CN103215296B - 一种多片段dna分子组装方法及应用 - Google Patents
一种多片段dna分子组装方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种多片段DNA分子组装方法，该方法包括以下步骤：载体***构建、目标序列Lm和Rn克隆进入供给载体B1和/或供给载体B2、接受载体A1与供给载体B1和/或供给载体B2进行多片段组装等。本发明还公开了该方法在基因合成方面、大片段DNA克隆和多基因载体构建中的应用。本发明可以实现多片段DNA的无缝连接，形成一个长的DNA片段，不仅大大降低了大片段基因合成中易出现的突变问题，而且大大缩短了合成时间；在大片段DNA克隆方面，避免了长片段一次性克隆易产生突变，通过多个小片段克隆测序，然后进行组装。在多基因载体构建方面，实现了多个基因构建在同一个载体上并且进行一次性转化的技术。
Description
技术领域
本发明涉及分子克隆技术，合成生物学技术领域，具体涉及的是一种多片段DNA分子组装方法及应用。
背景技术
目前，虽然有各种适合长片段扩增DNA聚合酶，但是在基因组大片段克隆上仍然存在不足，首先大片段扩增的能力有限10kb左右，其次长片段的突变率会随之增加，但是对于一个完整大片段的测序和回复突变都是需要很长的时间和花费很大的精力。对于全基因合成技术，是通过不对称PCR技术合成初期的PCR片段，但是此PCR片段不可能一次合成很长。所以要通过一定的拼接策略，往往要多轮PCR，但是这样又会带进去较多的突变。同时单纯的使用PCR合成的长度非常有限，往往1kb左右，目前销售的clone eazy***可以实现分段克隆，所以一些拥有此专利的公司能够实现较长DNA片段的合成，但是此***需要分段测序，合成速度较慢。在多基因载体构建方面，随着生物学研究的深入，将突破单个基因研究进行多基因相互协调的研究，单个基因进行转化将不能胜任。所以将多个基因构建在同一个载体上并且进行一次性转化的技术将非常必要，目前虽然有一些多基因组装***，但是操作相对复杂。每个基因加入需要多步的操作，而且不能实现无缝连接。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种多片段DNA分子组装方法及应用。主要提供一套适合于多个DNA片段无缝组装成一个完整大片段的方法及其在基因片段合成、含有多个基因的转基因载体构建，合成生物学等方面的应用。
技术方案：针对目前DNA分子组装方法存在的问题和缺陷，本发明的1、一种多片段DNA分子组装方法，其特征在于包括以下步骤：
1)载体***构建：该***包括由接受载体A1、供给载体B1和供给载体B2组成的***，
所述接受载体A1的多克隆位点中含有一组内切酶识别位点，且按照：“载体骨架---反向奇数位内切酶识别位点---任意碱基----正向奇数位内切酶识别位点----载体骨架”排列，且载体骨架中不含有此内切酶的识别位点；
所述供给载体B1的多克隆位点中含有三组内切酶位点，且按照多克隆位点序列左侧待添加目标序列Lm的顺序排列：“载体骨架---正向奇数位内切酶识别位点--反向克隆内切酶识别位点---任意碱基---正向克隆内切酶识别位点--反向偶数位内切酶识别位点---任意碱基----正向偶数位内切酶识别位点---反向奇数位内切酶识别位点---载体骨架”排列，且此供给载体B1的载体骨架中含有的克隆内切酶识别位点被全部剔除，其中m＝1，3，5，7……等奇数；
所述供给载体B2的多克隆位点中含有三组内切酶位点，且按照多克隆位点序列左侧待添加目标序列Ln的顺序排列：“载体骨架---正向偶数位内切酶识别位点--反向克隆内切酶识别位点---任意碱基---正向克隆内切酶识别位点--反向奇数位内切酶识别位点---任意碱基----正向奇数位内切酶识别位点---反向偶数位内切酶识别位点---载体骨架”排列，且此供给载体B2的载体骨架中不含有克隆内切酶识别位点，其中n＝2，4，6，8……等偶数；
2)目标序列Lm克隆进入供给载体B1：先将目标序列Lm通过PCR进行扩增，同时在PCR引物两端添加内切酶位点，使得通过酶切后产生与供给载体B1的克隆内切酶产生相同的粘末端，将目标序列Lm克隆进入供给载体B1，将供给载体B1上的“---反向克隆内切酶识别位点---任意碱基---正向克隆内切酶识别位点---”替代下来，得到载体B1-Lm；目标序列Ln克隆进入供给载体B2：分别先将目标序列Ln通过PCR进行扩增，同时在PCR引物两端添加内切酶位点，使得通过酶切后产生与供给载体B2的克隆内切酶产生相同的粘末端，将目标序列Ln克隆进入供给载体B2，将供给载体B2上的“---反向克隆内切酶识别位点---任意碱基---正向克隆内切酶识别位点---”替代下来，得到载体B2-Ln，其中m＝1，3，5，7……等奇数，n＝2，4，6，8……等偶数；
3)多片段组装：
a、将接受载体A1与载体B1-L1进行酶切连接反应，载体B1-L1上的目标序列L1将被转移到接受载体A1上，得到载体A1-L1；
b、将载体A1-L1和载体B2-L2用内切酶消化，然后用连接酶将载体A1-L1和L2连接得到载体A1-L1-L2；
c、将载体A1-L1-L2和载体B1-L3用内切酶消化，然后用连接酶将载体A1-L1-L2和L3连接得到载体A1-L1-L2-L3；
d、如此往复，直到完成得到载体A1-L1-L2-L3-L4-L5……-Lm-Ln大片段的组装，其中m＝1，3，5，7……等奇数，n＝2，4，6，8……等偶数。
所述接受载体A1和供给载体B1或供给载体B2的抗性不同，供给载体B1或供给载体B2的抗性不同或者相同。
所述内切酶为识别位点和酶切位点不重合的限制性内切酶，所述内切酶的特点在于其识别序列和酶切位点不重合，产生任意粘末端。当给定序列时能够产生任意特定的粘末端。
所述内切酶为typeIIs限制性内切酶或人工合成的锌指核酶，所述typeIIs限制性内切酶为BsmBI、BsaI、SapI或BbsI中的一种或几种。
所述步骤1)中载体***为Bio-Walk***，所述接受载体A1为接受载体pBWA，所述供给载体B1为供给载体pBWD(a)，供给载体B2为供给载体pBWD(b)。
所述连接酶为T4连接酶。
所述的多片段DNA分子组装方法在基因合成、大片段DNA克隆或多基因载体构建中的应用。
