖和糖片)。
可通过掺入除本发明的乳酸菌和/或发酵乳以外的用于生产上述饮食品的其他食物原料、各种营养物、各种维生素、矿物质、膳食纤维和各种添加剂(例如，呈味成分(taste components)、甜味剂、酸化剂例如有机酸、稳定剂和香料)，根据常规方法生产本发明的饮食品。
对于本发明的饮食品，本领域熟练技术人员可鉴于饮食品的形式和所需的味道或口感适当地确定乳酸菌、发酵乳或其处理物的掺入量。通过以允许管理本发明的饮食品的期望摄取量的形式消耗本发明的饮食品，例如，可提供使用所述饮食品以降低血压、消除压力、营养支持、能量补充、增强肌肉、改善脑功能、调节自主神经、调节副交感神经、调节交感神经、抑制肌肉分解和损伤、增强肌肉、减轻疲劳、改善耐久性或醇代谢的方法。
可由本领域熟练技术人员通过任意可得的适当方法生产本发明的饮食品。例如，本发明的乳酸菌和/或发酵乳(处理物)可以以液状、凝胶状、固体状、粉末状或粒状制备，然后将其掺入饮食品中。可选地，本发明的乳酸菌和/或发酵乳(处理物)可直接混合或溶解到饮食品的原材料中。本发明的乳酸菌和/或发酵乳(处理物)可涂布至、包衣至、浸入或喷涂至饮食品中。本发明的乳酸菌和/或发酵乳(处理物)可均匀分散或不均匀分布在饮食品中。可制备含有本发明的乳酸菌和/或发酵乳(处理物)的胶囊剂。可将可食用膜或食品涂层剂等包裹在本发明的乳酸菌和/或发酵乳(处理物)的周围。可选地，可在添加适当的赋形剂等后将本发明的乳酸菌和/或发酵乳(处理物)制备成例如片剂等形式。可进一步加工本发明的饮食品。此类加工产物也包括在本发明的范围内。
在本发明的饮食品的生产中，可采用多种常规用于饮食品的添加剂。添加剂的实例包括，但不限于，发色剂(例如，亚硝酸钠)、着色剂(例如，栀子色素和Red102)、香料(例如，橙味香料)、甜味剂(例如，甜叶菊和阿斯巴甜)、防腐剂(例如，乙酸钠和山梨酸)、乳化剂(例如，软骨素硫酸钠和脂肪酸丙二醇酯)、抗氧化剂(例如，EDTA二钠和维生素C)、pH调节剂(例如，柠檬酸)、化学调味品(例如，肌苷酸钠)、增稠剂(例如，黄原胶)、膨胀剂(例如，碳酸钙)、消泡剂(例如，磷酸钙)、粘结剂(例如，聚磷酸钠)、营养强化剂(nutrition-enriching agent)(例如，钙强化剂和维生素A)和赋形剂(例如，水溶性糊精)。可进一步添加功能性原料例如人参(Panax ginseng)提取物、刺五加(Acanthopanax senticosus)提取物、桉树提取物或杜仲茶提取物。
如上所述，本发明的饮食品具有由氨基酸和/或肽引起的各种功能并且十分安全，但无需考虑副作用。另外，本发明的乳酸菌和/或发酵乳可抑制酸度，具有良好的风味，并且当添加至各种饮食品时不抑制饮食品的风味。所获得的饮食品可容易地用于长期持续的摄取以期望长期发挥各种功能。
另外，本发明的乳酸菌和/或发酵乳不仅可以掺入到人类用饮食品中，而且还可以掺入到动物例如家畜(例如，牛和猪)、赛马和宠物(例如，狗和猫)用饲料中。饲料除了给予非人类受试者以外基本上相当于饮食品。因此，饮食品的以上描述可做必要的修正而适用于饲料。
实施例
以下，参考下列实施例更详细描述本发明，但是本发明不限于所述实施例。
[实施例1]瑞士乳杆菌CP3232菌株的鉴定
培育瑞士乳杆菌CM4菌株(登录号FERM BP-6060)。从源自所述CM4菌株的突变株获得显示如实施例2至5所述特性的新的瑞士乳杆菌CP3232菌株。
将所述瑞士乳杆菌CP3232菌株在37℃下在MRS琼脂培养基中厌氧培养24小时，然后检查所得菌落的形态学上观察到的特性和其生理特性等。此外，测定16S rRNA序列并证实与另外的瑞士乳杆菌菌株(模式株)具有99.9%的同源性。因此，揭示由此获得的菌株明确地属于瑞士乳杆菌并且为新菌株。
[实施例2]发酵乳的制备
