CN103204999A

CN103204999A - 水溶性荧光树枝状大分子的合成方法及其应用

Info

Publication number: CN103204999A
Application number: CN2013100951943A
Authority: CN
Inventors: 尹梅贞; 许泽军; 何碧程; 沈杰
Original assignee: Beijing University of Chemical Technology
Current assignee: Beijing University of Chemical Technology
Priority date: 2013-03-22
Filing date: 2013-03-22
Publication date: 2013-07-17
Anticipated expiration: 2033-03-22
Also published as: CN103204999B

Abstract

本发明公开了水溶性荧光树枝状大分子的合成方法及其应用。该类树枝状大分子采用“发散法”或“收敛法”制备了不同代数、携带不同官能团的荧光树枝状大分子。其中***携带铵盐阳离子的荧光树枝状大分子具有良好的水溶性和生物相容性，能够进入活细胞，并且能与负电性的DNA结合，可以作为基因载体将外源核酸构件DNA或RNA带入细胞。细胞摄取实验表明随着代数的增加，树枝状大分子穿透细胞膜及运载基因的能力增强。本发明具有合成简便、效率高、产品纯化简单等优点，且合成的树枝状大分子安全低毒、水溶性优异、光稳定性好，可作为多功能细胞荧光标记分子、基因载体，应用于生物医药领域的科学研究和基因诊断。

Description

水溶性荧光树枝状大分子的合成方法及其应用

技术领域

本发明属于树枝状大分子合成、基因载体及生物细胞标记领域，特别涉及一类合成可生物降解的苝类荧光树枝状大分子应用于非病毒体系的基因载体。

背景技术

伴随先进生物技术疗法的发展，基因导入体系变得更加重要。目前常用的基因载体主要有病毒型和非病毒型两大类，病毒型基因转染载体具有安全问题及低基因转染效率的局限性，限制了它们的应用范围。研发具有安全性的非病毒基因载体一直是生物材料领域的热点研究课题。目前研究较多的非病毒基因载体体系主要有阳离子多聚合物型载体、可生物降解的聚合物体系、多复合物脂质体体系、热敏型聚合物体系等。研究得比较多的阳离子型基因载体有聚乙烯亚胺（PEI）、聚赖氨酸（PLL）以及聚酰胺-胺型树枝状高分子（PAMAM），其中树枝状高分子的应用研究尤其受到重视。

苝及其衍生物具有很好的光、热、化学稳定性、几乎100％的荧光量子产率（FQY）、窄的荧光发射峰、能够与细胞背景荧光(395-479nm)分开以及优异的染色性能，已广泛应用于有机光电器件、激光染料以及生物荧光探针领域。

近年来，此类化合物已经应用于生物领域，如蛋白质靶向标记和细胞特异性标记等，然而水溶性差直接影响了它在这一领域的应用，因此提高此类化合物的水溶性及在水溶液中保持高荧光量子产率具有重要意义。在苝的***进行功能基团修饰可以使其最大吸收峰发生很大红移，能够更好的避开细胞背景荧光。

树枝状大分子由于其精确的三维纳米分子结构，分子内部存在着大量空腔、携带大量的表面官能团，能够广泛应用于生物医药领域，如药物载体和基因载体等。目前所合成的以苝衍生物为荧光核的树枝状大分子都具有良好的水溶性、生物相容性、较低的细胞毒性以及优异的细胞标记特性。然而，这些大分子合成步骤繁琐，需要对中间产物保护与解保护，而保护/去保护的过程往往会反应不完全且伴有副反应，从而导致树枝状大分子结构存在缺陷；同时，这些合成的苝衍生物树枝状大分子呈现电中性，还没有报道将它们应用于药物载体和基因载体等方面。因而，发明一种简单、高效的制备水溶性的苝类衍生物荧光树枝状大分子的方法，对于其在生物医药领域（如细胞标记、药物载体、基因载体等）具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一类光、热、化学稳定性好、水溶性好、可生物降解、结构可设计性的苝类荧光树枝状大分子，且其具有很好的生物相容性、细胞标记性。首先通过成熟的合成方法制备携带四个伯胺官能团的苝荧光核A0，然后通过不对称单体选择性“点击”化学反应，合成不同代数、携带不同官能团的荧光树枝状大分子。将携带不同氨基官能团的荧光阳离子树枝状大分子B1、B2和B3分别与活体细胞进行培养，研究其穿透细胞膜的能力；将B1、B2和B3分别与DNA复合，然后与细胞进行培养，研究其运载基因的能力。