有益效果：
本发明可以实现多片段DNA的无缝连接，形成一个长的DNA片段，不仅大大降低了大片段基因合成中易出现的突变问题，而且大大缩短了合成时间；在大片段DNA克隆方面，避免了长片段一次性克隆易产生突变，通过先进行小片段克隆和测序，将测序正确的片段，快速的组装成大片段，逐一的组装到接受载体，完成片段的累加从而在短时间内获得所需的完整DNA片段。在多基因载体构建方面，实现了多个基因构建在同一个载体上并且进行一次性转化的技术。
附图说明
图1本发明pBWA的图谱和多克隆位点示意图。
图2本发明pBWD(a)的图谱和多克隆位点示意图。
图3本发明pBWD(b)的图谱和多克隆位点示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。
实施例1：Bio-Walk***的建立
1)接受载体pBWA采用pBR322复制子，卡那霉素抗性，奇数位(第一次接受)的限制性内切酶为：BsmBI。如图1，多克隆位点的序列为：tagacgagacgagactgtccgtctcagtcg。
其中，gagacg，cgtctc分别为BsmBI的反向识别和正向识别序列，“taga”“gtcg”为BsmBI酶切后产生的粘末端。MCS：mult-clone sit；Kanar：卡纳霉素抗性基因；ori来源于质粒pBR322的复制起始位点，用于在大肠杆菌中复制；bom来源于质粒pBR322的复制动员位点(basis of mobility)；
2)供给载体pBWD(a)的抗性基因为氨苄青霉素抗性基因，其图谱和多克隆位点如图2。多克隆位点序列为：cgtctcAGAGACCNN…NNNGGTCTCNgaagagcaGctcttcggtcgcGagacg。
其中，cgtctc，gagacg分别为BsmbI的正向和反向识别序列；Gagacc，ggtctc分别为BsaI的反向和正向识别序列；gaagagc，gctcttc分别为SapI的反向和正向识别序列；MCS:mult-clone sit；Ampr：卡纳霉素抗性基因；ori来源于质粒pBR322的复制起始位点，用于在大肠杆菌中复制；bom来源于质粒pBR322的复制动员位点(basis of mobility)；“N”为任意碱基；“…”省略任意碱基。
供给载体pBWD(b)的抗性基因为壮观霉素抗性基因，其图谱和多克隆位点如图3。多克隆位点序列GctcttcNGAGACCNN…NNGGTCTCNGagacgNNN…NNNcgtctcggtcggaagagc。
其中，cgtctc，gagacg分别为BsmbI的正向和反向识别序列；Gagacc，ggtctc分别为BsaI的反向和正向识别序列；gaagagc，gctcttc分别为SapI的反向和正向识别序列。MCS:mult-clone sit；Spr：壮观霉素抗性基因；ori来源于质粒pBR322的复制起始位点，用于在大肠杆菌中复制；bom来源于质粒pBR322的复制动员位点(basis of mobility)。“N”为任意碱基；“…”省略任意碱基。
实施例2：用Bio-Walk***进行多基因组装
第一步：将目标基因克隆进入供给载体pBWD(a)，本实施例采用5个基因。pBWD(a)-GENE1：
用GENE1的上游引物“Gene1+”和Gene1的下游引物“Gene1-”扩增GENE1；“catggagtcaaagattcaaatag”，“agcggatggcctaaaaaaaaaac”分别为此GENE1的上游和下
游序列。Gene1+，Gene1-引物全序列如下：
Gene1+：ggtctcAtctc a tagacatggagtcaaagattcaaatag
Gene1-：ggtctc t cttc tctagttttttttttaggccatccgct
用此引物将基因扩增后得到序列：
ggtctcAataga--GENE1—tagaagagacc
pBWD(a)的MCS序列如下：
cgAGAGACCNN…NNGGTCTCNagcaNN…NNGctcttcggtcgcGagacg
用BsaI(下划线为其酶切位点)酶切后其粘末端完全互补从框格处显示。将BsaI消化后的GENE1PCR产物和BsaI消化后的载体骨架经T4连接酶连接后即得到如下序列结构命名为：pBWD(a)-GENE1：
pBWD(a)backbone---cgAtaga-GENE1-tagaagcaNN…NNGctcttcggtcgcGagacg---pBWD(a)backbone
同理得到pBWD(a)-GENE3和pBWD(a)-GENE5。
pBWD(a)-GENE3：
pBWD(a)backbone---cgAtaga-GENE3-tagaagcaNN…NNGctcttcggtcgcGagacg---pBWD(a)backbone
pBWD(a)-GENE5：
pBWD(a)backbone---cgAtaga-GENE5-tagaagcaNN…NNGctcttcggtcgcGagacg---pBWD(a)backbone
与GENE1，GENE3，GENE5相似，通过在扩增目标基因时添加不同的引物接头(正向引物接头：cgc A cttc a a；反向引物接头：cgc t tctc t tcta)扩增Gene2，Gene4然后与供给载体pBWD(b)一起用BsaI进行酶切，酶切后其粘末端完全互补从框格处显示，用T4连接酶进行连接可以得到pBWD(b)-GENE2，
pBWD(b)-GENE4：
pBWD(b)-GENE2：
pBWD(b)backbone---Gctcttcataga-GENE2-tagaaGagacgNN…NNcgtctcgggaagagc---pBWD(b)backbone
pBWD(b)-GENE4：
pBWD(b)backbone---Gctcttcataga–GENE4-tagaaGagacgNN…NNcgtctcgggaagagc---pBWD(b)backbone
第二步：将pBWD(a)-GENE1、pBWD(a)-GENE3、pBWD(a)-GENE5和供给载体pBWD(b)上的基因向接受载体pBWA上组装：
1、构建pBWA-1：
接受载体pBWA的多克隆位点序列如下：