通过将温度增加至95℃，将9.00%(w/w)的复原脱脂奶粉灭菌，然后冷却至15℃。所得物用作乳培养基。将含有乳酸菌(5%)的发酵乳添加至该乳培养基中(用于接种)，接着在37℃培养24小时。重复此步骤，然后将由此获得的发酵乳用作起子。将该起子(3%)添加至乳培养基，然后在32℃或37℃下培养24小时。测定该发酵乳的pH和酸度。使用平沼(Hiranuma)自动滴定器COMTITE-450(Hiranuma Sangyo Co.,Ltd.)测定酸度。使用作为乳酸菌的瑞士乳杆菌CP3232菌株和对比用瑞士乳杆菌CP3264菌株(分离自市售可得的抗高血压药品)、瑞士乳杆菌CM4菌株(登录号FERM BP-6060)、瑞士乳杆菌CP1092菌株、瑞士乳杆菌CP1100菌株、瑞士乳杆菌CP1081菌株及瑞士乳杆菌CPN4菌株(JP公开专利(特开平)H7-123977A(1995))。
结果示于表1。因为单位重量IPP的ACE抑制活性是VPP的1.7倍，所以通过下式根据VPP的换算量来计算IPP和VPP的量：
VPP换算量(μg/ml)=IPP的量(μg/ml)×1.7+VPP的量(μg/ml)
另外，术语“酸度”是指发酵乳中含有的酸(乳酸)的浓度。如表1所示，在通过用瑞士乳杆菌CP3232菌株使乳发酵而获得发酵乳的情况下，相对于所产乳酸的量(即，所述酸度)的IPP和VPP肽的量在以VPP的换算量计时为6.2mg/g，表明相对于酸度的肽量高。用1.02作为发酵乳的比重进行计算。
[表1]
酸度单位下的LTP(IPP和VPP)的量(VPP换算量)
[实施例3]发酵乳上清液中游离氨基酸的测定
将实施例2中获得的发酵乳在10000g下进行离心10分钟。用蒸馏水适当稀释上清液，用0.2μM膜滤器过滤该溶液，然后使用氨基酸自动分析器(C-R7A/LC-10A)通过高效液相色谱(HPLC，Shimadzu Corporation)进行测定。以下描述分析条件。
柱：Shim-pack Amino-Li(100mmL×6.0mmI.D.)
捕氨柱(Ammonia trap)：Shim-pack ISC-30Li(50mmL×4.0mmI.D.)
柱温:38℃至58℃
反应温度：65℃
流动相：氨基酸分析用岛津(Shimadzu)流动相试剂盒，即，Li型
反应溶液：氨基酸分析用岛津反应溶液试剂盒，即，OPA试剂
流量：0.4ml/min。
添加次氯酸钠至反应溶液以检测脯氨酸。用荧光分光检测器(Ex：348nm；Em：450nm)测定最终与邻苯二醛反应的氨基酸的荧光显色。具有各种氨基酸已知浓度的标准氨基酸混合物(H型)用作标准样品，然后计算氨基酸的含量。
结果示于图1和图2。图1A示出测定包含在通过在32℃下用各指定的乳酸菌菌株使乳发酵24小时而获得的发酵乳的上清液中各氨基酸的量(nmol/ml)的结果。图1B示出通过测定包含在通过在37℃下用各指定的乳酸菌菌株使乳发酵24小时而获得的发酵乳的上清液中各氨基酸的量(nmol/ml)而获得的结果。图2A示出包含在通过在32℃或37℃下用各指定的乳酸菌菌株使乳发酵24小时而获得的发酵乳的上清液中游离氨基酸的总量(μmol/ml)。图2B示出包含在通过在32℃或37℃下用各指定的乳酸菌菌株使乳发酵24小时而获得的发酵乳的上清液中支链氨基酸的量(μmol/ml)。这些结果表明，瑞士乳杆菌CP3232菌株具有高蛋白质水解活性且通过24小时发酵生产25mol/ml以上的游离氨基酸。特别地，瑞士乳杆菌CP3232菌株通过在37℃下使乳发酵生产29.9μmol/ml的游离氨基酸，而同样的菌株通过在32℃下使乳发酵生产33.1μmol/ml的游离氨基酸(图2A)。还表明，所生产的游离氨基酸中支链氨基酸的含量高，且通过24小时发酵生产的全部游离氨基酸的15%以上为支链氨基酸。具体地，在37℃发酵的情况下支链氨基酸约占全部游离氨基酸的19.4%，在32℃发酵的情况下支链氨基酸约占全部游离氨基酸的21.5%(图2B)。