合成一类以苝衍生物为荧光核的树枝状大分子，包括：（1）携带官能基团的苝类衍生物及其类似物（本发明选择多环芳香族烃的萘，芘，苝，terylene和它们的衍生物作为荧光发射团）与不对称单体AB（AB型不对称单体为甲基丙烯酰氧基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酰氧基丙烯酸丙酯或甲基丙烯酰氧基乙氧基乙氧基丙烯酸乙酯）反应后，重复依次加入不对称单体巯基乙胺和AB，通过AB与巯基乙胺之间选择性“点击”化学反应制备苝类荧光树枝状大分子。（2）苝荧光树枝状大分子端基的官能化修饰：将羟基、PEG链功能基团引入到荧光树枝状大分子的最***末端。（3）水溶性阳离子荧光树枝状大分子应用于基因载体，研究B1、B2、B3穿透细胞膜及运载基因能力。其具体制备步骤为：

1.树枝状大分子的设计合成

1.1首先以商业荧光化合物四溴苝酐（4Br-PDA）为原料，经过酰胺化反应合成具有高荧光量子产率的苝类衍生物4Br-PBI；然后利用取代反应将氨基引入到苝核的“海岛”位置，从而得到携带四个伯胺基团的苝类化合物A0（化合物A0属于苝类荧光发射团系列），其结构式如下：

1.2将化合物A0和甲基丙烯酰氧基丙烯酸乙酯（MAEA）加入反应管中，摩尔比在1：16-1：20之间，在氮气氛围下室温搅拌过夜，然后在48-53℃反应48-56h，得到端甲基丙烯酸酯的第一代荧光树枝状大分子（A1）；

1.3将上述A1和巯基乙胺按照摩尔比在1：9-1：11之间溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，在氮气氛围下室温搅拌30-45min后，得到氨基官能化的第一代荧光树枝状大分子（B1）；

1.4将上述化合物B1和MAEA按照摩尔比在1：32-1：80之间混合加入反应管中，在氮气氛围下室温搅拌过夜，然后在48-53℃反应56-72h，得到端甲基丙烯酸酯的第二代荧光树枝状大分子（A2）；

1.5将上述A2和巯基乙胺按照摩尔比在1：18-1：21之间溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，在氮气氛围下室温搅拌30-45min后，得到氨基官能化的第二代荧光树枝状大分子（B2）；

1.6将上述化合物B2和MAEA按照摩尔比在1：80-1：400之间混合加入反应管中，在氮气氛围下室温搅拌过夜，然后在48-53℃反应72-120h，得到端甲基丙烯酸酯的第三代荧光树枝状大分子（A3）；

1.7将上述A3和巯基乙胺按照摩尔比在1：38-1：42之间溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，在氮气氛围下室温搅拌30-45min后，得到氨基官能化的第三代荧光树枝状大分子（B3）；

2苝类荧光树枝状大分子端基的功能化修饰

2.1羟基功能化的苝类荧光树枝状大分子的合成

将上述A1和巯基甘油按照摩尔比在1：18-1：22之间溶解在DMSO中，并以三乙胺为催化剂，氮气氛围下室温搅拌22-26h后，得到羟基官能化的第一代荧光树枝状大分子（C1）；

将上述A2和巯基甘油按照摩尔比在1：36-1：42之间溶解在DMSO中，并以三乙胺为催化剂，氮气氛围下室温搅拌35-38h后，得到羟基官能化的第二代荧光树枝状大分子（C2）；

将上述A3和巯基甘油按照摩尔比在1：80-1：100之间溶解在DMSO中，并以三乙胺为催化剂，氮气氛围下室温搅拌38-48h后，得到羟基官能化的第三代荧光树枝状大分子（C3）。