pBWA-MCS：------tccgagacgagactgtccgtctcaa-------
将pBWA和pBWD(a)-GENE1一起用BsmbI进行消化，酶切后其粘末端完全互补从框格处显示，因为产生的粘末端完全互补，然后用T4连接酶可以将接受载体pBWA载体骨架和GENE1片段连接在一起，命名为：pBWA-1。
pBWA-1：--tc-GENE1-tagagaagagcaNN…NNGctcttcga-----
2、构建pBWA-2：
将pBWA-1和pBWD(b)-GENE2一起用SapI进行消化，酶切后其粘末端完全互补从框格处显示，因为产生的粘末端完全互补，然后用T4连接酶可以将pBWA-1载体骨架和GENE2片段连接在一起，命名为：pBWA-2。
pBWA-2：--tctaga-GENE1-a-GENE2-tagaaGagacgNN…NN cgtctcgga-----
3、构建pBWA-3：
将pBWA-2和pBWD(a)-GENE3一起用BsmBI进行消化，因为产生的粘末端完全互补，然后用T4连接酶可以将pBWA-2载体骨架和GENE3片段连接在一起,命名为：pBWA-3。
pBWA-3：--tctaga-GENE1-taga-GENE2-taga-GENE3-tagaagcaNN…NNGctcttcga-----
4、构建pBWA-4：
将pBWA-3和pBWD(b)-GENE4一起用SapI进行消化，因为产生的粘末端完全互补，然后用T4连接酶可以将pBWA-3载体骨架和GENE4片段连接在一起,命名为：pBWA-4。
pBWA-4：--tctaga-GENE1-taga-GENE2-taga-GENE3-taga–GENE4-tagaaGagacgNN…NN cgtc tcga—
5、构建pBWA-5：
将pBWA-4和pBWD(a)-GENE5一起用BsmbI进行消化，酶切后其粘末端完全互补从框格处显示，因为产生的粘末端完全互补，然后用T4连接酶可以将pBWA-4载体骨架和GENE5片段连接在一起,命名为：pBWA-5。
pBWA-5：--tctaga-GENE1-taga-GENE2-taga-GENE3-taga–GENE4-taga-GENE5-tagaagcaNN…NNGctcttcggtcga---
如此往复将5个，以至将更多的基因组装上去。
实施例3：用Bio-Walk***进行全基因合成和大片段DNA的分段克隆。
Cos9基因全基因合成。cos9基因是最近发明的DNAi中重要的介导基因，来源原核生物，所以在真核生物中应用需要进行密码子优化，才能达到较好的表达量，所以要进行全基因合成，序列总长度4147bp，合成序列如下：
CCTAGGCCACCATGGACAAGAAGTACTCCATTGGGCTCGATATCGGCACAAACAGCGTCGGCTGGGCCGTCATTACGGACGAGTACAAGGTGCCGAGCAAAAAATTCAAAGTTCTGGGCAATACCGATCGCCACAGCATAAAGAAGAACCTCATTGGCGCCCTCCTGTTCGACTCCGGGGAAACGGCCGAAGCCACGCGGCTCAAAAGAACAGCACGGCGCAGATATACCCGCAGAAGAATCGGATCTGCTACCTCCAGGAGATCTTTAGTAATGAGATGGCTAAGGTGGATGACTCTTTCTTCCATAGGCTGGAGGAGTCCTTTTTGGTGGAGGAGGATAAAAAGCACGAGCGCCACCCAATCTTTGGCAATATCGTGGACGAGGTGGCGTACCATGAAAAGTACCCAACCATATATCATCTGAGGAAGAAGCTGGTAGACAGTACTGATAAGGCTGACTTGCGGTTGATCTATCTCGCGCTGGCGCACATGATCAAATTTCGGGGACACTTCCTCATCGAGGGGGACCTGAACCCAGACAACAGCGATGTGGACAAACTCTTTATCCAACTGGTTCAGACTTACAATCAGCTTTTCGAAGAGAACCCGATCAACGCATCCGGAGTTGACGCCAAAGCAATCCTGAGCGCTAGGCTGTCCAAATCCCGGCGGCTCGAAAACCTCATCGCACAGCTCCCTGGGGAGAAGAAGAACGGCCTGTTTGGTAATCTTATCGCCCTGTCACTCGGGCTGACCCCCAACTTTAAATCTAACTTCGACCCGAAGATGCCAAGCTGCAACTGAGCAAAGACACCTACGATGATGATCTCGACAATCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCAGACCTTTTTTTGGCGGCAAAGAACCTGTCAGACGCCATTCTGCTGAGTGATATTCTGCGAGTGAACACGGAGATCACCAAAGCTCCGCTGAGCGCTAGTATGATCAAGCGCTATGATGAGCACCACCAAGACTTGACTTTGCTGAAGGCCCTTGTCAGACAGCAACTGCCTGAGAAGTACAAGGAAATTTTCTTCGATCAGTCTAAAAATGGCTACGCCGGATACATTGACGGCGGAGCAAGCCAGGAGGAATTTTACAAATTTATTAAGCCCATCTTGGAAAAAATGGACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTAAAGCTGAACAGAGAAGATCTGTTGCGCAAACAGCGCACTTTCGACAATGGAAGCATCCCCCACCAGATTCACCTGGGCGAACTGCACGCTATCCTCAGGCGGCAAGAGGATTTCTACCCCTTTTTGAAAGATAACAGGGAAAAGATTGAGAAAATCCTCACATTTCGGATACCCTACTATGTAGGCCCCCTCGCACGCGGAAATTCCAGATTCGCGTGGATGACTCGCAAATCAGAAGAAACCATCACTCGAACTTCGAGGAAGTCGTGGATAAGGGGGCCTCTGCCCAGTCCTTCATCGAAAGGATGACTAACTTTGATAAAAATCTGCCTAACGAAAAGGTGCTTCCTAAACACTCTCTGCTGTACGAGTACTTCACAGTTTATAACGAACTCACCAAGGTCAAATACGTCACAGAAGGGATGAGAAAGCCAGCATTCCTGTCTGGAGAGCAGAAGAAAGCTATCGTGGACCTCCTCTTCAAGACGAACCGGAAAGTTACCGTGAAACAGCTCAAAGAGGACTATTTCAAAAAGATTGAATGTTTCGACTCTGTTGAAATCAGCGGAGTGGAGGATCGCTTCAACGCATCCCTGGGAACGTATCACGATCTCCTGAAAATCATTAAAGACAAGGACTTCCTGGACAATGAGGAGAACGAGGACATTCTTGAGGACATTGTCCTCACCCTTACGTTGTTTGAAGATAGGGAGATGATTGAAGAACGCTTGAAAACTTACGCTCATCTCTTCGACGACAAAGTCATGAAACAGCTCAAGAGGCGCCGATATACAGGATGGGGGCGGCTGTCAAGAAAACTGATCAATGGGATTCGAGACAAGCAGAGTGGAAAGACAATCCTGGATTTTCTTAAGTCCGATGGATTTGCCAACCGGAACTTCATGCAGTTGATCCATGATGACTCTCTCACCTTTAAGGAGGACATCCAGAAAGCACAAGTTTCTGGCCAGGGGGACAGTCTGCACGAGCACATCGCTAATCTTGCAGGTAGCCCAGCTATCAAAAAGGGAATCAGACCGTTAAGGTCGTGGATGAACTCGTCAAAGTAATGGGAAGGCATAAGCCCGAGAATATCGTTATCGAGATGGCCCGAGAGAACCAAACTACCCAGAAGGGACAGAAGAACAGTAGGGAAAGGATGAAGAGGATTGAAGAGGGTATAAAAGAACTGGGGTCCCAAATCCTTAAGGAACACCCAGTTGAAAACACCCAGCTTCAGAATGAGAAGCTCTACCTGTACTACCTGCAGAACGGCAGGGACATGTACGTGGATCAGGAACTGGACATCAATCGGCTCTCCGACTACGACGTGGATCATATCGTGCCCCAGTCTTTTCTCAAAGATGATTCTATTGATAATAAAGTGTTGACAAGATCCGATAAAAATAGAGGGAAGAGTGATAACGTCCCCTCAGAAGAAGTTGTCAAGAAAATGAAAAATTATTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAACTGATCACACAACGGAAGTTCGATAATCTGACTAAGGCTGAACGAGGTGGCCTGTCTGAGTTGGATAAAGCCGGCTTCATCAAAAGGCAGCTTGTTGAGACACGCCAGATCACCAAGCACGTGGCCCAAATTCTCGATTCACGCATGAACACCAAGTACGATGAAAATGACAAACTGATTCGAGAGGTGAAAGTTATTACTCTGAAGTCTAAGCTGGTGTCAGATTTCAGAAAGGACTTTCAGTTTTATAAGGTGAGATCAACAATTACCACCATGCGCATGATGCCTACCTGAATGCAGTGGTAGGCACTGCACTTATCAAAAAATATCCCAAGCTGGAATCTGAATTTGTTTACGGAGACTATAAAGTGTACGATGTTAGGAAAATGATCGCAAAGTCTGAGCAGGAAATAGGCAAGGCCACCGCTAAGTACTTCTTTTACAGCAATATTATGAATTTTTTCAAGACCGAGATTACACTGGCCAATGGAGAGATTCGGAAGCGACCACTTATCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAATCGTGTGGGACAAGGGTAGGGATTTCGCGACAGTCCGGAAGGTCCTGTCCATGCCGCAGGTGAACATCGTTAAAAAGACCGAAGTACAGACCGGAGGCTTCTCCAAGGAAAGTATCCTCCCGAAAAGGAACAGCGACAAGCTGATCGCACGCAAAAAAGATTGGGACCCCAAGAAATACGGCGGATTCGATTCTCCTACAGTCGCTTACAGTGTACTGGTTGTGGCCAAAGTGGAGAAAGGGAAGTCTAAAAAACTCAAAAGCGTCAAGGAACTGCTGGGCATCACAATCATGGAGCGATCAAGTTTCGAAAAAAACCCCATCGACTTTCTGGAGGCGAAAGGATATAAAGAGGTCAAAAAAGACCTCTTAAGCTGCCCAAGTACTCTCTCTTTGAGCTTGAAAACGGCCGGAAACGAATGCTCGCTAGTGCGGGCGAGCTGCAGAAAGGTAACGAGCTGGCACTGCCCTCTAAATACGTTAATTTCTTGTATCTGGCCAGCCACTATGAAAAGCTCAAAGGGTCCCCCGAAGATAATGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAACAACACAAACACTACCTTGATGAGATCATCGAGCAAATAAGCGAGTTCTCCAAAAGAGTGATCCTCGCCGACGCTAACCTCGATAAGGTGCTTTCTGCTTACAATAAGCACAGGGATAAGCCCATCAGGGAGCAGGCAGAAAACATTATCCACTTGTTTACTCTGACCAACTTGGGCGCACCTGCAGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATAGACAGAAAGCGGTACACCTCTACAAAGGAGGTCCTGGACGCCACACTGATTCATCAGTCAATTACGGGGCTCTATGAAACAAGAATCGACCTCTCTCAGCTCGGTGGAGACAGCAGGGCTGACCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTG
合成策略分成6段(序列中标记方框的位置为分段位置)合成，每段大小600-700bp。每个小片段采用不对称PCR的方法合成。因为不对称PCR合成法只能合成1000bp以内的小段DNA序列，合成后分别克隆到pBWD(a)和pBWD(b)中。分别命名：pBWD(a)-cos91，pBWD(a)-cos93，pBWD(a)-cos95，pBWD(b)-cos92，pBWD(b)-cos94，pBWD(b)-cos96。
合成步骤如下：
第一步：先把不对称PCR合成的短片段克隆进供给载体pBWD(a)和pBWD(b)中并且测序正确。其中，酶切后其粘末端完全互补从框格处显示。
克隆后载体结构如下：
pBWD(a)-cos91：
pBWD(a)backbone-cgAtagaCCTA-cos91-CTGGagcaNN…NNGctcttcggtcgcGagacg-pBWD(a)backbone
pBWD(b)-cos92：
pBWD(b)backbone-GctcttcaCTGG-cos92-CCTGaGagacgNN…NNcgtctcgggaagagc—pBWD(b)backbone
pBWD(a)-cos93：
pBWD(a)backbone-cgACCTG-cos93-ACTGagcaNN…
NNGctcttcggtcgcGagacg-pBWD(a)backbone
pBWD(b)-cos94：
pBWD(b)backbone-GctcttcaACTG-cos94-GAGAaGagacgNN…NNcgtctcgggaagagc-pBWD(b)backbone
pBWD(a)-cos95：
pBWD(a)backbone--cgAGAGA-cos95-ATCAagcaNN…NNGctcttcggtcgcGagacg-pBWD(a)backbone
pBWD(b)-cos96：
pBWD(b)backbone-GctcttcaATCA-cos96-GGTGaGagacgNN…NNcgtctcgggaagagc-pBWD(b)backbone
第二步，短片段组装。酶切后其粘末端完全互补从框格处显示。
pBWA的多克隆位点序列如下：
pBWA-MCS：------tccgagacgagactgtccgtctcaa-------
1、构建pBWA-cos9(1)：
将pBWA和pBWD(a)-cos91一起用BsmbI进行消化，因为产生的粘末端完全互补，然后用T4连接酶可以将pBWA载体骨架和cos91片段连接在一起,命名为：pBWA-cos9(1)。
pBWA-cos9(1)：--tctagaccta-cos91-ctgggaagagcaNN…NNGctcttcga-----
2、构建pBWA-cos9(2)：
将pBWA-cos9(1)和pBWD(b)-cos92一起用SapI进行消化，因为产生的粘末端完全互补，然后用T4连接酶可以将pBWA-cos9(1)载体骨架和cos92片段连接在一起,命名为：pBWA-cos9(2)。
pBWA-cos9(2)：--tctaga-cos91-ctgg-cos92-CCTGaGagacgNN…NNcgtctcgga--
3、构建pBWA-cos9(3)：
将pBWA-cos9(2)和pBWD(a)-cos93一起用BsmbI进行消化，因为产生的粘末端完全互补，然后用T4连接酶可以将pBWA-cos9(2)载体骨架和cos93片段连接在一起，命名为：pBWA-cos9(3)。
pBWA-cos9(3):--tctaga-cos91-ctgg-cos92-CCTG-cos93-ACTGagcaNN…NNGctcttcggtcga—
4、构建pBWA-cos9(4)：
将pBWA-cos9(3)和pBWD(b)-cos94一起用SapI进行消化，因为产生的粘末端完全互补，然后用T4连接酶可以将pBWA-cos9(3)载体骨架和cos94片段连接在一起，命名为：pBWA-cos9(4)。
pBWA-cos9(4):--tctaga-cos91-ctgg-cos92-CCTG-cos93-ACTG-cos94-GAGAaGagacgNN…NNcgtctcgga—
5、构建pBWA-cos9(5)：
将pBWA-cos9(4)和pBWD(a)-cos95一起用BsmbI进行消化，因为产生的粘末端完全互补，然后用T4连接酶可以将pBWA-cos9(4)载体骨架和cos95片段连接在一起,命名为：pBWA-cos9(5)。
pBWA-cos9(5):-tctaga-cos91-ctgg-cos92-CCTG-cos93-ACTG-cos94-GAGA-cos95-ATCAagcaNN…NNGctcttcggtcga—
6、构建pBWA-cos9(6)：
将pBWA-cos9(5)和pBWD(b)-cos96一起用SapI进行消化，因为产生的粘末端完全互补，然后用T4连接酶可以将pBWA-cos9(5)载体骨架和cos96片段连接在一起,命名为：pBWA-cos9(6)。
pBWA-cos9(6):-tctaga-cos91-ctgg-cos92-CCTG-cos93-ACTG-cos94-GAGA-cos95-ATCA-cos96-GGTGaGagacgNN…NNcgtctcgga—
即将6个片段无缝拼接成完整的片段。
对于长片段基因的克隆可以采取如同长基因合成类似的方法，化长为短，分段克隆测序后用Bio-Walk进行无缝拼接。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉伯远生物生物科技有限公司
<120> 一种多片段DNA分子组装方法及应用
<130> WHU130223
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 4147
<212> DNA
<213> 原核生物Cos9基因
<220>
<221> gene
<222> (1)..(4147)
<400> 1
