CN103210839B - 一种油菜菌核病抗性改良的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种油菜菌核病抗性改良的方法，通过杂交、回交，将甘蓝的菌核病抗性转移到白菜型油菜中，再通过杂交，聚合甘蓝和白菜型油菜的菌核病抗性，选育高抗菌核病的甘蓝型油菜。
Description
技术领域
本发明属于植物新品系选育技术领域，具体涉及一种油菜菌核病抗性改良的方法。其国际专利分类号为A01H1/04。
背景技术
油菜是由白菜型油菜和甘蓝远缘杂交，经染色体加倍进化而来的一种油料作物。油菜是我国的主要油料作物，其种植区域主要分布在长江流域。该区域春季雨水充沛，油菜菌核病流行严重，每年导致油菜因菌核病危害减产10%到30%。选育抗病品种是解决油菜菌核病危害最经济有效的途径。
对甘蓝型油菜及其近缘种资源进行菌核病抗性鉴定的研究中，发现白菜的抗病水平较差，甘蓝型油菜抗性居中，而甘蓝对菌核病的抗性较强（Mei et al. 2011, Euphytica 134:599-604)。
油菜两个亲本种同属芸薹属，它们共同的祖先种在400万年前分化为该两个物种（Rana, et al. 2006, Plant Journal 40: 725-733）。现有研究证实白菜型油菜与甘蓝的基因组之间存在高度的同源性（Attia and Robbelen 1986, Can J Genet Cytol 28:323-329; Cheung, et al. 2009, Plant Cell 21:1912-1928）。通过白菜型油菜与甘蓝种间杂交，可将一个物种的遗传成分导入到另一物种中。
发明内容
本发明的目的在于提供一种油菜菌核病抗性改良的方法，提高油菜的菌核病抗性。
本发明的技术方案如下：
一种油菜菌核病抗性改良的方法，其首先利用菌核病抗性强的甘蓝与白菜型油菜远缘杂交，经过胚挽救，获得单倍体杂种；再将杂交后代与白菜型油菜亲本回交和自交，将甘蓝的菌核病抗性转移到白菜型油菜中，筛选得到菌核病抗性改良的白菜型油菜；最后通过杂交，聚合甘蓝和白菜型油菜的菌核病抗性，选育高抗菌核病的甘蓝型油菜。
其中，对于最后一步的通过杂交聚合甘蓝和白菜型油菜的菌核病抗性的方法有两种，一种是：用菌核病抗性改良的白菜型油菜与抗菌核病的甘蓝杂交，经过胚挽救，染色体加倍，并对后代进行菌核病抗性鉴定，筛选得到菌核病抗性强的甘蓝型油菜。
另一种是：先利用甘蓝型油菜与甘蓝杂交，染色体加倍获得的6倍体材料为桥梁，再与菌核病抗性改良的白菜型油菜杂交，后代进行菌核病抗性鉴定，筛选菌核病抗性强的甘蓝型油菜。
本发明提供的油菜菌核病抗性改良的方法其主要特点是：通过甘蓝与白菜型油菜远缘杂交，并与白菜型油菜回交，自交，将甘蓝的菌核病抗性转移到白菜型油菜中，通过杂交，聚合甘蓝和白菜型油菜的菌核病抗性，选育高抗菌核病的甘蓝型油菜。
采用本发明，合成的甘蓝型油菜的菌核病抗性得到了显著改良。
具体实施方式
以已鉴定出的高抗菌核病的甘蓝材料C01为供试材料（Mei, et al. 2011, Euphytica 177, 393-400），改良油菜菌核病抗性为本发明方法的具体实施方式，但并不是对本发明方法的限定，任何不超离本发明实质内容的变换，仍应属于本发明的保护范围。
实施例1：白菜型油菜菌核病抗性的改良
白菜型油菜与甘蓝远缘杂交：以白菜型油菜地方品种“浠水白油菜”为母本（中国农科院油料作物研究所提供），在开花前2天人工剥开花蕾，授以高抗菌核病甘蓝C01（Mei, et al. 2011, Euphytica 177, 393-400）的花粉，套袋一周。通过胚挽救，形态学，花粉育性和结实性观察，细胞学鉴定，获得远缘杂交材料。
共授粉131个花蕾，解剖子房26个，胚挽救获得了一个无性系共24株组培苗，花粉育性观察发现其花粉可染率平均为35.6%。杂种植株在苗期其叶面具有与甘蓝亲本相似的柔软细毛，叶色较绿，有叶柄，其叶片形态与白菜亲本相比差异十分明显，其成株期形态与甘蓝型油菜相似。对杂种F1进行体细胞染色体观察发现，杂种F1植株均为19条染色体，结实性观察到平均每荚粒数为1.53（粒）。
杂种与白菜型油菜回交，自交后代选择：在开花前2天剥开杂种植株花蕾，授以白菜型油菜“浠水白油菜”的花粉，套袋一周。对授粉后第8天的胚进行胚挽救，扩繁，生根后的植株在油菜移栽季节移至大田，采用一般的大田管理。根据后代鉴定情况，与白菜型油菜进行回交1到2次后，然后自交。
回交和自交后代进行菌核病抗性鉴定，花粉育性及结实性的观察，和细胞学检测。取白菜型油菜花粉授予杂种，共授粉976花蕾，解剖子房214个，获得了12株BC1，花粉育性观察发现平均花粉可染率为51.2%，其中一个染色体数回复到白菜型油菜亲本染色体数目的BC1，与白菜型油菜亲本相比，其菌斑扩展的程度，叶片为0.67，茎杆为0.82，结实性为平均每荚粒数为7.53。