2.2末端PEG链功能化的苝类荧光树枝状大分子的合成

携带四个伯胺基团的苝类化合物A0与乙氧基乙氧基乙基丙烯酸酯在无溶剂、无催化剂、氮气氛围下室温搅拌过夜，然后在48-52℃反应48-56h，合成出了末端PEG链的第一代苝类荧光树枝状大分子D1；化合物B1与乙氧基乙氧基乙基丙烯酸酯在无溶剂、无催化剂、氮气氛围下室温搅拌过夜，然后在48-55℃反应68-72h，合成出了末端PEG链的第二代苝类荧光树枝状大分子D2；

化合物B2与乙氧基乙氧基乙基丙烯酸酯在无溶剂、无催化剂、氮气氛围下室温搅拌过夜，然后在48-60℃反应78-100h，合成出了末端PEG链的第三代苝类荧光树枝状大分子D3。

3水溶性阳离子荧光树枝状大分子应用于基因载体

上述合成方法合成的荧光树枝状大分子（B1，B2，B3）应用于基因载体，其特征在于：

将合成的第一代到第三代荧光树枝状大分子（B1，B2，B3）用浓度为1-4M的酸处理后，与活体细胞一起培养，发现B1，B2，B3都能够快速进入活细胞，表现出良好的生物相容性；同时该类化合物具有很强携带基因的能力，其中B3的运载基因能力最高。

本发明具有如下有益效果：

1.通过设计新的荧光核分子，首次在苝“海岛”位通过“点击”化学的方法，合成出了不同代数的水溶性的、可生物降解的苝类荧光树枝状大分子。该类大分子还具有良好的光、热、化学稳定性、结构可设计性、优异的生物相容性、细胞标记性等特性。

2.本发明利用不对称单体对间接近点击化学反应的方法来进行反应，目标树枝状大分子是唯一的产物，减少了树枝状大分子的合成和纯化步骤，加快了合成速度，提高了荧光树枝状大分子的质量和产品安全性。同时，本发明方法可以根据实际需要控制重复交替加入的不对称单体AB和巯基乙胺的次数，制备得到不同代数的荧光树枝状大分子，如可制备1-6代不同分子量的荧光树枝状大分子。

3.本发明方法制备得到的荧光树枝状大分子具有很好的生物相容性，且携带不同氨基官能团的荧光阳离子树枝状大分子表面富含大量的氨基官能团，端氨基的质子化可以使树枝状大分子带有正电荷，从而能与负电性核酸物质DNA或RNA分子相互作用，能够作为基因载体将外源核酸转运进入细胞内。实验证明，合成的荧光树枝状大分子对细胞进行基因转移的效率随着代数的增大而增大，且细胞毒性很低，具有很好的应用价值。

4.此外，该合成路线可节省以往合成及分离纯化高代数树枝状大分子所需要的大量时间，提高合成效率。

附图说明

图1苝类衍生物及其类似物的结构式。

图2实施例1中合成携带四个伯胺基团的苝类化合物A0的反应流程图。

图3实施例1中制备第一代到第三代荧光树枝状大分子的反应原理示意图。

图4实施例4中羟基功能化的苝类荧光树枝状大分子C1、C2、C3的结构式。

图5实施例5中端PEG链功能化的苝类荧光树枝状大分子D1、D2、D3的结构式。

图6实施例1中树枝状大分子B1、B2、B3的荧光发射光谱谱图。

图7实施例6中树枝状大分子B1、B2、B3进入活体细胞后荧光成像图。图9A是B1与活体细胞一起培养24h后的荧光成像图；图9B是B2与活体细胞一起培养12h后的荧光成像图;图9C是B3与活体细胞一起培养12h后的荧光成像图。

图8实施例7中树枝状大分子B1、B2、B3基因转染测试。2μMB1/100μM DNA复合物、2μM B2/100μM DNA复合物、2μM B3/100μM DNA复合物(N/P=8:1)穿透进入活体细胞培养48h后的荧光成像图。图A1为树枝状大分子B1的荧光成像；图A2为树枝状大分子B2的荧光成像；图A3为树枝状大分子B3的荧光成像。图B1、图B2、图B3都以CXR参照染料标记DNA。图C1为图A1和图B1合并成像图，图C2为图A2和图B2合并成像图，图C3为图A3和图B3合并成像图。