[实施例4]发酵乳上清液中肽的量(OPA法)
根据Church等人的方法(J.Dairy Sci.1983.66:1219-1227)测定实施例2中获得的发酵乳上清液中肽的量。简言之，将25ml的100mM四硼酸钠溶液、2.5ml的20%SDS和0.1ml的2-巯基乙醇混合。将通过溶解邻苯二醛于甲醇(4重量%)中而制备的1ml溶液添加至该混合物，然后用蒸馏水将该溶液最终调整至50ml，由此制备OPA试剂。将实施例2中获得的发酵乳在10,000g下进行离心10分钟，并将所获得的培养物上清液适当稀释，以便制备分析样品。将OPA试剂(200μl)和分析样品(10μl)混合。充分搅拌后，将混合物在室温静置5分钟，然后测定在340nm下的吸收。将细菌用胰蛋白胨(bacto-tryptone)用作标准物质。
结果示于图3。由结果表明瑞士乳杆菌CP3232菌株具有高蛋白质水解活性并通过发酵生产大量的肽。具体地，瑞士乳杆菌CP3232菌株通过24小时发酵生产8.5mg/ml以上的肽、通过在32℃下发酵生产11.1mg/ml的肽以及通过在37℃下发酵生产9.6mg/ml的肽(图3)。
[实施例5]功能性肽的定量
将实施例2中获得的发酵乳在10,000g下进行离心10分钟，并用蒸馏水将上清液适当稀释，然后在LC/MS分析之前用0.2μM膜滤器过滤。通过Inoue等人的方法(J.Biosci.Bioeng.,2009,108,111-115)进行LC/MS分析。具体地，使用LCMS-2010A***(Shimadzu Corporation)和RP-aqueous柱(NomuraChemical Co.,Ltd.)作为分离柱进行分析。使用合成肽作为标准样品计算含量。本文中使用的合成肽为(13C5)Val-(13C5)Pro-Pro,Ile-(13C5)Pro-Pro、Glu-Pro与Gln-Pro(购自Scrum Inc.)和Leu-Pro-Pro、Tyr-Pro、Val-Pro、Ile-Pro、Ala-Pro、Arg-Pro、Thr-Pro、Met-Pro与Gly-Pro(购自Bachem)。
结果示于图4和图5。图4A和图4B示出的结果揭示瑞士乳杆菌CP3232菌株具有高蛋白质水解活性且通过24小时发酵生产各种功能性肽。已报道在图4中所列出的功能性肽之中，VPP和IPP具有ACE抑制活性和放松效果，LPP具有ACE抑制活性，YP具有降血压作用和抗焦虑作用，以及VP、IP、AP、EP、RP、QP、TP、MP和GP为生物不可降解的并具有ACE抑制活性。瑞士乳杆菌CP3232菌株特别生产大量的VPP、IPP、YP、QP和TP。
图5A和图5B所示结果进一步揭示，瑞士乳杆菌CP3232菌株具有高蛋白质水解活性且通过24小时发酵生产总量为260μg/ml以上的功能性肽(XP+XPP)。特别地，瑞士乳杆菌CP3232菌株分别通过在32℃下发酵生产318μmol/ml的功能性肽(图5A)以及通过在37℃下发酵生产282μmol/ml的功能性肽(图5B)。
[实施例6]发酵乳的制备和肽量的测定
在使用作为乳酸菌的瑞士乳杆菌CP3232菌株和对比用瑞士乳杆菌CNCM I-3435菌株(专利文献4)、瑞士乳杆菌FERM BP-5445菌株(专利文献7)与瑞士乳杆菌CM4菌株(登录号FERM BP-6060)培养后，以与实施例2相似的方式测定发酵乳的pH和酸度以及由此生产的IPP肽和VPP肽的量。