cctaggccac catggacaag aagtactcca ttgggctcga tatcggcaca aacagcgtcg 60
gctgggccgt cattacggac gagtacaagg tgccgagcaa aaaattcaaa gttctgggca 120
ataccgatcg ccacagcata aagaagaacc tcattggcgc cctcctgttc gactccgggg 180
aaacggccga agccacgcgg ctcaaaagaa cagcacggcg cagatatacc cgcagaagaa 240
tcggatctgc tacctccagg agatctttag taatgagatg gctaaggtgg atgactcttt 300
cttccatagg ctggaggagt cctttttggt ggaggaggat aaaaagcacg agcgccaccc 360
aatctttggc aatatcgtgg acgaggtggc gtaccatgaa aagtacccaa ccatatatca 420
tctgaggaag aagctggtag acagtactga taaggctgac ttgcggttga tctatctcgc 480
gctggcgcac atgatcaaat ttcggggaca cttcctcatc gagggggacc tgaacccaga 540
caacagcgat gtggacaaac tctttatcca actggttcag acttacaatc agcttttcga 600
agagaacccg atcaacgcat ccggagttga cgccaaagca atcctgagcg ctaggctgtc 660
caaatcccgg cggctcgaaa acctcatcgc acagctccct ggggagaaga agaacggcct 720
gtttggtaat cttatcgccc tgtcactcgg gctgaccccc aactttaaat ctaacttcga 780
cctggccgaa gatgccaagc tgcaactgag caaagacacc tacgatgatg atctcgacaa 840
tctgctggcc cagatcggcg accagtacgc agaccttttt ttggcggcaa agaacctgtc 900
agacgccatt ctgctgagtg atattctgcg agtgaacacg gagatcacca aagctccgct 960
gagcgctagt atgatcaagc gctatgatga gcaccaccaa gacttgactt tgctgaaggc 1020
ccttgtcaga cagcaactgc ctgagaagta caaggaaatt ttcttcgatc agtctaaaaa 1080
tggctacgcc ggatacattg acggcggagc aagccaggag gaattttaca aatttattaa 1140
gcccatcttg gaaaaaatgg acggcaccga ggagctgctg gtaaagctga acagagaaga 1200
tctgttgcgc aaacagcgca ctttcgacaa tggaagcatc ccccaccaga ttcacctggg 1260
cgaactgcac gctatcctca ggcggcaaga ggatttctac ccctttttga aagataacag 1320
ggaaaagatt gagaaaatcc tcacatttcg gataccctac tatgtaggcc ccctcgcacg 1380
cggaaattcc agattcgcgt ggatgactcg caaatcagaa gaaaccatca ctccctggaa 1440
cttcgaggaa gtcgtggata agggggcctc tgcccagtcc ttcatcgaaa ggatgactaa 1500
ctttgataaa aatctgccta acgaaaaggt gcttcctaaa cactctctgc tgtacgagta 1560
cttcacagtt tataacgaac tcaccaaggt caaatacgtc acagaaggga tgagaaagcc 1620
agcattcctg tctggagagc agaagaaagc tatcgtggac ctcctcttca agacgaaccg 1680
gaaagttacc gtgaaacagc tcaaagagga ctatttcaaa aagattgaat gtttcgactc 1740
tgttgaaatc agcggagtgg aggatcgctt caacgcatcc ctgggaacgt atcacgatct 1800
cctgaaaatc attaaagaca aggacttcct ggacaatgag gagaacgagg acattcttga 1860
ggacattgtc ctcaccctta cgttgtttga agatagggag atgattgaag aacgcttgaa 1920
aacttacgct catctcttcg acgacaaagt catgaaacag ctcaagaggc gccgatatac 1980
aggatggggg cggctgtcaa gaaaactgat caatgggatt cgagacaagc agagtggaaa 2040
gacaatcctg gattttctta agtccgatgg atttgccaac cggaacttca tgcagttgat 2100
ccatgatgac tctctcacct ttaaggagga catccagaaa gcacaagttt ctggccaggg 2160
ggacagtctg cacgagcaca tcgctaatct tgcaggtagc ccagctatca aaaagggaat 2220
actgcagacc gttaaggtcg tggatgaact cgtcaaagta atgggaaggc ataagcccga 2280