图9实施例7中树枝状大分子B1与DNA复合荧光成像图。

具体实施方式

实施例1利用点击化学反应方法合成荧光树枝状大分子

（1）合成端甲基丙烯酸酯的第一代荧光树枝状大分子（A1）

将0.16g（0.16mmol）携带四个伯胺基团的苝类化合物A0和0.2g（3.15mmol）MAEA加入10mL两口反应管中，在氮气氛围下室温搅拌过夜，然后在50℃反应48h，等反应温度降到室温后，用正己烷洗涤反应液3次，每次30mL正己烷，真空干燥得红色油状产物A1，产率为98%。

¹H-NMR(400Hz,CDCl₃):δppm:8.20(s,4H),7.09(d,8H),6.91(d,8H),6.11(s,8H),5.56(d,8H),4.32(br,32H),4.12(t,4H),2.87(t,16H),2.69(m,16H),2.51(t,16H),1.9(s,24H),1.59(m,4H),1.36(m,4H),0.90(t,6H).MS(MALDI-TOF,m/z)Calc.for C₁₃₆H₁₅₈N₆O₄₀,2516.73;found:2515.8.

（2）合成氨基官能化的第一代荧光树枝状大分子（B1）

将上述0.201g(0.08mmol)A1和0.062g(0.81mmol)巯基乙胺溶解在1mL二甲基亚砜（DMSO）中，在氮气氛围下室温搅拌45min后，加入20mL二氯甲烷稀释溶液，然后用饱和冰盐水洗涤四次，每次30mL冰盐水，萃取分液后，经减压蒸馏除去有机溶剂得红色油状产物B1，产率为98%。

¹H-NMR(CDCl₃,400Hz):δppm:8.12(s,4H),7.03(d,8H),6.84(d,8H),4.22(m,32H),4.15(t,4H),2.81(t,16H),2.77(m,32H),2.61(m,24H),2.53(m,16H),2.43(t,16H),1.56-1.44(m,8H),1.18(s,24H),0.91(t,6H).

（3）合成端甲基丙烯酸酯的第二代荧光树枝状大分子（A2）

将0.228g（0.072mmol）化合物B1和0.5g（2.71mmol）MAEA加入10mL两口反应管中，在氮气氛围下室温搅拌24h，然后在50℃反应72h，等反应温度降到室温后，用正己烷洗涤反应液4次，每次30mL正己烷，然后用二氯甲烷重新溶解粗产物，经减压蒸馏除去有机溶剂得红色油状产物A2，产率为90%。

¹H-NMR(400Hz,CDCl₃):δppm:8.18(s,4H),7.10(d,8H),6.92(d,8H),6.12(s,16H),5.59(d,16H),4.33-4.27(br,96H),4.15(t,4H),2.90-2.42(m,168H),1.94(s,48H),1.55-1.48(m,8H)1.25(d,24H),0.89(t,6H).

（4）合成氨基官能化的第二代荧光树枝状大分子（B2）

将上述0.0725g(0.012mmol)A2和0.0195g(0.25mmol)巯基乙胺溶解在1mL二甲基亚砜（DMSO）中，在氮气氛围下室温搅拌45min后，加入20mL二氯甲烷稀释溶液，然后用饱和冰盐水洗涤四次，每次30mL冰盐水，萃取分液后，经减压蒸馏除去有机溶剂得红色油状产物B2，产率为92%。

（5）合成第三代荧光树枝状大分子（B3）

将0.087g（0.012mmol）化合物B2和0.5g（2.71mmol）MAEA加入10mL两口反应管中，在氮气氛围下室温搅拌24h，然后在50℃反应72h，等反应温度降到室温后，用正己烷洗涤反应液4次，每次30mL正己烷，然后用二氯甲烷重新溶解粗产物，经减压蒸馏除去有机溶剂得红色油状产物A3，产率为95%。

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):δppm:8.18(s,4H),7.11(d,J=7.1Hz,8H),6.92(s,8H),6.13(s,32H),5.60(s,32H),4.31(d,J=22.1Hz,224H),4.14(t,4H),2.88-2.44(m,408H),1.95(s,96H),1.50-1.42(m,8H)1.25(d,J=6.5Hz,72H),0.88(t,6H).