结果示于表2。以与实施例2中相似的方式表示结果：即，IPP和VPP的量以VPP换算量来表示。术语“酸度”是指发酵乳中含有的酸(乳酸)的浓度。如表2所示，在通过用瑞士乳杆菌CP3232菌株发酵而获得发酵乳的情况下，相对于所产乳酸(即，酸度)的IPP和VPP肽的量在以VPP的换算量计时为7.0mg/g，表明酸度单位下的肽量高。用1.02作为发酵乳的比重进行计算。
[表2]
酸度单位下的LTP(IPP和VPP)的量(VPP换算量)
[实施例7]发酵乳上清液中的游离氨基酸的测定
使用实施例6中获得的发酵乳以与实施例3中相似的方式测定游离氨基酸。结果示于图6和图7。
图6A示出包含在通过在32℃下用各指定的乳酸菌菌株使乳发酵24小时而获得的发酵乳的上清液中各氨基酸的量(nmol/ml)。图6B示出包含在通过在37℃下用各指定的乳酸菌菌株使乳发酵24小时而获得的发酵乳的上清液中各氨基酸的量(nmol/ml)。同样，图7A示出包含在通过在32℃或37℃下用各指定的乳酸菌菌株使乳发酵24小时而获得的发酵乳的上清液中游离氨基酸的总量(μmol/ml)。图7B示出包含在通过在32℃或37℃下用各指定的乳酸菌菌株使乳发酵24小时而获得的发酵乳的上清液中支链氨基酸的量(μmol/ml)。这些结果表明，瑞士乳杆菌CP3232菌株具有高蛋白质水解活性，且通过24小时发酵生产25mol/ml以上的游离氨基酸。特别地，瑞士乳杆菌CP3232菌株通过在37℃下发酵生产28.1μmol/ml的游离氨基酸，且通过在32℃下发酵生产32.4μmol/ml的游离氨基酸(图7A)。还表明由此生产的游离氨基酸中支链氨基酸的含量高，且支链氨基酸占通过24小时发酵生产的游离氨基酸的15%以上。具体地，在37℃发酵的情况下支链氨基酸约占游离氨基酸的20%。在32℃发酵的情况下支链氨基酸约占游离氨基酸的21%(图7B)。
[实施例8]发酵乳上清液中肽的量(OPA法)
以与实施例4中相似的方式测定实施例6中获得的发酵乳上清液中肽的量。结果示于图8。结果表明瑞士乳杆菌CP3232菌株具有高蛋白质水解活性并通过发酵生产大量的肽。具体地，瑞士乳杆菌CP3232菌株通过24小时发酵生产8.5mg/ml以上的肽、通过在32℃下发酵生产10.4mg/ml的肽以及在37℃下发酵生产9.1mg/ml的肽(图8)。
[实施例9]功能性肽的定量
以与实施例5中相似的方式通过LC/MS分析实施例6中获得的发酵乳，然后测定功能性肽的量。图9和图10出示结果。图9A和图9B所示结果揭示，瑞士乳杆菌CP3232菌株具有高蛋白质水解活性且通过24小时发酵生产各种功能性肽。特别地，瑞士乳杆菌CP3232菌株特别生产大量的VPP、IPP、YP、QP和TP。
此外，由图10A和图10B所示结果表明，瑞士乳杆菌CP3232菌株具有高度的蛋白质水解活性并通过24小时发酵生产260μg/ml以上的(总量)功能性肽(XP+XPP)。特别地，瑞士乳杆菌CP3232菌株通过在32℃下发酵生产280μmol/ml的功能性肽(图10A)以及通过在37℃下发酵生产295μmol/ml的功能性肽(图10B)。
[参考例1]瑞士乳杆菌CP3232菌株及其突变株的鉴定方法
通过将经由实施例2-9中描述的方法的测定与通过聚合酶链式反应(PCR)法的鉴定组合，可容易地将乳酸菌，即，实施例1中获得的瑞士乳杆菌CP3232菌株及其突变株区别于其他乳酸菌菌株。此外，可通过PCR法方便地确定菌株是否为作为瑞士乳杆菌CP3232菌株的亲株的瑞士乳杆菌CM4菌株的突变株。
以下简单描述一个实施例。可通过制备DNA样品、使用以下引物通过PCR法进行基因扩增、用0.9%琼脂糖凝胶进行电泳、然后分析电泳图谱来确定目的乳酸菌菌株是否为瑞士乳杆菌CP3232菌株的突变株或瑞士乳杆菌CM4菌株的突变株。
引物：
agccacttcctccgattacag(SEQ ID NO:1)；和
gctattttagcagcgattcg(SEQ ID NO:2)。