该实施方案涉及具体实验方法如下：
胚挽救：授粉后第8天，摘取正在发育的子房，用75%的酒精表面消毒15秒后，无菌水洗涤1分钟，再用10%的次氯酸钠溶液消毒15分钟，接着用无菌水洗涤3次，每次5分钟。在无菌条件下剥离子房取出幼胚接种到含有1.5%蔗糖的1/2MS培养基中，置于25℃培养室中培育（每日16小时2000 lx光照，8小时黑暗），直至幼胚萌发后，转移到含有3%蔗糖、2.0 mg/L 6-BA和0.2 mg/L NAA的MS培养基中进行分化培养，然后转移至MS培养基中进行生根培养。生根后的植株在油菜移栽季节移至大田，采用一般的大田管理。
花粉育性观察：取当天新开未污染的花朵的雄蕊，将花粉轻轻抖落在10%的醋酸洋红溶液中染色，然后在光学显微镜下观察并计数，瘪小且染色浅的花粉粒为不育花粉，饱满且染色深的花粉粒为可育花粉。每单株观察花粉的总数为300个。
植株结实性观察：选取主花序或者最上部两个分枝自由授粉的角果 30枚，统计饱满种子粒数，计算平均每角果粒数。
细胞学鉴定：取初花期的幼小花蕾，经0.002 mol/L的8-羟基喹啉在22 ℃下处理3h，然后用卡诺固定液（V乙醇:V冰醋酸= 3:1）固定24h以上，之后换至70%乙醇于4 ℃下保存。观察时，取子房在1 mol/L的HCl溶液中于60 ℃水解10 min，之后将柱头置于载玻片上，滴一滴10%改良的卡宝品红，压片后在光学显微镜（200倍）下观察细胞染色体数目。
菌核病抗性鉴定：参照Mei 等的方法（Euphytica 2011, 177:393-399； Eur J Plant Pathol 2012, 34:599-604），对苗期叶片和成株期茎杆进行离体接种鉴定。当植株处于9-12叶期时，剪取倒4叶进行菌核病接种，并置于温度22 ℃，湿度为95%的接种室。接种后第三天测量菌斑的长径和短径，根据公式S = π*a*b/4计算病斑面积。当青荚期时，截取约45 cm长的主茎或者侧枝，两端用保鲜膜缠绕，用直径为4 mm的打孔器在茎杆上处创造一个相同的创伤，然后在伤口处接种菌丝块，接种后第四天测量病斑长度。其菌斑扩展的程度的计算是以待测植株病斑观察值与白菜型油菜亲本病斑观察值的相对比值。
实施例2：白菜型油菜与甘蓝杂交合成甘蓝型油菜
以菌核病抗性改良的白菜型油菜与抗病甘蓝C01（Mei, et al. 2011, Euphytica 177, 393-400）进行种间杂交，授粉后第8天对杂种胚按照实施例1中的方法进行胚挽救，直至幼胚萌发后，转移到含有3%蔗糖、2.0 mg/L 6-BA和0.2 mg/L NAA的MS培养基中进行分化培养，发展至预定拷贝数后转移至MS培养基中进行生根培养。生根后，采用0.5 %秋水仙素泡根处理6小时诱导染色体加倍，以发展人工合成甘蓝型油菜，然后将植株移栽到大田，进行一般的田间管理。最后按照实施例1中抗性鉴定的方法对获得的20份人工合成油菜进行菌核病抗性鉴定，筛选得到菌核病抗性比甘蓝型油菜品种中双9号强1.5倍的个体。
实施例3：以6倍体材料为桥梁，聚合白菜型油菜和甘蓝抗性
以抗病甘蓝C01（Mei, et al. 2011, Euphytica 177, 393-400）与甘蓝型油菜品种中双9号（中国农科院油料作物研究所提供）杂交，染色体加倍获得基因型为AACCCC的6倍体材料，然后与实施例1获得的菌核病抗性改良的白菜型油菜杂交，后代进行菌核病抗性鉴定，聚合白菜型油菜和甘蓝的菌核病抗性，对获得的200份材料进行菌核病抗性鉴定，筛选得到菌核病抗性比甘蓝型油菜品种中双9号强2倍的个体。
Claims (3)
1.一种油菜菌核病抗性改良的方法，其特征在于，首先利用抗菌核病的甘蓝与白菜型油菜远缘杂交，经过胚挽救，获得单倍体F1杂种；再将杂交后代与白菜型油菜亲本回交，从回交后代中选择菌核病抗性显著强于原白菜型油菜亲本、且染色体数目恢复白菜型油菜应有的染色体数目的个体进行自交，将甘蓝的菌核病抗性转移到白菜型油菜中，通过形态学鉴定，细胞学分析和菌核病抗性鉴定，筛选得到菌核病抗性改良的白菜型油菜；最后通过杂交，聚合甘蓝和白菜型油菜的菌核病抗性，选育高抗菌核病的甘蓝型油菜。
2.根据权利要求1所述的油菜菌核病抗性改良的方法，其特征在于所述通过杂交，聚合甘蓝和白菜型油菜的菌核病抗性的方法之一是：用菌核病抗性改良的白菜型油菜与抗菌核病的甘蓝杂交，经过胚挽救，染色体加倍，并对后代进行菌核病抗性鉴定，筛选得到菌核病抗性强的甘蓝型油菜。
3.根据权利要求1所述的油菜菌核病抗性改良的方法，其特征在于所述通过杂交，聚合甘蓝和白菜型油菜的菌核病抗性的方法之二是：先利用甘蓝型油菜与甘蓝杂交，染色体加倍获得的6倍体材料为桥梁，再与菌核病抗性改良的白菜型油菜杂交，后代进行菌核病抗性鉴定，筛选菌核病抗性强的甘蓝型油菜。
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