将上述0.074g(0.006mmol)A3和0.0195g(0.25mmol)巯基乙胺溶解在1mL二甲基亚砜（DMSO）中，在氮气氛围下室温搅拌45min后，加入20mL二氯甲烷稀释溶液，然后用饱和冰盐水洗涤四次，每次30mL冰盐水，萃取分液后，经减压蒸馏除去有机溶剂得红色油状产物B3，产率为90%。

实施例2

除步骤（1）中采用甲基丙烯酰氧基丙烯酸丙酯代替甲基丙烯酰氧基丙烯酸乙酯与携带四个伯胺基团的苝类化合物A0反应外，其它操作均同于实施例1，制备得到第一代到第三代苝类荧光树枝状大分子。

实施例3

除步骤（1）中采用甲基丙烯酰氧基乙氧基乙氧基丙烯酸乙酯代替甲基丙烯酰氧基丙烯酸乙酯与携带四个伯胺基团的苝类化合物A0反应外，其它操作均同于实施例1，制备得到第一代到第三代苝类荧光树枝状大分子。

实施例4羟基功能化的苝类荧光树枝状大分子的合成

（1）根据实施实例1合成化合物A1，A2，A3；

（2）化合物A1与巯基甘油在DMSO为溶剂，三乙胺为催化剂条件下室温反应24h后，可得到羟基功能化的第一代苝类荧光树枝状大分子C1；

（3）化合物A2与巯基甘油在DMSO为溶剂，三乙胺为催化剂条件下室温反应36h后，可得到羟基功能化的第二代苝类荧光树枝状大分子C2；

（4）化合物A3与巯基甘油在DMSO为溶剂，三乙胺为催化剂条件下室温反应40h后，可得到羟基功能化的第三代苝类荧光树枝状大分子C3。

实施例5端PEG链功能化的苝类荧光树枝状大分子的合成

（1）携带四个伯胺基团的苝类化合物A0与乙氧基乙氧基乙基丙烯酸酯在无溶剂、无催化剂、氮气氛围下室温搅拌过夜，然后在50℃反应48h，合成出了端PEG链的第一代苝类荧光树枝状大分子D1；

（2）根据实施实例1合成化合物B1，B2；

（3）化合物B1与乙氧基乙氧基乙基丙烯酸酯在无溶剂、无催化剂、氮气氛围下室温搅拌过夜，然后在50℃反应72h，合成出了端PEG链的第二代苝类荧光树枝状大分子D2；

（4）化合物B2与乙氧基乙氧基乙基丙烯酸酯在无溶剂、无催化剂、氮气氛围下室温搅拌过夜，然后在50℃反应80h，合成出了端PEG链的第三代苝类荧光树枝状大分子D3。

实施例6活体细胞摄取实验

将合成的第一代到第三代荧光树枝状大分子（B1，B2，B3）用2M的HBr酸化处理后，与活体细胞一起培养，发现B1，B2，B3都能够进入活细胞，表现出良好的生物相容性。

实施例7基因转染实验

利用本发明的树枝状大分子B1，B2，B3粘结DNA转染活体细胞，考察了DNA和树枝状大分子复合的比例，即树枝状大分子末端铵盐数目与DNA分子磷酸根的数目比（N/P）对转染实验的影响。通过研究以不同N/P比（1：1，2：1，4：1，8：1）形成的DNA和B1，B2，B3复合物转染细胞的结果发现，B3在所有N/P比条件下都显示很高的转染活性。当N/P比为8：1，2μM B3,100μM DNA时，B3对活体细胞的转染效率最好。