gaatatcgtt atcgagatgg cccgagagaa ccaaactacc cagaagggac agaagaacag 2340
tagggaaagg atgaagagga ttgaagaggg tataaaagaa ctggggtccc aaatccttaa 2400
ggaacaccca gttgaaaaca cccagcttca gaatgagaag ctctacctgt actacctgca 2460
gaacggcagg gacatgtacg tggatcagga actggacatc aatcggctct ccgactacga 2520
cgtggatcat atcgtgcccc agtcttttct caaagatgat tctattgata ataaagtgtt 2580
gacaagatcc gataaaaata gagggaagag tgataacgtc ccctcagaag aagttgtcaa 2640
gaaaatgaaa aattattggc ggcagctgct gaacgccaaa ctgatcacac aacggaagtt 2700
cgataatctg actaaggctg aacgaggtgg cctgtctgag ttggataaag ccggcttcat 2760
caaaaggcag cttgttgaga cacgccagat caccaagcac gtggcccaaa ttctcgattc 2820
acgcatgaac accaagtacg atgaaaatga caaactgatt cgagaggtga aagttattac 2880
tctgaagtct aagctggtgt cagatttcag aaaggacttt cagttttata aggtgagaga 2940
gatcaacaat taccaccatg cgcatgatgc ctacctgaat gcagtggtag gcactgcact 3000
tatcaaaaaa tatcccaagc tggaatctga atttgtttac ggagactata aagtgtacga 3060
tgttaggaaa atgatcgcaa agtctgagca ggaaataggc aaggccaccg ctaagtactt 3120
cttttacagc aatattatga attttttcaa gaccgagatt acactggcca atggagagat 3180
tcggaagcga ccacttatcg aaacaaacgg agaaacagga gaaatcgtgt gggacaaggg 3240
tagggatttc gcgacagtcc ggaaggtcct gtccatgccg caggtgaaca tcgttaaaaa 3300
gaccgaagta cagaccggag gcttctccaa ggaaagtatc ctcccgaaaa ggaacagcga 3360
caagctgatc gcacgcaaaa aagattggga ccccaagaaa tacggcggat tcgattctcc 3420
tacagtcgct tacagtgtac tggttgtggc caaagtggag aaagggaagt ctaaaaaact 3480
caaaagcgtc aaggaactgc tgggcatcac aatcatggag cgatcaagtt tcgaaaaaaa 3540
ccccatcgac tttctggagg cgaaaggata taaagaggtc aaaaaagacc tcatcattaa 3600
gctgcccaag tactctctct ttgagcttga aaacggccgg aaacgaatgc tcgctagtgc 3660
gggcgagctg cagaaaggta acgagctggc actgccctct aaatacgtta atttcttgta 3720
tctggccagc cactatgaaa agctcaaagg gtcccccgaa gataatgagc agaagcagct 3780
gttcgtggaa caacacaaac actaccttga tgagatcatc gagcaaataa gcgagttctc 3840
caaaagagtg atcctcgccg acgctaacct cgataaggtg ctttctgctt acaataagca 3900
cagggataag cccatcaggg agcaggcaga aaacattatc cacttgttta ctctgaccaa 3960
cttgggcgca cctgcagcct tcaagtactt cgacaccacc atagacagaa agcggtacac 4020
ctctacaaag gaggtcctgg acgccacact gattcatcag tcaattacgg ggctctatga 4080
aacaagaatc gacctctctc agctcggtgg agacagcagg gctgacccca agaagaagag 4140
gaaggtg 4147
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> Gene1的上游引物
<400> 2
ggtctc a tctc a tagacatggagtcaaagattcaaatag 39
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> Gene1的下游引物
<400> 3
ggtctc t cttc tctagttttttttttaggccatccgct 38
<210>4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 接受载体（pBWA）的多克隆位点序列
<400> 4
tagacgagacgagactgtccgtctcagtcg
<210>5
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 供给载体1 pBWD(a) 的多克隆位点序列
<400> 5