该实施例中，使用多种瑞士乳杆菌菌株进行上述PCR法。图11出示结果。图11中各泳道如下。
泳道1：瑞士乳杆菌CP3232菌株
泳道2：瑞士乳杆菌CM4菌株
泳道3：瑞士乳杆菌CP3231菌株
泳道4：瑞士乳杆菌CP3264菌株
泳道5；瑞士乳杆菌CP1081菌株
泳道6；瑞士乳杆菌CP209菌株
泳道7；瑞士乳杆菌CP210菌株
泳道8；瑞士乳杆菌CP293菌株
泳道9：瑞士乳杆菌CP617菌株
泳道10：瑞士乳杆菌CP39菌株
泳道11：瑞士乳杆菌CP790菌株
泳道12：瑞士乳杆菌JCM1120菌株
M：λ噬菌体DNA的限制性内切酶HindⅢ消化产物。
如图11所示，观察到CM4突变株(瑞士乳杆菌CP3232菌株与CP3231菌株)和亲株CM4菌株(泳道1至3)的特征DNA片段。但是未观察到除了瑞士乳杆菌菌株的其他片段。将λ噬菌体DNA的限制性内切酶HindⅢ消化产物作为DNA标记(DNA marker)同时电泳，然后确定特征DNA片段的分子量约为2.2kb。
另外，如下鉴定瑞士乳杆菌CP3232菌株和CP3231菌株，以及亲株CM4菌株。如实施例4和8所述，也可通过使用OPA试剂分析发酵乳中肽的量选择瑞士乳杆菌CP3232菌株。具体地，使用OPA试剂测定根据实施例2制备的发酵乳中肽的量如下。然而瑞士乳杆菌CP3231菌株和CM4菌株分别生产7.5mg/ml和4.5mg/ml的肽，瑞士乳杆菌CP3232菌株生产多达11.1mg/ml的肽，且因此可容易地区别于其他菌株。
[参考例2]瑞士乳杆菌CP3232菌株及其突变株的鉴别方法
以与参考例1中相似的方式，测试实施例1中获得的乳酸菌、瑞士乳杆菌CP3232菌株及其突变株是否可通过进行聚合酶链式反应(PCR)法区别于其他乳酸菌菌株(瑞士乳杆菌CNCM I-3435菌株(专利文献4)和瑞士乳杆菌FERMBP-5445菌株(专利文献7))。
图12示出使用引物通过PCR法进行基因扩增和进行电冰的结果。图12中，各泳道如下：
泳道1：瑞士乳杆菌CP3232菌株
泳道2：瑞士乳杆菌CM4菌株
泳道3：瑞士乳杆菌CNCM I-3435菌株
泳道4：瑞士乳杆菌FERM BP-5445菌株
M：λ噬菌体DNA的限制性内切酶HindⅢ消化产物。
如图12所示，观察到瑞士乳杆菌CP3232菌株(CM4突变株)和亲株CM4菌株(泳道1至2)的特征DNA片段，但是未观察到除了瑞士乳杆菌菌株的其他片段。
将本文所引用的所有出版物、专利和专利申请的全部内容引入本文以作参考。
产业上的可利用性
根据本发明，提供具有高蛋白质水解活性和良好的肽生产能力和/或氨基酸生产能力的属于瑞士乳杆菌的乳酸菌。通过所述乳酸菌生产的氨基酸和/或肽具有各种功能。例如，肽如IPP、VPP和YP具有降血压作用。此外，借助于所述乳酸菌发酵，可获得含有高浓度的具有此类各种功能的各种氨基酸和/或肽及良好风味的发酵乳。因此，本发明在医药、饮食品和健康促进等领域是有用的。
登录号
登录号：FERM BP-11271(Lactobacillus Helveticus CP3232菌株,于2010年8月4日保藏)
登录号：FERM BP-6060(Lactobacillus Helveticus CM4菌株，于1997年8月15日保藏)
序列表的自由文本
SEQ ID NOS：1和2：DNA(合成的寡核苷酸)
Claims (26)
1.一种属于瑞士乳杆菌的乳酸菌，其具有以下(a)至(d)特性的至少一种：
(a)通过使动物乳发酵生产25μmol/ml以上的游离氨基酸；
(b)通过使动物乳发酵生产8.5mg/ml以上的肽；
(c)通过使动物乳发酵生产总量为260μg/ml以上的XP肽和/或XPP肽；和
(d)在通过使动物乳在30-34℃下发酵所获得的发酵乳的酸度单位下，生产以VPP的换算量计为6.0mg/g以上的IPP和VPP肽。