Claims

1.水溶性荧光树枝状大分子的合成方法，其特征在于：

四个伯胺基团的苝类化合物，以下简称化合物A0，化合物A0的结构式如下：

将化合物A0和甲基丙烯酰氧基丙烯酸乙酯MAEA加入反应管中，摩尔比在1：16-1：20之间，在氮气氛围下室温搅拌过夜，然后在48-53℃反应48-56h，得到端甲基丙烯酸酯的第一代荧光树枝状大分子A1。

2.根据权利要求1所述的水溶性荧光树枝状大分子的合成方法，其特征在于还包括：

将上述A1和巯基乙胺按照摩尔比在1：9-1：11之间溶解在二甲基亚砜DMSO中，在氮气氛围下室温搅拌30-45min后，得到氨基官能化的第一代荧光树枝状大分子B1。

3.根据权利要求2所述的水溶性荧光树枝状大分子的合成方法，其特征在于还包括：

将上述化合物B1和MAEA按照摩尔比在1：32-1：80之间混合加入反应管中，在氮气氛围下室温搅拌过夜，然后在48-53℃反应56-72h，得到端甲基丙烯酸酯的第二代荧光树枝状大分子A2。

4.根据权利要求3所述的水溶性荧光树枝状大分子的合成方法，其特征在于还包括：

将上述A2和巯基乙胺按照摩尔比在1：18-1：21之间溶解在二甲基亚砜DMSO中，在氮气氛围下室温搅拌30-45min后，得到氨基官能化的第二代荧光树枝状大分子B2。

5.根据权利要求4所述的水溶性荧光树枝状大分子的合成方法，其特征在于还包括：

将上述化合物B2和MAEA按照摩尔比在1：80-1：400之间混合加入反应管中，在氮气氛围下室温搅拌过夜，然后在48-53℃反应72-120h，得到端甲基丙烯酸酯的第三代荧光树枝状大分子A3；

将上述A3和巯基乙胺按照摩尔比在1：38-1：42之间溶解在二甲基亚砜DMSO中，在氮气氛围下室温搅拌30-45min后，得到氨基官能化的第三代荧光树枝状大分子B3。

6.根据权利要求1或3或5所述的水溶性荧光树枝状大分子的合成方法，其特征在于还包括：

将上述A1和巯基甘油按照摩尔比在1：18-1：22之间溶解在DMSO中，并以三乙胺为催化剂，氮气氛围下室温搅拌22-26h后，得到羟基官能化的第一代荧光树枝状大分子C1；

将上述A2和巯基甘油按照摩尔比在1：36-1：42之间溶解在DMSO中，并以三乙胺为催化剂，氮气氛围下室温搅拌35-38h后，得到羟基官能化的第二代荧光树枝状大分子C2；

将上述A3和巯基甘油按照摩尔比在1：80-1：100之间溶解在DMSO中，并以三乙胺为催化剂，氮气氛围下室温搅拌38-48h后，得到羟基官能化的第三代荧光树枝状大分子C3。

7.根据权利要求2或4所述的水溶性荧光树枝状大分子的合成方法，其特征在于还包括：

化合物A0与乙氧基乙氧基乙基丙烯酸酯在无溶剂、无催化剂、氮气氛围下室温搅拌过夜，然后在48-52℃反应48-56h，合成出了端PEG链的第一代苝类荧光树枝状大分子D1；

化合物B1与乙氧基乙氧基乙基丙烯酸酯在无溶剂、无催化剂、氮气氛围下室温搅拌过夜，然后在48-55℃反应68-72h，合成出了端PEG链的第二代苝类荧光树枝状大分子D2；

化合物B2与乙氧基乙氧基乙基丙烯酸酯在无溶剂、无催化剂、氮气氛围下室温搅拌过夜，然后在48-60℃反应78-100h，合成出了端PEG链的第三代苝类荧光树枝状大分子D3。

8.采用权利要求2或4或5所述方法合成的大分子的应用，其特征在于还包括：

将合成的树枝状大分子B1，B2，B3用1-4M的酸酸化处理后，按加入细胞培养液中，培养活体细胞1小时以上后，这些分子都能进入活体细胞；这些分子能和外源核酸物质DNA或RNA结合，充当载体，携带外源核酸物质转染活体细胞。