cgtctcAGAGACCNNNNNGGTCTCN gaagagcaGctcttcggtcgcGagacg
<210>6
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 供给载体1 pBWD(a) 的多克隆位点序列
<400> 6
GctcttcNGAGACCNNNNGGTCTCNGagacgNNNNNN cgtctcggtcggaagagc
<210>7
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> pBWD(a)-GENE1/ GENE3/ GENE5
<400> 7
cgtctcAtaga- GENE1/ GENE3/ GENE5-tagagaagagcaNNNNGctcttcggtcgcGagacg
<210>8
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> pBWD(a)-GENE2/ GENE4/ GENE6
<400> 8
Gctcttcataga-GENE2/ GENE4/ GENE6-tagaaGagacgNNNNcgtctcggtcggaagagc
Claims (4)
1.一种多片段DNA分子组装方法，其特征在于包括以下步骤：
1)载体***构建：该***包括由接受载体A1、供给载体B1和供给载体B2组成的***，
所述接受载体A1的多克隆位点中含有一组内切酶识别位点，且按照：“载体骨架---反向奇数位内切酶识别位点---任意碱基----正向奇数位内切酶识别位点----载体骨架”排列，且载体骨架中不含有此内切酶的识别位点；
所述供给载体B1的多克隆位点中含有三组内切酶位点，且按照多克隆位点序列左侧待添加目标序列Lm的顺序排列：“载体骨架---正向奇数位内切酶识别位点--反向克隆内切酶识别位点---任意碱基---正向克隆内切酶识别位点--反向偶数位内切酶识别位点---任意碱基----正向偶数位内切酶识别位点---反向奇数位内切酶识别位点---载体骨架”排列，且此供给载体B1的载体骨架中含有的克隆内切酶识别位点被全部剔除，其中m＝1，3，5，7……等奇数；
所述供给载体B2的多克隆位点中含有三组内切酶位点，且按照多克隆位点序列左侧待添加目标序列Ln的顺序排列：“载体骨架---正向偶数位内切酶识别位点--反向克隆内切酶识别位点---任意碱基---正向克隆内切酶识别位点--反向奇数位内切酶识别位点---任意碱基----正向奇数位内切酶识别位点---反向偶数位内切酶识别位点---载体骨架”排列，且此供给载体B2的载体骨架中不含有克隆内切酶识别位点，其中n＝2，4，6，8……等偶数；
2)目标序列Lm克隆进入供给载体B1：先将目标序列Lm通过PCR进行扩增，同时在PCR引物两端添加内切酶位点，使得通过酶切后产生与供给载体B1的克隆内切酶产生相同的粘末端，将目标序列Lm克隆进入供给载体B1，将供给载体B1上的“---反向克隆内切酶识别位点---任意碱基---正向克隆内切酶识别位点---”替代下来，得到载体B1-Lm；目标序列Ln克隆进入供给载体B2：分别先将目标序列Ln通过PCR进行扩增，同时在PCR引物两端添加内切酶位点，使得通过酶切后产生与供给载体B2的克隆内切酶产生相同的粘末端，将目标序列Ln克隆进入供给载体B2，将供给载体B2上的“---反向克隆内切酶识别位点---任意碱基---正向克隆内切酶识别位点---”替代下来，得到载体B2-Ln，其中m＝1，3，5，7……等奇数，n＝2，4，6，8……等偶数；
3)多片段组装：
a、将接受载体A1与载体B1-L1进行酶切连接反应，载体B1-L1上的目标序列L1将被转移到接受载体A1上，得到载体A1-L1；
b、将载体A1-L1和载体B2-L2用内切酶消化，然后用连接酶将载体A1-L1和L2连接得到载体A1-L1-L2；
c、将载体A1-L1-L2和载体B1-L3用内切酶消化，然后用连接酶将载体A1-L1-L2和L3连接得到载体A1-L1-L2-L3；
d、如此往复，直到完成得到载体A1-L1-L2-L3-L4-L5……-Lm-Ln大片段的组装，其中m＝1，3，5，7……等奇数，n＝2，4，6，8……等偶数；
其中，所述内切酶为BsmBI、BsaI、SapI或BbsI中的一种或几种。
2.如权利要求1所述的一种多片段DNA分子组装方法，其特征在于：所述接受载体A1和供给载体B1或供给载体B2的抗性不同，供给载体B1或供给载体B2的抗性不同或者相同。
3.如权利要求1所述的一种多片段DNA分子组装方法，其特征在于：所述连接酶为T4连接酶。
4.权利要求1所述的多片段DNA分子组装方法在基因合成、大片段DNA克隆或多基因载体构建中的应用。
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|---|---|---|---|
| CN201310094572.6A CN103215296B (zh) | 2013-03-22 | 2013-03-22 | 一种多片段dna分子组装方法及应用 |
| PCT/CN2014/072894 WO2014146539A1 (zh) | 2013-03-22 | 2014-03-05 | 一种多片段dna分子组装方法及应用 |
| US14/862,133 US10144936B2 (en) | 2013-03-22 | 2015-09-22 | Method of assembling multi-fragment DNA molecule and use thereof |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| CN201310094572.6A CN103215296B (zh) | 2013-03-22 | 2013-03-22 | 一种多片段dna分子组装方法及应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103215296A CN103215296A (zh) | 2013-07-24 |
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