2.根据权利要求1所述的乳酸菌，其中15%以上的所述游离氨基酸为支链氨基酸。
3.根据权利要求1或2所述的乳酸菌，其以60μg/ml以上的量生产YP肽。
4.根据权利要求1至3任一项所述的乳酸菌，其为瑞士乳杆菌CM4菌株(登录号FERM BP-6060)的突变株。
5.根据权利要求1至4任一项所述的乳酸菌，其为瑞士乳杆菌CP3232菌株(登录号FERM BP-11271)或其突变株。
6.一种瑞士乳杆菌CP3232菌株(登录号FERM BP-11271)。
7.一种用于由动物乳生产氨基酸和/或肽的组合物，其包括属于瑞士乳杆菌的至少一种乳酸菌。
8.根据权利要求7所述的组合物，其通过使动物乳发酵生产25μmol/ml以上的游离氨基酸。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述游离氨基酸的15%以上为支链氨基酸。
10.根据权利要求7至9任一项所述的组合物，其通过使动物乳发酵以8.5mg/ml以上的量生产肽。
11.根据权利要求7至10任一项所述的组合物，其通过使动物乳发酵生产总量为260μg/ml以上的XP肽和/或XPP肽。
12.根据权利要求7至11任一项所述的组合物，其通过使动物乳发酵以60μg/ml以上的量生产YP肽。
13.根据权利要求7至12任一项所述的组合物，在通过使动物乳在30-34℃下发酵所获得的发酵乳的酸度单位下，其生产以VPP的换算量计为6.0mg/g以上的IPP和VPP肽。
14.根据权利要求7至13任一项所述的组合物，其中所述乳酸菌为权利要求1至6任一项所述的乳酸菌。
15.一种发酵乳，其通过用属于瑞士乳杆菌的至少一种乳酸菌使动物乳发酵而获得并包含以下(a)至(d)成分的至少一种：
(a)25μmol/ml以上的游离氨基酸；
(b)8.5mg/ml以上的肽；
(c)总计为260μg/ml以上的XP肽和/或XPP肽；和
(d)在酸度单位下，当以VPP的换算量计时为6.0mg/g以上的IPP和VPP肽。
16.根据权利要求15所述的发酵乳，其包括属于瑞士乳杆菌的至少一种乳酸菌。
17.根据权利要求15或16所述的发酵乳，其包括权利要求1至6任一项所述的至少一种乳酸菌。
18.根据权利要求15至17任一项所述的发酵乳，其中所述游离氨基酸的15%以上为支链氨基酸。
19.根据权利要求15至18任一项所述的发酵乳，其包括60μg/ml以上的YP肽。
20.根据权利要求15至19任一项所述的发酵乳，其中在30-34℃的温度下进行所述发酵。
21.根据权利要求15至20任一项所述的发酵乳，其用于降血压药、脑功能改善剂、自主神经调节剂、副交感神经调节剂、交感神经调节剂、营养补充剂、能量补充剂、肌肉分解与肌肉损伤抑制剂、肌肉增强剂、疲劳减轻剂、耐久性改善剂、风味改善剂或醇代谢剂。
22.一种饮食品，其包括权利要求1至6任一项所述的至少一种乳酸菌和/或其处理物、和/或权利要求15至21任一项所述的发酵乳和/或其处理物。
23.一种氨基酸和/或肽的生产方法，其包括使用权利要求1至6任一项所述的至少一种乳酸菌或权利要求7至14任一项所述的组合物使动物乳或乳蛋白质发酵，然后从所获得的发酵产物中收集氨基酸和/或肽。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述氨基酸为支链氨基酸。
25.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述肽为选自由XP肽和/或XPP肽组成的组的至少一种肽。
26.根据权利要求23至25任一项所述的方法，其中在30-34℃的温度下进行所述发酵。
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